Summary
I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.
Abstract
Oltre al loro ruolo fondamentale nel generare ATP, i mitocondri fungono anche da calcio locale (Ca 2+) buffer per regolare strettamente concentrazione intracellulare di Ca 2+. Per fare questo, mitocondri utilizzano il potenziale elettrochimico attraverso la membrana interna (ΔΨ m) di sequestrare Ca 2+. L'afflusso di Ca 2+ nei mitocondri stimola tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico, aumentare il trasferimento di elettroni attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) complessi. Questa stimolazione mantiene ΔΨ m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale.
Descriviamo qui un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive usando la microscopia confocale. Con permeabilizzante le cellule, Ca 2+ mitocondriale puòessere misurata utilizzando la fluorescenza Ca 2+ indicatore Fluo-4, AM, con la misura di m ΔΨ utilizzando il tetramethylrhodamine colorante fluorescente, estere metilico, perclorato (TMRM). Il vantaggio di questo sistema è che c'è poca sovrapposizione spettrale tra i coloranti fluorescenti, consentendo una misurazione precisa della mitocondriale Ca 2+ e ΔΨ m simultaneamente. Utilizzando l'aggiunta sequenziale di Ca 2+ aliquote, Ca 2+ mitocondriale assorbimento possono essere monitorati, e la concentrazione alla quale Ca 2+ induce mitocondriale transizione di permeabilità della membrana e la perdita di ΔΨ M determinato.
Introduction
I mitocondri svolgono un ruolo importante nella regolazione intracellulare concentrazione di Ca 2+, agendo come locali Ca 2+ buffer 1. Ca 2+ entra nei mitocondri attraverso il Ca 2+ uniporter, un processo guidato dal gradiente elettrochimico che esiste attraverso la membrana mitocondriale interna (ΔΨ m) 2. Una volta all'interno della matrice mitocondriale, Ca 2+ può attivare fosforilazione ossidativa stimolando tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico 3. Questa stimolazione mantiene ΔΨ m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale. Se il Ca 2+ concentrazione ai mitocondri diventa molto alta, transizione di permeabilità mitocondriale può essere avviata, con conseguente dissipazione di ΔΨ m, la cessation di fosforilazione ossidativa e l'induzione della morte cellulare vie di segnalazione 4.
Il ruolo importante che i mitocondri giocano nel buffer spaziale del cellulare di calcio rende il monitoraggio accurato del calcio mitocondriale critica. Vari metodi sono stati stabiliti per monitorare calcio mitocondriale, compreso l'uso di coloranti a base di rodamina. Uno di questi dye, Rhod-2, AM, è molto efficace nel partizionamento ai mitocondri per misurare mitocondriali di Ca 2+ livelli 5, 6. Tuttavia, la cura deve essere utilizzato come una tintura si accumulerà in altri organelli, come liposomi, o rimanere nel citosol delle cellule. Tuttavia, analisi a valle possono essere impiegati per distinguere questi segnali da quelli dai mitocondri 7.
Un'altra tecnica per monitorare il calcio mitocondriale utilizza reporter fluorescente costrutti 8 up>. Il vantaggio di queste sonde geneticamente codificati è che possono essere specificamente mirata ai mitocondri utilizzando endogeni peptidi N-terminali, ad esempio il segnale di targeting N-terminale della subunità COX umana VIII. Questo sistema è stato impiegato per generare una sonda equorina mitocondriale targeting che si è dimostrata estremamente utile per studiare calcio mitocondriale segnalazione 9. L'inconveniente principale di queste sonde geneticamente codificate è che hanno bisogno di essere introdotti nelle cellule di espressione transitoria (che non è fattibile per alcuni tipi di cellule e possono produrre risultati variabili) o attraverso la creazione di sistemi di espressione stabili (che richiede molto tempo).
Per aggirare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per misurare mitocondriale Ca 2+ e ΔΨ m contemporaneamente. Questo protocollo si basa su un metodo precedentemente descritto che aggiunge calcio esogeno per cellule permeabilizzates = "xref"> 10. Il nostro protocollo ha tre vantaggi principali rispetto ad altri metodi: in primo luogo, usiamo Fluo-4, AM e TMRM per monitorare Ca 2+ mitocondriale e ΔΨ m, due coloranti che hanno ben distinte proprietà spettrali; in secondo luogo, le cellule vengono permeabilizzate modo che il segnale Fluo-4 è solo rilevando mitocondriale Ca 2+ e non Ca 2+ localizzato ad altri organelli o citosol delle cellule; e in terzo luogo, l'uso di Fluo-4 per rilevare Ca 2+ mitocondriale consente per la colorazione delle cellule veloce e semplice, negando eventuali problemi di trasfezione cellulare o trasformazione esistenti se si usano sonde geneticamente codificati.
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Protocol
1. Preparazione di cellule
- Crescere le cellule in 10 cm piatti di coltura cellulare o 75 cm 2 palloni in terreni di coltura [10 ml di Dulbecco Eagles Modificati (DMEM) integrato con il 5% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1x penicillina / streptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% CO 2.
- Per raccogliere le cellule, rimuovere il supporto per aspirazione, quindi lavare con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS 1x). Rimuovere 1x PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 1,5 ml di 0,25% (w / v) Tripsina / 0,25% (w / v) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 2 min. Toccare piatto o pallone delicatamente per rimuovere le cellule, poi risospendere in terreni di coltura 5 ml.
- Contare le cellule con l'aggiunta di 12 ml di cellule risospese su un emocitometro.
- cellule piastra in piatti o lamelle camerata per l'imaging confocale.
NOTA: Questi avranno un idoneo fondo in plastica o vetro che è stato progettato per l'utilizzo con microscopi invertiti. - cellule piastra in modo tha ~ 80% di confluenza viene raggiunto il giorno di imaging. Ad esempio, circa 2 x 10 4 cellule di osteosarcoma 143B possono essere placcati in un pozzetto di un 8-ben scorrevole camera di un giorno prima di imaging.
- Incubare le cellule per una notte a 37 ° C / 5% di CO 2 per consentire cellule per fissare e recuperare.
2. Tamponi per TMRM e Fluo-4 Imaging
- Preparare Record Solution (RS) contenente 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 1,25 mm KH 2 PO 4, 10 mm D-glucosio, 2 mM CaCl 2 e 10 mm HEPES pH 7,35. Conservare RS in aliquote a -20 ° C.
- Preparare intracellulare Medium (IM) contenente 6 mM NaCl, 130 mm KCl, 7,8 mm MgCl 2, 1 mM KH 2 PO 4, 0,4 mm CaCl 2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malato, 2 mM glutammato, 2 mM ADP e 20 mM HEPES pH 7.1. 200 mm soluzioni stock di malato, glutammato e ADP possono essere preparati separatamente, aliquotati e conservati a -20 ° C. questi stgreggi possono essere aggiunti a GI appena prima dell'uso.
- Ca soluzione salina tamponata 2+ libero di Hank (HBSS) può essere ottenuto pre-preparato da fornitori commerciali. Aggiungere etilene glicol-bis (β-amminoetil etere) -N, N, N ', N'-tetraacetico (EGTA) ad una concentrazione finale di 500 mM.
- Preparare una soluzione madre di 10 mm tetramethylrhodamine, estere metilico, perclorato (TMRM) in 100% di metanolo. A partire da questa, fare una scorta di lavoro di 2 micron di H 2 O. distillata
- Preparare una soluzione madre di 10 mm Verapamil in 100% di etanolo.
- Preparare una 1 mg / ml (p / v) Soluzione di Fluo-4 estere acetossimetil (Fluo-4, AM) in dimetilsolfossido (DMSO).
NOTA: Fluo-4, AM è un indicatore di calcio che esibisce aumento di fluorescenza dal legame Ca 2+. Fluo-4 è un analogo di fluo-3, con i due sostituenti cloro sostituiti da fluori. Ciò si traduce in un aumento di eccitazione di fluorescenza a 488 nm e superiori livelli del segnale di fluorescenza. IlAM gruppo estereo traduce in un uncharged Fluo-4 molecola che può permeare le membrane cellulari. Una volta all'interno della cellula, l'estere AM viene scisso dalle esterasi non specifiche, risultante in una forma carica di Fluo-4 che è intrappolato all'interno della cellula. - Preparare una soluzione madre di 1 mm di carbonile cianuro di p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% di etanolo.
- Preparare una soluzione stock di 25 mg / ml (w / v) digitonina in H 2 O. distillata
- Preparare una soluzione stock di 100 micron thapsigargin in DMSO.
- Preparare una soluzione madre di 40 mm cloruro di calcio (CaCl 2) in H 2 O. distillata
3. La colorazione delle cellule con TMRM e Fluo-4, AM
- Preparare la soluzione RS colorazione con 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM e 0,005% di tensioattivo come Pluronic F-127 in RS.
NOTA: Questo tensioattivo non ionico è un poliolo che facilita la solubilizzazione di Fluo-4, AM. Nota: 10 micron Verapamil può anche essere aggiunto alla inibizionet TMRM esportazione dal trasportatore multidrug membrana plasmatica se espressa nel tipo di cellula in fase di analisi. - Rimuovere terreni di coltura dalle cellule per pipetta e lavare con 100 ml PBS 1X.
- Rimuovere 1x PBS mediante pipetta e incubare cellule in 250 microlitri soluzione RS colorazione per 45 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Una volta che il Fluo-4, AM entra nella cellula, l'estere AM viene scisso dalle esterasi cellulari. Incubazione a temperatura ambiente inibisce l'attività esterasi, permettendo Fluo-4, AM per inserire i mitocondri. - Rimuovere la soluzione RS colorazione dalla pipetta e lavare le cellule in 100 ml di Ca 2+ libera HBSS per rimuovere l'eccesso Fluo-4, AM e TMRM.
- Preparare la soluzione di imaging IM con 25 mg / ml (w / v) digitonina, 200 Nm TMRM e 1 micron tapsigargina in IM.
NOTA: La concentrazione di digitonina può avere bisogno di essere regolato per garantire che permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna non si verifica. Questo può essere determinato empiricamente valutando l'intensitàdel segnale TMRM a differenti concentrazioni di digitonina. - Rimuovere il Ca 2+ libera HBSS dalla pipetta e aggiungere 300 ml di soluzione di imaging IM alle cellule. Lasciare cellule equilibrare a temperatura ambiente per 10 min. Le cellule sono ora pronti per l'imaging con CaCl 2 aggiunte.
4. Imaging cellulare
- Mettere piatto o vetrino camerata con le cellule in soluzione di imaging IM su un microscopio confocale a scansione laser invertito.
- Utilizzare impostazione laser microscopio per l'eccitazione ed emissione spettri TMRM e Fluo-4. Ad esempio, utilizzare 543 nm He-Ne e 473 linee laser ad argon nm per eccitare rispettivamente TMRM e Fluo-4. Utilizzare una potenza laser basso di circa il 5% di minimizzare una foto-danni alle cellule.
- Impostare microscopio per eseguire la scansione di immagini ogni 25 secondi. celle di scansione per 10 minuti per stabilire le letture di base per la TMRM e Fluo-4 segnali.
NOTA: Il segnale Fluo-4 può essere debole o non rilevabile a riposo concent calciorazioni. - Aggiungere 3 ml di 40 mM CaCl 2 soluzione madre direttamente alle cellule in 300 ml di soluzione di imaging IM (una diluizione 1: 100) e mescolare delicatamente con una pipetta. Mettere in pausa la scansione di immagini, mentre l'aggiunta e la miscelazione del CaCl 2, se necessario.
NOTA: La Ca 2+ concentrazione finale libera ioni [Ca 2+] nella soluzione di imaging IM può essere calcolata utilizzando software come Maxchelator WEBMAXC estesa ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o chelante 11. Una descrizione dettagliata di come calcolare il Ca 2+ concentrazione finale libera ioni [Ca 2+] è descritto nella sezione 6 di seguito. - Continuare la scansione di immagini per circa 4 minuti, quindi ripetere CaCl 2 aggiunte ogni 4 minuti fino a quando il TMRM desiderato o Fluo-4 segnali vengono raggiunti, di solito circa 8 a 10 aggiunte.
- Usando una pipetta, aggiungere una diluizione 1: 100 di 1 mm FCCP (finale concentration di 10 micron) direttamente alle cellule per dissipare ΔΨ m. celle di immagine per un ulteriore 5 min. L'esperimento è ormai finito.
Analisi 5. Immagine
- Una volta che l'imaging è completa, determinare l'intensità dei segnali Fluo-4 e TMRM utilizzando software di analisi delle immagini, ad esempio il software ImageJ con il plugin Bio-Formati (scaricare 'bioformats_package.jar' dal http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / e salvarlo nella 'C: Program Files ImageJ plugins' cartella).
- Aprire il file di immagini (ad esempio un file .oif) in ImageJ. Fare clic sullo strumento di selezione e selezionare una regione di interesse (ROI) che contiene mitocondri. Utilizzare il segnale TMRM iniziale per selezionare il ROI.
- Apri 'Analizza> Strumenti> ROI Manager', fare clic su 'Add' per includere il ROI selezionata per la misurazione dell'intensità. ROI multipli possono essere selezionati in una singola immagine per la misurazione. Ripetere passaggi precedenti fino a quando tutte ROIs sono stati aggiunti al ROI Manager.
- Fare clic su 'Altro> Misura Multi', fare in modo che 'Misura tutte le sezioni' sia selezionata e che 'una riga per ogni fetta' non è selezionata, cliccare su 'OK' per ottenere un tavolo di intensità della fluorescenza media dei TMRM e Fluo-4 segnali per ogni ROI in ogni punto.
- Utilizzare i dati da tutte le ROI per calcolare l'intensità media e deviazione standard per la TMRM e Fluo-4 segnali.
6. Calcolo del Finale libero Ca 2+ Ion Concentrazione [Ca 2+]
- Il Ca 2+ concentrazione di ioni liberi [Ca 2+] nella soluzione di imaging IM può essere determinata utilizzando software come Maxchelator WEBMAXC estesa ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o chelante 11. Ad esempio, impostare le variabili in WEBMAXC prolungato nel modo seguente: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, ionico forza = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M e Mg 2+ = 0,0078 M. Questo si traduce in una Ca 2+ concentrazione di ioni liberi finale [Ca 2+] di 62 Nm . Si noti che questi programmi non possono tener conto di tutte le variabili, come ad esempio il reagente purezza, precisione delle misure e determinazione del pH. Il metodo più preciso per determinare la libera Ca 2+ concentrazione è quello di utilizzare un elettrodo selettivo Ca 2+ calibrato.
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Representative Results
Abbiamo usato questo protocollo per esaminare gli effetti di una mutazione MT-ND5 sulla capacità dei mitocondri delle cellule 143B per tamponare gli aumenti di calcio 12. Nell'esempio mostrato qui, le cellule 143B di controllo sono stati caricati con TMRM e Fluo-4, sono davanti a permeabilizzazione con digitonina. Dopo 5 minuti di immagini, otto aggiunte sequenziali di un diluizione 1: 100 di 40 mm esogeni CaCl 2 sono stati fatti, con la concentrazione di ioni finale libero Ca 2+ [Ca 2+] calcolato.
Dopo ogni aggiunta CaCl 2, il segnale TMRM diminuisce l'afflusso di ioni Ca 2+ nei mitocondri dissipa la membrana mitocondriale potenziale ΔΨ m (Figura 1). ΔΨ m poi recupera come la respirazione è aumentata per mantenere ΔΨ m. Ciò si verifica quattro volte dopo ogni CaCl
La concentrazione di calcio mitocondriale (Fluo-4 segnale) inizia ad aumentare a seguito della seconda aggiunta CaCl 2 quando la libera [Ca 2+] i media raggiunge 0,32 mM (Figura 2). Ogni successiva aggiunta CaCl 2 causato un progressivo aumento di calcio mitocondriale.
Immagini delle misurazioni simultanee di ΔΨ m (TMRM, il segnale rosso) e di calcio mitocondriale (Fluo-4, sig verdenal) sono mostrate (Figura 3).
Figura 1: Misura di mitocondriale ΔΨ m di digitonina permeabilizzate 143B cellule utilizzando TMRM. cellule 143B sono stati precaricati con Fluo-4, AM e TMRM prima permeabilizzazione con digitonina. A diluizione 1: 100 di 40 mM CaCl 2 esogeni stato aggiunto in aliquote sequenziali. La finale gratis [Ca 2+] nei mezzi di comunicazione è indicato per ogni aggiunta (*). FCCP stato aggiunto ad una concentrazione finale di 10 pM dopo circa 40 min. ΔΨ m è mostrato in rosso, rappresentato dalla intensità relativa (RI) del segnale TMRM. I dati sono media ± deviazione standard n = 3. La figura è adattato con il permesso di riferimento 12. Clicca qui per visualizzare un versio più granden di questa figura.
Figura 2: Misura di calcio mitocondriale in digitonina permeabilizzate 143B cellule utilizzando Fluo-4, AM. cellule 143B sono stati precaricati con Fluo-4, AM e TMRM prima permeabilizzazione con digitonina. A diluizione 1: 100 di 40 mM CaCl 2 esogeni stato aggiunto in aliquote sequenziali. La finale gratis [Ca 2+] nei mezzi di comunicazione è indicato per ogni aggiunta (*). FCCP stato aggiunto ad una concentrazione finale di 10 pM dopo circa 40 min. calcio mitocondriale è mostrato in verde, rappresentata dalla intensità relativa (RI) del segnale Fluo-4. I dati sono media ± deviazione standard n = 3. La figura è adattato con il permesso di riferimento 12. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la misurazione simultanea di calcio mitocondriale e ΔΨ m di digitonina permeabilizzate 143B cellule con Fluo-4, AM e TMRM. cellule 143B sono stati precaricati con Fluo-4, AM e TMRM prima permeabilizzazione con digitonina. A diluizione 1: 100 di 40 mM CaCl 2 esogeni stato aggiunto in aliquote sequenziali. La finale gratis [Ca 2+] nei mezzi di comunicazione è indicato per ogni aggiunta. Immagini confocale rappresentative che mostrano la colorazione simultanea di ΔΨ m (TMRM, rosso) e calcio mitocondriale (Fluo-4, verde). Si noti che il segnale di Fluo-4 è difficile da rilevare alla concentrazione di calcio riposo di 0,062 mM. barre di scala bianco = 10 micron. Figura è adattato con il permesso di riferimento 12.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il calcio gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari, tra cui la contrazione muscolare, la segnalazione neuronale e proliferazione cellulare 13. Aumento delle concentrazioni di calcio delle cellule sono spesso associati con la domanda di energia, con il calcio in grado di stimolare direttamente fosforilazione ossidativa mitocondriale per aumentare la produzione di ATP 3. E 'quindi essenziale che abbiamo la capacità di controllare efficacemente l'accumulo di calcio mitocondriale e di essere in grado di confrontare come questa funzione è influenzata sia da fattori genetici e agenti farmacologici.
Passaggi critici all'interno del protocollo
Questo protocollo descrive la capacità di monitorare l'accumulo di calcio mitocondri e ΔΨ m in contemporanea con Fluo-4, AM e TMRM. Durante il processo di colorazione è fondamentale per incubare le cellule a temperatura ambiente per ottimizzare l'efficacia di Fluo-4, AM nel rilevare mitocondrialecalcio. L'incubazione a temperatura ambiente riduce l'attività di esterasi citosolico, consentendo uncharged Fluo-4, AM di attraversare le membrane mitocondriali e immettere la matrice mitocondriale. Viceversa, l'incubazione a 37 ° C aumenta l'attività esterasi nel citosol, fendere fuori l'estere AM lasciare una carica Fluo-4 colorante che non sarebbe in grado di attraversare efficacemente le membrane mitocondriali.
Dopo colorazione della cellula è stata eseguita, le cellule sono immersi in soluzione di imaging IM. Questa soluzione ha una concentrazione TMRM superiore rispetto alla soluzione iniziale RS colorazione. Ora che le cellule sono permeabilizzate, il TMRM non equilibra attraverso la membrana plasmatica. Pertanto, la concentrazione TMRM è sollevata nella soluzione di imaging IM per ottenere il corretto equilibrio attraverso la membrana mitocondriale interna. E 'anche importante in questa fase per includere tapsigargina nella soluzione di imaging IM. Tapsigargina blocca il reticolo endoplasmatico (ER) Ca 2+ ATPasi, assicurando che il segnale Fluo-4 non rileva ER calcio.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Alcuni tipi di cellule possono esprimere il trasportatore multidrug resistance (noto anche come MDR1 o P-glicoproteina) sulle loro membrane plasmatiche. Questa proteina è noto per esportare indicatori fluorescenti, compresi i derivati esteri AM, dal citosol fuori dalla cella 14. Se il trasportatore si esprime, sia Fluo-4, AM e TMRM possono essere esportati dal citoplasma delle cellule, con conseguente colorazione sub-ottimale. Per bloccare questo effetto, Verapamil può essere aggiunto alla soluzione RS colorazione per bloccare il trasportatore multidrug resistance, inibendo Fluo-4, AM e TMRM esportazioni durante il processo di colorazione.
Con permeabilizzante le cellule da analizzare, Fluo-4, AM può essere utilizzato per rilevare mitocondriale Ca 2+, senza segnali concorrenti di altri organelli o citosol. Noi abitualmente utilizziamo il detergen non ionicot digitonina per permeabilizzazione ad una concentrazione di 25 ug / ml. Questa concentrazione può essere necessario regolare per assicurare che solubilizzazione delle membrane mitocondriali non si verifica. Questo può essere determinato empiricamente valutando l'intensità del segnale TMRM a differenti concentrazioni di digitonina. Se la concentrazione di digitonina è troppo alto, la membrana mitocondriale sarà parzialmente solubilizzato, riducendo il segnale TMRM.
Limitazioni della tecnica
Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è che utilizzando Fluo-4, AM per rilevare il calcio mitocondriale, TMRM può essere utilizzato per misurare contemporaneamente ΔΨ m, con trascurabili sovrapposizione spettrale tra i due coloranti. Necessità di garantire la specificità di Fluo-4 per il calcio mitocondriale, le cellule in esame da permeabilizzate per eliminare il segnale citosolico Fluo-4. Questo permeabilizzazione è una limitazione di questa tecnica. Mentre la soluzione clo di imaging IMcorrisponde sely la forza ionica del citosol delle cellule, non può completamente replicare tutti i suoi componenti. Questo può influenzare i risultati, se sono necessari componenti citosolici specifiche nel sistema sperimentale in esame. Inoltre, le cellule vengono permeabilizzate, il protocollo può non essere adatto per esperimenti più lunghi maggiori di 1 ora.
Importanza della tecnica rispetto ai metodi esistenti / alternativi
Vari coloranti fluorescenti sono stati sviluppati per valutare il calcio mitocondriale 8. Questi coloranti sono semplici da usare e possono fornire dati utili in un breve lasso di tempo. Mentre questi coloranti accumulano prevalentemente nei mitocondri, alcuni possono anche accumularsi in altri organelli, tra liposomi, o rimanere nel citosol delle cellule. Pertanto, occorre prestare attenzione per garantire che questi altri segnali non influenzano il segnale calcio mitocondriale.
In questo protocollo, mitochondrial Ca 2+ è misurata in cellule permeabilizzate in presenza di thapsigargin. Il vantaggio di questo metodo è che i segnali di calcio citosolico e ER sono eliminati. Inoltre, permeabilizzazione permette l'utilizzo di Fluo-4, AM per rilevare mitocondriale Ca 2+. Fluo-4, AM ha ben poco sovrapposizione spettrale con TMRM, il che significa che mitocondriale Ca 2+ e ΔΨ m possono essere misurare simultaneamente utilizzando questi due coloranti.
Mitocondriale Ca 2+ può essere misurata con i reporter fluorescenti geneticamente codificate 8. Questi giornalisti possono essere mirati ai mitocondri, con conseguente specifici mitocondriali di Ca 2+ segnali. sonde geneticamente codificati devono essere introdotte nelle cellule in fase di studio, che in alcuni casi può richiedere molto tempo e fatica. Al contrario, il nostro protocollo utilizza i coloranti Fluo-4, AM e TMRM, consentendo per la colorazione delle cellule veloce e semplice per misurare mitocondriale Ca
Le future applicazioni o direzioni Dopo aver imparato questa tecnica
I mitocondri agiscono come buffer di calcio locali per regolare le concentrazioni intracellulari di calcio e il fabbisogno energetico della cellula. Quando questo processo si interrompe, un eccessivo assorbimento di calcio mitocondriale può indurre transizione di permeabilità mitocondriale, con conseguente crollo di ΔΨ m ed il rilascio di molecole pro-apoptotici che innescano la morte cellulare induzione 4.
Vi presentiamo un protocollo veloce e diretto per l'esame di calcio mitocondriale e il suo rapporto con ΔΨ m e l'induzione di transizione di permeabilità mitocondriale. Questo può essere usato per studiare come questi parametri mitocondriali influenzano patogenesi in una vasta gamma di malattie umane, compreso il diabete 15 e legata all'etàcondizioni di neurodegenerazione come l'Alzheimer e il morbo di Parkinson 16. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per esaminare come calcio mitocondriale e ΔΨ m sono interessati da difetti genetici o tossine ambientali, e anche come questi effetti possono essere modulata da terapie o farmaci che colpiscono i mitocondri. Questi tipi di esperimenti futuri in grado di fornire nuove importanti informazioni sul ruolo che il calcio mitocondriale svolge nella salute umana e della malattia.
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Acknowledgments
Ringraziamo il dottor Kirstin Elgass e il Dr Sarah Creed dal Monash Micro Imaging per l'assistenza tecnica, e il Wellcome Trust e Medical Research Council del Regno Unito per il sostegno finanziario. MMcK è supportato il futuro Fellowship Scheme australiano Research Council (FT120100459), il Buckland Fondazione William, The Australian mitocondriale Disease Foundation (AMDF), l'Istituto Hudson della ricerca medica e Monash University. Questo lavoro è stato supportato dal sistema di infrastrutture operative di supporto Governo del Victoria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
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