Summary
线粒体可以利用在其内的膜（Δ 膜电势 ）的电化学势螯合钙（Ca 2+），允许它们塑造细胞内的Ca 2+的细胞内信号传导。我们描述了使用荧光染料和共聚焦显微镜同时测量线粒体的Ca 2+摄取和ΔΨ 微米活细胞的方法。
Abstract
除了在产生的ATP其重要作用，线粒体还充当本地钙（Ca 2+）缓冲器，以紧密地调节细胞内Ca 2+浓度。要做到这一点，线粒体利用电化学势在其内膜（ΔΨ 米 ）隔离的 Ca 2+。 的 Ca 2+的流入线粒体刺激三羧酸循环三个限速脱氢酶，通过氧化磷酸化（OXPHOS）配合增加的电子转移。这种刺激保持ΔΨ 男 ，作为正钙离子越过线粒体内膜进入线粒体基质被暂时消散。
我们在这里描述了使用共聚焦显微镜同时测量线粒体的Ca 2+摄取和ΔΨ 微米活细胞的方法。由透化细胞，线粒体的 Ca 2+能使用荧光钙指示剂的Fluo-4，AM被测定，与使用荧光染料四甲（TMRM）ΔΨ 男 ，甲酯，高氯酸盐测量。本系统的好处是，有荧光染料之间很少光谱重叠，使线粒体的Ca精确测量2+和ΔΨ 米同时。使用顺序除钙等分，线粒体钙的摄取可以被监控，并在其中钙诱导线粒体膜通透性过渡和ΔΨ的损失浓度中号决定。
Introduction
线粒体通过充当本地的 Ca 2+缓冲液1在调节细胞内Ca 2+浓度的一个重要的角色。钙离子通过钙单向转运体进入线粒体，通过跨线粒体内膜（ΔΨ 米 ）2存在电化学梯度驱动的方法。一旦线粒体基质内，钙离子可通过刺激三羧酸循环3三限速脱氢酶激活氧化磷酸化。这种刺激保持ΔΨ 男 ，作为正钙离子越过线粒体内膜进入线粒体基质被暂时消散。如果线粒体内的Ca 2+浓度变得非常高，线粒体通透性转换可以启动，导致ΔΨ 米耗散，cessatio氧化磷酸化的n和细胞死亡的信号传导途径4的诱导。
线粒体在细胞中钙的缓冲空间发挥的重要作用，使线粒体钙的准确的监测非常重要。各种方法已被建立并监控线粒体钙，包括使用基于若丹明染料。一个这样的染料，RHOD-2，AM是在分区到线粒体相当有效测量线粒体的 Ca 2+水平5,6。然而，必须注意用作某些染料将在其他细胞器，如脂质体的积累，或保留在细胞胞质溶胶。然而，下游分析可被用来从那些从线粒体7区分这些信号。
监测线粒体钙另一种技术利用荧光记者构造8 了>。这些基因编码的探针的好处是，它们可以通过使用内源性N-末端肽，例如人COX VIII亚基的N-末端的定位信号进行具体靶向线粒体。该系统已被用来产生已经证明了线粒体调查钙信号9是非常有用的线粒体靶向探针水母发光蛋白。这些基因编码的探针的主要缺点是，它们需要被引入到由瞬时表达的细胞（其是不适合某些细胞类型可行，并且能够产生不同的结果），或者通过创建稳定表达系统（这是耗时）。
为了规避上述问题，我们已经开发出一种新的协议，同时测量线粒体钙和ΔΨ 米此协议是基于添加了外源钙到透化的细胞一前述方法S =“外部参照”> 10。我们的协议比其他方法三大优势：首先，我们使用荧光- 4，AM和TMRM监测线粒体钙和ΔΨm，即具有非常独特的光谱特性两种染料;其次，将细胞透化，以使的Fluo-4信号仅检测线粒体的Ca 2+和不钙定位于其它细胞器或细胞胞质溶胶;第三，使用的Fluo-4的检测线粒体的 Ca 2+允许快速和简单的细胞染色，否定存在如果使用遗传编码的探针的任何细胞转染或转化的问题。
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Protocol
1.细胞的制备
- 生长10 1cm池培养皿的细胞或75cm 2的烧瓶中补充有5％（体积/体积）胎牛血清（FBS）和1×青霉素/链霉素（P / S培养基[10毫升Dulbecco氏改良的Eagles培养基（DMEM）中）]，在37℃/ 5％CO 2。
- 收获细胞，通过抽吸除去培养基，然后用5ml 1×磷酸盐缓冲盐水（1×PBS）洗涤。通过抽吸除去1×PBS中，然后加入1.5毫升0.25％（重量/体积）胰蛋白酶/ 0.25％（重量/体积）乙二胺四乙酸（EDTA），并在37℃/ 5％CO 2孵育2分钟。点击菜或烧瓶轻轻除去细胞，然后悬浮在5毫升培养基。
- 加入12微升悬浮细胞到血细胞计数器的细胞。
- 板块细胞菜肴或共焦成像腔盖玻片。
注意：这些将有一个合适的塑料或玻璃底已设计用于倒置显微镜的使用。 - 板细胞，使日在〜80％汇合上成像的天来实现。例如，大约2×10 4个 143B骨肉瘤细胞可以接种到成像之前的8孔腔室载玻片一天一个阱。
- 孵育细胞过夜，在37℃/ 5％CO 2，以允许细胞附着和恢复。
2.缓冲器，用于TMRM和荧光 - 4数字影像
- 制备含有156 mM氯化钠，3毫米氯化钾，2mM的硫酸镁 ，记录溶液（RS） - 1.25毫KH 2 PO 4，10mM的D-葡萄糖，2mM的氯化钙和10mM的HEPES pH值7.35。 RS储存在-20ºC等分。
- 制备细胞内中等（IM）含有6毫摩尔NaCl，130毫摩尔的KCl，7.8毫的MgCl 2，1mM的KH 2 PO 4，0.4mM的氯化钙 ，2毫EGTA，10mM的HEDTA，2毫苹果酸盐，2mM的谷氨酸，2毫ADP和20mM HEPES pH值7.1。苹果酸盐，谷氨酸盐和ADP的的200mM储备溶液可以单独制备，等分并储存在-20℃。这些STocks可以只使用前加入到IM。
- 从商业供应商的 Ca 2+游离Hank氏缓冲盐溶液（HBSS）中，可以得到的预制备。添加乙二醇 - 双（β氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA），以500μM的最终浓度。
- 制备在100％甲醇的10mM四甲甲酯，高氯酸根（TMRM）的贮备溶液。从这种股票使2μm的工作原液在蒸馏水H 2 O
- 制备的10mM维拉帕米在100％乙醇中的储备溶液。
- 制备为1mg / ml（重量/体积）的二甲亚砜（DMSO）的Fluo-4乙酰氧基甲基酯（的Fluo-4，AM）的储备溶液。
注：荧光- 4，AM是在结合钙离子表现出增加的荧光钙指标。的Fluo-4是FLUO-3的类似物，由氟取代的两个氯取代基。这导致在488纳米增加的荧光激发和更高的荧光信号水平。该AM酯基团产生的是能够渗透细胞膜不带电的荧光 - 4分子。一旦进入细胞内，在AM酯通过非特异性酯酶裂解，导致在被截留在细胞内的Fluo-4的充电形式。 - 制备在100％乙醇1mM的羰基氰化物对 - trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）的贮备溶液。
- 制备的25毫克/毫升的蒸馏水H 2 O储备溶液（重量/体积）毛地黄皂苷
- 制备100μM的毒胡萝卜素的DMSO储备溶液。
- 在蒸馏H 2 O制备的40毫氯化钙（氯化钙2）的储备溶液
3. TMRM和荧光 - 4，AM细胞染色
- 用20nM的TMRM制备RS染色溶液，5微克/毫升（重量/体积）的Fluo-4，AM和0.005％表面活性剂，如尼克F-127的RS。
注：这种表面活性剂是一种非离子型多元醇，其促进的Fluo-4，AM的溶解。注：也可加入10μM的维拉帕米到INHIBI吨TMRM出口通过质膜药转运如果它是在细胞类型中表达所分析。 - 通过吸移管除去从细胞培养基，并用100微升1×PBS洗涤。
- 通过吸移管除去1×PBS中并孵育在250微升的RS染色溶液的细胞在室温下45分钟。
注意：一旦的Fluo-4，AM进入细胞中，AM酯通过蜂窝酯酶裂解。在室温下温育抑制酯酶的活性，允许的Fluo-4，AM进入线粒体。 - 通过吸移管除去RS染色液和洗涤细胞在100μl 的 Ca 2+的HBSS以除去过量的Fluo-4，AM和TMRM。
- 用25微克/毫升制备的IM成像溶液（重量/体积）毛地黄皂苷，200nM的TMRM和在IM1μM的毒胡萝卜素。
注：毛地黄皂苷的浓度可能需要进行调整，以确保线粒体内膜不会发生的那透。这可凭经验通过评估强度来确定在不同浓度的毛地黄皂苷的TMRM信号。 - 用移液管除去的 Ca 2+的HBSS，并添加300微升的IM成像溶液到细胞中。离开细胞在室温下平衡10分钟。细胞现在已经准备好与氯化钙补充成像。
4.细胞成像
- 将菜或在IM成像解决方案细胞腔盖玻片上倒置激光扫描共聚焦显微镜。
- 使用显微镜激光器TMRM和的Fluo-4的激发和发射光谱的设置。例如，使用543纳米的氦氖和473纳米的氩激光线分别以激发TMRM和的Fluo-4。使用大约5％的低激光功率，以最小化对细胞的任何光损伤。
- 设置显微镜扫描图像每25秒。扫描单元10分钟以建立用于TMRM和的Fluo-4的信号的基线读数。
注：荧光 - 4的信号可能是在静息钙concent微弱或无法检测口粮。 - 加入3微升的40mM的CaCl 2储备溶液直接向细胞中加入300μl的IM成像溶液（1：100稀释），并用移液管轻轻混匀。暂停图像扫描同时加入，如果需要混合的CaCl 2。
注：最终的游离钙离子浓度的离子钙离子浓度在IM成像解决方案可以使用软件进行计算，如Maxchelator WEBMAXC扩展（ http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）或螯合剂11。如何计算最终的游离钙离子离子浓度的详细描述钙离子浓度在下面第6条所述。 - 持续约4分钟图像扫描，然后重复氯化钙增加每4分钟，直到所需的TMRM或荧光- 4信号到达，通常在8到10加法。
- 使用吸管，加入1：100稀释1 mM的FCCP的（决赛Concentration 10μM）直接向细胞消散ΔΨ 微米 。图像细胞再5分钟。实验已经结束。
5.图像分析
- 一旦成像完成后，确定使用图像分析软件的Fluo-4和TMRM信号的强度，对于具有生物格式的插件（下载'bioformats_package.jar“从http://downloads.openmicroscopy.org/bio例如ImageJ的软件 - 格式/并将其保存在“C： Program Files文件的ImageJ 插件”文件夹）。
- 打开ImageJ的影像文件（例如一个.oif文件）。点击选择工具，并选择感兴趣区域（ROI）的区域包含线粒体。使用初始TMRM信号来选择投资回报率。
- 打开“分析>工具>投资回报率经理”，单击“添加”，以包括强度测量选定的投资回报率。多个ROI可以测量单个图像上进行选择。重复上述步骤，直到所有的投资回报率■找被添加到的ROI管理器。
- 点击“更多>多措施”，确保“衡量所有切片”被选中，那是一排每片“被选中，然后点击”确定“，以获得TMRM和荧光 - 4信号的平均荧光强度的表在每个时间点每个ROI。
- 从所有ROI使用数据来计算用于TMRM和的Fluo-4的信号的平均强度和标准偏差。
6.计算最终游离钙离子离子浓度钙离子浓度
- 游离钙离子浓度的[Ca 2+]在IM成像解决方案可以使用软件，如Maxchelator WEBMAXC扩展（待定http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）或螯合剂11。例如，设置WEBMAXC变量EXTENDED如下：温度= 24℃，pH值为7。1，离子强度= 0.162，EGTA = 0.002男，HEDTA = 0.01男， 钙 = 0.0004 M和镁离子 = 0.0078 M.这将导致最终的游离钙离子浓度的离子钙离子浓度 62纳米。请注意，这些程序可以不考虑每一个变量，如试剂的纯度，测量和pH测定精度。用于确定游离Ca 2+浓度的最准确的方法是使用经过校准的钙选择性电极。
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Representative Results
我们已经使用该协议来检查上143B细胞线粒体的钙12缓冲的增加的能力的MT-ND5突变的影响。在这里所示的例子中，控制143B细胞加载TMRM和的Fluo-4，用毛地黄皂苷透化之前AM。 5分钟成像之后，一个1的8个连续的增补：100稀释的40毫摩尔外源性的CaCl 2被做了，与最终游离Ca 2+离子浓度计算[2+钙。
以下各氯化钙此外，TMRM信号作为钙涌入2+离子进入线粒体减小消散线粒体膜电位ΔΨ 米 （ 图1）。 ΔΨ先按m，再按恢复为呼吸增加，以保持ΔΨ 米这每氯化钙后出现四次
线粒体钙浓度（的Fluo-4的信号）开始增加所述第二氯化钙2加法以下时游离的[Ca 2+]在介质达到0.32微米（ 图2）。每个后续氯化钙除了引起线粒体钙逐步增加。
ΔΨ的M（TMRM，红色信号）和线粒体钙的同时测量的图像（荧光- 4，绿色环保SIGNAL）示（ 图3）。
图1：在毛地黄皂苷线粒体ΔΨm测定透143B细胞使用TMRM。 143B细胞用毛地黄皂苷透化之前的Fluo-4，AM和TMRM预装。在连续等份加入100稀释为40毫米外源性氯化钙2：1。最终的自由钙离子浓度在媒体上表示对于每一次加（*）。 FCCP物后约40分钟内加入到10μM的终浓度。 ΔΨm被显示为红色，由TMRM信号的相对强度（RI）表示。 ±SD N = 3。图是由12参考适合与许可数据是平均数。 请点击此处查看大versio这个数字的n个。
图2：毛地黄皂苷线粒体钙的测定透使用的Fluo-4，AM 143B细胞。 143B细胞用毛地黄皂苷透化之前的Fluo-4，AM和TMRM预装。在连续等份加入100稀释为40毫米外源性氯化钙2：1。最终的自由钙离子浓度在媒体上表示对于每一次加（*）。 FCCP物后约40分钟内加入到10μM的终浓度。线粒体钙示于绿色，由的Fluo-4的信号的相对强度（RI）表示。 ±SD N = 3。图是由12参考适合与许可数据是平均数。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：洋地黄线粒体钙和ΔΨM的同时测量透143B细胞使用荧光- 4，AM和TMRM。 143B细胞用毛地黄皂苷透化之前的Fluo-4，AM和TMRM预装。在连续等份加入100稀释为40毫米外源性氯化钙2：1。最终的自由钙离子浓度在媒体上表示对于每一次加。代表共聚焦图像显示的ΔΨ 米同时染色（TMRM，红色）和线粒体钙（荧光- 4，绿色）。需要注意的是的Fluo-4信号是埋头的0.062μM静息钙浓度来检测。白比例尺= 10微米。图是从参考12适于与权限。请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
钙起着在许多细胞过程，包括肌肉收缩，神经元信号传导和细胞增殖13的关键作用。在细胞钙离子浓度的增加往往与能源需求有关，与钙能直接刺激线粒体氧化磷酸化，以提高ATP生成3。因此，重要的是，我们必须有效地监测线粒体钙累积，并且能够以比较如何这个功能是由遗传因素和药剂的影响的能力。
该协议中的关键步骤
本协议描述与荧光- 4，AM和TMRM同时监测线粒体钙积累和ΔΨ 米的能力。在染色过程中，关键是要室温下培养所述细胞，以优化的Fluo-4的有效性，AM检测线粒体钙。在室温下孵育减少细胞质酯酶的活性，使不带电荷的Fluo-4，AM越过线粒体膜和进入线粒体基质。相反地，孵育在37℃下增强在细胞质酯酶活性，裂解掉调幅酯留下带电的Fluo-4染料，其将不能够有效地越过线粒体膜。
一旦细胞染色已经执行，将细胞浸泡在IM成像溶液。相比于最初的RS染色液该溶液具有更高的TMRM浓度。现在，将细胞透化，在TMRM不再穿过质膜达到平衡。因此，TMRM浓度在IM成像溶液升至实现跨线粒体内膜的正确平衡。它也是在这一阶段的关键，以包括在IM成像溶液毒胡萝卜素。毒胡萝卜素块内质网（ER）的Ca 2+ ATP酶，确保的Fluo-4的信号未检测的ER钙。
修改和故障排除
某些类型的细胞可以表达他们的血浆膜上的多药耐药转运体（也称为MDR1或P-糖蛋白）。这种蛋白质被称为导出荧光指示剂，包括AM酯衍生物，从胞浆出细胞14。如果转运表达时，两者的Fluo-4，AM和TMRM可以从细胞胞浆出口，导致次优的染色。阻止此效果，维拉帕米可添加到RS染色液阻止多药耐药转运，在染色过程中抑制的Fluo-4，AM和TMRM出口。
由透化的细胞进行分析，的Fluo-4，AM可用于检测线粒体的Ca 2+，与来自其他细胞器或细胞质中没有竞争的信号。我们经常使用的非离子型detergen吨毛地黄皂苷为透以25微克/ ml的浓度。该浓度可能需要进行调整，以确保线粒体膜的该增溶不会发生。这可凭经验通过在不同浓度的毛地黄皂苷的评估TMRM信号的强度来确定。如果毛地黄皂苷的浓度过高，线粒体膜将被部分溶解，降低了TMRM信号。
该技术的局限性
一的该协议的主要优点是，通过使用的Fluo-4，AM检测线粒体钙，TMRM可以用来同时测量ΔΨ 米 ，两种染料之间可忽略的光谱重叠。以保证的Fluo-4的线粒体钙的特异性，被检查的细胞需要被透消除胞质的Fluo-4的信号。此透是本技术的一个限制。虽然IM成像解决方案CLOsely匹配的细胞胞质中的离子强度，并不能完全复制其所有成分。这可能会影响是否在被检查的试验系统中所需的特定细胞内组分的结果。此外，如将细胞透化，该协议可能不适合于较长的实验比1小时以上。
相对于现有的/替代方法的技术意义
各种荧光染料已经开发了用于评估线粒体钙8。这些染料是简单的使用，并且可以在很短的时间空间提供有用的数据。而这些染料在线粒体主要积累，有些还可以积累在其它的细胞器，包括脂质体，或保持在细胞胞质溶胶。因此，必须小心，以确保这些其它信号不影响线粒体钙信号。
在这个协议中，mitochondr胶质的 Ca 2+在透化的细胞测定在毒胡萝卜素的存在。这种方法的优点是，胞质及ER钙信号被消除。此外，通透允许使用的Fluo-4，AM检测线粒体钙 。荧光- 4，AM与TMRM很少光谱重叠，这意味着线粒体钙和ΔΨm可以是使用这两种染料的同时测量。
线粒体的 Ca 2+也可以使用基因编码荧光报道8进行测量。这些记者可以有针对性地线粒体，导致线粒体特定钙信号。遗传编码的探针需要被引入到细胞中正在研究，在某些情况下可能需要相当长的时间和精力。相反，我们的协议使用染料荧光 - 4，AM和TMRM，从而实现了快速和简单的细胞染色来衡量线粒体钙
掌握这一技术后，未来的应用或指示
线粒体充当本地钙缓冲剂来调节细胞内钙离子浓度和电池的能量要求。当这个过程被打乱，过度线粒体摄取钙可诱发线粒体通透性转换，导致ΔΨ 米崩溃，触发细胞死亡4诱导促凋亡分子的释放。
我们提出了一个快速和直接的协议，用于线粒体钙的检查及其ΔΨ 米的关系，线粒体通透性转换的诱导。这可以被用来研究这些线粒体参数如何在广泛的人类疾病的影响发病，包括糖尿病15和年龄相关的神经变性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏病16。此外，该协议可以用于研究如何线粒体钙和ΔΨm的由遗传缺陷或环境毒素的影响，以及如何这些影响可通过治疗或靶向线粒体的药物进行调制。这些类型的未来的实验可以提供重要的新的见解的作用线粒体钙在人类健康和疾病的播放。
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Acknowledgments
我们感谢希尔丝廷Elgass博士和莫纳什显微成像技术援助萨拉信条博士和威康信托基金会和医学研究理事会英国的财政支持。 MMcK支持澳大利亚研究理事会未来的奖学金计划（FT120100459），威廉·巴克兰基金会，澳大利亚线粒体病基金会（AMDF），医学研究和莫纳什大学的哈德逊研究所。这项工作是由维多利亚州政府经营性基础设施支持计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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