Summary
Митохондрии могут использовать электрохимический потенциал через их внутреннюю мембрану (Δ фт) секвестр кальция (Ca 2+), что позволяет им формировать цитозольного Ca 2+ сигналов внутри клетки. Мы опишем метод для одновременного измерения митохондрий поглощения Са 2+ и ΔΨ м в живых клетках с использованием флуоресцентных красителей и конфокальной микроскопии.
Abstract
Помимо своей важной роли в создании АТФ, митохондрии также выступать в качестве местного кальция (Ca 2+) буферы плотно регулировать концентрацию внутриклеточного Ca 2+. Для этого, митохондрии используют электрохимический потенциал через их внутреннюю мембрану (ΔΨ м) секвестр Ca 2+. Приток Са 2+ в митохондрии стимулирует три ограничения скорости дегидрогеназ цикла лимонной кислоты, увеличивая перенос электронов через окислительное фосфорилирование (OXPHOS) комплексов. Эта стимуляция поддерживает Аф м, что временно рассеиваемой как положительные ионы кальция пересекают внутренней мембраны митохондрий в митохондриях.
Здесь мы опишем метод одновременного измерения митохондрий поглощения Са 2+ и ΔΨ м в живых клетках с использованием конфокальной микроскопии. По permeabilizing клеток, митохондриальных Ca 2+ можетбыть измерена с использованием флуоресцентного Са 2+ индикатора Fluo-4, AM, с измерением разориен- м с использованием тетраметилродамин флуоресцентный краситель, метиловый эфир, перхлорат (TMRM). Преимущество этой системы состоит в том , что существует очень мало спектральное перекрытие между флуоресцентных красителей, что позволяет точно измерять митохондриального Са 2+ и Аф м одновременно. Используя последовательное добавление Ca 2+ аликвот, митохондриальная Ca 2+ поглощение можно контролировать, и концентрация , при которой Са 2+ индуцирует митохондриальной переход проницаемость мембран и потеря Аф м определяется.
Introduction
Митохондрии играют важную роль в регуляции внутриклеточной концентрации Са 2+, выступая в качестве местных Са2 + буферов 1. Ca 2+ поступает в митохондрии через унипорт Ca 2+, процесс , приводимый электрохимического градиента , который существует по всей внутренней митохондриальной мембране (ΔΨ м) 2. Оказавшись внутри митохондриях, Ca 2+ может активировать окислительного фосфорилирования, стимулируя три ограничения скорости дегидрогеназ цикла лимонной кислоты 3. Эта стимуляция поддерживает Аф м, что временно рассеиваемой как положительные ионы кальция пересекают внутренней мембраны митохондрий в митохондриях. Если концентрация Са 2+ в митохондриях становится очень высокой, митохондриальная переход проницаемость может быть инициирована, что приводит к распылению разориен- м, то cessatioп окислительного фосфорилирования и индукция гибели клеток путей 4 передачи сигналов.
Важная роль, которую играют митохондрии в пространственной буферизации клеточного кальция делает точный мониторинг митохондриального кальция критическим. Различные методы были созданы для мониторинга митохондриальную кальция, в том числе с использованием красителей на основе родамина. Одним из таких красителей, Rhod-2, АМ, весьма эффективен при разбиении на митохондрии для измерения уровней митохондриальных 5 Ca 2+, 6. Однако необходимо использовать в качестве какой-то краситель будет накапливаться в других органеллах, таких как липосомы, или остаются в цитозоле клетки. Тем не менее, ниже по течению анализы могут быть использованы , чтобы отличить эти сигналы от тех , из митохондрий 7.
Другой метод для мониторинга митохондриальную кальций использует флуоресцентные репортер строит 8 вверх>. Польза от этих генетически кодируемых зондов является то, что они могут быть конкретно направлены на митохондрии с помощью эндогенные N-концевых пептидов, например, сигнал с N-концевым адресности человеческого ЦОГ-субъединицы VIII. Эта система была использована для создания митохондриальный-мишенью акворина зонд , который оказался чрезвычайно полезным для исследования митохондриальной кальция сигнализации 9. Главный недостаток этих генетически кодируемых зондов является то, что они должны быть введены в клетки путем временной экспрессии (что не представляется возможным для некоторых типов клеток, и может производить различные результаты), либо путем создания стабильных систем экспрессии (что отнимает много времени).
Для того, чтобы обойти проблемы , описанные выше, мы разработали новый протокол для измерения митохондриальную Са 2+ и Аф м одновременно. Этот протокол основан на методе, описанном ранее, который добавляет экзогенного кальция в клетках пермеабилизированныхs = "Xref"> 10. Наш протокол имеет три основных преимущества по сравнению с другими способами: во - первых, мы используем Fluo-4, AM и TMRM для мониторинга митохондриальную Са 2+ и Аф м, два красителей , которые имеют очень разные спектральные свойства; Во- вторых, клетки проницаемыми , так что сигнал Fluo-4 только обнаружение митохондриальных Ca 2+ и Ca 2+ не локализованы в других органеллах , или в цитозоль клеток; и в- третьих, использование Fluo-4 для обнаружения митохондриальных Ca 2+ позволяет быстро и просто окрашивания клеток, отрицающий любые трансфекции клеток или трансформации проблемы , которые существуют при использовании генетически кодируемых зондов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение клеток
- Рост клеток на 10 см чашки для культивирования клеток или 75 см 2 колбах в культуральной среде [10 мл Дульбекко Модифицированные орлов Medium (DMEM) , дополненной 5% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1x пенициллина / стрептомицина (P / S )] при 37 ° C / 5% CO 2.
- Для сбора клеток, удалить носитель путем аспирации, а затем промывают 5 мл 1x фосфатным буферным солевым раствором (1x PBS). Удалить 1X PBS отсасыванием, а затем добавляют 1,5 мл 0,25% (вес / об) трипсин / 0,25% (вес / объем) этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 2 мин. Нажмите чашка или колба осторожно, чтобы удалить клетки, а затем ресуспендируют в 5 мл культуральной среды.
- Граф клеток путем добавления 12 мкл ресуспендировали клеток на гемоцитометра.
- Пластина клеток в посуде или камерных покровные для конфокальной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет иметь подходящий пластмассовый или со стеклянным дном, который был разработан для использования с перевернутыми микроскопов. - Пластинчатые клетки так йна ~ 80% конфлюэнтности достигается в день визуализации. Например, примерно 2 х 10 4 143B остеосаркомы клетки можно высевать в одну лунку 8-а камера слайд за один день до обработки изображений.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C / 5% CO 2 , чтобы позволить клеткам прикрепляться и восстанавливаться.
2. Буферы для TMRM и Fluo-4 изображений
- Подготовка записи решения (RS) , содержащего 156 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 2 мМ MgSO 4, 1,25 мМ KH 2 PO 4, 10 мМ D-глюкозы, 2 мМ CaCl 2 и 10 мМ HEPES , рН 7,35. Магазин RS в аликвотах при -20 ° С.
- Подготовьте внутриклеточный Medium (IM) , содержащего 6 мМ NaCl, 130 мМ KCl, 7,8 мМ MgCl 2, 1 мМ KH 2 PO 4, 0,4 мМ CaCl 2, 2 мМ EGTA, 10 мМ ГЭДТК, 2 мМ малат, 2 мМ глутамата, 2 мМ АДФ и 20 мМ HEPES, рН 7,1. 200 мМ маточные растворы малат, глутамат и АДФ могут быть приготовлены отдельно, на аликвоты и хранили при -20 ° С. Эти улocks могут быть добавлены в IM непосредственно перед использованием.
- Ca 2+ свободного Хэнка буферном солевом растворе (HBSS) , может быть получен заранее подготовленные от коммерческих поставщиков. Добавить этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ', N'-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA) до конечной концентрации 500 мкМ.
- Подготовка исходного раствора 10 мМ тетраметилродамин, метиловый эфир, перхлорат (TMRM) в 100% метаноле. Из этого запаса, сделать рабочий запас 2 мкМ в дистиллированной H 2 O.
- Подготовка исходного раствора 10 мМ Верапамил в 100% этаноле.
- Подготовьте 1 мг / мл (вес / об) маточного раствора Fluo-4 ацетоксиметил эфира (Fluo-4, AM) в диметилсульфоксиде (ДМСО).
Примечание: Fluo-4, AM является индикатором кальция , который проявляет повышенную флуоресценцию при связывании Са 2+. Fluo-4 является аналогом Fluo-3, с двумя заместителями хлора замещены атомами фтора. Это приводит к увеличению возбуждения флуоресценции при длине волны 488 нм и более высоким уровнем сигнала флуоресценции.сложноэфирная группа AM приводит к незаряженной Fluo-4 молекулы, которые могут проникать через клеточные мембраны. После того, как внутри клетки, сложный эфир АМ расщепляется неспецифических эстераз, в результате чего в заряженном виде Fluo-4, который захватывается внутри клетки. - Готовят раствор 1 мМ карбонилцианид р-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) в 100% этаноле.
- Подготовка исходного раствора 25 мг / мл (вес / об) дигитонина в дистиллированной H 2 O.
- Готовят раствор 100 мкМ тапсигаргин в ДМСО.
- Подготовка исходного раствора 40 мМ хлорида кальция (CaCl 2) в дистиллированной H 2 O.
3. Окрашивание клеток с TMRM и Fluo-4, AM
- Готовят RS окрашивающий раствор с 20 нМ TMRM, 5 мкг / мл (вес / об) Fluo-4, AM и 0,005% поверхностно-активного вещества, такие как Pluronic F-127 в RS.
Примечание: Этот поверхностно-активное вещество представляет собой неионный полиол, который облегчает солюбилизацию Fluo-4, AM. Примечание: 10 мкМ верапамила также могут быть добавлены к inhibiэкспорт т TMRM в плазматической мембране с множественной лекарственной переносчика, если она экспрессируется в типе клеток, анализируемой. - Удалить из культуральной среды клеток с помощью пипетки и промывают 100 мкл 1x PBS.
- Удалить 1X PBS с помощью пипетки и инкубировать клеток в 250 мкл окрашивающего раствора Р.С. в течение 45 мин при комнатной температуре.
Примечание: После того, как Fluo-4, М. поступает в клетку, сложный эфир АМ расщепляется с помощью клеточных эстераз. Инкубация при комнатной температуре ингибирует активность эстеразы, позволяя Fluo-4, AM, чтобы войти в митохондрии. - Удалить RS окрашивание раствора с помощью пипетки и промыть клетки в 100 мкл Ca 2+ свободный HBSS для удаления избытка Fluo-4, AM и TMRM.
- Готовят раствор формирования изображения IM с 25 мкг / мл (вес / объем) дигитонин, 200 нМ TMRM и 1 мкМ тапсигаргин в IM.
Примечание: Концентрация дигитонина может потребоваться скорректировать, чтобы гарантировать, что пермеабилизации из внутренней мембраны митохондрий не происходит. Это может быть определено эмпирически путем оценки интенсивностисигнала TMRM при различных концентрациях дигитонином. - Удалите Ca 2+ свободный HBSS с помощью пипетки и добавляют 300 мкл раствора визуализации IM к клеткам. Оставьте клетки уравновешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Клетки теперь готовы для работы с изображениями с CaCl 2 дополнения.
4. Сотовый обработки изображений
- Поместите блюдо или камерные покровное с клетками в растворе визуализации IM на инвертированного лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
- Используйте настройки на микроскоп лазеров для возбуждения и излучения спектров TMRM и Fluo-4. Например, можно использовать 543 нм He-Ne-и 473 нм аргонового лазера линии для возбуждения TMRM и Fluo-4 соответственно. Используйте низкую мощность лазера примерно на 5%, чтобы свести к минимуму любые фото-повреждения клеток.
- Установите микроскоп для сканирования изображений каждые 25 сек. Сканирование клеток в течение 10 мин, чтобы получить базовые показания для TMRM и сигналов Fluo-4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал Fluo-4 может быть слабым или невозможно обнаружить при отдыхает ОБОГАЩЕНИЯ кальциярационы. - Добавить 3 мкл 40 мМ CaCl 2 маточного раствора непосредственно в клетки в 300 мкл раствора изображений IM (1: 100 разведение) и осторожно перемешать с помощью пипетки. Приостановка сканирования изображения во время добавления и смешивания CaCl 2 при необходимости.
Примечание: Конечный свободный Са 2+ концентрации ионов [Са 2+] в растворе визуализации IM можно рассчитать с помощью программного обеспечения , такого как Maxchelator WEBMAXC Длинное ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) или хелатор 11. Подробное описание того , как вычислить конечный свободный Ca 2+ концентрации ионов [Са 2+] описана в разделе 6 ниже. - Продолжить сканирование изображения в течение примерно 4 мин, а затем повторить CaCl 2 дополнения каждые 4 мин до получения желаемого TMRM или сигналов Fluo-4 достигаются, как правило , около 8 до 10 дополнений.
- С помощью пипетки добавьте 1: 100 разведение 1 мМ FCCP (финал Concentration 10 мкМ) непосредственно к клеткам , чтобы рассеять Аф м. Клетки изображение еще в течение 5 мин. Эксперимент теперь закончен.
Анализ 5. Изображение
- После завершения формирования изображения, определяют интенсивность сигналов Fluo-4 и TMRM с использованием программного обеспечения для анализа изображений, например, ImageJ программного обеспечения с помощью плагина Био-форматов (скачать 'bioformats_package.jar' от http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / и сохранить его в "C: Program Files ImageJ Plugins 'папку).
- Откройте файл изображения (например, файл .oif) в ImageJ. Нажмите на инструмент выбора и выбора интересующей области (ROI), который содержит митохондрии. Использовать исходный сигнал TMRM для выбора ROI.
- Открыть "Анализ> Инструменты> ROI менеджер", нажмите кнопку "Добавить", чтобы включить выбранный ROI для измерения интенсивности. Несколько трансформирования могут быть выбраны на одном изображении для измерения. Повторите предыдущие шаги, пока все ROIs, которые были добавлены в ROI Manager.
- Нажмите кнопку "Дополнительно> Многопозиционное измерение ', убедитесь, что" Мера все ломтики' выбран и что "по одной строке на фрагмент 'снят, затем нажмите кнопку" OK ", чтобы получить таблицу средней интенсивности флуоресценции сигналов от TMRM и Fluo-4 для каждого ROI в каждый момент времени.
- Используйте данные из всех трансформирования для расчета средней интенсивности и стандартное отклонение для TMRM и сигналов Fluo-4.
6. Расчет конечного свободного Са 2+ концентрации ионов [Са 2+]
- Бесплатно Ca 2+ концентрации ионов [Са 2+] в растворе визуализации IM может быть определена с помощью программного обеспечения , таких как Maxchelator WEBMAXC РАСПРОСТРАНЕНИЯ ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) или хелатирующего 11. Например, установите переменные в WEBMAXC РАСПРОСТРАНЕНИЯ следующим образом: температура = 24 ° С, рН = 7.1, Ионная сила = 0,162, EGTA = 0,002 М, ГЭДТК = 0,01 М, Са 2+ = 0,0004 М и Mg 2+ = 0,0078 М. Это приводит к конечной свободной Са 2+ концентрации ионов [Са 2+] 62 нм , Обратите внимание, что эти программы не могут принимать во внимание каждую переменную, например, чистота реактива, точность измерений и определения рН. Наиболее точный метод определения концентрации свободного Ca 2+ является использование калиброванной Ca 2+ селективный электрод.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали этот протокол для изучения влияния мутации MT-ND5 на способность митохондрий клеток 143B в буфер возрастает кальция 12. В примере, показанном здесь, клетки 143В управления были загружены TMRM и Fluo-4, М., прежде чем пермеабилизации дигитонином. Через 5 мин визуализации, восемь последовательных добавлениями 1: были сделаны 100 разбавлении 40 мМ CaCl 2 , экзогенные, с конечной свободной Са 2+ концентрации ионов [Са 2+] вычисляется.
После каждого CaCl 2 Кроме того, сигнал TMRM уменьшается по мере притока ионов Са 2+ в митохондриях рассеивает митохондриального мембранного потенциала Аф м (рисунок 1). ΔΨ м затем восстанавливается , как дыхание увеличивается для поддержания Аф м. Это происходит в четыре раза после каждого CaCl
Митохондриальная концентрация кальция (Fluo-4 сигнала) начинает увеличиваться после второго CaCl 2 Кроме того , когда свободный [Са 2+] в средствах массовой информации достигает 0,32 мкм (рисунок 2). Каждый последующий CaCl 2 Добавление вызывает прогрессивное увеличение митохондриального кальция.
Образы одновременных измерений Аф м (TMRM, красный сигнал) и митохондриальной кальция (Fluo-4, зеленый сигNAL) показаны (рисунок 3).
Рисунок 1: Измерение митохондриальной Аф м в дигитонином проницаемыми 143B клеток с использованием TMRM. Клетки 143В были предварительно загружены с Fluo-4, AM и TMRM перед тем пермеабилизации с дигитонином. В соотношении 1: 100 разбавление 40 мМ CaCl 2 экзогенных добавляли в последовательных аликвот. Окончательный свободный [Са 2+] в средствах массовой информации указывается для каждого добавления (*). FCCP был добавлен до конечной концентрации 10 мкМ приблизительно через 40 мин. ΔΨ м отображается красным цветом, в лице относительной интенсивности (RI) сигнала TMRM. Данные среднее ± стандартное отклонение п = 3. Рис адаптирована с разрешения автора из ссылки 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versioп этой фигуры.
Рисунок 2: Измерение митохондриального кальция в дигитонина проницаемыми 143B клеток с использованием Fluo-4, AM. Клетки 143В были предварительно загружены с Fluo-4, AM и TMRM перед тем пермеабилизации с дигитонином. В соотношении 1: 100 разбавление 40 мМ CaCl 2 экзогенных добавляли в последовательных аликвот. Окончательный свободный [Са 2+] в средствах массовой информации указывается для каждого добавления (*). FCCP был добавлен до конечной концентрации 10 мкМ приблизительно через 40 мин. Митохондриальная кальция отображается зеленым цветом, в лице относительной интенсивности (RI) сигнала Fluo-4. Данные среднее ± стандартное отклонение п = 3. Рис адаптирована с разрешения автора из ссылки 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Одновременное измерение митохондриального кальция и Аф м в дигитонином проницаемыми 143B клеток с использованием Fluo-4, AM и TMRM. Клетки 143В были предварительно загружены с Fluo-4, AM и TMRM перед тем пермеабилизации с дигитонином. В соотношении 1: 100 разбавление 40 мМ CaCl 2 экзогенных добавляли в последовательных аликвот. Окончательный свободный [Са 2+] в средствах массовой информации указывается для каждого добавления. Представитель конфокальной изображения , показывающие одновременное окрашивание Аф м (TMRM, красный) и митохондриальную кальция (Fluo-4, зеленый). Обратите внимание, что сигнал Fluo-4, трудно обнаружить при покоящейся концентрации кальция 0,062 мкМ. Белые шкалы баров = 10 мкм. Рисунок адаптирован с разрешения автора из ссылки 12.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кальций играет важную роль во многих клеточных процессах, в том числе сокращение мышц, нервных клеток сигнализации и пролиферации клеток 13. Увеличение концентрации клеток кальция часто связаны с спроса на энергию, с кальцием , способного непосредственно стимулировать митохондриального окислительного фосфорилирования поднять АТФ поколения 3. Поэтому крайне важно, что у нас есть возможность эффективно контролировать накопление митохондриальную кальция и, чтобы иметь возможность сравнить, как эта функция зависит от обоих генетических факторов и фармакологических агентов.
Критические шаги в рамках протокола
Этот протокол описывает способность контролировать митохондрии накопление кальция и Аф м одновременно с Fluo-4, AM и TMRM. Во время процесса окрашивания важно, чтобы инкубировать клетки при комнатной температуре, чтобы оптимизировать эффективность Fluo-4, AM в обнаружении митохондриальнуюкальций. Инкубация при комнатной температуре снижает активность цитозольных эстераз, позволяя незаряженный Fluo-4, AM пересечь митохондриальной мембраны и проникать в митохондриях. С другой стороны, инкубация при 37 ° С повышает активность эстеразы в цитозоле, отщеплением эфир AM, чтобы оставить заряженный Fluo-4 краситель, который не был бы в состоянии эффективно пересекать митохондриальные мембраны.
После того, как окрашивание клеток была выполнена, клетки погружали в раствор визуализации IM. Это решение имеет более высокую концентрацию TMRM по сравнению с исходным раствором RS окрашивания. Теперь, когда клетки проницаемыми, то TMRM больше не уравновешивается через плазматическую мембрану. Таким образом, концентрация TMRM повышается в растворе И.М. формирования изображения для достижения правильного равновесия при использовании внутренней митохондриальной мембраны. Также очень важно на данном этапе включать тапсигаргин в растворе IM визуализации. Тапсигаргин блокирует эндоплазматической сети (ER) Ca 2+ АТФазы, гарантируя , что сигнал Fluo-4 не обнаружено ER кальция.
Модификации и устранение неисправностей
Некоторые типы клеток могут выразить множественной лекарственной устойчивости переносчик (также известный как MDR1 или Р-гликопротеина) на их плазматических мембран. Этот белок известен экспортировать флуоресцентные показатели, в том числе производные АМ сложный эфир, из цитоплазмы из клетки 14. Если переносчик выражается, как Fluo-4, AM и TMRM могут быть экспортированы из цитозоле клетки, что приводит к неоптимальным окрашивания. Чтобы блокировать этот эффект, верапамил может быть добавлен к RS окрашивающего раствора блокировать множественную лекарственную устойчивость транспортером, ингибируя Fluo-4, AM и TMRM экспорта в процессе окрашивания.
По permeabilizing ячейки , которые будут проанализированы, Fluo-4, АМ может быть использован для обнаружения митохондриального Са 2+, без каких - либо конкурирующих сигналов от других органелл или цитозоле. Мы обычно используем неионного detergenт дигитониновый для пермеабилизации при концентрации 25 мкг / мл. Эта концентрация может потребоваться скорректировать, чтобы гарантировать, что солюбилизация митохондриальных мембран не происходит. Это может быть определено эмпирически путем оценки интенсивности сигнала TMRM при различных концентрациях дигитонином. Если концентрация дигитонина слишком высока, митохондриальная мембрана будет частично солюбилизируют, уменьшая сигнал TMRM.
Ограничения метода
Одним из основных преимуществ этого протокола является то , что с помощью Fluo-4, AM , чтобы обнаружить митохондриальный кальций, TMRM может использоваться для одновременного измерения разориен- м, с пренебрежимо малой спектральной перекрытия между двумя красителями. Для обеспечения специфичности Fluo-4 для митохондриального кальция, клетки рассматривается необходимость быть проницаемыми для устранения цитозольного Fluo-4 сигнала. Это пермеабилизации одно ограничение этого метода. В то время как ССН раствора IM изображенийСэли соответствует ионной силы цитозоле клетки, он не может полностью воспроизвести все ее компоненты. Это может повлиять на результаты, если конкретные цитозольных компоненты необходимы в экспериментальной системе рассматривается. Кроме того, как клетки проницаемыми, протокол может не подходить для длительных экспериментов больше, чем 1 час.
Значение метода в отношении существующих / альтернативных методов
Различные флуоресцентные красители были разработаны для оценки митохондриального кальция 8. Эти красители просты в использовании и могут предоставить полезные данные в короткий промежуток времени. В то время как эти красители накапливаются преимущественно в митохондриях, некоторые из них могут также накапливаться в других органеллах, в том числе липосом, или остаются в цитозоле клетки. Поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы гарантировать, что эти другие сигналы не влияют на митохондриальную сигнал кальция.
В этом протоколе mitochondrМВЛ Са 2+ измеряется в проницаемыми клеток в присутствии тапсигаргин. Преимущество этой методики является то, что цитозольной и ER кальциевых сигналов устраняются. Кроме того, пермеабилизации позволяет использовать Fluo-4, AM для обнаружения митохондриальных Ca 2+. Fluo-4, AM имеет очень мало спектральное перекрытие с TMRM, а это означает , что митохондриальная Са 2+ и ΔΨ м можно одновременно измерять с помощью этих двух красителей.
Митохондриальная Ca 2+ также может быть измерена с использованием генетически кодируемых флуоресцентных репортеров 8. Эти журналисты могут быть направлены на митохондрии, что приводит к определенным митохондриальных сигналов Ca 2+. Генетически кодируемые зонды должны быть введены в клетки изучаются, которые в некоторых случаях это может занять много времени и усилий. С другой стороны, наш протокол использует красители Fluo-4, AM и TMRM, что позволяет быстро и просто клеточного окрашивания для измерения митохондриальную Са
Будущие приложения или направления после освоения этой техники
Митохондрии действуют как локальные буферы кальция регулировать внутриклеточные концентрации кальция и потребности в энергии клетки. Когда этот процесс нарушается, чрезмерное поглощение кальция митохондриальная может вызвать митохондриальную переход проницаемость, что приводит к коллапсу Аф м и высвобождение про-апоптотических молекул , которые вызывают гибель клеток индукции 4.
Мы представляем быстрый и прямой вперед протокол для изучения митохондриального кальция и его отношения к Аф м и индукции митохондриального перехода проницаемости. Это может быть использовано , чтобы исследовать , как эти параметры влияют митохондриальные патогенеза в широком диапазоне заболеваний человека, в том числе сахарного диабета 15 и связанных с возрастомусловия нейродегенерации , такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона 16. Кроме того, этот протокол может быть использован для изучения , как митохондриальные кальция и ΔΨ м страдают от генетических дефектов или токсинов окружающей среды, а также , как эти влияет , можно модулировать с помощью терапии или лекарств , которые нацелены на митохондрии. Эти типы будущих экспериментов могут обеспечить важные новые знания о роли, которую играет митохондриальная кальция в здоровье человека и болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Kirstin Elgass и д-р Сара Крида из Monash Micro Imaging, для оказания технической помощи, а также Wellcome Trust и Совет по медицинским исследованиям Великобритании за финансовую поддержку. MMcK поддерживается будущее стипендий схема австралийского совета по научным исследованиям (FT120100459), Бакланд Фонд Уильяма, Австралийский фонд митохондриального заболевания (AMDF), Института Хадсона медицинских исследований и Университета Монаша. Эта работа была поддержана Викторианский правительства Схемы операционной инфраструктуры поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
