Summary
ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。
Abstract
別にATPを生成する際に、それらの本質的な役割から、ミトコンドリアはまた、地元のカルシウム（Ca 2+）として機能緊密細胞内Ca 2+濃度を調節するためにバッファリングします。これを行うには、ミトコンドリアは、Ca 2+を封鎖するために彼らの内膜（ΔΨmの）全体に電気化学ポテンシャルを利用しています。ミトコンドリアへの Ca 2+の流入は、酸化的リン酸化（OXPHOS）錯体を介して電子伝達を増加させる、クエン酸サイクルの三律速デヒドロゲナーゼを刺激します。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散されΔΨmを 、保持しています。
ここでは、同時に、共焦点顕微鏡を用いて、ミトコンドリアに生細胞におけるCa 2+取り込みおよびΔΨmを測定する方法について説明します。細胞を透過性により、ミトコンドリアのCa 2+することができます蛍光色素テトラメチルローダミンを用いて、ΔΨmの、メチルエステル、過塩素酸塩（TMRM）の測定を、蛍光の Ca 2+指示薬のFluo-4、AMを使用して測定します。このシステムの利点は、同時にミトコンドリアの Ca 2+及びΔΨMの正確な測定を可能にする蛍光色素との間の非常に小さなスペクトルの重なりがあることです。 Ca 2+アリコートの連続添加を用いて、ミトコンドリアの Ca 2+取り込みを監視することができ、およびCa 2+は 、ミトコンドリア膜透過性遷移とΔΨの損失を誘発する濃度を決定mです 。
Introduction
ミトコンドリアは、ローカルの Ca 2+緩衝液1として作用することにより、細胞内Ca 2+濃度の調節において重要な役割を果たしています。 Ca 2+のCa 2+ユニポーター、ミトコンドリア内膜（ΔΨmの）2を横切って存在する電気化学的勾配によって駆動されるプロセスを介してミトコンドリアに入ります。いったんミトコンドリアマトリックス内部に、Ca 2+がクエン酸回路3の3律速デヒドロゲナーゼを刺激することによって、酸化的リン酸化を活性化することができます。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散されΔΨmを 、保持しています。ミトコンドリア内のCa 2+濃度が非常に高くなる場合は、ミトコンドリア透過性転移は、ΔΨmの損失で、その結果、開始することができ、cessatio酸化的リン酸化のNおよび経路4シグナル 、細胞死の誘導。
ミトコンドリアは細胞内カルシウムの空間的なバッファリングで果たす重要な役割は、ミトコンドリアのカルシウムの正確なモニタリングが重要なことができます。様々な方法は、ローダミン系染料の使用を含む、ミトコンドリアのカルシウムを監視するために確立されています。そのような染料、Rhod-2 AMは、6はミトコンドリアのCa 2+レベル5を測定するためにミトコンドリアに分割に非常に効果的です。ただし、注意がいくつかの染料は、リポソームのような他の細胞小器官に蓄積し、または細胞質ゾルに留まるとして使用する必要があります。それにもかかわらず、下流の分析は、ミトコンドリア7のものから、これらの信号を区別するために使用することができます。
ミトコンドリアのカルシウムを監視するための別の技術は蛍光レポーターが8を構築し利用します >アップ。これらの遺伝的にコードされたプローブの利点は、特に、例えば、ヒトCOXサブユニットVIIIのN末端標的化シグナルを内因性のN末端ペプチドを用いて、ミトコンドリアを標的とすることができるということです。このシステムは、9シグナリングミトコンドリアカルシウムを調査するために非常に有用であることが証明されている、ミトコンドリア標的エクオリンプローブを生成するために使用されてきました。これらの遺伝的にコードされたプローブの主な欠点は、（特定の細胞型のために実行可能ではなく、変数の結果を生成することができる）の一過性発現によって、または（時間がかかる場合）安定な発現系を作成することにより、細胞内に導入する必要があることです。
上記概説した問題を回避するために、我々は同時に、ミトコンドリアのCa 2+とΔΨ メートルを測定するための新しいプロトコルを開発しました。このプロトコルは、透過性細胞への外因性のカルシウムを追加し、以前に記載された方法に基づいていますS = "外部参照"> 10。私たちのプロトコルは、他の方法に比べて3の主な利点があります：まず、我々は、ミトコンドリアのCa 2+とのΔΨ メートル 、非常に異なるスペクトル特性を有する2つの染料を監視するために、AMとTMRMをのFluo-4を使用します。第二のFluo-4信号のみがミトコンドリアのCaを検出しているように、細胞を透過処理されている2+およびCa 2+他の細胞小器官または細胞質ゾルに局在化していません。第三に、ミトコンドリアのCaを検出するためのFluo-4の使用は2+遺伝的にコードされたプローブを使用している場合に存在する任意の細胞トランスフェクションまたは形質転換の問題を否定する、高速かつ簡単な細胞染色を可能にします。
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Protocol
細胞の調製
- 10〔10cmの細胞培養皿または75 cmの培養培地中で2フラスコで細胞を増殖mlの5％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1×ペニシリン/ストレプトマイシン（P / Sを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） ）] 37℃/ 5％CO 2で。
- 細胞を採取するために、その後、5ミリリットル1×リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で洗浄し、吸引してメディアを取り出します。次に（w / v）のトリプシン/ 0.25％1.5 mlの0.25％を追加し、吸引によって1×PBSを取り外し（/ Wをv）のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2分間、37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。 5ミリリットルの培養培地に再懸濁した後、細胞を除去するために静かに皿やフラスコをタップします。
- 血球計数器に再懸濁した細胞の12μLを追加することによって、細胞をカウントします。
- 食器や共焦点イメージングのためのチャンバーカバースリップでプレートの細胞。
注：これらは、倒立顕微鏡で使用するために設計された適切なプラスチックやガラスボトムを持っています。 - プレート細胞番目ので、〜80％の密集度は、撮影日に達成されます。例えば、約2×10 4 143B骨肉腫細胞は、一日の撮像前に8ウェルチャンバースライドの1ウェルに播種することができます。
- 細胞が付着し、回復できるようにするために、37℃/ 5％CO 2で一晩細胞をインキュベートします。
TMRMとのFluo-4イメージング用2.バッファ
- 156ミリモルのNaCl、3mMのKClを、2mMのMgSO 4を、1.25mMのKH 2 PO 4、10mMのD-グルコース、2mMのCaCl 2を、10 mMのHEPES pH値7.35を含有する記録液（RS）を準備します。 -20ºCでの分量を保存するRS。
- 6のNaCl、130mMの塩化カリウム、7.8のMgCl 2、1 mMのKH 2 PO 4、0.4mMのCaCl 2を、2mMのEGTA、10mMのHEDTA、2mMのリンゴ酸、2 mMのグルタミン酸、2 mMのを含む細胞内培地（IM）を準備ADPおよび20mMのHEPES pHは7.1。リンゴ酸、グルタミン酸およびADPの200mMのストック溶液を、別々に調製等分し、-20℃で保存することができます。これらの目ocksは、使用直前にIMに添加することができます。
- Ca 2+フリーのハンクス緩衝塩溶液（HBSS）は、商業的供給業者から事前に準備を得ることができます。 500μMの最終濃度でエチレングリコール - ビス（βアミノエチルエーテルに）-N、N、N '、N'-四酢酸（EGTA）を加えます。
- 100％メタノール中の10mMテトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩（TMRM）のストック溶液を準備します。このストックから、蒸留H 2 O中に2μMのワーキングストックを作ります
- 100％エタノール中10mMベラパミルのストック溶液を準備します。
- ジメチルスルホキシド（DMSO）中のFluo-4アセトキシメチルエステル（フルオ-4、AM）の1mg / mlの（w / v）のストック溶液を調製します。
注：フルオ4は、AMは、Ca 2+に結合すると蛍光が増大するカルシウム指示薬です。フルオ4はフッ素で置き換えられ2個の塩素置換基で、フルオ-3のアナログです。これは、488nmで増加した蛍光励起及びより高い蛍光シグナルレベルを生じます。ザAMエステル基は、細胞膜を透過することができる非荷電のFluo-4分子をもたらします。細胞内に一旦、AMエステルは細胞内に捕捉されるのFluo-4の帯電した形で、その結果、非特異的エステラーゼによって切断されます。 - 100％エタノール中で1 mMのカルボニルシアニドp型trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）のストック溶液を準備します。
- 蒸留H 2 Oの株式25 mg / mlとの溶液（w / v）のジギトニンを準備
- DMSO中の100μMタプシガルジンのストック溶液を準備します。
- 蒸留H 2 O中の40mMの塩化カルシウム（CaCl 2）のストック溶液を調製します
TMRMとのFluo-4、AMを用いた細胞の3染色
- 20 nMのTMRMとRS染色溶液を調製し、5μg/ mlの（w / vで）のFluo-4、AMおよびプルロニックF-127 RSのように0.005％の界面活性剤。
注：この界面活性剤があるFluo-4、AMの可溶化を促進する非イオン性ポリオールです。注：10μMのベラパミルもinhibiに添加することができますそれは、分析される細胞型で発現される場合に、原形質膜の多剤輸送体によるT TMRM輸出。 - ピペットで細胞から培養培地を取り除き、100μlの1×PBSで洗浄しました。
- ピペットで1×PBSを削除し、室温で45分間、250μlのRS染色液中で細胞をインキュベートします。
注：のFluo-4、AMが細胞に入ると、AMエステルは細胞のエステラーゼによって切断されます。室温でインキュベートすることのFluo-4、AMは、ミトコンドリアを入力することを可能にする、エステラーゼ活性を阻害します。 - ピペットでRS染色溶液を除去し、過剰のFluo-4、AMおよびTMRMを削除するには、のCa 2+μlの100のフリーHBSSを細胞を洗浄。
- 25 / mlの（w / v）のジギトニン、200 nMのTMRMとIMで1μMのタプシガルジンとIMイメージングソリューションを準備します。
注：ジギトニンの濃度は、ミトコンドリア内膜の透過化が起こらないことを確実にするために調整する必要があります。これは、強度を評価することによって経験的に決定することができますジギトニンの異なる濃度でTMRM信号の。 - ピペットでのCa 2+フリーのHBSSを削除して、細胞へのIMイメージングソリューションの300μlのを追加します。室温で10分間平衡化した細胞を残します。細胞は、今のCaCl 2添加物の撮像のための準備が整いました。
4.細胞イメージング
- 倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡上に皿やIMイメージング溶液中の細胞とチャンバーカバーガラスを置きます。
- TMRMとのFluo-4の励起および発光スペクトルのための顕微鏡レーザーの設定を使用します。例えば、それぞれTMRMとのFluo-4を励起し543nmでのHe-Ne及び473nmのアルゴンレーザーラインを使用しています。細胞への光損傷を最小限に抑えるために、約5％の低レーザーパワーを使用してください。
- 画像ごとに25秒をスキャンするために顕微鏡を設定します。 TMRMとのFluo-4信号のベースライン測定値を確立するために10分間細胞をスキャンします。
注：フルオ4信号は、カルシウムコンセントを休んで弱いまたは検出不能であってもよいです配給。 - IMのイメージングソリューションの300μlの中の細胞への直接の40mMのCaCl 2ストック溶液3μlの追加（1：100希釈）をピペットで軽く混ぜます。必要に応じてのCaCl 2を添加し、混合しながら画像のスキャンを一時停止します。
注：Maxchelator WEBMAXCは（拡張として、最終的な遊離Ca 2+イオン濃度の[Ca 2+] IM撮像溶液中でそのようなソフトウェアを用いて計算することができるhttp://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）又はキレート化剤11。最終の遊離Ca 2+イオン濃度の計算方法の詳細な説明は、の[Ca 2+]は、以下のセクション6に記載されています。 - 希望TMRMまたはのFluo-4の信号は、通常8〜10の追加の周りに、到達するまでのCaCl 2の追加ごとに4分を繰り返した後、約4分間の画像走査を続けます。
- 1 mMのFCCPの100希釈（最終C：ピペットを使用して、1を追加します。ΔΨmを放散する細胞に直接、10μMのoncentration）。さらに5分間画像セル。実験は完了です。
5.画像解析
- 撮像が完了すると、http://downloads.openmicroscopy.org/bioからバイオフォーマットプラグイン（ダウンロード 'bioformats_package.jar'で例示ImageJソフトウェア、画像分析ソフトウェアを使用してのFluo-4とTMRMシグナルの強度を決定します-formats /とに保存 'C：プログラムファイル ImageJのプラグイン」フォルダ）。
- ImageJの中で（例えば.oifファイル）画像ファイルを開きます。選択ツールをクリックして、ミトコンドリアが含まれている関心領域（ROI）を選択します。 ROIを選択するには、最初のTMRM信号を使用してください。
- 開く]> [ツール]> [ROIマネージャー分析」、強度測定のために選択されたROIを含むように「追加」をクリックします。複数のROIを測定するための単一の画像上で選択することができます。すべてのROIまで、前の手順を繰り返しますsがROI Managerに追加されました。
- 「詳細>マルチ測定」をクリックし、「すべてのスライスを測定する 'が選択され、「スライスごとに1つの行が「選択解除されていること、そして、TMRMの平均蛍光強度のテーブルとのFluo-4の信号を得るために、「OK」をクリックしていることを確認してください各時点での各ROIのため。
- TMRMとのFluo-4の信号の平均強度および標準偏差を計算するために、すべてのROIからのデータを使用してください。
6.最終的な無料のCa 2+イオン濃度の[Ca 2+]の計算
- 遊離Ca 2+イオン濃度IM撮像溶液中の[Ca 2+]は、Maxchelator WEBMAXC EXTENDED（などのソフトウェアを用いて決定することができるhttp://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）またはキレート剤11。 =温度を24℃、pH値= 7：たとえば、次のようにWEBMAXCの変数がEXTENDEDに設定します。1、イオン強度= 0.162、EGTA = 0.002 M、HEDTA = 0.01 M、のCa 2+ = 0.0004 MおよびMg 2+ = 0.0078 M.これは、最終的な遊離Ca 2+イオン濃度62 nMでの[Ca 2+]になります。これらのプログラムは、このような試薬の純度、測定およびpH決意の精度として、アカウントにすべての変数を取ることができないことに注意してください。遊離Ca 2+濃度を測定するための最も正確な方法は、較正された Ca 2+選択性電極を使用することです。
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Representative Results
私たちは、カルシウムの12の増加をバッファリングする143B細胞のミトコンドリアの能力にMT-ND5変異の影響を調べるために、このプロトコルを使用しています。ここに示した例では、制御143B細胞はTMRMとのFluo-4、ジギトニンで透過処理の前にAMを負荷しました。イメージングの5分後、1の8の順次追加：40mMの外因性のCaCl 2の100希釈の[Ca 2+]算出された最終遊離Ca 2+イオン濃度で、行われました。
それぞれのCaCl 2を添加した後、TMRM信号は、ミトコンドリアへのCaの流入として2+イオンを減少させ、ミトコンドリア膜電位ΔΨmを（ 図1）を消費します。呼吸がΔΨmを維持するために増加するとΔΨmが 、その後回復します。これは、それぞれのCaCl後4回発生します
メディアでのフリーの[Ca 2+]が0.32μM（ 図2）に達すると、ミトコンドリアのカルシウム濃度（のFluo-4信号）は、第二のCaCl 2添加に続いて増加し始めます。後続の各CaCl 2を添加すると、ミトコンドリアカルシウムの漸進的増加を引き起こしました。
ΔΨmの同時測定の画像（TMRM、赤信号）とミトコンドリアのカルシウム（フルオ4、緑SIGNAL）（ 図3）が示されています。
図1：ジギトニンでのミトコンドリアのΔΨmの測定は、TMRMを使用して、143B細胞を透過処理しました。 143B細胞は、ジギトニンで透過性化する前のFluo-4、AMおよびTMRMがプリロードされました。 1：40mMの外因性のCaCl 2の100希釈は、連続アリコートで追加されました。最終的な自由の[Ca 2+]メディアに各添加（*）のために示されています。 FCCPは約40分後、10μMの最終濃度に添加しました。 ΔΨmは TMRM信号の相対強度（RI）で表される、赤で示されています。データは、平均±SDはn = 3図は、基準12からの許可を得て適応されます。 大きい版？をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図のn個。
図2：ジギトニンにおけるミトコンドリアのカルシウムの測定は、フルオ4、AMを使用して、143B細胞を透過処理しました。 143B細胞は、ジギトニンで透過性化する前のFluo-4、AMおよびTMRMがプリロードされました。 1：40mMの外因性のCaCl 2の100希釈は、連続アリコートで追加されました。最終的な自由の[Ca 2+]メディアに各添加（*）のために示されています。 FCCPは約40分後、10μMの最終濃度に添加しました。ミトコンドリアカルシウムがあるFluo-4シグナルの相対強度（RI）で表される、緑色で示されています。データは、平均±SDはn = 3図は、基準12からの許可を得て適応されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：ジギトニンにおけるミトコンドリアのカルシウムとΔΨmの同時測定は、フルオ4、AMおよびTMRMを使用して143B細胞を透過処理しました。 143B細胞は、ジギトニンで透過性化する前のFluo-4、AMおよびTMRMがプリロードされました。 1：40mMの外因性のCaCl 2の100希釈は、連続アリコートで追加されました。最終的な自由の[Ca 2+]メディアに各添加のために示されています。 ΔΨmの同時染色（赤TMRM）とミトコンドリアのカルシウム（フルオ4、緑）を示す代表的な共焦点画像。 Fluo-4信号は0.062μMの静止カルシウム濃度で検出することは困難であることに注意してください。ホワイトスケールバー=10μmです。図は、基準12からの許可を得て適応されます。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
カルシウムは筋収縮、神経伝達および細胞増殖13を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。細胞カルシウム濃度の増加は、多くの場合、直接ATP世代3を上昇させるために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を刺激することができるカルシウムで、エネルギー需要と関連しています。我々が効果的にミトコンドリアのカルシウム蓄積を監視すると、この機能は遺伝的要因と薬理学的薬剤の両方に影響されるかを比較できるようにする能力を持っていることが不可欠です。
プロトコル内の重要なステップ
このプロトコルは、フルオ4、AMおよびTMRMと同時に、ミトコンドリアのカルシウム蓄積とΔΨmを監視する機能について説明します。染色プロセス中、のFluo-4の効果を最適化するために、室温で細胞をインキュベートすることが重要である、ミトコンドリアを検出するAMカルシウム。室温でのインキュベーションは、ミトコンドリア膜を通過し、ミトコンドリアマトリックスを入力するように荷電していないのFluo-4、AMを可能にする、細胞質ゾルエステラーゼの活性を低下させます。逆に、37℃でのインキュベーションは、細胞質ゾル中にエステラーゼ活性を高める効果的にミトコンドリア膜を通過することができません帯電したFluo-4色素を残すためにAMエステルを切断します。
細胞染色が行われた後、細胞を、IM撮像溶液中に浸漬されています。この解決策は、最初のRS染色液と比較してより高いTMRM濃度を有します。現在、細胞を透過性にされていること、TMRMは、もはや細胞膜を横切って平衡化しません。したがって、TMRM濃度は、ミトコンドリア内膜を横切る正しい平衡を達成するためにIMのイメージングソリューションで発生します。 IM撮像溶液中タプシガルギンを含むように、この段階で重要です。ブロック小胞体（ER）のCa 2タプシガルギン+ ATPアーゼ、フルオ4信号は、ERカルシウムを検出していないことを保証します。
修正およびトラブルシューティング
いくつかの細胞型は、それらの形質膜上の多剤耐性輸送体（また、MDR1またはP-糖タンパク質として知られる）を発現することができます。このタンパク質は、セル14の外に細胞質ゾルから、AMエステル誘導体を含む蛍光指示薬をエクスポートすることが知られています。トランスポーターを発現している場合、のFluo-4、AMおよびTMRM両方は、準最適な染色を生じ、細胞質ゾルからエクスポートされてもよいです。この効果をブロックするには、ベラパミル、染色プロセス中のFluo-4、AMおよびTMRM輸出を阻害多剤耐性輸送体をブロックするためにRS染色溶液に添加することができます。
分析されるべき細胞を透過性にすることによって、のFluo-4、AMは、他の細胞小器官または細胞質ゾルからのNOの競合信号に、ミトコンドリアの Ca 2+を検出することができます。私たちは日常的に、非イオン性detergenを使用します25μg/ mlの濃度で透過性のtジギトニン。この濃度は、発生しないミトコンドリア膜の可溶化を確実にするために調整する必要があるかもしれません。これは、ジギトニンの異なる濃度でTMRMシグナルの強度を評価することによって経験的に決定することができます。ジギトニンの濃度が高すぎると、ミトコンドリア膜は、TMRMシグナルを減少させる、部分的に可溶化されたであろう。
技術の制限事項
このプロトコルの主な利点の1つは、ミトコンドリアのカルシウムを検出するためのFluo-4、AMを使用することにより、TMRMは同時に2つの色素の間のごくわずかなスペクトルの重なりで、ΔΨmを測定するために使用することができることです。ミトコンドリアのカルシウムのFluo-4の特異性を確実にするために、細胞は、検査される必要性は、サイトゾルのFluo-4の信号を除去するために透過処理されます。この透過性は、この技術の1制限です。 IMイメージングソリューションのCLOながら、SELY細胞質ゾルのイオン強度と一致し、それは完全にその構成要素の全てを複製することはできません。特定の細胞質ゾル成分が検査されている実験系で必要とされる場合、これは結果に影響を与えることができます。細胞を透過処理するようさらに、プロトコルは、1時間よりも大きく長い実験に適していないかもしれません。
既存の/代替の方法に対する技術の意義
様々な蛍光色素は、ミトコンドリアカルシウム8を評価するために開発されています。これらの染料は、使い方が簡単で、短期間で有用なデータを提供することができます。これらの色素は、ミトコンドリア内に主に蓄積するが、一部はまた、リポソームを含む他の細胞小器官に蓄積し、または細胞質ゾルに留まることができます。そのため、注意がこれらの他の信号は、ミトコンドリアのカルシウム信号に影響を及ぼさないように注意する必要があります。
このプロトコル、mitochondrでIALのCa 2+タプシガルギンの存在下で透過処理した細胞で測定されます。この方法の利点は、サイトゾルおよび小胞体カルシウムシグナルが除去されることです。また、透過性があるFluo-4、AMの使用は、ミトコンドリアのCa 2+を検出することができます。 FLUO-4、AMは、ミトコンドリアの Ca 2+及びΔΨmは 、これら2つの色素を使用して同時に測定することができることを意味し、TMRMと非常に小さなスペクトルの重なりを有しています。
ミトコンドリアのCa 2+も遺伝的にコードされた蛍光レポーター8を用いて測定することができます。これらの記者は、特定のミトコンドリアのCa 2+シグナルの結果、ミトコンドリアを標的とすることができます。遺伝的にコードされたプローブは、いくつかの場合にはかなりの時間と労力を要することができ、研究されて細胞内に導入する必要があります。逆に、私たちのプロトコルは、ミトコンドリアのCaを測定するための迅速かつ簡単な細胞染色を可能にする、色素のFluo-4、AMおよびTMRMを使用しています
この技術を習得した後、将来のアプリケーションや方向性
ミトコンドリアは、細胞内カルシウム濃度、細胞のエネルギー要求を調整するために、ローカルカルシウムバッファとして作用します。このプロセスが中断されると、過剰なミトコンドリアのカルシウム取り込みは、ΔΨmの崩壊および細胞死の誘導4を誘発プロアポトーシス分子の放出をもたらす、ミトコンドリア透過性転移を誘発することができます。
我々は、ミトコンドリアのカルシウムとΔΨmとミトコンドリア透過性遷移の誘導との関係の検討のための高速かつ直接的なプロトコルを提示します。これは、糖尿病15及び年齢関連を含め、これらのミトコンドリアのパラメータは、ヒト疾患の広範囲の病因に影響を与えるかを調査するために使用することができ例えば、アルツハイマー病やパーキンソン病16などの神経変性条件。さらに、このプロトコルは、これらがどのように影響するか、また遺伝的欠陥、または環境毒素の影響を受け、及び方法ミトコンドリアカルシウム及びΔΨmの検査するために使用することができるミトコンドリアを標的とする治療法または薬剤によって調節することができます。将来の実験のこれらのタイプは、ミトコンドリアカルシウムが人間の健康と病気の両方で果たす役割に重要な新しい洞察を提供することができます。
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Acknowledgments
私たちは、財政支援のために博士Kirstin Elgassおよび技術支援のためのモナッシュマイクロイメージングから博士サラ・クリード、およびウェルカム・トラストおよび医学研究評議会、英国に感謝します。 MMcKは、オーストラリアの研究評議会今後のフェローシップ制度（FT120100459）、ウィリアム・バックランド財団、オーストラリアのミトコンドリア病財団（AMDF）、医学研究、モナッシュ大学のハドソン研究所がサポートされています。この作品は、ビクトリア州政府運用インフラ支援スキームによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
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