Summary
Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.
Abstract
Aparte de su papel esencial en la generación de ATP, las mitocondrias también actúan como amortiguadores de calcio locales para regular fuertemente la concentración intracelular de Ca2 + (Ca2 +). Para hacer esto, mitocondrias utilizan el potencial electroquímico a través de su membrana interna (ΔΨ m) para secuestrar Ca 2 +. La afluencia de Ca2 + en la mitocondria estimula tres deshidrogenasas que limitan la velocidad del ciclo del ácido cítrico, el aumento de la transferencia de electrones a través de la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) complejos. Esta estimulación mantiene ΔΨ m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial.
Se describe aquí un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas mediante microscopía confocal. Por permeabilización de las células, Ca 2 + mitocondrial puedemedirse utilizando el Ca 2 + indicador fluorescente Fluo-4 AM, con la medición de ΔΨ m usando el colorante fluorescente tetrametilrodamina, éster metílico, el perclorato (TMRM). El beneficio de este sistema es que hay muy poco solapamiento espectral entre los colorantes fluorescentes, lo que permite una medición precisa de Ca 2 + mitocondrial y ΔΨ m simultáneamente. Uso de la adición secuencial de Ca 2+ alícuotas, Ca 2 + mitocondrial captación pueden ser monitoreados, y la concentración a la que Ca2 + induce la transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la pérdida de ΔΨ m determinado.
Introduction
Las mitocondrias juegan un papel importante en la regulación de la concentración intracelular de Ca2 +, actuando como locales Ca 2 + buffers 1. Ca 2+ entra en la mitocondria a través de la uniporter Ca2 +, un proceso impulsado por el gradiente electroquímico que existe a través de la membrana interna mitocondrial (ΔΨ m) 2. Una vez dentro de la matriz mitocondrial, Ca 2+ puede activar la fosforilación oxidativa mediante la estimulación de tres deshidrogenasas limitantes de la velocidad del ciclo del ácido cítrico 3. Esta estimulación mantiene ΔΨ m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial. Si la concentración de Ca2 + dentro de las mitocondrias se vuelve muy alta, la transición de permeabilidad mitocondrial puede ser iniciado, dando lugar a la disipación de ΔΨ m, la cessation de la fosforilación oxidativa y la inducción de la muerte celular vías 4 de señalización.
El importante papel que las mitocondrias desempeñan en el búfer espacial de calcio celular hace que la supervisión precisa de calcio mitocondrial crítica. Se han establecido varios métodos para controlar de calcio mitocondrial, incluyendo el uso de colorantes a base de rodamina. Uno de estos colorantes, Rhod-2, AM, es muy eficaz en la partición a la mitocondria para medir los niveles de Ca2 + mitocondrial 5, 6. Sin embargo, se debe tener cuidado ya que algunos de colorante se acumulará en otros orgánulos, tales como liposomas, o permanecer en el citosol de la célula. Sin embargo, los análisis posteriores se pueden emplear para distinguir estas señales a los de la mitocondria 7.
Otra técnica para controlar de calcio mitocondrial utiliza reportero fluorescente construye 8 arriba>. El beneficio de estas sondas codificados genéticamente es que pueden ser dirigidos específicamente a la mitocondria mediante el uso de péptidos endógenos N-terminal, por ejemplo, la señal de direccionamiento N-terminal de la subunidad VIII de la COX humano. Este sistema se ha empleado para generar una sonda aequorina mitocondrial de orientación que ha demostrado ser extremadamente útil para la investigación mitocondrial de señalización 9 de calcio. El principal inconveniente de estas sondas codificados genéticamente es que necesitan para ser introducido en las células por la expresión transitoria (que no es factible para ciertos tipos de células y pueden producir resultados variables) o mediante la creación de sistemas de expresión estables (que está consumiendo tiempo).
Para evitar los problemas descritos anteriormente, hemos desarrollado un nuevo protocolo para medir mitocondrial de Ca2 + y ΔΨ m simultáneamente. Este protocolo se basa en un método descrito previamente que añade calcio exógeno a células permeabilizadass = "xref"> 10. Nuestro protocolo tiene tres ventajas principales con respecto a otros métodos: en primer lugar, utilizamos Fluo-4 AM y TMRM para supervisar Ca 2 + mitocondrial y ΔΨ m, dos colorantes que tienen propiedades espectrales muy distintas; En segundo lugar, las células se permeabilizaron de modo que la señal de Fluo-4 solamente está detectando mitocondrial Ca 2 + y Ca2 + no localiza en otros orgánulos o el citosol de la célula; y en tercer lugar, el uso de Fluo-4 para detectar Ca 2 + mitocondrial permite la tinción celular rápido y simple, anulando cualquier problema de transfección de células o de transformación que existen si el uso de sondas codificados genéticamente.
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Protocol
1. Preparación de las células
- Se cultivan las células en 10 cm placas de cultivo celular o 75 cm 2 frascos en medios de cultivo [10 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1 x penicilina / estreptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Para cosechar las células, retirar el medio por aspiración, luego se lava con 5 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS 1x). Eliminar 1x PBS por aspiración, a continuación, añadir 1,5 ml 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante 2 min. Toque plato o frasco suavemente para eliminar las células, a continuación, volver a suspender en medios de cultivo de 5 ml.
- Recuento de células mediante la adición de 12 l de células resuspendidas en un hemocitómetro.
- células de la placa en platos o cubreobjetos con cámaras de imagen confocal.
NOTA: Estos tendrán un fondo de plástico o vidrio adecuado que ha sido diseñado para su uso con microscopios invertidos. - células de la placa por lo THen ~ se consigue 80% de confluencia en el día de obtención de imágenes. Por ejemplo, aproximadamente 2 x 10 4 células de osteosarcoma 143B se pueden sembrar en un pocillo de una una jornada de 8 así porta con cámara antes de exponer.
- Se incuban las células durante la noche a 37 ° C / 5% de CO 2 para permitir que las células se unan y se recuperan.
2. Tampones para TMRM y Fluo-4 Imaging
- Preparar la solución de registro (RS) que contiene NaCl 156 mM, KCl 3 mM, 2 mM MgSO 4, 1,25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-glucosa, 2 mM CaCl 2 y HEPES 10 mM pH 7,35. RS almacenar en alícuotas a -20 ºC.
- Preparar intracelular Medio (IM) que contiene NaCl 6 mM, KCl 130 mM, 7,8 mM MgCl 2, mM KH 2 PO 4, 0,4 mM CaCl 2, EGTA 2 mM, mM HEDTA 10, malato 2 mM, glutamato 1 mM 2, 2 mM ADP y HEPES 20 mM pH 7,1. 200 mM de soluciones stock de malato, glutamato y ADP se pueden preparar por separado, en alícuotas y se almacenaron a -20 ° C. estos stocks se pueden añadir a la IM justo antes del uso.
- Ca solución de sal tamponada 2+ libre de Hank (HBSS) se puede obtener pre-preparado a partir de proveedores comerciales. Añadir ácido etilenglicol-bis (éter de β-aminoetil) -N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) a una concentración final de 500 mM.
- Preparar una solución madre de 10 mM tetrametilrodamina, éster de metilo, perclorato (TMRM) en 100% de metanol. De esta población, hacer una reserva de trabajo de 2 M en H2O destilada
- Preparar una solución madre de verapamilo 10 mM en 100% de etanol.
- Preparar un 1 mg / ml (p / v) solución madre de éster Fluo-4 acetoximetil (Fluo-4 AM) en dimetilsulfóxido (DMSO).
NOTA: Fluo-4 AM es un indicador de calcio que presenta una mayor fluorescencia tras la unión a Ca2 +. Fluo-4 es un análogo de fluo-3, con los dos sustituyentes de cloro reemplazado por átomos de flúor. Esto da como resultado un aumento de la excitación de fluorescencia a 488 nm y los niveles de señal de fluorescencia más altas. losgrupo éster AM resulta en una molécula sin carga Fluo-4 que puede penetrar en las membranas celulares. Una vez dentro de la célula, el éster AM se escinde por las esterasas no específicas, lo que resulta en una forma cargada de Fluo-4 que está atrapado dentro de la célula. - Preparar una solución madre de 1 mM carbonil cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en 100% de etanol.
- Preparar una solución madre de 25 mg / ml (w / v) de digitonina en H2O destilada
- Preparar una solución madre de 100 thapsigargin mu M en DMSO.
- Preparar una solución madre de cloruro de calcio 40 mM (CaCl 2) en H2O destilada
3. La tinción de células con TMRM y Fluo-4, AM
- Preparar la solución RS tinción con 20 nM TMRM, 5 g / ml (w / v) Fluo-4, AM y 0,005% de tensioactivo tal como Pluronic F-127 en RS.
NOTA: Este tensioactivo es un poliol no iónico que facilita la solubilización de Fluo-4, AM. Nota: 10 M verapamilo también se puede añadir a inhibit TMRM exportación por el transportador de múltiples fármacos membrana plasmática si se expresa en el tipo celular que se está analizando. - Retire el medio de cultivo de células con una pipeta y se lava con 100 l de PBS 1x.
- Eliminar 1x PBS mediante una pipeta y se incuba células en solución de tinción RS 250 l durante 45 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Una vez que el Fluo-4, AM entra en la célula, el éster AM se escinde por esterasas celulares. Incubando a temperatura ambiente inhibe la actividad de esterasa, permitiendo Fluo-4, AM para entrar en la mitocondria. - Retire la solución RS tinción mediante una pipeta y lavar las células en 100 l de Ca2 + libre de HBSS para eliminar el exceso de Fluo-4 AM y TMRM.
- Preparar solución de imagen IM con 25 g / ml de digitonina (v / w), 200 nM y 1 TMRM thapsigargin mu M en IM.
NOTA: puede ser necesario ajustar para asegurar que la permeabilización de la membrana interna mitocondrial no se produce la concentración de digitonina. Esto se puede determinar empíricamente mediante la evaluación de la intensidadde la señal de TMRM a diferentes concentraciones de digitonina. - Retire el Ca2 + libre de HBSS mediante una pipeta y añadir 300 l de solución de imagen IM a las células. Deja células que se equilibre a temperatura ambiente durante 10 min. Las células están listas para imágenes con CaCl 2 adiciones.
4. Cell Imaging
- Introducir la cápsula o cubreobjetos cámaras con células en solución de imágenes IM en un microscopio confocal de barrido láser invertida.
- Utilice el ajuste de los láseres microscopio para detectar la excitación y espectros de emisión de TMRM y Fluo-4. Por ejemplo, utilice 543 nm de He-Ne y 473 líneas de láser de argón nm para excitar TMRM y Fluo-4, respectivamente. Utilice una fuente de láser de baja de aproximadamente 5% para reducir al mínimo cualquier foto-daño a las células.
- Establecer microscopio para escanear imágenes cada 25 segundos. escaneo de células durante 10 minutos para establecer lecturas de referencia para el Fluo-4 señales y TMRM.
NOTA: La señal de Fluo-4 puede ser débil o indetectable en la que descansa concent calcioraciones. - Añadir 3 l de CaCl 2 solución madre 40 mM directamente a las células en 300 l de solución de imágenes IM (una dilución 1: 100) y se mezcla suavemente con una pipeta. Una pausa en la exploración de la imagen, mientras que la adición y mezcla del CaCl2 si es necesario.
NOTA: La concentración de iones Ca2 + libre final [Ca 2 +] en la solución de imagen IM puede calcularse utilizando software como Maxchelator WEBMAXC EXTENDIDO ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o quelante 11. Una descripción detallada de cómo calcular la concentración de iones Ca2 + libre final de [Ca2 +] se describe en la sección 6 a continuación. - Continuar escaneado de imágenes por aproximadamente 4 minutos, y luego repetir CaCl 2 adiciones cada 4 minutos hasta que la TMRM deseado o Fluo-4 señales se alcanzan, por lo general alrededor de 8 a 10 adiciones.
- Con una pipeta, añadir una dilución 1: 100 de FCCP 1 mM (c definitivaoncentración de 10 mM) directamente a las células para disipar ΔΨ m. celdas de imagen para otros 5 minutos. El experimento ha finalizado.
Análisis 5. Imagen
- Una vez que se haya completado la imagen, determinar la intensidad de las señales de Fluo-4 y TMRM utilizando el software de análisis de imágenes, por ejemplo, software ImageJ con el plugin Bio-formatos (Descargar 'bioformats_package.jar' de http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / y guardarlo en el "C: archivos de programa ImageJ plugins 'carpeta).
- Abra el archivo de imagen (por ejemplo, un archivo de .oif) en ImageJ. Haga clic en la herramienta de selección y seleccionar una región de interés (ROI) que contiene mitocondrias. Utilice la señal de TMRM inicial para seleccionar el retorno de la inversión.
- Abrir 'Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión ", haga clic en Añadir para incluir el ROI seleccionada para la medición de la intensidad. Varias regiones de interés pueden ser seleccionados en una sola imagen para la medición. Repita los pasos anteriores hasta que todos ROIs se han agregado al Administrador de retorno de la inversión.
- Haga clic en "Más> Medida de múltiples ', asegúrese de que« medida de todas las divisiones' se selecciona y que 'una fila por rebanada' no está seleccionada, haga clic en 'Aceptar' para obtener una tabla de intensidad de fluorescencia media de las TMRM y Fluo-4 señales para cada ROI en cada punto de tiempo.
- Utilizar los datos de todas las regiones de interés para calcular las intensidades promedio y desviación estándar para la TMRM y Fluo-4 señales.
6. Cálculo de la Concentración final libre de iones Ca2 + [Ca2 +]
- La concentración de iones Ca2 + libre de [Ca 2 +] en la solución de imagen IM puede determinarse utilizando software como Maxchelator WEBMAXC EXTENDIDO ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o quelante 11. Por ejemplo, establecer las variables en WEBMAXC amplía del modo siguiente: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, La fuerza iónica = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M y Mg 2+ = 0,0078 M. Esto resulta en una concentración de iones de Ca2 + libre final de [Ca2 +] de 62 nM . Tenga en cuenta que estos programas no pueden tener en cuenta todas las variables, tales como la pureza del reactivo, la precisión de las mediciones y la determinación del pH. El método más preciso para determinar la concentración de Ca2 + libre es el uso de un electrodo selectivo de Ca 2+ calibrada.
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Representative Results
Hemos utilizado este protocolo para examinar los efectos de una mutación de MT-ND5 en la capacidad de las mitocondrias de células 143B para amortiguar los aumentos en el calcio 12. En el ejemplo que se muestra aquí, las células 143B de control se cargaron con TMRM y Fluo-4 AM antes de permeabilización con digitonina. Después de 5 min de formación de imágenes, ocho adiciones secuenciales de un 1: se hicieron dilución 100 de 40 mM CaCl 2 exógenos, con la concentración de iones de Ca2 + libre final de [Ca2 +] calculado.
Después de cada adición de CaCl 2, la señal de TMRM disminuye a medida que la afluencia de iones de Ca2 + en la mitocondria se disipa el potencial de membrana mitocondrial ΔΨ m (Figura 1). ΔΨ m continuación, se recupera como la respiración se incrementa para mantener ΔΨ m. Esto ocurre cuatro veces después de cada CaCl
La concentración de calcio mitocondrial (señal de Fluo-4) comienza a aumentar después de la segunda adición de CaCl2 cuando la libre [Ca 2 +] en los medios de comunicación llega a 0,32 M (Figura 2). Cada subsiguiente CaCl 2 Además causó un aumento progresivo de calcio mitocondrial.
Las imágenes de las mediciones simultáneas de ΔΨ m (TMRM, señal roja) y calcio mitocondrial (SIG verde Fluo-4nal) se muestran (Figura 3).
Figura 1: Medición de mitocondrial ΔΨ m de digitonina permeabilized células 143B usando TMRM. 143B células se cargan previamente con Fluo-4 AM y TMRM antes de permeabilización con digitonina. Se añadió la dilución 100 de 40 mM CaCl2 exógenos en alícuotas secuenciales: A 1. La final libre de [Ca 2 +] en los medios de comunicación está indicado para cada adición (*). FCCP se añadió a una concentración final de 10 mM después de aproximadamente 40 min. ΔΨ m se muestra en rojo, representado por la intensidad relativa (RI) de la señal TMRM. Los datos son la media ± SD n = 3. La figura está adaptado con permiso de referencia 12. Haga clic aquí para ver una versio más granden de esta figura.
Figura 2: Medición de calcio mitocondrial en digitonina permeabilized células 143B utilizando Fluo-4 AM. 143B células se cargan previamente con Fluo-4 AM y TMRM antes de permeabilización con digitonina. Se añadió la dilución 100 de 40 mM CaCl2 exógenos en alícuotas secuenciales: A 1. La final libre de [Ca 2 +] en los medios de comunicación está indicado para cada adición (*). FCCP se añadió a una concentración final de 10 mM después de aproximadamente 40 min. calcio mitocondrial se muestra en verde, representado por la intensidad relativa (RI) de la señal de Fluo-4. Los datos son la media ± SD n = 3. La figura está adaptado con permiso de referencia 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición simultánea de calcio mitocondrial y ΔΨ m de digitonina permeabilized células 143B usando Fluo-4 AM y TMRM. 143B células se cargan previamente con Fluo-4 AM y TMRM antes de permeabilización con digitonina. Se añadió la dilución 100 de 40 mM CaCl2 exógenos en alícuotas secuenciales: A 1. La final libre de [Ca 2 +] en los medios de comunicación se indica para cada adición. Confocal de imágenes representativas que muestran la tinción simultánea de ΔΨ m (TMRM, rojo) y calcio mitocondrial (Fluo-4, verde). Tenga en cuenta que la señal de Fluo-4 es difícil de detectar en la concentración de calcio en reposo de 0.062 M. Las barras blancas de escala = 10 m. La figura está adaptado con permiso de referencia 12.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El calcio juega un papel fundamental en muchos procesos celulares, incluyendo la contracción muscular, la señalización neuronal y la proliferación celular 13. Los aumentos en las concentraciones de calcio de células se asocian a menudo con la demanda de energía, con el calcio capaz de estimular directamente la fosforilación oxidativa mitocondrial para aumentar la generación de ATP 3. Por tanto, es esencial que tengamos la capacidad de controlar con eficacia la acumulación de calcio mitocondrial y para poder comparar cómo esta función se ve afectada tanto por factores genéticos y agentes farmacológicos.
Los pasos críticos en el protocolo
Este protocolo describe la capacidad de controlar la acumulación de calcio mitocondrias y ΔΨ m simultáneamente con Fluo-4, AM y TMRM. Durante el proceso de tinción es fundamental para incubar las células a temperatura ambiente para optimizar la eficacia de Fluo-4, en la detección de AM mitocondrialcalcio. La incubación a temperatura ambiente reduce la actividad de las esterasas citosólicas, permitiendo que el no cargado Fluo-4, AM para cruzar las membranas mitocondriales y entrar en la matriz mitocondrial. Por el contrario, la incubación a 37 ° C mejora la actividad esterasa en el citosol, disociando el éster AM para dejar un acusado Fluo-4 colorante que no sería capaz de cruzar las membranas mitocondriales eficacia.
Una vez que la tinción de células se ha realizado, las células se sumergen en solución de imagen IM. Esta solución tiene una concentración TMRM mayor en comparación con la solución inicial RS tinción. Ahora que se permeabilizan las células, la TMRM ya no se equilibra a través de la membrana plasmática. Por lo tanto, la concentración TMRM se eleva en la solución de imagen de mensajería instantánea para lograr el equilibrio correcto través de la membrana mitocondrial interna. También es fundamental en esta etapa para incluir thapsigargina en la solución de imagen IM. Thapsigargina bloquea el retículo endoplasmático (ER) Ca2+ ATPasa, asegurando que la señal de Fluo-4 no detecta calcio ER.
Modificaciones y solución de problemas
Algunos tipos de células pueden expresar el transportador de resistencia a múltiples fármacos (también conocido como MDR1 o P-glicoproteína) en sus membranas plasmáticas. Esta proteína es conocida para exportar indicadores fluorescentes, incluyendo derivados de éster AM, desde el citosol de la célula 14. Si se expresa el transportador, tanto Fluo-4 AM y TMRM puede ser exportado desde el citosol de la célula, lo que resulta en la tinción subóptima. Para bloquear este efecto, verapamilo se puede añadir a la solución RS tinción de bloquear el transportador de resistencia a múltiples fármacos, la inhibición de Fluo-4, AM y TMRM exportación durante el proceso de tinción.
Por permeabilización de las células a analizar, Fluo-4, AM puede utilizarse para detectar mitocondrial Ca 2 +, sin señales de la competencia de otros orgánulos o el citosol. Como rutina usamos la detergen no iónicot digitonina para la permeabilización a una concentración de 25 mg / ml. puede ser necesario ajustar para asegurar que la solubilización de las membranas mitocondriales no se produce esta concentración. Esto se puede determinar empíricamente mediante la evaluación de la intensidad de la señal de TMRM a diferentes concentraciones de digitonina. Si la concentración de digitonina es demasiado alta, la membrana mitocondrial será parcialmente solubilizado, la reducción de la señal de TMRM.
Las limitaciones de la técnica
Uno de los principales beneficios de este protocolo es que mediante el uso de Fluo-4, AM para detectar calcio mitocondrial, TMRM se puede utilizar para medir simultáneamente ΔΨ m, con solapamiento espectral despreciable entre los dos colorantes. necesidad de garantizar la especificidad de Fluo-4 para el calcio mitocondrial, las células que están siendo examinados para ser permeabiliza para eliminar la señal citosólica Fluo-4. Esta permeabilización es una limitación de esta técnica. Mientras que la solución clo imágenes IMsely coincide con la fuerza iónica de la citosol de la célula, no se puede replicar completamente todos sus componentes. Esto puede afectar a los resultados si se requieren componentes citosólicos específicas en el sistema experimental que está siendo examinada. Además, como se permeabilizan las células, el protocolo puede no ser adecuado para los experimentos más largos de más de 1 hr.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes / alternativos
Varios colorantes fluorescentes se han desarrollado para la evaluación de calcio mitocondrial 8. Estos colorantes son simples de usar y puede proporcionar datos útiles en un corto espacio de tiempo. Mientras que estos colorantes se acumulan principalmente en la mitocondria, algunos también puede acumularse en otros orgánulos, incluyendo liposomas, o permanecer en el citosol de la célula. Por lo tanto, se debe tener cuidado para garantizar que estas otras señales no influyen en la señal de calcio mitocondrial.
En este protocolo, mitochondrial Ca 2 + se mide en células permeabilizadas en presencia de tapsigargina. La ventaja de esta metodología es que las señales de calcio citosólico y ER se eliminan. Además, la permeabilización permite el uso de Fluo-4, AM para detectar mitocondrial Ca 2 +. Fluo-4, AM tiene muy poco solapamiento espectral con TMRM, lo que significa que mitocondrial de Ca2 + y ΔΨ m se pueden medir simultáneamente el uso de estos dos colorantes.
Mitochondrial Ca 2 + también se puede medir usando codificados genéticamente reporteros fluorescentes 8. Estos reporteros pueden ser dirigidos a la mitocondria, lo que resulta en señales específicas de Ca2 + mitocondrial. sondas genéticamente codificados necesitan ser introducido en las células objeto de estudio, que en algunos casos puede tomar mucho tiempo y esfuerzo. Por el contrario, nuestro protocolo utiliza los tintes Fluo-4, AM y TMRM, lo que permite la tinción celular rápido y sencillo para medir mitocondrial de Ca
Las aplicaciones futuras o direcciones después de dominar esta técnica
Las mitocondrias actúan como amortiguadores de calcio locales para regular las concentraciones de calcio intracelulares y los requerimientos de energía de la célula. Cuando se interrumpe este proceso, la absorción excesiva de calcio mitocondrial puede inducir la transición de permeabilidad mitocondrial, lo que resulta en el colapso de ΔΨ m y la liberación de moléculas pro-apoptóticas que desencadenan inducción de muerte celular 4.
Se presenta un protocolo rápido y sencillo para el examen de calcio mitocondrial y su relación con ΔΨ m, y la inducción de la transición de permeabilidad mitocondrial. Esto se puede utilizar para investigar cómo estos parámetros mitocondriales influyen en la patogénesis de una amplia gama de enfermedades humanas, incluyendo la diabetes 15 y relacionada con la edadcondiciones de neurodegeneración tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. 16 Además, este protocolo se puede utilizar para examinar la forma de calcio mitocondrial y ΔΨ m se ven afectados por defectos genéticos o toxinas ambientales, y también cómo estos afectos puede ser modulada por las terapias o fármacos que se dirigen a las mitocondrias. Estos tipos de experimentos futuros pueden proporcionar nuevas e importantes ideas sobre el papel que juega el calcio mitocondrial tanto en la salud humana y la enfermedad.
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Acknowledgments
Se agradece al Dr. Kirstin Elgass y el Dr. Sarah Credo de Monash Micro Imaging para la asistencia técnica, y el Wellcome Trust y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido para el apoyo financiero. MMcK se apoya el Consejo de Investigación Australiano futuro Plan de Becas (FT120100459), la Fundación William Buckland, La fundación de la enfermedad mitocondrial australiano (AMDF), El Instituto de Investigación Médica de Hudson y de la Universidad de Monash. Este trabajo fue apoyado por el Plan de Apoyo a la infraestructura operativa del Gobierno de Victoria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
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