Summary
Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.
Abstract
Apart ATP üreten önemli rolleri dışında, mitokondri de (Ca 2+) sıkıca hücre içi Ca 2 + konsantrasyonu düzenleyen tamponlar, yerel kalsiyum gibi hareket ederler. Bunu yapmak için, mitokondri Ca 2+ ayırmak için kendi iç zarı (ΔΨ m) arasında elektrokimyasal potansiyelini kullanmak. Mitokondriye Ca 2 + akını oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kompleksleri ile elektron transferini artırmak, sitrik asit döngüsünün üç oran sınırlayıcı dehidrojenazları uyarır. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur.
Biz konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler aynı anda ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m burada bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreleri permeabilizing, mitokondriyal Ca 2+ canfloresan boya tetrametilrodamin kullanılarak ΔΨ m, metil ester, perklorat (TMRM) ölçümü ile, floresan Ca2 + göstergesi Fluo-4 AM kullanılarak ölçülebilmektedir. Bu sistemin avantajı, floresan boyalar arasında çok az spektral örtüşme aynı zamanda, doğru mitokondriyal Ca + 2 ve ölçüm ΔΨ m sağlayan olmasıdır. Ca2 + alikotları dizisel ilavesini kullanarak, mitokondriyal Ca 2 + alımı izlenebilir ve Ca2 + mitokondriyal membran geçirgenliği geçiş ve ΔΨ kaybını indükleyen edildiği konsantrasyon saptanmıştır m.
Introduction
Mitokondri yerel Ca 2 + tampon 1 olarak hareket ederek hücre içi Ca2 + konsantrasyonu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ca 2 +, Ca 2 + uniporter yoluyla mitokondri iç zarının (ΔΨ m) 2 arasında var olan elektrokimyasal gradyan tarafından yönlendirilen bir süreç mitokondri girer. Bir kez mitokondrial matriks içinde, Ca 2 + sitrik asit döngüsü 3 üç hız sınırlayıcı dehidrojenazları uyararak oksidatif fosforilasyonu aktif hale getirebilirsiniz. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur. Mitokondri içinde Ca2 + konsantrasyonu çok yüksek olursa, mitokondriyal geçirgenlik ΔΨ m dağılımı ile sonuçlanan başlatılabilir, cessatioOksidatif fosforilasyon, n ve yolları 4 sinyal hücre ölümünün indüklenmesi.
mitokondri hücresel kalsiyum mekansal tamponlama oynadıkları önemli rol mitokondriyal kalsiyum doğru izlenmesi kritik hale getirir. Çeşitli yöntemler Rodamin bazlı boyaların kullanımı dahil mitokondriyal kalsiyum, izlemek için kurulmuştur. Böyle bir boya, Rhod-2, AM, 6 mitokondriyal Ca 2 + düzeyleri 5 ölçmek için mitokondri bölümleme oldukça etkilidir. Bazı boya lipozomlar gibi diğer organellere birikir, ya da hücre sitozol kalır Ancak dikkat etmek gerekir. Bununla birlikte, alt analizler mitokondri 7'den olanlardan bu sinyalleri ayırt edilmesi için kullanılabilir.
Mitokondriyal kalsiyum izlemek için başka bir teknik floresan muhabiri 8 oluşturur kullanır > Yukarı. Bu genetik olarak kodlanmış prob yararı özellikle, örneğin, insan COX alt birim VIII N-terminal hedefleme sinyali endojen N-terminali peptidi kullanılarak mitokondri hedef olabilir. Bu sistem 9 sinyalizasyon mitokondriyal kalsiyum araştırmak için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır mitokondriyal hedefli aequorin probu oluşturmak için istihdam edilmiştir. Bu genetik olarak kodlanmış prob ana dezavantajı, geçici ekspresyonu ile hücre içine gereken (belirli hücre tipleri için uygun değildir ve değişken sonuçları üretebilir) veya sabit bir sentezleme sistemleri (ki zaman alıcı) oluşturarak olmasıdır.
Yukarıda özetlenen sorunları aşmak için, biz aynı anda mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m ölçmek için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, permeabilize hücrelerin ekzojen kalsiyum ekler daha önce tarif edilen yönteme dayalıdırs = "xref"> 10. Bizim protokol diğer yöntemlere göre üç ana avantajı vardır: Birincisi, biz Flu-4, AM ve TMRM mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m, çok farklı spektral özelliklere sahip iki boyalar izlemek için kullanın; ikincisi, hücreler Flu-4 sinyali sadece mitokondriyal Ca tespit edilir +2 ve Ca +2 diğer organellere veya hücre sitoplazmada lokalize olmayan şekilde permeabilize; ve üçüncüsü, Flu-4 kullanımı 2+ mitokondriyal Ca tespit etmek için genetik olarak kodlanmış problar kullanılarak eğer mevcut herhangi bir hücre transfeksiyon veya transformasyon sorunları inkâr, hızlı ve basit hücre boyama sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hücrelerin hazırlanması 1.
- 10 cm hücre kültür kaplarına hücreleri ya da 75 cm büyütün% 5 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve 1 x penisilin / streptomisin (s / s ile takviye edilmiş kültür ortamı [10 mi Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM) 'de 2 şişe )] 37 ° C /% 5 CO2 de.
- hücreleri hasat etmek için, daha sonra, 5 ml 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS) ile yıkamak, aspirasyon ile ortamı çıkarın. Daha sonra, (ağ / hac) tripsin /% 0.25, 1.5 ml% 0.25 ekleyin aspirasyonla 1x PBS çıkarın (a / h) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 2 dakika için 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edilir. çanak dokunun veya daha sonra 5 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon, hücreleri çıkarmak için hafifçe şişe.
- Bir hemasitometre üzerine yeniden süspanse hücrelerin 12 ul ekleyerek hücreleri saymak.
- yemekler veya konfokal görüntüleme için odacıklı lamelleri Levha hücreleri.
Not: Bu ters çevrilmiş mikroskop ile kullanılmak için dizayn edilmiştir, uygun bir plastik ya da cam alt olacaktır. - Plaka hücreleri inci böylece~% 80 konflüansa görüntüleme gününde elde edilir. Örneğin, yaklaşık 2 x 10 4 143B osteosarkom hücreleri görüntüleme önce 8 oyuklu oda slayt bir gün tek bir oyuk içine kaplama olabilir.
- Hücreler takmak ve kurtarmak için izin 37 ° C /% 5 CO 2 gecede hücreleri inkübe.
TMRM ve Flu-4 Görüntüleme için 2. Tamponlar
- 156 mM NaCI, 3 mM KCI, 2 mM MgSO 4 içeren Telaffuz Solüsyonu (SC) hazırlanması 1.25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-glukoz, 2 mM CaCl2 ve 10 mM HEPES pH 7.35. -20 ° C'de alikotları saklayın RS.
- Hazırlama Hücre içi Orta (IM), 6 mM NaCI, 130 mM KCI, 7.8 mM MgCI2, 1 mM KH 2 PO 4, 0.4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2mM malat, 2 mM glutamat, 2 mM ihtiva eden ADP ve 20 mM HEPES pH 7.1. malat, glutamat ve ADP 200 mM stok çözeltileri, ayrı olarak hazırlanır bölünmüştür ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Bunlar stocks kullanımdan hemen önce IM eklenebilir.
- 2 + serbest Hank tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) elde edilebilir Ca ticari satıcılardan önceden hazırlanmış. etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) ekleyin -N, N, N ', 500 uM nihai konsantrasyona kadar N'-tetraasetik asit (EGTA).
- % 100 metanol içinde 10 mM tetrametilrodamin, metil ester, perklorat (TMRM) içindeki bir stok çözelti hazırlayın. Bu stoktan, distile H 2 O 2 mcM bir çalışma stok yapmak
- % 100 etanol içinde 10 mM Verapamil bir stok çözelti hazırlayın.
- dimetil sülfoksit (DMSO) içinde Fluo-4 asetoksimetil ester (Fluo-4 AM) stok çözeltisi (ağırlık / hacim), 1 mg / ml hazırlayın.
Not: Fluo-4 AM Ca2 + bağlanma üzerine artmış floresan arzeden bir kalsiyum göstergesidir. Fluo-4 florin ile ikame iki klorin ikame edici ile, fluo-3, bir analogudur. Bu, 488 nm'de artan flüoresans uyarma ve daha yüksek floresans sinyali seviyeleri ile sonuçlanır.AM ester grubu hücre zarlarının nüfuz edebilir yüksüz Fluo-4 molekülüne sonuçlanır. hücre içinde bir kez, AM ester hücre içinde tutulur Flu-4 yüklü bir biçimde elde edilen, spesifik olmayan esterazlarla ayrılır. - % 100 etanol içinde 1 mM karbonil siyanit p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) içindeki bir stok çözelti hazırlayın.
- Damıtılmış H2O içinde bir stok 25 mg / ml çözelti (ağ / hac) digitonin hazırlanması
- DMSO içinde 100 uM thapsigargin bir stok çözelti hazırlayın.
- Damıtılmış H2O 40 mM kalsiyum klorür (CaCl2) bir stok çözelti hazırlayın
TMRM ve Fluo-4 AM 3. Hücrelerin boyanması
- 20 nM TMRM RS boyama çözeltisi hazırlayın, 5 ug / ml (a / h) Fluo-4 AM ve Pluronic F-127, RS gibi% 0.005 yüzeyaktif madde.
NOT: Bu yüzey aktif Flu-4, GM çözünürlüğünü kolaylaştırır iyonik olmayan bir polioldür. Not: 10 uM Verapamil, aynı zamanda inhibitörlerinin eklenebilirBu hücre tipinde ifade edilir, eğer plazma zarı çoklu ilaç taşıyıcı T TMRM verme analiz edilir. - pipetle hücreler kültür ortamı çıkarın ve PBS 1X 100 ul ile yıkayın.
- Pipetle 1 x PBS alınır ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 250 ul RS boyama çözeltisi içinde hücreler inkübe edin.
Not: Fluo-4 AM hücre girdiğinde, AM ester, hücresel esterazlarla ayrılır. Oda sıcaklığında inkübe Fluo-4 AM mitokondri girmesine izin esteraz aktivitesini inhibe eder. - Pipet ile RS boyama çözüm çıkarın ve aşırı Flu-4, AM ve TMRM kaldırmak için Ca 2 + ul 100 ücretsiz HBSS hücreleri yıkayın.
- 25 ug / ml İM görüntüleme çözeltisi hazırlayın digitonin (w / v), 200 nM TMRM ve IM 1 uM thapsigargin.
Not: digitonin konsantrasyonu oluşmaz mitokondriyal iç membran bu geçirgenliği sağlamak üzere ayarlanması gerekebilir. Bu yoğunluk değerlendirerek ampirik olarak saptanabilirdigitonin farklı konsantrasyonlarda TMRM sinyali. - Pipet ile Ca 2 + ücretsiz HBSS çıkarın ve hücrelere IM görüntüleme çözümü 300 ul ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye hücreleri bırakın. Hücreler artık CaCl2 eklemelerle görüntüleme için hazırız.
4. Hücre Görüntüleme
- ters bir lazer tarama konfokal mikroskop üzerine çanak veya IM görüntüleme çözümü hücrelerin ile odacıklı lamel yerleştirin.
- TMRM ve Flu-4 eksitasyon ve emisyon spektrumları mikroskop lazer ayarı kullanın. Örneğin, sırasıyla TMRM ve Fluo-4 heyecanlandırmak için 543 nm He-Ne ve 473 nm argon lazer çizgileri kullanıyoruz. hücrelere herhangi bir fotoğraf zararı en aza indirmek için yaklaşık% 5 düşük lazer gücü kullanın.
- görüntüleri her 25 sn tarama mikroskobu ayarlayın. 10 dakika tarama hücreleri TMRM ve Flu-4 sinyaller için temel okumalar kurmak.
NOT: Flu-4 sinyal istirahat kalsiyum konsantrasyonlarda ise zayıf ya da saptanamayan olabilirerzak. - Hızlı görüntüleme çözeltisi 300 ul doğrudan hücrelere 40 mM CaCl2 stok solüsyonu 3 ul ekle (1: 100 dilüsyon) ve bir pipet ile yavaşça karıştırın. Ekleme ve gerekirse CaCl 2 karıştırma sırasında görüntü tarama Pause.
NOT: Son ücretsiz Ca 2 + iyonu konsantrasyonu [Ca 2 +] IM görüntüleme çözümü gibi Maxchelator WEBMAXC gibi yazılımları kullanarak hesaplanabilir UZATILDI ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ya da Şelatör 11. Son serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu hesaplanması için ayrıntılı bir açıklaması [Ca2 +], aşağıda Bölüm 6'da tarif edilmektedir. - Yaklaşık 4 dakika boyunca görüntü taramaya devam, sonra genellikle yaklaşık 8 ila 10 eklemeler, ulaşıldığında istenilen TMRM veya Flu-4 sinyalleri kadar CaCl2 eklemeler her 4 dk tekrarlayın.
- 1 mM FCCP 100 seyreltme (nihai C: Bir pipet kullanarak, 1 ekleyinşirketinden hücrelere bağlı yoğunlaşma 10 uM) ΔΨ m kaybeder. 5 dakika daha Görüntü hücreleri. Deney şimdi bitti.
5. Görüntü Analizi
- Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, http://downloads.openmicroscopy.org/bio Bio-Biçimleri eklentisi (indir 'bioformats_package.jar' ile örnek ImageJ yazılım, görüntü analiz yazılımı kullanılarak Fluo-4 ve TMRM sinyallerin yoğunluğunu belirlemek -formats / ve kaydedin 'C: Program Files ImageJ eklentileri' klasörü).
- ImageJ (örneğin bir .oif dosyası) görüntüleme dosyasını açın. mitokondri içeren seçim aracını tıklayın ve faiz (ROI) bir bölge seçin. ROI seçmek için ilk TMRM sinyalini kullanın.
- Aç 'Analiz> Araçlar> ROI Yöneticisi', yoğunluk ölçümü için seçilen ROI eklemek için 'Ekle' düğmesini tıklayın. Birden fazla ROI ölçümü için tek bir görüntü seçilebilir. Tüm ROI kadar önceki adımları yineleyins ROI Manager eklenmiştir.
- 'Daha fazla> Çok Tedbir tıklayın seçildiğinde' tüm dilimleri ölçün 'olduğundan emin olun ve' Dilim Başına Bir Satır 'seçilmemiş olduğunu, daha sonra TMRM ve Flu-4 sinyallerin ortalama floresan yoğunluğu bir tablo elde etmek için' Tamam'ı tıklayın her zaman noktasında her ROI için.
- TMRM ve Flu-4 sinyaller için ortalama yoğunluğu ve standart sapmayı hesaplamak için tüm ROI verileri kullanır.
6. Final Ücretsiz Ca 2 + İyon Konsantrasyon [Ca2 +] Hesaplanması
- Serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu, İM görüntüleme çözelti içinde [Ca2 +] gibi Maxchelator WEBMAXC GENİŞLETİLMİŞ (gibi bir yazılımı kullanılarak belirlenebilir http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ya da kelat yapıcı 11. = Sıcaklık 24 ° C, pH = 7: Örneğin, şu şekilde WEBMAXC değişkenleri genişletilmiş bir dizi.1, iyonik kuvvet = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, Ca 2 + = 0.0004 M, Mg + 2 = 0.0078 M Bu nihai serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu [Ca + 2] 62 nM ile sonuçlanır . Bu programlar, reaktif saflık, ölçümler ve pH tespiti doğruluğu olarak dikkate her değişken alamaz unutmayın. Ücretsiz Ca 2 + konsantrasyonunun belirlenmesi için en doğru yöntem kalibre Ca 2+ seçici elektrot kullanmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz kalsiyum 12 artış tampon 143B hücre mitokondri yeteneği üzerinde bir MT-ND5 mutasyonunun etkilerini incelemek için bu protokolü kullanılır. Burada gösterilen örnekte, kontrol 143B hücrelerinin TMRM ve Flu-4 ile yüklendi, digitonin permeabilization önce Am. Görüntüleme 5 dakika sonra, 1 sekiz ardışık eklemeler: CaCI2 ekzojen 40 mM, 100 seyreltme Son serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu, yapılmıştır [Ca2 +] hesaplanan.
Her bir CaCİ2 ilave edildikten sonra, TMRM sinyali mitokondriyal membran potansiyeli ΔΨ m (Şekil 1) dağıtır 2+ iyonların mitokondriye Ca akışı azalır. Solunum ΔΨ m korumak için arttırıldıkça ΔΨ m ve sonra kurtarır. Bu, her bir CaCl sonra dört kez meydana gelir
Medyada ücretsiz [Ca 2 +] 0.32 mcM (Şekil 2) ulaştığında mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu (Flu-4 sinyali) ikinci CaCl2 ilave edildikten sonra artmaya başlar. Her bir sonraki CaCl2 ilave mitokondriyal kalsiyum ilerici bir artışa neden olmuştur.
ΔΨ m eşzamanlı ölçümlerinin (TMRM, kırmızı sinyali) ve mitokondriyal kalsiyum görüntüleri (Fluo-4, yeşil signal)) (Şekil 3 gösterilmiştir.
Şekil 1: digitonin mitokondriyal ΔΨ m ölçümü TMRM kullanarak 143B hücreleri permeabilize. 143B hücreleri digitonin permeabilization önce Flu-4, AM ve TMRM ile önceden yüklenmiş bulundu. Bir 1: CaCI2 ekzojen 40 mM, 100 dilüsyon sıralı parçalar halinde ilave edildi. Nihai bilgilerini [Ca2 +] ortam her ek (*) için belirtilmiştir. FCCP yaklaşık olarak 40 dakika sonra, 10 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar ilave edildi. ΔΨ m TMRM sinyalinin nispi yoğunluğu (RI) ile temsil edilen, kırmızı renkte gösterilmiştir. Sd n = 3. Şekil referansı 12 izniyle uyarlanmıştır ± Veri ortalamasıdır. Daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınızBu rakamın n.
Şekil 2: digitonin mitokondriyal kalsiyum ölçümü Flu-4, AM kullanarak 143B hücreleri permeabilize. 143B hücreleri digitonin permeabilization önce Flu-4, AM ve TMRM ile önceden yüklenmiş bulundu. Bir 1: CaCI2 ekzojen 40 mM, 100 dilüsyon sıralı parçalar halinde ilave edildi. Nihai bilgilerini [Ca2 +] ortam her ek (*) için belirtilmiştir. FCCP yaklaşık olarak 40 dakika sonra, 10 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar ilave edildi. Mitokondrial kalsiyum Fluo-4 sinyalin nispi yoğunluğu (RI) ile temsil edilen, yeşil gösterilir. Sd n = 3. Şekil referansı 12 izniyle uyarlanmıştır ± Veri ortalamasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: digitonin mitokondriyal kalsiyum ve ΔΨ m eş zamanlı ölçümü Flu-4, AM ve TMRM kullanarak 143B hücreleri permeabilize. 143B hücreleri digitonin permeabilization önce Flu-4, AM ve TMRM ile önceden yüklenmiş bulundu. Bir 1: CaCI2 ekzojen 40 mM, 100 dilüsyon sıralı parçalar halinde ilave edildi. Nihai bilgilerini [Ca2 +] ortam her ek endikedir. ΔΨ m eşzamanlı boyama (kırmızı TMRM) ve mitokondriyal kalsiyum (Flu-4, yeşil) gösteren Temsilcisi konfokal görüntüler. Flu-4 sinyal 0.062 uM istirahat kalsiyum konsantrasyonunda tespit etmek zor olduğunu unutmayın. Beyaz ölçekli çubukları 10 mikron =. Şekil referans 12 izni ile uyarlanmıştır.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsiyum kas kasılması, nöronal sinyalleşme ve hücre çoğalması 13 de dahil olmak üzere bir çok hücre süreçlerinde, çok önemli bir rol oynar. Hücre kalsiyum konsantrasyonlarında artışlar genellikle doğrudan ATP nesil 3 yükseltmek için mitokondrial oksidatif fosforilasyonu teşvik edebilmek kalsiyum ile enerji talebi ile ilişkilidir. Etkili bir mitokondriyal kalsiyum birikimini izlemek ve bu fonksiyon genetik faktörler ve farmakolojik ajanların hem nasıl etkilendiğini karşılaştırmak mümkün yeteneğine sahip elzemdir.
protokolü içinde kritik adımlar
Bu protokol Flu-4, AM ve TMRM ile eş zamanlı olarak mitokondri kalsiyum birikimi ve ΔΨ m izleme yeteneği açıklanır. boyama işlemi sırasında Flu-4 etkinliğini optimize etmek için, oda sıcaklığında inkübe hücreleri için kritik öneme sahiptir, mitokondriyal tespit AMkalsiyum. Oda sıcaklığında Kuluçka mitokondriyal membranlar arası ve mitokondriyal matris girmek için yüksüz Flu-4, AM izin sitozolik esterazların aktivitesini azaltır. Tersine, 37 ° C'de inkübasyon, sitozolde esteraz aktivitesini artırır etkili bir mitokondriyal membranlar geçmeye mümkün olmaz bir ücret Flu-4 boya bırakmak AM ester yararak.
Hücre boyama yapılmıştır sonra, hücreler, İM görüntüleme çözeltisi içine daldırılmaktadır. Bu çözelti, ilk RS boyama çözeltisine kıyasla daha yüksek bir TMRM konsantrasyonuna sahiptir. Artık, hücreler, geçirgen olduğu, TMRM artık plazma zarından dengeler. Bu nedenle, TMRM konsantrasyonu mitokondriyal iç membran boyunca doğru denge sağlamak için Hızlı görüntüleme çözelti içinde yükseltilir. Hızlı görüntüleme çözeltisi içinde thapsigargin dahil edilmesi de bu aşamada çok önemlidir. Bloklar endoplazmik retikulum (ER) Ca 2 thapsigargin+ ATPaz, Flu-4 sinyal ER kalsiyum algılamıyor sağlamak.
Değişiklikler ve sorun giderme
Bazı hücre tipleri kendi plazma zarlarında ilaca direnç taşıyıcı (aynı zamanda MDR1 veya P-glikoprotein olarak da bilinir) ifade edebilir. Bu protein hücrenin 14 üzerinden sitozolden, AM ester türevlerinin de dahil olmak üzere floresan göstergeler, ihracat bilinmektedir. taşıyıcı ifade edilirse, iki Fluo-4 AM ve TMRM alt optimal lekelenme ile sonuçlanan hücre sitoplazmada ihraç edilebilir. Bu etkiyi engellemek için, verapamil boyama işlemi sırasında Fluo-4 AM ve TMRM ihracat inhibe çoklu ilaç direnci taşıyıcı bloke RS boyama çözeltisine ilave edilebilir.
Analiz edilecek hücrelerin geçirgenleştirdikten olarak, Fluo-4 AM diğer organellere ve sitoplazmada hiçbir rakip sinyallerle mitokondriyal Ca 2 + tespit etmek için kullanılabilir. Rutin olarak, iyonik olmayan detergen kullanımı25 ug / ml'lik bir konsantrasyonda nüfuziyet kabiliyeti t Digitonin. Bu konsantrasyon oluşmaz mitokondriyal membranlar bu çözülmesini sağlamak için ayarlanabilir olması gerekebilir. Bu digitonin farklı konsantrasyonlarda TMRM sinyalin şiddetini değerlendirerek ampirik bir şekilde tespit edilebilir. digitonin konsantrasyonu çok yüksek ise, mitokondriyal membran TMRM sinyalini azaltır kısmen çözünür olacaktır.
tekniğin sınırlamaları
Bu protokolün başlıca yararlarından biri, mitokondriyal kalsiyum algılamak AM Flu-4 kullanılarak, TMRM aynı anda iki boyalar arasındaki önemsiz spektral örtüşme ile, ΔΨ m ölçmek için kullanılabilir olmasıdır. Mitokondriyal kalsiyum Flu-4 özgüllüğü sağlamak için, hücreler, incelenen ihtiyaç sitosolik Fluo-4 sinyal ortadan kaldırmak için geçirgen olması. Bu Permeabilization bu tekniğin bir sınırlama olduğunu. Sohbet görüntüleme çözümü clo ikenyapt klar hücre sitoplazmada iyonik gücünü maçları, tamamen bileşenlerinin tüm çoğaltma yapamaz. Belirli sitozolik bileşenleri deneysel sistem incelenmektedir gereklidir, bu sonuçları etkileyebilir. Hücreler permeabilize Dahası, iletişim kuralı 1 saat daha fazla uzun deneyleri için uygun olmayabilir.
Mevcut / alternatif yöntemlere göre tekniğin önemi
Çeşitli Floresan boyalar mitokondriyal kalsiyum 8 değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu boyalar kullanımı basit ve kısa bir alanda yararlı veriler sağlayabilir. Bu boyalar, mitokondri ağırlıklı olarak birikir, bazı lipozomlar dahil olmak üzere diğer organel, birikir, ya da hücre sitozol içinde kalabilir. Bu nedenle, bakım bu sinyaller mitokondriyal kalsiyum sinyalini etkileyecek etmemelerini sağlamak için dikkat edilmelidir.
Bu protokol, mitochondr olarakial Ca 2 + thapsigargin mevcudiyetinde permeabilize hücrelerinde ölçülür. Bu metodolojinin avantajı sitozolik ve ER kalsiyum sinyalleri ortadan kalkar olmasıdır. Ayrıca, Permeabilization Flu-4 kullanımı, AM Ca 2 + mitokondriyal algılamasını sağlar. Flu-4, AM mitokondriyal Ca 2 + ve ΔΨ m bu iki boyalar kullanarak aynı anda ölçmek olabilir, yani TMRM ile çok az spektral örtüşme vardır.
Mitokondriyal Ca2 + da genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere 8 kullanılarak ölçülebilir. Bu muhabirler belirli mitokondriyal Ca 2 + sinyalleri sonuçlanan mitokondri hedeflenebilir. Genetik olarak kodlanmış sondalar bazı durumlarda önemli ölçüde zaman ve çaba alabilir, çalışılan hücrelere dahil edilmesi gerekir. Tersine, bizim protokol mitokondriyal Ca ölçmek için hızlı ve basit hücre boyama için izin boyalar Flu-4, AM ve TMRM kullanır
Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamalar veya yön
Yerel kalsiyum tampon olarak Mitokondri hareket hücre içi kalsiyum konsantrasyonlarını ve hücrenin enerji ihtiyacını düzenler. Bu işlemi kesintiye, fazla mitokondriyal kalsiyum alımı ΔΨ m çöküşü ve Hücre ölümüne sebebiyet verilmesinden 4 tetikleyen pro-apoptotik molekülleri salınmasına yol açar mitokondriyal geçirgenlik geçişi indükleyebilir.
Biz mitokondriyal kalsiyum muayene ve ΔΨ m ilişkisi ve mitokondriyal geçirgenlik geçişi indüksiyonu için hızlı ve düz ileri protokol mevcut. Bu diyabet 15 ve yaş ile ilgili olmak üzere, bu mitokondriyal parametreler insan hastalıklarının çeşitli patojenesisini etkileyen araştırmak için kullanılabilirAlzheimer ve Parkinson Hastalığı 16 olarak nörodejenerasyon koşulları. Ayrıca, bu protokol mitokondriyal kalsiyum ve ΔΨ m genetik bozukluklar ya da çevresel toksinler tarafından nasıl etkilendiğini incelemek için kullanılan ve olabilir de bu tedavilerin veya mitokondri hedefleyen ilaçlarla modüle edilebilir etkiler. mitokondriyal kalsiyum insan sağlığı ve hastalıkları hem de oynadığı gelecek deneylerde bu tür rolü önemli yeni bilgiler sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansal destek için Dr. Kirstin Elgass ve teknik yardım için Monash Micro Görüntüleme Dr Sarah Creed ve Wellcome Trust ve Tıbbi Araştırma Konseyi UK teşekkür ederim. MMcK Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu Programı (FT120100459), William Buckland Vakfı, Avustralya Mitokondriyal Hastalık Vakfı (AMDF), Tıbbi Araştırma ve Monash Üniversitesi Hudson Enstitüsü desteklenmektedir. Bu eser Victoria Hükümeti Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
