Summary
As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.
Abstract
Para além do seu papel fundamental na geração de ATP, mitocôndrias também actuar como cálcio local (Ca 2+), tampões para regular firmemente concentração intracelular de Ca2 +. Para fazer isso, as mitocôndrias utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (ΔΨ m) para sequestrar Ca 2+. O influxo de Ca2 + para as mitocôndrias estimula três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo do ácido cítrico, aumentando a transferência de electrões através da fosforilação oxidativa (FOX) complexos. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial.
Descrevemos aqui um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ captação e ΔΨ m em células vivas usando microscopia confocal. Por permeabilização das células, o Ca 2+ mitocondrial podeser medida utilizando o indicador fluorescente de Ca 2+ Fluo-4, AM, com medição de ΔΨ m utilizando o corante fluorescente de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM). A vantagem deste sistema é que existe muito pouca sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma medição precisa de Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m simultaneamente. Utilizando a adição sequencial de alíquotas de Ca 2+, Ca 2+ mitocondrial captação pode ser monitorizada, e a concentração na qual Ca 2+ induz a transição da permeabilidade da membrana mitocondrial e a perda de ΔΨ m determinada.
Introduction
As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação da concentração intracelular de Ca2 +, agindo como locais de Ca2 + tampões 1. Ca 2+ entra as mitocôndrias através da uniporter Ca2 +, um processo conduzido por o gradiente electroquímico que existe através da membrana mitocondrial interna (ΔΨ m) 2. Uma vez dentro da matriz mitocondrial, Ca2 + pode activar a fosforilação oxidativa, estimulando três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo de ácido cítrico 3. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial. Se a concentração de Ca 2+ no interior da mitocôndria se torna muito alta, a transição de permeabilidade mitocondrial pode ser iniciado, resultando na dissipação de ΔΨ m, o cessatioN da fosforilação oxidativa e a indução de morte celular percursos de sinalização 4.
O importante papel que as mitocôndrias jogar no tamponamento espacial de cálcio celular faz com que o monitoramento preciso do cálcio mitocondrial crítica. Vários métodos têm sido estabelecido para controlar ccio mitocondrial, incluindo a utilização de corantes à base de rodamina. Um tal tintura, Rhod-2, AM, é bastante eficaz no particionamento para a mitocôndria para medir mitocondriais níveis de Ca 2+ 5, 6. No entanto, o cuidado deve ser usado como algum corante irá acumular em outras organelas, tais como lipossomas, ou permanecer no citoplasma celular. No entanto, análises a jusante pode ser utilizado para distinguir estes sinais dos da mitocôndria 7.
Uma outra técnica para monitorar cálcio mitocondrial utiliza repórter fluorescente constrói 8 -se>. O benefício destas sondas geneticamente codificados é que eles podem ser especificamente dirigidas para a mitocôndria utilizando péptidos endógenos N-terminais, por exemplo o sinal de direccionamento do terminal N da subunidade de COX VIII humano. Este sistema tem sido empregado para gerar uma sonda aequorina alvejado-mitocondrial, que revelou-se extremamente útil para a investigação de cálcio mitocondrial sinalização 9. A principal desvantagem destas sondas geneticamente codificados é que eles têm de ser introduzidos nas células por expressão transitória (que não é viável para certos tipos de células e pode produzir resultados variáveis) ou através da criação de sistemas de expressão estáveis (que é demorado).
Para contornar os problemas acima referidos, temos desenvolvido um novo protocolo para medir mitocondrial Ca 2+ e ΔΨ m simultaneamente. Este protocolo baseia-se num método anteriormente descrito que adiciona cálcio exógeno para as células permeabilizadass = "xref"> 10. Nosso protocolo tem três vantagens principais em relação a outros métodos: em primeiro lugar, usamos Fluo-4, AM e TMRM para monitorar Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m, dois corantes que têm propriedades espectrais muito distintas; Em segundo lugar, as células são permeabilizadas de modo a que o sinal de Fluo-4 apenas está detectando mitocondrial de Ca2 + e de Ca2 + não localizada para outros organelos ou o citosol da célula; e em terceiro lugar, a utilização de Fluo-4 para detectar Ca 2+ mitocondrial permite a coloração de células rápido e simples, eliminando qualquer problema de transfecção de células ou de transformação que existem se utilizando sondas geneticamente codificados.
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Protocol
1. Preparação de células
- Cultivar células em placas de cultura celular de 10 cm ou 75 cm 2 frascos em meio de cultura [10 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1x penicilina / estreptomicina (P / S )] a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Para colher as células, meios remover por aspiração, em seguida, lava-se com 5 ml de 1x tampão de fosfatos salino (PBS 1x). Remover PBS 1x por aspiração, em seguida, adicionar 1,5 ml de 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 min. Toque prato ou frasco suavemente para remover as células, em seguida, ressuspender em 5 ml de meio de cultura.
- Contar as células por adição de 12 ul de células ressuspensas em um hemocitómetro.
- células da placa em pratos ou lamelas de câmaras de imagem confocal.
NOTA: Estes terão um fundo de plástico ou de vidro adequado que tenha sido desenvolvido para utilização com microscópios invertidos. - células da placa de modo them ~ 80% de confluência é alcançada no dia da imagiologia. Por exemplo, cerca de 2 x 10 células de osteossarcoma 4 143B pode ser plaqueadas em um poço de uma corrediça de 8 poços um dia antes da câmara de imagiologia.
- Incubar as células durante a noite a 37 ° C / 5% de CO2 para permitir que as células fixar e recuperar.
2. Tampões para TMRM e Fluo-4 Imagem
- Prepare ficha Solução (RS) contendo NaCl 156 mM, KCl a 3 mM, MgSO 4 2 mM, 1,25 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de D-glucose, CaCl2 e 10 mM de HEPES 2 mM pH 7,35. Armazene RS em alíquotas a -20 ºC.
- Prepare intracelular médio (IM) contendo NaCl 6 mM, KCl 130 mM, MgCl 7,8 mM, 2, mM de KH 2 PO 4, mM CaCl 0,4 2, EGTA 2 mM, HEDTA 10 mM, malato 2 mM, glutamato 1 mM 2, 2 mM ADP e 20 mM de HEPES pH 7,1. 200 mM de soluções de reserva de malato, o glutamato e o ADP pode ser preparado separadamente, aliquotados, e armazenados a -20 ° C. estes stocks podem ser adicionados ao IM imediatamente antes da utilização.
- Ca 2+ solução salina tamponada de Hank livre de (HBSS) pode ser obtida pré-preparados a partir de fornecedores comerciais. Adicionar ácido etilenoglicol-bis (éter β-aminoetil) -N, N, N ', N' -tetra-acético (EGTA) para uma concentração final de 500 uM.
- Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM) em metanol a 100%. Deste estoque, fazer um estoque de trabalho de 2 M em H2O destilada
- Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de Verapamil em 100% de etanol.
- Prepare 1 mg / ml (p / v) solução stock de Fluo-4 éster de acetoximetilo (Fluo-4, AM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
NOTA: Fluo-4, AM é um indicador de cálcio que exibe aumento da fluorescência mediante Ca 2+ vinculativo. Fluo-4 é um análogo de fluo-3, com os dois substituintes de cloro substituídos por átomos de flúor. Isto resulta num aumento da excitação de fluorescência a 488 nm e os níveis de sinal de fluorescência mais elevados. ogrupo éster AM resulta numa Fluo-4 molécula não carregada que pode permear as membranas celulares. Uma vez dentro da célula, o éster de AM é clivada por esterases inespecíficas, resultando numa forma carregada de Fluo-4, que está preso no interior da célula. - Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de p-carbonil cianeto Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) em etanol a 100%.
- Prepara-se uma solução estoque de 25 mg / ml (w / v) de digitonina em H2O destilada
- Prepara-se uma solução stock de 100 uM em DMSO tapsigargina.
- Prepara-se uma solução estoque de 40 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) em H2O destilada
3. A coloração de células com TMRM e Fluo-4, AM
- Preparar a solução de coloração RS com 20 nM de TMRM, 5 ug / ml (w / v) de Fluo-4, AM e 0,005% de tensioactivo, tal como Pluronic F-127 em RS.
NOTA: Este agente tensioactivo não iónico é um poliol que facilita a solubilização de Fluo-4, AM. Nota: 10 uM verapamil também pode ser adicionado à inhibit TMRM exportação pelo transportador multidroga membrana plasmática se for expresso no tipo celular a ser analisado. - Remover o meio de cultura de células com uma pipeta e lava-se com 100 ul de PBS 1x.
- Remover PBS 1x com uma pipeta e incubar as células na solução de coloração RS 250 uL durante 45 min à temperatura ambiente.
Observação: Uma vez que o Fluo-4, AM entra na célula, o éster de AM é clivada por esterases celulares. A incubação à temperatura ambiente inibe a actividade de esterase, permitindo Fluo-4, AM para introduzir as mitocôndrias. - Remova a solução RS coloração com uma pipeta e lavar as células em 100 ul de Ca2 + livre HBSS para remover o excesso de Fluo-4, AM e TMRM.
- Prepare solução de imagem primário com 25 ug / ml digitonina (v / w), 200 nM TMRM e 1 PM thapsigargin no IM.
NOTA: A concentração de digitonina pode necessitar de ser ajustada para assegurar que a permeabilização da membrana interna mitocondrial não ocorre. Isto pode ser determinado empiricamente através da avaliação da intensidadedo sinal de TMRM em diferentes concentrações de digitonina. - Remover o Ca2 + livre HBSS por pipeta e adicionar 300 ul de solução de imagem IM para as células. Deixar células para equilibrar à temperatura ambiente durante 10 min. As células são agora pronto para geração de imagens com CaCl 2 adições.
Imagem 4. celular
- Coloque prato ou lamela câmaras com células em solução de imagem IM em um microscópio confocal de varredura a laser invertido.
- Use a configuração sobre os lasers de microscópio para a excitação e emissão espectros de TMRM e Fluo-4. Por exemplo, use 543 nm He-Ne e 473 nm linhas de laser de argônio para excitar TMRM e Fluo-4, respectivamente. Utilizar uma fonte de laser de baixa de cerca de 5% a minimizar qualquer foto-dano para as células.
- Definir microscópio para digitalizar imagens a cada 25 seg. células de digitalização durante 10 min para estabelecer as leituras da linha de base para o TMRM e Fluo-4 sinais.
NOTA: O sinal de Fluo-4 pode ser fraco ou indetectável no descanso concent cálciorações. - Adicione 3 mL de solução de estoque 40 mM de CaCl2 directamente para as células em 300 ul de solução de imagem IM (uma diluição 1: 100) e misturar cuidadosamente com uma pipeta. Pausar a digitalização de imagem, enquanto a adição e mistura do CaCl 2, se necessário.
NOTA: O Ca2 + livre concentração de íons final [Ca 2+] na solução de imagem IM pode ser calculada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou quelante 11. Uma descrição detalhada de como calcular o Ca 2+ concentração final íon livre [Ca 2+] é descrito no ponto 6 abaixo. - Continuar a digitalização de imagens para aproximadamente 4 min, em seguida, repita CaCl 2 adições a cada 4 min até o TMRM desejado ou Fluo-4 sinais são alcançados, geralmente em torno de 8 a 10 adições.
- Usando uma pipeta, adicionar uma diluição 1: 100 de FCCP 1 mM (final Concentration de 10 uM) directamente para as células para dissipar ΔΨ m. células de imagem por mais 5 min. O experimento foi concluída.
Análise 5. Imagem
- Depois de imagem estiver concluído, determinar a intensidade dos sinais de Fluo-4 e TMRM usando o software de análise de imagem, por exemplo software ImageJ com o plugin Bio-Formatos (download 'bioformats_package.jar' do http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / e guardá-lo no "C: Program Files ImageJ plugins 'pasta).
- Abra o arquivo de imagem (por exemplo, um arquivo de .oif) em ImageJ. Clique na ferramenta de seleção e selecione uma região de interesse (ROI) que contém mitocôndrias. Use o sinal TMRM inicial para selecionar o ROI.
- Abrir "Analisar> Ferramentas> ROI Manager ', clique em' Adicionar 'para incluir o ROI selecionados para medição da intensidade. Várias ROIs pode ser seleccionado de uma única imagem para medição. etapas anteriores Repita até que todos ROIs foram adicionados ao Gestor de ROI.
- Clique em "Mais> Medida multi ', certifique-se de que" Medir todas as fatias' é selecionado e que "uma linha por Slice 'não está selecionada, clique em' OK 'para obter uma tabela de intensidade de fluorescência média das TMRM e fluo-4 sinais para cada ROI em cada ponto de tempo.
- Use dados de todos os ROIs para calcular as intensidades média e desvio padrão para o TMRM e Fluo-4 sinais.
6. Cálculo do final gratuito Ca2 + Ion Concentração [Ca 2+]
- A concentração de Ca2 + íon livre [Ca 2+] na solução de imagem IM pode ser determinada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou quelante 11. Por exemplo, definir as variáveis em WEBMAXC prolongada da seguinte maneira: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, força iónica = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca2 + H = 0,0004 e = 0,0078 Mg 2+ M. Isto resulta num livre de Ca 2+ concentração final de iões de [Ca 2+] de 62 nM . Note-se que estes programas não podem ter em conta todas as variáveis, tais como a pureza de reagente, a precisão das medições e determinação do pH. O método mais preciso para a determinação da concentração de Ca2 + livre é a utilização de um eléctrodo de Ca 2+ calibrado selectiva.
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Representative Results
Nós temos usado este protocolo para examinar os efeitos de uma mutação MT-ND5 sobre a capacidade das mitocôndrias de células 143B para o buffer aumenta em cálcio 12. No exemplo mostrado aqui, células 143B de controlo foram carregadas com Fluo-TMRM e 4, antes de SOU permeabilização com digitonina. Após 5 min de imagiologia, oito adições sequenciais de uma diluição 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foram feitos, com o Ca 2+ concentração final de iões livres [Ca2 +] calculado.
Após cada adição de CaCl2, o sinal de TMRM diminui à medida que o influxo de Ca 2+ para as mitocôndrias dissipa a membrana mitocondrial potencial ΔΨ M (Figura 1). ΔΨ m seguida, recupera como respiração é aumentada para manter ΔΨ m. Isto ocorre quatro vezes após cada CaCl
A concentração de cálcio mitocondrial (sinal de Fluo-4) começa a aumentar após a segunda adição de CaCl2, quando o livre [Ca 2+] nos meios atinge 0.32 uM (Figura 2). Cada subsequente adição de CaCl2 causou um aumento progressivo no ccio mitocondrial.
Imagens das medições simultâneas de ΔΨ m (TMRM, sinal vermelho) e cálcio mitocondrial (Fluo-4, sig verdenal) são mostrados (Figura 3).
Figura 1: Medição da mitocondrial ΔΨ M em digitonina permeabilizadas células 143B usando TMRM. células 143B foram pré-carregado com Fluo-4, AM e TMRM antes de permeabilização com digitonina. Uma diluição de 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foi adicionado em alíquotas sequenciais. A livre final [Ca 2+] nos meios de comunicação é indicado para cada adição (*). FCCP foi adicionado a uma concentração final de 10 uM, após aproximadamente 40 min. ΔΨ m é mostrado a vermelho, representado pela intensidade relativa (RI) do sinal de TMRM. Dados é média ± sd n = 3. Figura é adaptado com permissão de referência de 12. Por favor clique aqui para ver uma versio maiorn desta figura.
Figura 2: Medição de ccio mitocondrial em células 143B digitonina permeabilizadas utilizando Fluo-4, AM. células 143B foram pré-carregado com Fluo-4, AM e TMRM antes de permeabilização com digitonina. Uma diluição de 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foi adicionado em alíquotas sequenciais. A livre final [Ca 2+] nos meios de comunicação é indicado para cada adição (*). FCCP foi adicionado a uma concentração final de 10 uM, após aproximadamente 40 min. cálcio mitocondrial é mostrado em verde, representado pela intensidade relativa (RI) do sinal de Fluo-4. Dados é média ± sd n = 3. Figura é adaptado com permissão de referência de 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medição simultânea de cálcio mitocondrial e ΔΨ m em digitonina permeabilizadas células 143B utilizando Fluo-4, AM e TMRM. células 143B foram pré-carregado com Fluo-4, AM e TMRM antes de permeabilização com digitonina. Uma diluição de 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foi adicionado em alíquotas sequenciais. A livre final [Ca 2+] nos meios de comunicação é indicado para cada adição. Imagens confocal representativas que mostram a coloração simultânea de ΔΨ m (TMRM, vermelho) e cálcio mitocondrial (Fluo-4, verde). Note-se que o sinal de Fluo-4 é difícil de detectar, na concentração de cálcio em repouso de 0,062 uM. barras de escala Branco = 10 uM. Figura é adaptado com permissão de referência de 12.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O cálcio desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a contracção do músculo, sinalização neuronal e a proliferação celular 13. Aumentos nas concentrações de cálcio celular são frequentemente associados com a demanda de energia, com o cálcio capaz de estimular diretamente a fosforilação oxidativa mitocondrial para aumentar a geração de ATP 3. Portanto, é essencial que nós temos a capacidade de controlar eficazmente o acúmulo de cálcio mitocondrial e para ser capaz de comparar a forma como esta função é afetada por fatores genéticos e agentes farmacológicos.
As etapas críticas no âmbito do protocolo
Este protocolo descreve a capacidade de monitorizar a acumulação de cálcio e mitocôndrias ΔΨ m simultaneamente com Fluo-4, AM e TMRM. Durante o processo de coloração é crítica para incubar as células à temperatura ambiente para optimizar a eficácia de Fluo-4, AM para detectar mitocondrialcálcio. A incubação à temperatura ambiente, reduz a actividade das esterases citossólicas, permitindo que a descarregada Fluo-4, AM para atravessar as membranas mitocondriais e entrar na matriz mitocondrial. Por outro lado, a incubação a 37 ° C aumenta a actividade de esterase no citosol, clivagem do éster AM para deixar um corante Fluo-4 carregada que não iria ser capaz de atravessar as membranas mitocondriais eficazmente.
Uma vez que a coloração de células foi realizada, as células são imersas na solução de imagem IM. Esta solução tem uma concentração de TMRM superior em comparação com a solução inicial RS coloração. Agora que as células são permeabilizadas, a TMRM não equilibra-se através da membrana plasmática. Portanto, a concentração TMRM é gerado na solução IM de imagem para atingir o equilíbrio correcto através da membrana interna mitocondrial. Também é fundamental nesta fase para incluir thapsigargin na solução de imagem IM. Thapsigargin bloqueia o retículo endoplasmático (ER) Ca 2+ ATPase, assegurando que o sinal de Fluo-4 não está a detectar ER cálcio.
Modificações e solução de problemas
Alguns tipos de células pode expressar o transportador de resistência a múltiplos fármacos (também conhecido como MDR1 ou P-glicoproteína) nas suas membranas plasmáticas. Esta proteína é conhecida para exportar indicadores fluorescentes, incluindo derivados de éster AM, desde o citosol para fora da célula 14. Se o transportador é expressa, tanto Fluo-4, AM e TMRM podem ser exportados a partir do citoplasma da célula, resultando em coloração sub-óptima. Para bloquear este efeito, verapamil pode ser adicionado à solução de coloração RS para bloquear o transportador de resistência a múltiplas drogas, inibindo Fluo-4, AM e TMRM exportação durante o processo de coloração.
Por permeabilizando as células a serem analisadas, Fluo-4, AM pode ser usado para detectar mitocondrial de Ca2 +, sem sinais concorrentes de outros organelos ou o citosol. Rotineiramente usar o DETERGEN não-iônicot digitonina para permeabilização, a uma concentração de 25 ug / ml. Esta concentração pode necessitar de ser ajustada para assegurar que a solubilização das membranas mitocondriais não ocorre. Isto pode ser determinado empiricamente através da avaliação da intensidade do sinal de TMRM em diferentes concentrações de digitonina. Se a concentração de digitonina é demasiado elevada, a membrana mitocondrial será parcialmente solubilizado, reduzindo o sinal de TMRM.
Limitações da técnica
Um dos principais benefícios deste protocolo é que usando Fluo-4, AM para detectar cálcio mitocondrial, TMRM pode ser usado para medir simultaneamente ΔΨ m, com sobreposição espectral insignificante entre os dois corantes. necessidade de garantir a especificidade do Fluo-4 para o cálcio mitocondrial, as células a ser examinada a ser permeabilizadas para eliminar o sinal citosólica Fluo-4. Esta permeabilização é uma limitação desta técnica. Enquanto a solução de imagem IM closely corresponde a força iónica do citossol celular, não pode replicar completamente todos os seus constituintes. Isto pode afectar os resultados se os componentes citosólicos específicos são necessários no sistema experimental a ser examinado. Além disso, como as células são permeabilizadas, o protocolo pode não ser adequado para as experiências mais longas com mais de 1 h.
Significância da técnica em relação a métodos existentes / alternativas
Vários corantes fluorescentes têm sido desenvolvidos para a avaliação de cálcio mitocondrial 8. Estes corantes são simples de usar e pode fornecer dados úteis em um curto espaço de tempo. Enquanto estes corantes se acumulam predominantemente nas mitocôndrias, alguns também podem acumular-se em outros organelos, incluindo lipossomas, ou permanecer no citosol da célula. Portanto, cuidados devem ser tomados para garantir que estes outros sinais não influenciam o sinal de cálcio mitocondrial.
Neste protocolo, mitochondrial de Ca2 + é medida em células permeabilizadas, na presença de tapsigargina. A vantagem desta metodologia é que os sinais de cálcio citosólicos e ER são eliminados. Além disso, a permeabilização permite o uso de Fluo-4, AM para detectar Ca2 + mitocondrial. Fluo-4, AM tem muito pouca sobreposição espectral com TMRM, o que significa que mitocondrial Ca 2+ e ΔΨ m pode ser medir simultaneamente usando esses dois corantes.
Mitochondrial Ca2 + também pode ser medida utilizando repórteres fluorescentes geneticamente codificados 8. Esses repórteres podem ser direcionados para as mitocôndrias, resultando em sinais de Ca2 + mitocondrial específicos. sondas geneticamente codificados devem ser introduzidos nas células em estudo, que em alguns casos pode levar muito tempo e esforço. Por outro lado, o nosso protocolo usa os corantes Fluo-4, AM e TMRM, permitindo a coloração celular rápido e simples de medir mitocondrial Ca
As aplicações futuras ou direções Depois de dominar esta técnica
As mitocôndrias actuam como tampões de cálcio locais para regular as concentrações de cálcio intracelulares e as exigências de energia da célula. Quando este processo é interrompido, a absorção de cálcio mitocondrial excessiva pode induzir a transição de permeabilidade mitocondrial, resultando no colapso da ΔΨ M e a libertação de moléculas pro-apoptóticas que desencadeiam a indução da morte celular 4.
Nós apresentamos um protocolo rápido e direto para o exame do cálcio mitocondrial e sua relação com ΔΨ m e a indução da transição de permeabilidade mitocondrial. Isto pode ser utilizado para investigar a forma como estes parâmetros mitocondriais influenciar patogénese de uma ampla gama de doenças humanas, incluindo diabetes 15 e Age-Relatedcondições de neurodegeneração tais como a doença de Alzheimer e Doença 16 de Parkinson. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para examinar o modo como o cálcio mitocondrial e ΔΨ m são afectadas por defeitos genéticos ou toxinas ambientais, e também a forma como esses efeitos podem ser modulados por terapias ou drogas que têm como alvo as mitocôndrias. Estes tipos de experimentos futuros pode fornecer importantes novos insights sobre o papel que o cálcio mitocondrial desempenha na saúde humana e doenças.
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Acknowledgments
Agradecemos Dr Kirstin Elgass e Dr Sarah Creed de Monash Micro Imaging para assistência técnica, eo Wellcome Trust and Medical Research Council do Reino Unido para apoio financeiro. MMcK é suportado do futuro regime Australian Research Council Fellowship (FT120100459), o Buckland Fundação William, O mitocondrial Disease Foundation australiano (AMDF), O Instituto Hudson de Pesquisa Médica e da Universidade de Monash. Este trabalho foi apoiado pelo regime de apoio infra-estrutura operacional Governo de Victoria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
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