Summary
يمكن الميتوكوندريا الاستفادة من إمكانات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (Δ Ψm) لعزل الكالسيوم (الكالسيوم 2+)، مما يتيح لهم تشكيل الكالسيوم عصاري خلوي 2+ يشير داخل الخلية. نحن تصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص وΔΨ م في الخلايا الحية باستخدام الأصباغ الفلورية والفحص المجهري متحد البؤر.
Abstract
وبصرف النظر عن دورها الأساسي في توليد اعبي التنس المحترفين، تعمل الميتوكوندريا أيضا الكالسيوم المحلي (كا 2+) مخازن لتنظيم بإحكام داخل الخلايا تركيز الكالسيوم 2+. للقيام بذلك، الميتوكوندريا الاستفادة من الإمكانيات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (ΔΨ م) إلى عزل الكالسيوم 2+. تدفق الكالسيوم 2+ في الميتوكوندريا يحفز ثلاثة أنزيم نازع للهيدروجين معدل الحد من دورة حمض الستريك، وزيادة نقل الإلكترون من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) المجمعات. يحافظ هذا التحفيز ΔΨ م، التي تبدد مؤقتا على أيونات الكالسيوم إيجابية تعبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في مصفوفة الميتوكوندريا.
نحن هنا وصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص وΔΨ م في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري. بواسطة permeabilizing الخلايا، والكالسيوم الميتوكوندريا 2+ يمكنيتم قياسها باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ مؤشر فلوو-4، صباحا، مع قياس ΔΨ م باستخدام tetramethylrhodamine صبغة الفلورسنت، استر الميثيل، فوق كلورات (TMRM). الاستفادة من هذا النظام هو أن هناك القليل جدا من التداخل الطيفي بين الأصباغ الفلورية، مما يتيح القياس الدقيق للالميتوكوندريا الكالسيوم 2+ وΔΨ م في وقت واحد. عن طريق إضافة متتابعة من الكالسيوم 2+ قسامات، كاليفورنيا الميتوكوندريا 2+ امتصاص يمكن رصدها، والتركيز الذي كا 2+ يدفع الميتوكوندريا الانتقال نفاذية الأغشية وفقدان ΔΨ م تحديدها.
Introduction
الميتوكوندريا تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا تركيز الكالسيوم 2+ من خلال العمل كحلقة المحلية الكالسيوم 2+ مخازن 1. كاليفورنيا 2+ يدخل الميتوكوندريا عبر uniporter كاليفورنيا 2+، وهي عملية يقودها التدرج الكهروكيميائية موجود عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا (ΔΨ م) 2. مرة واحدة داخل المصفوفة الميتوكوندريا، كاليفورنيا 2+ يمكن تنشيط الفسفرة التأكسدية من خلال تحفيز ثلاثة أنزيم نازع للهيدروجين معدل الحد من دورة حمض الستريك 3. يحافظ هذا التحفيز ΔΨ م، التي تبدد مؤقتا على أيونات الكالسيوم إيجابية تعبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في مصفوفة الميتوكوندريا. إذا كا 2+ تركيز داخل الميتوكوندريا يصبح عالية جدا، ويمكن البدء في الانتقال نفاذية الميتوكوندريا، مما أدى إلى تبديد ΔΨ م، وcessatioن من الفسفرة التأكسدية وتحريض موت الخلايا مسارات الإشارات 4.
الدور الهام الذي تلعبه الميتوكوندريا في التخزين المؤقت المكاني من الكالسيوم الخلوي يجعل رصد دقيق من الكالسيوم الميتوكوندريا حرجة. وقد وضعت أساليب مختلفة لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا، بما في ذلك استخدام الأصباغ القائمة على رودامين. واحدة من هذه الصبغة، Rhod-2، صباحا، هو فعال جدا في التقسيم إلى الميتوكوندريا لقياس الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ مستويات 5 و 6. ومع ذلك، يجب توخي الحذر لأن بعض صبغ سوف تتراكم في عضيات أخرى مثل الجسيمات الشحمية، أو البقاء في العصارة الخلوية الخلية. ومع ذلك، تحليلات المصب ويمكن استخدام لتمييز هذه الإشارات من تلك الموجودة في الميتوكوندريا 7.
أسلوب آخر لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا تستخدم مراسل فلوري يبني 8 تصل>. ويستفيد من هذه المجسات المشفرة وراثيا هي أنها يمكن أن تستهدف على وجه التحديد إلى الميتوكوندريا باستخدام الببتيدات-N محطة الذاتية، على سبيل المثال إشارة استهداف N-الطرفية من البشر كوكس فرعية الثامن. واستخدمت هذا النظام لإنشاء مسبار aequorin استهداف الميتوكوندريا التي أثبتت مفيدة للغاية لتحقيق الكالسيوم الميتوكوندريا مما يشير إلى 9. العيب الرئيسي لهذه التحقيقات المشفرة وراثيا هو أنها تحتاج إلى إدخالها في الخلايا عن طريق التعبير عابر (وهو ليس ممكنا بالنسبة لأنواع الخلايا معينة، ويمكن أن تؤدي إلى نتائج متغيرة) أو عن طريق إنشاء نظم التعبير مستقرة (والذي هو مضيعة للوقت).
الالتفاف على المشاكل المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير بروتوكول جديد لقياس الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ وΔΨ م في وقت واحد. ويستند هذا البروتوكول على الطريقة الموصوفة سابقا أن يضيف الكالسيوم دخيلة على الخلايا permeabilizedالصورة = "XREF"> 10. بروتوكول لدينا ثلاثة المزايا الرئيسية مقارنة مع الطرق الأخرى: أولا، ونحن نستخدم فلوو-4، صباحا وTMRM لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا 2+ وΔΨ م، وهما الأصباغ التي لها خصائص طيفية مميزة جدا. ثانيا، وpermeabilized الخلايا بحيث إشارة فلوو-4 ويكتشف فقط الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ وليس كا 2+ المترجمة إلى العضيات الأخرى أو العصارة الخلوية الخلية؛ وثالثا، استخدام فلوو-4 لكشف الكالسيوم الميتوكوندريا 2+ يسمح سريعة وبسيطة تلطيخ الخلية، ويلغي أي قضايا ترنسفكأيشن الخلية أو التحول التي توجد في حالة استخدام تحقيقات المشفرة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الخلايا
- تنمو الخلايا على أطباق زراعة الخلايا 10 سم أو 75 سم 2 قوارير في وسائل الإعلام والثقافة [10 مل التعديل النسور Dulbecco والمتوسطة (DMEM) تستكمل مع 5٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و1X البنسلين / الستربتومايسين (ص / ق )] في 37 ° C / 5٪ CO 2.
- حصاد الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام التي كتبها الطموح، ثم يغسل مع 5 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني 1X). إزالة برنامج تلفزيوني 1X بواسطة الشفط، ثم يضاف 1.5 مل 0.25٪ (ث / ت) التربسين / 0.25٪ (ث / ت) ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 2 دقيقة. الاستفادة من طبق أو قارورة برفق لإزالة الخلايا resuspend ثم في وسائل الإعلام ثقافة 5 مل.
- عد الخلايا عن طريق إضافة 12 ميكرولتر من الخلايا معلق على عدادة الكريات.
- لوحة الخلايا في أطباق أو coverslips غرف للتصوير متحد البؤر.
ملاحظة: هذه لديها من البلاستيك أو الزجاج أسفل مناسبة والتي تم تصميمها للاستخدام مع المجاهر المقلوب. - لوحة الخلايا حتى عشرفي ~ يتحقق 80٪ confluency في يوم التصوير. على سبيل المثال، ما يقرب من 2 × 10 4 خلايا عظمية 143B يمكن مطلي في بئر واحدة من 8 جيدا الشرائح الغرفة يوم واحد قبل التصوير.
- احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 للسماح للخلايا لنعلق والتعافي.
2. المخازن لTMRM وفلوو-4 التصوير
- إعداد الحل سجل (RS) التي تحتوي على 156 ملي مول كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 2 ملي MgSO 4، 1.25 ملي KH 2 PO 4، 10 ملم مد الجلوكوز، 2 مم CaCl 2 و 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.35. متجر RS في aliquots في -20 درجة مئوية.
- إعداد بين الخلايا المتوسطة (IM) التي تحتوي على 6 مم كلوريد الصوديوم، و 130 ملي بوكل، 7.8 ملي MgCl 2، 1 ملم KH 2 PO 4، 0.4 ملي CaCl 2، 2 مم EGTA، 10 ملي HEDTA، 2 مم مالات، 2 مم الغلوتامات، 2 مم شرطة أبوظبي و 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.1. 200 الحلول الأسهم ملم من مالات، الغلوتامات وADP يمكن إعداد بشكل منفصل، aliquoted، وتخزينها في -20 درجة مئوية. هذه الحاديويمكن أن يضاف ocks إلى IM فقط قبل الاستخدام.
- كاليفورنيا مجانا 2+ هانك في محلول الملح مخزنة (HBSS) ويمكن الحصول على معدة سلفا من الموردين التجارية. إضافة جلايكول الإثيلين مكرر (β-aminoethyl الأثير) -N، N، N '، حمض N' tetraacetic (EGTA) إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر.
- يعد حل الأسهم من 10 ملي tetramethylrhodamine، استر الميثيل، فوق كلورات (TMRM) في الميثانول بنسبة 100٪. من هذا المخزون، وجعل مخزون العمل من 2 ميكرومتر في H المقطر 2 O.
- يعد حل الأسهم من 10 ملي فيراباميل في الإيثانول بنسبة 100٪.
- إعداد 1 ملغ / مل (ث / ت) حل سهم فلوو-4 acetoxymethyl استر (فلوو-4، ص) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]).
ملاحظة: فلوو-4، صباحا هو مؤشر الكالسيوم التي يسلك زيادة مضان على ربط الكالسيوم 2+. فلوو-4 هو التناظرية من فلوو-3، مع بدائل الكلور اثنين من يحل محله الفلورين. هذا يؤدي إلى زيادة الإثارة مضان في 488 نانومتر، وأعلى مستويات إشارة مضان. النتائج AM استر الجماعة في بدون تهمة فلوو-4 الجزيء الذي يمكن أن تتخلل أغشية الخلايا. مرة واحدة داخل الخلية، هو المشقوق استر AM بواسطة المونوأمينوأوكسيداز غير محددة، مما أدى إلى شكل بتهمة فلوو-4 الذي محاصرين داخل الخلية. - إعداد محلول المخزون من 1 ملم الكربونيل السيانيد ف trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) في الإيثانول بنسبة 100٪.
- إعداد محلول المخزون من 25 ملغ / مل (ث / ت) ديجيتونين في H المقطر 2 O.
- إعداد محلول المخزون من 100 thapsigargin ميكرومتر في DMSO.
- إعداد محلول المخزون 40 ملي كلوريد الكالسيوم (CaCl 2) في H المقطر 2 O.
3. تلطيخ الخلايا مع TMRM وفلوو-4، AM
- يعد حل RS تلطيخ مع 20 نانومتر TMRM، 5 ميكروغرام / مل (ث / ت) فلوو-4، صباحا و0.005٪ السطحي مثل Pluronic F-127 في RS.
ملاحظة: هذه السطحي هو بوليول غير أيوني أن يسهل ذوبان من فلوو-4، ص. ملاحظة: يمكن أيضا إضافة 10 ميكرومتر فيراباميل لinhibiتصدير ر TMRM قبل نقل غشاء البلازما المتعددة إذا تم التعبير عن ذلك في نوع من الخلايا التي يجري تحليلها. - إزالة سائل الإعلام والثقافة من الخلايا عن طريق ماصة، ويغسل مع 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
- إزالة برنامج تلفزيوني 1X بواسطة ماصة واحتضان خلايا في 250 ميكرولتر حل RS تلطيخ لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: مرة واحدة في فلوو-4، AM يدخل الخلية، هو المشقوق استر AM بواسطة المونوأمينوأوكسيداز الخلوية. تفرخ في درجة حرارة الغرفة يثبط النشاط استريز، مما يسمح فلوو-4، صباحا لدخول الميتوكوندريا. - إزالة حل RS تلطيخ بواسطة ماصة وغسل الخلايا في 100 ميكرولتر الكالسيوم 2+ مجانا HBSS لإزالة الزائد فلوو-4، صباحا وTMRM.
- إعداد IM حل التصوير مع 25 ميكروغرام / مل (ث / ت) ديجيتونين، 200 نانومتر TMRM و1 thapsigargin ميكرومتر في الدردشة.
ملاحظة: قد تحتاج تركيز ديجيتونين إلى تعديل لضمان permeabilization الغشاء الداخلي الميتوكوندريا لا يحدث. وهذا يمكن أن تحدد تجريبيا من خلال تقييم كثافةللإشارة TMRM بتركيزات مختلفة من ديجيتونين. - إزالة الكالسيوم 2+ مجانا HBSS بواسطة ماصة وإضافة 300 ميكرولتر من محلول التصوير IM إلى الخلايا. ترك الخلايا لتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. الخلايا هي الآن جاهزة للتصوير مع CaCl 2 إضافات.
التصوير 4. خلية
- وضع طبق أو غرف ساترة مع الخلايا في حل التصوير IM على مجهر متحد البؤر مقلوب المسح بالليزر.
- استخدام الإعداد على أشعة الليزر المجهر لالإثارة وانبعاث أطياف TMRM وفلوو-4. على سبيل المثال، استخدم 543 نانومتر وني وخطوط 473 الأرجون ليزر نانومتر لإثارة TMRM وفلوو-4 على التوالي. استخدام طاقة الليزر المنخفضة ما يقرب من 5٪ للحد من أي الصور والأضرار التي لحقت الخلايا.
- تعيين المجهر لمسح الصور كل 25 ثانية. خلايا المسح الضوئي لمدة 10 دقيقة لإقامة قراءات أساسية لTMRM وفلوو-4 إشارات.
ملاحظة: إشارة فلوو-4 قد يكون ضعيفا أو لا يمكن الكشف عنها في يستريح تناسق الكالسيومحصص. - إضافة 3 ميكرولتر من 40 ملي CaCl 2 حل الأسهم مباشرة إلى الخلايا في 300 ميكرولتر من محلول التصوير IM (التخفيف 1: 100) وتخلط بلطف مع ماصة. وقفة مسح صورة مع إضافة وخلط CaCl 2 إذا لزم الأمر.
ملاحظة: مجانا الكالسيوم 2+ تركيز أيون النهائي [كا 2+] في حل التصوير IM يمكن حسابها باستخدام برامج مثل Maxchelator WEBMAXC الموسعة ( http://www.stanford.edu/٪7Ecpatton/maxc.html ) أو خالب 11. وصف مفصل لكيفية حساب مجانا الكالسيوم 2+ تركيز أيون النهائي [كا 2+] يوصف في القسم 6 أدناه. - متابعة المسح الضوئي على الصورة لحوالي 4 دقائق، ثم كرر CaCl 2 إضافات كل 4 دقائق حتى TMRM المطلوبة أو فلوو-4 الإشارات التي تم التوصل إليها، وعادة حوالي 8-10 الإضافات.
- باستخدام ماصة، إضافة التخفيف 1: 100 1 ملم FCCP (ج النهائيةoncentration من 10 ميكرومتر) مباشرة إلى الخلايا لتبديد ΔΨ م. خلايا صورة لمدة 5 دقائق إضافية. الانتهاء من التجربة الآن.
تحليل 5. صورة
- مرة واحدة التصوير اكتمال، وتحديد كثافة إشارات فلوو-4 و TMRM باستخدام برمجيات تحليل الصور، للحصول على البرنامج المثال يماغيج مع البرنامج المساعد بيو تنسيقات (تنزيل "bioformats_package.jar" من http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / وحفظه في: المجلد "C الإضافات ملفات البرنامج يماغيج ').
- فتح ملف التصوير (على سبيل المثال ملف .oif) في ImageJ. انقر على أداة التحديد واختر المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي يحتوي على الميتوكوندريا. استخدام إشارة TMRM الأولية لتحديد العائد على الاستثمار.
- فتح 'تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار "، انقر فوق' إضافة 'لتشمل العائد على الاستثمار التي اختيرت لقياس كثافة. يمكن اختيار رويس متعددة على صورة واحدة للقياس. الخطوات السابقة كرر حتى عن العائد على الاستثمارتم إضافة الصورة إلى مدير العائد على الاستثمار.
- انقر على "المزيد> قياس متعددة، تأكد من أن" قياس جميع شرائح 'تم اختياره وهذا صف واحد لكل شريحة "سيتم إلغاء، ثم انقر فوق" موافق "للحصول على جدول كثافة الفلورسنت يعني من TMRM وفلوو-4 إشارات لكل العائد على الاستثمار في كل نقطة زمنية.
- استخدام البيانات من جميع رويس لحساب متوسط الشدة والانحراف المعياري لTMRM وفلوو-4 إشارات.
6. حساب الختامي 2+ الكالسيوم الحرة ايون تركيز [كا 2+]
- حرية الكالسيوم 2+ تركيز أيون [كا 2+] في حل التصوير IM يمكن تحديد باستخدام برنامج مثل Maxchelator WEBMAXC الموسعة ( http://www.stanford.edu/٪7Ecpatton/maxc.html ) أو خالب 11. على سبيل المثال، تعيين المتغيرات في WEBMAXC ممتدة على النحو التالي: درجة الحرارة = 24 درجة مئوية، ودرجة الحموضة = 7.1، أيوني قوة = 0.162، EGTA = 0.002 M، HEDTA = 0.01 م، كا 2+ = 0.0004 M والمغنيسيوم 2+ = 0،0078 م. وهذا يؤدي إلى حر كا 2+ التركيز النهائي أيون [كا 2+] من 62 نانومتر . نلاحظ أن هذه البرامج لا يمكن أن تأخذ في الاعتبار كل متغير، مثل نقاء الكاشف، دقة القياسات وتحديد درجة الحموضة. الطريقة الأكثر دقة لتحديد المجاني تركيز الكالسيوم 2+ هو استخدام الكالسيوم معايرة 2+ القطب الانتقائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة الآثار المترتبة على الطفرة MT-ND5 على قدرة الميتوكوندريا خلية 143B لتخفيف الزيادة في الكالسيوم 12. في المثال الموضح هنا، تم تحميل خلايا 143B السيطرة مع TMRM وفلوو-4، صباحا قبل permeabilization مع ديجيتونين. بعد 5 دقائق من التصوير، وثمانية الإضافات متسلسلة من 1: قدمت 100 تمييع 40 ملي الخارجية CaCl 2، مع حرية تركيز أيون الكالسيوم 2+ النهائي [كا 2+] المحسوبة.
وبعد كل إضافة CaCl 2، يقلل من إشارة TMRM كما تدفق الكالسيوم 2+ الأيونات في الميتوكوندريا تبدد الميتوكوندريا الغشاء المحتملين ΔΨ م (الشكل 1). ثم يسترد ΔΨ م كما هو زيادة التنفس للحفاظ على ΔΨ م. يحدث هذا أربع مرات بعد كل CaCl
تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا (فلوو-4 إشارة) يبدأ في زيادة بعد الثانية CaCl 2 بالإضافة عندما المجاني [كا 2+] في وسائل الإعلام تصل إلى 0.32 ميكرومتر (الشكل 2). تسبب كل لاحقة CaCl 2 إضافة الزيادة التدريجية في الكالسيوم الميتوكوندريا.
صور من القياسات في وقت واحد من ΔΨ م (TMRM، إشارة حمراء) والكالسيوم الميتوكوندريا (فلوو-4، سيج الأخضرنال) وعرض (الشكل 3).
الشكل 1: قياس الميتوكوندريا ΔΨ م في ديجيتونين permeabilized 143B الخلايا باستخدام TMRM. تم مسبقة خلايا 143B مع فلوو-4، صباحا وTMRM قبل permeabilization مع ديجيتونين. تم إضافة 100 تمييع 40 ملي الخارجية CaCl 2 في قسامات متتابعة: A 1. الحرة نهائي [كا 2+] في وسائل الإعلام هو مبين لكل بالإضافة (*). وأضاف FCCP إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر بعد حوالي 40 دقيقة. يظهر ΔΨ م باللون الأحمر، ممثلة في والكثافة النسبية (RI) للإشارة TMRM. البيانات هي يعني ± يتم تكييف التنمية المستدامة ن = 3. الشكل بإذن من المرجع 12. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصدارات ن من هذا الرقم.
الشكل 2: قياس الكالسيوم الميتوكوندريا في ديجيتونين permeabilized 143B الخلايا باستخدام فلوو-4، ص. تم مسبقة خلايا 143B مع فلوو-4، صباحا وTMRM قبل permeabilization مع ديجيتونين. تم إضافة 100 تمييع 40 ملي الخارجية CaCl 2 في قسامات متتابعة: A 1. الحرة نهائي [كا 2+] في وسائل الإعلام هو مبين لكل بالإضافة (*). وأضاف FCCP إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر بعد حوالي 40 دقيقة. يظهر الكالسيوم الميتوكوندريا باللون الأخضر، ممثلة في والكثافة النسبية (RI) للإشارة فلوو-4. البيانات هي يعني ± يتم تكييف التنمية المستدامة ن = 3. الشكل بإذن من المرجع 12. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
SS = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 3: القياس في وقت واحد من الكالسيوم الميتوكوندريا وΔΨ م في ديجيتونين permeabilized 143B الخلايا باستخدام فلوو-4، صباحا وTMRM. تم مسبقة خلايا 143B مع فلوو-4، صباحا وTMRM قبل permeabilization مع ديجيتونين. تم إضافة 100 تمييع 40 ملي الخارجية CaCl 2 في قسامات متتابعة: A 1. الحرة نهائي [كا 2+] في وسائل الإعلام هو مبين لكل إضافة. صور مبائر الممثل تظهر تلطيخ وقت واحد من ΔΨ م (TMRM والأحمر) والكالسيوم الميتوكوندريا (فلوو-4 والأخضر). لاحظ أن إشارة فلوو-4 من الصعب كشف في تركيز الكالسيوم يستريح من 0.062 ميكرومتر. الحانات نطاق البيضاء = 10 ميكرون. ويتم تكييف الرقم بإذن من المرجع 12.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكالسيوم يلعب دورا حاسما في العديد من عمليات الخلية، بما في ذلك تقلص العضلات، مما يشير الى العصبية والخلايا انتشار 13. غالبا ما ترتبط الزيادة في تركيز الكالسيوم الخلية مع الطلب على الطاقة، مع الكالسيوم قادرة على تحفيز مباشرة الميتوكوندريا الفسفرة التأكسدية لرفع جيل ATP 3. ولذا فمن الضروري أن يكون لدينا القدرة على رصد فعال تراكم الكالسيوم الميتوكوندريا ولتكون قادرة على مقارنة مدى تأثر هذه الوظيفة من قبل كل من العوامل الوراثية وكلاء الدوائية.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
يصف هذا البروتوكول القدرة على رصد تراكم الكالسيوم الميتوكوندريا وΔΨ م في وقت واحد مع فلوو-4، صباحا وTMRM. أثناء عملية تلطيخ فمن الأهمية بمكان أن احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لتحسين فعالية فلوو-4، صباحا في الكشف عن الميتوكوندرياالكالسيوم. حضانة في درجة حرارة الغرفة يقلل من نشاط المونوأمينوأوكسيداز عصاري خلوي، والسماح للبدون تهمة فلوو-4، صباحا لعبور أغشية الميتوكوندريا وأدخل المصفوفة الميتوكوندريا. على العكس من ذلك، الحضانة عند 37 درجة مئوية يعزز النشاط استريز في العصارة الخلوية، الشق قبالة AM استر لترك اتهم فلوو-4 الصبغة التي لن تكون قادرة على عبور أغشية الميتوكوندريا على نحو فعال.
مرة واحدة وقد تم تنفيذ تلطيخ الخلية، مغمورة الخلايا في حل التصوير IM. هذا الحل لديه تركيز TMRM أعلى بالمقارنة مع الحل الأولي RS تلطيخ. والآن بعد أن تم permeabilized الخلايا، وTMRM لم يعد equilibrates عبر غشاء البلازما. لذلك، يتم رفع تركيز TMRM في حل IM التصوير لتحقيق موازنة صحيحة عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. ومن الأهمية بمكان في هذه المرحلة أيضا لتشمل thapsigargin في حل IM التصوير. Thapsigargin كتل الشبكة الإندوبلازمية (ER) كا 2+ أتباز، وضمان أن إشارة فلوو-4 لا يكتشف ER الكالسيوم.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يمكن لبعض أنواع الخلايا التعبير عن نقل المقاومة للأدوية المتعددة (المعروف أيضا باسم MDR1 أو P-بروتين سكري) على الأغشية البلازما الخاصة بهم. ويعرف هذا البروتين لتصدير المؤشرات الفلورسنت، بما في ذلك AM المشتقات استر، من العصارة الخلوية خارج الخلية 14. إذا يتم التعبير عن نقل، على حد سواء فلوو-4، صباحا وTMRM يمكن تصديرها من العصارة الخلوية الخلية، مما أدى إلى تلطيخ دون المستوى الأمثل. لمنع هذا التأثير، ويمكن أن يضاف فيراباميل إلى حل RS تلطيخ لمنع نقل المقاومة للأدوية المتعددة، مما يعوق فلوو-4، صباحا وTMRM تصدير أثناء عملية التلوين.
بواسطة permeabilizing الخلايا لتحليلها، فلوو-4، صباحا يمكن أن تستخدم لكشف الميتوكوندريا الكالسيوم 2+، مع عدم وجود إشارات المتنافسة من العضيات الأخرى أو العصارة الخلوية. نحن نستخدم بشكل روتيني في detergen غير الأيونيةر ديجيتونين لpermeabilization بتركيز 25 ميكروغرام / مل. قد تحتاج إلى تعديل لضمان ذوبان في الأغشية الميتوكوندريا لا يحدث هذا التركيز. وهذا يمكن أن تحدد تجريبيا من خلال تقييم شدة إشارة TMRM بتركيزات مختلفة من ديجيتونين. إذا كان تركيز ديجيتونين مرتفع جدا، فإن غشاء الميتوكوندريا أن تذوب جزئيا، والحد من إشارة TMRM.
القيود المفروضة على تقنية
واحدة من الفوائد الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه باستخدام فلوو-4، صباحا لكشف الكالسيوم الميتوكوندريا، TMRM يمكن استخدامها لقياس وقت واحد ΔΨ م، مع تداخل الأطياف يذكر بين الأصباغ اثنين. الحاجة لضمان خصوصية فلوو-4 للكالسيوم الميتوكوندريا، والخلايا قيد النظر إلى أن permeabilized للقضاء على عصاري خلوي فلوو-4 إشارة. هذا permeabilization هو واحد الحد من هذه التقنية. في حين أن IM التصوير حل اومهكتبها sely مباريات القوة الأيونية من العصارة الخلوية الخلية، فإنه لا يمكن نسخ تماما لكل مكوناته. قد تؤثر على هذه النتائج إذا هي المكونات المطلوبة عصاري خلوي محددة في نظام تجريبي يجري بحثها. وعلاوة على ذلك، كما permeabilized الخلايا، والبروتوكول قد لا تكون مناسبة لإجراء التجارب أطول أكبر من 1 ساعة.
أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية / البديلة
وقد وضعت العديد من الأصباغ الفلورية لتقييم الكالسيوم الميتوكوندريا 8. هذه الأصباغ هي سهلة الاستخدام ويمكن أن توفر بيانات مفيدة في فترة قصيرة من الزمن. في حين أن هذه الأصباغ تتراكم في الغالب في الميتوكوندريا، بعض يمكن أيضا أن تتراكم في العضيات الأخرى، بما في ذلك الجسيمات الشحمية، أو البقاء في العصارة الخلوية الخلية. ولذلك، يجب الحرص على التأكد من أن هذه الإشارات الأخرى لا تؤثر على إشارة الكالسيوم الميتوكوندريا.
في هذا البروتوكول، mitochondrيقاس الاتحاد العالمي للتعليم الكالسيوم 2+ في الخلايا permeabilized بحضور thapsigargin. وميزة هذه المنهجية هي أن القضاء على إشارات الكالسيوم عصاري خلوي وER. وعلاوة على ذلك، permeabilization يسمح باستخدام فلوو-4، صباحا للكشف عن الميتوكوندريا الكالسيوم 2+. فلوو-4، صباحا لديها القليل جدا من التداخل الطيفي مع TMRM، وهذا يعني أن الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ وΔΨ م يمكن قياس وقت واحد باستخدام هذه الأصباغ اثنين.
الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ كما يمكن قياسها باستخدام صحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا 8. هؤلاء المراسلين يمكن أن تستهدف الميتوكوندريا، مما أدى إلى الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ إشارات محددة. تحتاج إلى إدخالها في الخلايا التي تجري دراستها، والتي في بعض الحالات يمكن أن يستغرق وقتا طويلا وجهدا كبيرا تحقيقات المشفرة وراثيا. على العكس من ذلك، يستخدم بروتوكول لدينا الأصباغ فلوو-4، صباحا وTMRM، والسماح لسريعة وبسيطة خلية تلطيخ لقياس الميتوكوندريا كاليفورنيا
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
عمل الميتوكوندريا كحواجز الكالسيوم المحلية لتنظيم تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا ومتطلبات الطاقة للخلية. عندما تتعطل هذه العملية، يمكن أن الإفراط في امتصاص الكالسيوم الميتوكوندريا حمل الانتقال نفاذية الميتوكوندريا، مما أدى إلى انهيار ΔΨ م والإفراج عن جزيئات الموالية لأفكارك التي تؤدي خلية تحريض وفاة 4.
نقدم بروتوكول سريع ومباشرة إلى الأمام لفحص الكالسيوم الميتوكوندريا وعلاقته ΔΨ م وتحريض الانتقال نفاذية الميتوكوندريا. وهذا يمكن أن تستخدم لمعرفة كيف تؤثر هذه المعايير الميتوكوندريا المرضية في مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك مرض السكري 15 والمتعلقة بالعمرشروط التنكس العصبي مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون (16). وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة كيفية تأثر الكالسيوم الميتوكوندريا وΔΨ متر عن عيوب وراثية أو السموم البيئية، وأيضا كيف أن هذه يؤثر يمكن عن طريق التضمين العلاجات أو الأدوية التي تستهدف الميتوكوندريا. هذه الأنواع من التجارب في المستقبل يمكن أن توفر رؤى جديدة هامة إلى الدور الذي يلعبه الكالسيوم الميتوكوندريا في كل من صحة البشر والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر الدكتور كريستين Elgass والدكتورة سارة العقيدة من جامعة موناش مايكرو التصوير للحصول على المساعدة التقنية، ويلكوم ترست ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة للحصول على الدعم المالي. ويدعم MMcK مجلس البحوث مخطط استراليا المستقبل زمالة (FT120100459)، ومؤسسة وليام باكلاند، مؤسسة أمراض الميتوكوندريا الأسترالية (AMDF)، ومعهد هدسون للأبحاث الطبية وجامعة موناش. وأيد هذا العمل من قبل برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية حكومة فيكتوريا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
