Summary
בעקבות הכנת נוגדן חד-שבטי-modified Cu 64 מחייב לקולטן תא T בעכברים טרנסגניים, תאי T הם רדיואקטיבי in vivo, ניתח עבור כדאיות, פונקציונליות, יציבות תיוג אפופטוזיס, והועברו adoptively לעכברים עם דרכי הנשימה מתעכב מסוג רגישות יתר תגובה עבור הדמיה לא פולשנית של טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים / טומוגרפיה ממוחשבת (PET / CT).
Abstract
פרוטוקול זה ממחיש את הייצור של 64 Cu ואת radiolabeling נטיה / chelator של נוגדנים חד שבטיים (מב) ואחריו תרבית תאים לימפוציטים בעכברים ו 64 Cu-נוגדן לקולטן מיקוד של תאים. בהערכה במבחנה של radiolabel ולא פולשנית ב מעקב תא vivo במודל חיה של תגובת רגישות יתר בדרכי נשימה מתעכב-סוג (DTHR) על ידי PET / CT מתוארים.
בפירוט, הנטייה של מב עם חומצת 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic chelator (DOTA) מוצגת. בעקבות ייצור של 64 Cu רדיואקטיבי, radiolabeling של מב DOTA מצומדות מתואר. הבא, הרחבת ovalbumin עוף (Cova) -specific CD4 + אינטרפרון (IFN) -γ-ייצור תאי T מסייעים (Cova-TH1) ואת radiolabeling עוקבות של תאים Cova-TH1 מתוארים. טכניקות שונות במבחנה ב מוצגות להעריך את EFfects של 64 Cu-radiolabeling על תאים, כגון קביעת כדאיות התא על ידי הרחקה trypan כחול, מכתים עבור אפופטוזיס עם Annexin V עבור זרימת cytometry, ואת ההערכה של פונקציונליות ידי IFN-γ assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) . יתר על כן, קביעת ספיגת רדיואקטיבי לתוך התאים ואת יציבות התיוג מתוארת בפירוט. פרוטוקול זה ממשיך ומתאר כיצד לבצע מחקרי מעקב תא במודל חיה במשך DTHR דרכי נשימה, ולכן, בדומה להשפעה DHTR בדרכי נשימה חריפה הנגרמת Cova בעכברי BALB / ג כלולה. לבסוף, זרימת עבודת PET / CT חזקה כולל רכישת תמונה, שחזור וניתוח מוצגת.
64 גישת מיקוד קולטן Cu-הנוגדן עם הפנמת קולטן עוקבת מספקת סגולית ויציבות גבוהות, רעילויות הסלולר מופחתות, ושיעורים בזרימה נמוכים לעומת PET-קליעים נותבים משותפים תיוג תא, למשל 64 CuBIS -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). לבסוף, הגישה שלנו מאפשרת לא פולשנית למעקב תא vivo על ידי PET / CT עם יחס אות-רקע אופטימלי עבור 48 h. גישה ניסיונית זו ניתן להעביר מודלים שונים של בעלי חיים סוגי תאים עם קולטני קרום הנכנס כי הן הפנימו.
Introduction
מעקב תא לא פולשני הוא כלי תכליתי כדי לפקח תא פונקציה, גירת ביות in vivo. מחקרי מעקב תא שנעשה לאחרונה התמקדו המזנכימה 1, 2 או תאי גזע שמקורם במוח עצם 3 בהקשר של רפואת רגנרטיבית, תאי דם לבנים היקפיים עצמיים דלקת או לימפוציטים מסוג T ב טיפולים בתאי מאמצת נגד סרטן 3, 4. וביאור באתרי הפעולה ואת העקרונות הביולוגיים הבסיסיים של טיפולים מבוססי תאי היא בעלת חשיבות עצומה. לימפוציטים CD8 + T ציטוטוקסיים, מהונדסים גנטיים הקולטן לאנטיגן כימרי (CAR) תאי T או לימפוציטים שחדר-גידול (TILs) נחשבו נרחב כתקן הזהב. עם זאת, אנטיגן ספציפי הקשור לגידול תא TH1 שהוכח מהווה טיפול אלטרנטיבי יעיל 4, </ sup> 5, 6, 7.
כמו שחקני מפתח דלקת, מחלות אוטואימוניות ספציפי איבר (למשל, דלקת מפרקים שגרוניות או אסטמה), ותאים של ריבית גבוהה חיסוני סרטן, חשוב לאפיין את דפוסי הפצת ביות הזמניים של תאי TH1. הדמיה לא פולשנית in vivo על ידי PET מציגה שיטה כמותית, רגישה מאוד 8 לבחון דפוסי נדידת תאים, ב ביות vivo, וכן באתרי פעולת תא T ותגובות בזמן דלקת, אלרגיות, דלקות או גידולי דחייה 9, 10, 11.
מבחינה קלינית, 111 ב-oxine משמש scintigraphy לויקוציטים עבור אפליה של דלקת וזיהום 12, תוך 2-deoxy-2- (18F) fluoro-D-גלוקוז (18 F-FDG) הוא נפוץ ללימודי מעקב התא על ידי 3 PET, 13. חסרון עיקרי אחד נותב PET הזה, לעומת זאת, הוא זמן מחצית החיים הקצר של 18 F רדיונוקלידית ב 109.7 דקות ואת היציבות התאית הנמוכה המונעת הדמיה בנקודות זמן מאוחר לפרסם העברת תא מאמצת. עבור לטווח ארוך יותר במחקרי מעקב תא vivo על ידי PET, למרות יציבה בתאים, 64 Cu-PTSM משמש לעתים קרובות כדי לתייג nonspecifically תאים 14, 15 עם השפעות מזיקות ממוזערות על כדאיויות תא T ולתפקד 16.
פרוטוקול זה מתאר שיטה נוספת להפחית תופעות נחות על כדאיות התא ומתפקדים באמצעות קולטן תא T (TCR) מב רדיואקטיבי -specific. ראשית, הייצור של Cu 64 רדיואיזוטופיים, הנטייה של KJ1-26 מב עם הדואר chelator DOTA, ואת radiolabeling Cu-64 העוקבות מוצגות. בשלב שני, הבידוד הרחב של תאי Cova-TH1 של עכברים תורמים DO11.10 ואת radiolabeling עם 64 Cu-טעון DOTA מצומדות מב KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) מתוארים בפירוט. ההערכה של ערכים ספיגים בזרימה של רדיואקטיביות עם כיל מינון ועל ידי γ-ספירה, בהתאמה, כמו גם את הערכה של ההשפעות של 64 Cu-radiolabeling על כדאיויות תא על ידי הרחקת trypan כחולה ופונקציונלי עם IFN-γ ELISA מוצג . עבור לא פולשנית למעקב תא vivo, ההתמחרות של מודל עכבר של רכישת תמונת DTHR בדרכי נשימה חריפה הנגרמת Cova ידי PET / CT לאחר העברת תא מאמצת מתוארת.
יתר על כן, גישת תיוג זו ניתן להעביר מודלים למחלות שונים, תאי T בעכברים עם TCRs שונה או תאים בכלל עניין עם קולטנים או mar ביטוי קרום הנכנסKERS שבבסיס קרום רציף shuttling 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוראות בטיחות: כאשר טיפול רדיואקטיביות, לאחסן 64 Cu מאחורי 2 אינץ 'בעובי לבן להוביל ולהשתמש מיגון בהתאמה לכל כלי נושאת פעילות. שימוש בכלים מתאימים כדי להתמודד בעקיפין מקורות מסוככים כדי למנוע מגע יד ישיר למזער חשיפה לחומר רדיואקטיבי. תמיד ללבוש תגי מעקב dosimetry קרינה וציוד מיגון אישי ולבדוק את עצמך ואת אזור העבודה עבור זיהום מייד לטפל בה. בטל ציוד מיגון אישי מזוהם לפני שעזבתי את האזור שבו חומר רדיואקטיבי משמש. אחסן את פסולת רדיואקטיבית כולו מאחורי שריון העופרת עד Cu 64 הרדיואקטיבי רקובים (כ 10 חצי lifes = 127 h) לפני סילוק נאות.
1. 64 הפקת Cu
הערה: רדיואיזוטופיים 64 Cu מופק באמצעות 64 Ni (p, n) 64 תגובה גרעינית Cu באמצעות PETtהציקלוטרון הגזע על פי פרוטוקול שונה של אל מקארתי et. 18.
- במשך 64 ייצור Cu, מקרינים 64 Ni, אשר electroplated על צלחת פלטינה / אירידיום (90/10), עם 30 מיקרו-אמפר עבור 6 שעות עם קרן הפרוטונים של 12.4 MeV.
- מחממים את היעד פלטינה / אירידיום ל 100 מעלות צלזיוס בתא ייעודי polyetheretherketone (פיק) דגירה 2 מ"ל של HCl מרוכזת עבור 20 דקות לפרק 64 Cu / 64 Ni.
- הוסף עוד 1 מ"ל של HCl מרוכזת דגירה במשך 10 דקות.
- לאדות HCl באמצעות זרם של ארגון לקרר את תא לטמפרטורת החדר.
- לרוקן את החדר עם 3 מ"ל של 4% 0.2 M HCl ו 96% מתנול (נ / נ) ולהעביר את הפתרון הזה לעמודה חילוף יונים כי היה טרום מותנה עם 4% 0.2 M HCl מתנול דקות לפחות 15. תזרים-דרך שניתן להשתמש בהם כדי למחזר 64 Ni.
- שטפו את 64 Cu שמרו בטור עם 4% 0.2 i M HClמתנול n.
- Elute 64 Cu עם 70% 1.3 M HCl / 30% isopropanol (נ / V) לתוך בקבוקון אוסף, להתאדות הפתרון בזרם של ארגון ולתת את הבקבוקון להתקרר לטמפרטורת החדר.
- ממיסים 64 Cu ב 140-210 μL של 0.1 M HCl.
2. הצמידו נוגדן עם DOTA ו לאחר 64 Cu-radiolabeling
הערה: chelator DOTA יקושר לקבוצות אמינו תפקודית של מב ידי N-hydroxysuccinimide (NHS) כימיה אסתר ואת המצומד יהיה מאוחר רדיואקטיבי עם 64 Cu 19.
- התאם את הריכוז של KJ1-26-מב ל 8 מ"ג / מ"ל ו diafiltrate 1 מ"ל של מב פתרון נגד 0.1 M Na 2 HPO 4 pH 7.5 שטופלו 1.2 g / L של שרף חילוף יונים chelating באמצעות משקל מולקולרי מנותקים ( MWCO 30 kDA) יחידת מסנן צנטריפוגלי. החל 3 שלבים הכביסה הבאים עם 14 מ"ל של חיץ. לאחר שלב הכביסה הסופי,להתרכז הפתרון שוב 1 מ"ל. לכמת את ריכוז הנוגדנים על ידי מדידות 280nm OD.
- הכן פתרון DOTA-NHS ב ultrapure או מים PCR כיתה בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל מיד לפני השימוש. תנו בקבוקון להסתגל לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה כדי למנוע התעבות מים, ובזהירות להסיר DOTA-NHS בעזרת מרית פלסטיק. הוספת 216 μL של פתרון DOTA-NHS זה 8 מ"ג של הפתרון KJ1-26-מב diafiltrated, ומערבבים היטב, דגירה במשך 24 שעות ב 4 ° C על מיקסר נפילה.
- Diafiltrate DOTA-KJ1-26-מב נגד 0.25 M אמוניום אצטט, pH 7.0, שטופלו 1.2 g / L של שרף חילוף יונים chelating, באמצעות משקל מולקולרי מנותקים (MWCO 30 KDA) יחידת מסנן צנטריפוגלי. החל 7 צעדי כביסה. לרכז את מב לנפח סופי של 1 מ"ל ושוב למדוד את ריכוז החלבון על ידי מדידות 280nm OD.
- לפני radiolabeling, להחליף את החיץ של DOTA-KJ1-26-מב ל PBS באמצעות בגודל EXCכרומטוגרפיה lusion באמצעות עמודות סינון ג'ל. זה גם מסיר זיהומי מולקולות קטנות פוטנציאל.
- הכן 100 MBq 64 CuCl 2 פתרון 10 מ"מ HCl ולהתאים את ה- pH 6-7 עם 10x PBS. הוספת 200 מיקרוגרם של DOTA-KJ1-26-מב. דגירה של 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- עבור בקרת איכות, לבצע כרומטוגרפיה בשכבה דקה עם נתרן ציטרט 0.1 M (pH 5) כשלב הנייד ולנתח ידי autoradiography. לפחות 90% מהפעולה צריכים להיות קשורים הנוגדן ובכך להתגלות בנקודת ההתחלה. פעילות מאוגדת היא chelated ידי השלב הנייד מבוסס ציטרט פסים לחזית הממסה. לקבלת הפניה, שימוש 64 2 CuCl מומלץ.
3. עוף ovalbumin ספציפי TH1 (Cova-TH1) בידוד תא והרחבה
הערה: התרבות של תאי TH1 מתוארת על פי מחקרים שפורסמו בעבר 16, 17.
- לבודד טחול ובלוטות לימפה extraperitoneal (LNs) מעכברים DO11.10.
- קורבן העכבר בהתאם לתקנות פדרליות. לחטא את החיה עם 70% אתנול ו לקבע אותו עם דבק להסרת הטחול LNs. ביצוע חתך החציוני ולהפריד את העור מפני הצפק על ידי רוחבית משיכתו לכל אתר.
- אתר את צוואר הרחם, צירים, הזרוע ואת LNs מפשעתי. הסר אותם עם מלקחיים בוטים ולמקם אותם 1% נסיוב עגל עוברי (FCS) / חיץ PBS.
- פתח את הצפק ולאתר את הטחול. הפרד את הטחול לבלב ורקמת חיבור ולמקם אותו 1% חיץ FCS / PBS. לקבלת הנחיות נוספות, לראות אזכור 20,21.
- הטחול LNs בשר טחון דרך מסנן 40 מיקרומטר לתוך 50 מ"ל להבריג צינור כובע באמצעות הבוכנה של המזרק. יש לשטוף את המסנן עם 10 מ"ל 1% FCS / PBS-חיץ.
- צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. Subsequently, לבצע תמוגה של אריתרוציטים ידי הוספת אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) חיץ תמס (1.5 מ"ל לכל חיה התורם) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 8.5 מ"ל 1% FCS / PBS-חיץ (לכל חיה התורם).
- צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל 1% FCS / PBS-חיץ, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- עבור הפרדה תא מגנטי, להשעות את התאים 1% FCS / PBS-חיץ ולהוסיף CD4 + microbeads. עיין בהוראות היצרן עבור נפח המאגר וכמות CD4 + microbeads להשתמש.
- דגירה של 20 דקות ב 4 °. ואז להוסיף 1% FCS / PBS-חיץ עד 50 מ"ל, צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
- המשך עם בידוד תא CD4 + T באמצעות עמודות הפרדה מגנטית מסחריות עמדת מגנט בהתאמה על פי הפרוטוקול של היצרן. התאם את תאי CD4 + T eluted על שיתוףncentration של 10 6 תאים / מ"ל ב בינוני של הנשר Modified של Dulbecco עם 10% חום מומת FCS, 2.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% חיץ HEPES, 1% חומצות אמינו MEM, פירובט סודיום 1%, ו 0.2% 2-mercaptoethanol וחנות אותם 4 מעלות צלזיוס.
- אסוף את פריקת עמודת צינור כובע 50 מיליליטר בורג להכין תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים). צנטריפוגה הפריקה הטור ב 400 XG במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ל אנטי CD4 (שיבוט: Gk1.5), 10 מיקרוגרם / מ"ל אנטי CD8 (שיבוט: 5367.2) ו 10 מיקרוגרם / מ"ל עכבר אנטי עכברוש-מב (MAR18.5) ו 1.5 השלמה ארנב מ"ל. דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant ולהוסיף 3 בינוני מ"ל. מקרינים את נגמ"שים על מקור γ-ray או רנטגן עם 30 Gy בסך הכל. לאחר מכן, להתאים את נגמ"שי לריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל.
- הוספת 100 μL של CD4 + T תאים 100 μL של נגמ"שים על PLA 96-היטבte יחד עם 10 מיקרוגרם / מ"ל Cova 323-339-פפטיד, 10 מיקרוגרם / מ"ל אנטי-IL-4-מב, 0.3 מיקרומטר CPG1668-oligonucleotides ו 5 U / mL IL-2.
- להוסיף 50 U / mL IL-2 כל שני וחמישי. לאחר 3 - 4 ימים, להעביר את התאים מן צלחות 96-היטב צלחות 24-היטב. שלב 3-5 בארות מהצלחת 96-היטב היטב אחד על הצלחת 24-היטב. הוספת 100 U / mL IL-2 בינוני המכיל בתוך 1: יחס 1.
- לאחר 2-3 ימים אחרים, להעביר את התאים מן הצלחת 48-היטב 175 בקבוקוני תרבית תאי סנטימטר 2 (1 x 48-גם צלחת לכל בקבוק). מלאו עם מדיום 1: יחס 1. להוסיף 50 U / mL IL-2 כל שני וחמישי.
- פיצול התאים על פי צפיפות התאים ולהוסיף 50 U / mL IL-2 כל שני וחמישי. באופן זה, תרבות התאים עבור 10 ימים אחרים.
4. Radiolabeling Cell Cova-TH1
הערה: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב יחול על תאים בתרבית Cova-TH1 לאפשר תיוג רדיואקטיבי תאי.
- עבור Cova-TH1 CEradiolabeling ll, לצייר 37 MBq של Cu-DOTA-KJ1-26-מב רדיואקטיבי 64 בתוך מזרק ללא נפח מת באמצעות כיל מנה. להוסיף 1 מ"ל מלוחים לקבל פתרון 37 MBq / מ"ל.
- להשעות תאים Cova-TH1 במדיום ב 2 x 10 6 תאים / מ"ל ולהוסיף 0.5 מ"ל של השעיה התא היטב כל צלחת 48-היטב.
- להוסיף 20 μL של 37 MBq מוכן טרי / מ"ל 64 פתרון Cu-DOTA-KJ1-26-מב היטב בכל צלחת 48-היטב. היחס הסופי עבור התיוג הוא 0.7 MBq לכל 10 6 תאים בנפח של 520 μL. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 7.5% CO 2 עבור 30 דקות.
- לאחר הדגירה, בזהירות מחדש להשעות את התאים בכל טוב ולהעביר את ההשעיה תא מהצלחת 48-היטב לתוך 50 מ"ל להבריג צינור כובע. כדי להקטין את איבוד התא, לשטוף היטב עם כל מדיום מחומם מראש.
- צנטריפוגה ההשעיה תא Cova-TH1 ב 400 XG במשך 5 דקות, לבטל את supernatant, מחדש להשעות התאים 10 מ"ל prewarmed PBS. הסר ו-ל'liquot השעית התא עבור ספירת תאים. חזור על שלב הכביסה.
- ספירת תאי Cova-TH1 קיימא ב דילול מתאים עם כתמי כחולי trypan.
- התאם את הריכוז התא 5 x 10 7 תאים / מ"ל עבור הזרקה (IP) הזרקה של 10 7 תאים 200 μL PBS.
- חזור על שלבים 4.3-4.5 כדי radiolabel התאים Cova-TH1 עם כמויות גדלות והולכות של פעילות, למשל, 1.4 MBq או 2.1 MBq לכל 10 6 תאים.
- כדי radiolabel התאים עם 1.4 MBq לכל 10 6 תאים, השתמש 40 μL של 37 MBq / מ"ל 64 פתרון Cu-DOTA-KJ1-26-מב ו 60 μL עבור radiolabeling עם 2.1 MBq לכל 10 6 תאים. בצע את השלבים 4.3-4.7 עם 0.7 MBq, 1.4 MBq ו 2.1 MBq 64 Cu-PTSM אך להגדיל את זמן תיוג כדי 3 h לחקירות השוואתי 17.
- עבור לשלב 5 כדי לקבוע את הכמות האופטימלית של פעילות.
5. הערכה במבחנה של השפעת Radiolabel על תאי Cova-TH1
הערה: אפיון ההשפעות של radiolabel על תאי TH1 מתבצע באמצעות assay הרחקה trypan כחול עבור כדאיות, IFN-γ ELISA עבור הערכה פונקציונליות PE-Annexin V מכתים עבור אינדוקציה של אפופטוזיס 16, 17. קביעה הספיגה תאי ואת בזרימה של רדיואקטיביות גם מתוארת למטה. בתור השוואה, 64 Cu-PTSM שכותרתו תאים Cova-TH1 יכול לשמש גם.
- השפעה על כדאיות ידי הרחקה כחול trypan
- התאם לפחות 18 x 10 6 תאים Cova-TH1 רדיואקטיבי עם 0.7 MBq / 10 6 תאים, 1.4 MBq / 10 6 תאים ו 2.1 MBq / 10 6 תאים בהתאמה לריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ"ל ולבצע צעדים 5.1. 2-5.1.7 עבור כל מנת פעילות. שימוש לא radioactive KJ1-26-מב שכותרתו תאים Cova-TH1 ותאי Cova-TH1 ללא תווית כמו הפקדים.
- Pipet 1 מ"ל של פתרון התא לתוך 9 בארות של צלחת 24-היטב.
- אסוף את התוכן של 3 בארות לתוך 3 15 מ"ל נפרד לדפוק צינורות כובע, 3 שעות לאחר radiolabeling הראשונית.
- שוטפים את בארות שעכשיו ריקה בינוני מחומם מראש כדי למזער אובדן התא ולהוסיף המדיום אל 15 מ"ל בהתאמה לדפוק צינורות כובע משלב 5.1.3.
- צנטריפוגה 15 צינורות מ"ל ב 400 XG במשך 5 דקות מחדש להשעות את התא גלולה וכתוצאה 1 מ"ל של מדיום מראש התחמם.
- רוזן הוא תאי קיימא מתו בכחול trypan בנפרד עבור כל צינור 15 מיליליטר ו לחשב את אחוז תאי קיימא.
- חזור על שלבים 5.1.3-5.1.6 24 ו 48 פוסט h 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב radiolabeling.
- אפקטים על פונקציונליות נקבע על ידי γ-IFN ELISA
הערה: כדי להעריך את ההשפעה של productio Cu-DOTA-KJ1 26-מב radiolabel על IFN-γ 64n כסמן של פונקציונליות, לבצע ELISA IFN-γ מן ההספק מסחרי להתייחס התייחסות 17 לפרטים נוספים.- לפזר 10 5 תאים קיימא ב 100 μL של המדיום על צלחת 96-היטב, 3 פוסט h 64 radiolabeling Cu-DOTA-KJ1-26 של תאים Cova-TH1 עם 0.7 MBq, 1.4 MBq או 2.1 MBq. השתמשו ללא תווית, הלא רדיואקטיבי KJ1-26-מב-שכותרתו או 64 תאים Cu-PTSM שכותרתו Cova-TH1 כמו הפקדים.
- לעורר ייצור IFN-γ ב 10 5 64 תאים Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 ב 100 בינוני μL עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של הפפטיד Cova, 5 U / mL IL-2 ו 5x10 5 נגמ"שים ב 100 μL של המדיום עבור 24 שעות ב 37 ° C ו- 7.5% CO 2. פקדים נוספים עשויים להיות תנאים אחרים ללא תוספת של הפפטיד Cova.
- לנתח את supernatant ידי ELISA פי הוראות היצרן.
- חזור על שלב 5.2.2. כדי 5.2.3. ב 24 ו 48 שעות לאחר הליך התיוג.
- אינדוקציה של אפופטוזיס נקבע על ידי מכתים V PE-Annexin עבור cytometry זרימה
הערה: כדי להעריך אינדוקציה אפופטוזיס על ידי radiolabel Cu-DOTA-KJ1-26-מב 64, השתמש בערכה זמין מסחרית עבור זרימת cytometry ולהכין דגימות תאים על פי הוראות היצרן לפני צביעה עם Annexin V עבור אקספוזיציה סרין phosphatidyl על קרום התא .- בשלב 3, 24 ו 48 פוסט h 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב radiolabeling של תאים Cova-TH1, triplicates כתם עם לפחות 10 6 64 תאים Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 עם ערכת Annexin V לפי הוראות היצרן ולנתח במהלך השעה הקרובה. שימוש שאינו רדיואקטיבי KJ1-26-מב-שכותרתו, 64 Cu-PTSM שכותרתו ללא תווית Cova-TH1 תאים כקבוצת ביקורת. אנא להתייחס התייחסות 17 לפרטים נוספים.
- ספיג בזרימה
הערה: הספיגה של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב לתוך התאים נמדד כיל מינון ואת בזרימה של רדיואקטיביות נמדדת ב assay ספירה-γ 0, 5, 24, ו 48 שעות לאחר radiolabeling.- כן עשרה צינורות γ-ספירה בכל במשך 64 תאי Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1, supernatant בהתאמה ואת השלב לשטוף.
- העברת 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו תאים Cova-TH1 ב 1 מ"ל של מדיום לתוך אחד מעשרת צינורות γ-ספירה ישירות לאחר radiolabeling. עבור כל אחת מנקודות הזמן 5, 24 ו 48 שעות לאחר radiolabeling, לשמור לפחות 10 7 64 תאים Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 במדיום על צלחות תרבית תאים 24-היטב באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 7.5% CO 2.
- בצנטריפוגה הצינורות-ספירת γ ב 400 XG במשך 5 דקות ולהעביר את supernatant לתוך עשרה צינורות חדשים γ-ספירה.
- שוטפים את התאים פעם בינוני 1 מ"ל להסיר את שבריר מאוגד של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מבd לאסוף את supernatant עשר צינורות γ-ספירה חדשה.
- להוסיף 1 מדיום חדש מיליליטר לתאי Cova-TH1 ולקבוע את הערך הספיג הראשוני כיל מנה. הצינורות ניתן לאחסן גם באינקובטור ב 37 ° C ו- 7.5% CO 2.
- חזור על שלבי 5.4.2 עד 5.4.5 לאחר 5, 24 ו 48 h ולמדוד כל הצינורות ב נגדי γ על פי הפרוטוקול של היצרן. כדי לתקן דעיכה רדיואקטיבית לניתוח כמותי, להשתמש סטנדרט עם מנה מוגדרת של רדיואקטיביות.
6. OVA מושרה DTHR Airway החריף
הערה: דינמיקת ההגירה ודפוסי ביות של שהועברו adoptively ו רדיואקטיבי Cova-TH1 תאים לאתר של דלקת תהיה מדמיינים לכמת במודל חיה עבור מושרה Cova בדרכי נשימה-DTHR 16, 17.
- להזריק 8 שבועות בן עכברים BALB / C-IP עם תערובת של 150 μL אלuminum ג'ל / 50 μL Cova-פתרון (10 מיקרוגרם ב 50 μL PBS) לחסן העכברים.
- שבועיים לאחר חיסון, להרדים את העכברים עם 100 מ"ג / ק"ג קטמין 5 מ"ג / ק"ג xylazine ידי הזרקת IP. מניחים את עכברי הניסוי על גבם לאט pipet 100 מיקרוגרם Cova מומס 50 μL PBS לתוך הנחיריים של החיות. החיות ינשמו טיפת פתרון אחר טיפה.
- חזור אחרי 24 h. עבור זירוזים DTHR בדרכי הנשימה חזק, לחזור שוב לאחר 48 שעות.
- כדי לנתח את ההגירה הספציפית של תאי Cova-TH1 הועברו, לגרום-DTHR דרכי נשימה עם טורקיה-או פסיון-OVA שליטה. לכן, חזור על שלבים 6.1-6.3 באמצעות OVA-חלבון בהתאמה.
7. הדמיה vivo באמצעות PET / CT
הערה: in vivo ההדמיה של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 תאי Cova-DTHR עכברים חולים להמלטה מלאה מדגימים את הביות הספציפית המיילדינמיקת Gration של תאי Cova-TH1. לכן, לרכוש סריקות PET CT סטטי אנטומיים סורק ברצף 3, 24 ו 48 שעות לאחר העברת תא המאמצת.
- מיד לאחר radiolabeling, להתאים את Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 התאים 5 x 10 7 תאים / מ"ל להזרקה ip של 10 7 תאים 200 μL 64.
- באמצעות מזרק מ"ל 1 ו מחט 30-מד, לצייר 200 μL של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 תא ההשעיה ו להזריק את התאים IP לתוך החיות Cova-DTHR-חולה בין 4 וה הפטמה ה 5. כדי לקבוע את הסכום הכולל מוזרק של רדיואקטיביות, למדוד את המזרק כיל מנה לפני ואחרי ההזרקה.
- להרדים את העכברים, 10 דקות לפני המועד הספיג הרצוי, עם isoflurane 1.5% חמצן 100% (קצב זרימה: 0.7 L / min) בקופסא הרדמה מבוקרת טמפרטורה.
- בינתיים, כדי להקל על שיתוף רישוםתמונות PET ו- CT במהלך ניתוח תמונה, לתקן נימי זכוכית המכילות 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב פתרון או חינם 64 CuCl 2 פתרון מתחת למיטת העכבר.
- לכן, להכין תמיסה של 0.37 MBq / מ"ל ולמלא נימי זכוכית עם נפח של 10 μL עם הפתרון הזה. מאז אותות רדיואקטיביות תאים שמקורם הוא מטבען חלשים, לא להשתמש בכמויות גבוהות של פעילות כדי לוודא כי הסמנים אינם מפריעים אותות הנגזרות תא בעכברים.
- לאחר שהגיע סובלנות כירורגיים, כפי שצוין על ידי האובדן של רפלקס נסיגת פדלים של הגפיים האחוריים, להעביר את העכבר כדי מיטה חיה מחמד-ו CT-תואמת קטנה מצוידת במערכת צינורות מתאימה לשמור הרדמה.
- לשתק את העכבר על מיטת החיה הקטנה באמצעות צמר גפן באיספלנית. החל משחת עין כדי למנוע התייבשות של העיניים.
- מעביר את מיטת עכבר סורק PET, למרכז את שדה ראייה עם focuים על הריאות ועל לרכוש סריקת PET סטטי 20 דק 'עם חלון האנרגיה של 350-650 keV.
- מעביר את מיטת עכבר סורק CT. ויה הסקאוט נוף, למרכז את שדה הראייה על הריאות. לרכוש תמונה CT מישוריים באמצעות 360 תחזיות במהלך סיבוב 360 מעלות במצב "צעד לירות" עם זמן חשיפה של 350 ms ו binning גורם 4.
ניתוח תמונה 8.
- לשחזר נתוני הרשימה-mode PET-ידי החלת מקסימיזציה ציפיית משנה סטטיסטי איטרטיבי הורה אלגוריתם 2D (אסם) וסריקות CT לתמונת 3D עם גודל פיקסל של 75 מיקרומטר.
- עבור שיתוף רישום תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה (למשל Inveon מחקר עבודה או Pmod), להשתמש בכלי שיתוף רישום האוטומטיים. אם זה לא מצליח, השתמש נימי הזכוכית מתחת למיטת העכבר כהנחיה לשתף לרשום את תמונות PET ו- CT המשוחזרות מרחבית של צירי, נוף עטרה ועל sagittal.
- תקן את תמונות חיות המחמדעבור התפרקות רדיואקטיבית באמצעות החוק דעיכה רדיואקטיבית במחצית במשרה של 64 Cu רדיונוקלידית ב 12.7 h. עבור נורמליזציה תמונה, לבחור תמונה אחת (א) כהפניה ולהתאים את עוצמת התצוגה התמונה בתוכנת ניתוח תמונה בהתאמה.
- ניצול הערכי פשוט להגדיר עבור תמונת הפנייה (א), את הפעילות המוזרקת (א) ואת הפעילות המוזרקת עבור תמונות האחרות (X), לנרמל את התמונות האחרות באמצעות המשוואה הבאה: (פעילות מוזרקת (X) / פעילות מוזרקת ( א)) ערכי עוצמת x (א).
- צייר כרכי 3D של עניין (VOI) על אות PET המנורמלת של LNs ריאתי perithymic.
- לקבוע את המינון אחוז מוזרק לס"מ 3 (% מזהה / ס"מ 3) באמצעות המשוואה הבאה: (ממוצע הפעילות בפעילות VOI / הכוללת את העכבר) x 100. לקבלת הנחיות נוספות לגבי ניתוח תמונה, לראות אזכור 22, 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מסכם את התיוג של תאי Cova-TH1 עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב ואת עיצוב ניסיוני עבור במבחנה במחקרי vivo מכוסים בפרוטוקול זה.
איור 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב תהליך תיוג ועיצוב ניסיוני. (א) ייצוג סכמטי של תיוג התא רדיואקטיבי עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב. 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב נקשר לקולטנים Cova-TCR על פני התא של תאי TH1 ו מופנם עם קולטן בתוך 24 שעות. Cova-TCRs מחדש הביעו 24 שעות לאחר radiolabeling. (ב) תאי CD4 + T בודדו, מורחבת רדיואקטיבי עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב במבחנה. ערכים הספיגים בזרימת werדואר נקבע על ידי כיל מינון ו-ספירה γ. אפקטים של נוגדן רדיואקטיבי על כדאיות התא הוערכו עם כתמים כחולים trypan, על פונקציונליות עם IFN-γ ELISA, ועל אינדוקציה של אפופטוזיס עם Phycoerythrin (PE) -Annexin מכתים V. (ג) Cova-בדרכי הנשימה DHTR הושרה בעכברים BALB / ג הנשי. 10 7 תא TH1 הועברו adoptively לתוך חיות DHTR-חולה Cova-מסלול טיסה ישירות לאחר radiolabeling. תמונות PET / CT נרכשו 3, 24 ו 48 פוסט h העברת תא המאמצת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
תיוג תאיים המוצלח של תאי TH1 עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב אושר על ידי (איור 2 א) אימונוהיסטוכימיה. 64 Cu-DOTA-KJ1-26 הנוגדן (הירוק) היה שותף מקומי עם CD3 על h קרום התא 3 לאחר radiolabeling, ואילו האות של מב בבית קרום התא היה קלוש בלבד על 24 h (צהוב). בשעה 48 שעות לאחר radiolabeling, 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR מורכב הופנמה באמצעות אנדוציטוזה עם אות חזק בציטופלסמה של תאי TH1. מינון רדיואקטיבי המוחל של 0.7 MBq מופחת כדאיות של תאי TH1 ידי רק 8% ואילו מינונים גבוהים יותר של 1.4 MBq ו 2.1 MBq 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב היו תופעות בולטות יותר. בהשוואה radiolabeling עם 64 Cu-PTSM, לעומת זאת, אין יתרון משמעותי של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב נצפתה (איור 2B). 64 תאים רדיואקטיבי Cu-נוגדן הראה הפסד קטן פונקציונליות כפי שמוצג על ידי הפרשת IFN-γ (איור 2C), הקטינה בזרימת של רדיואקטיביות (איור 2D), והקטין אינדוקציה של אפופטוזיס (2E איור) לעומת 64 Cu-PTSM שכותרתו TH1 תאים.
לשמור-together.within-page = "1"> 
איור 2: בהערכה במבחנה של תיוג תא רדיואקטיביים TH1 עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב. (א) מיקרוסקופיה Confocal מוכיחה את ספיגת תאיים של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מהבז (ירוק) בתאי Cova-TH1 (קרום תא; אדום) בתוך 24 שעות לאחר תיוג ראשוני (דמות זו שונתה מהתייחסות 17) . (ב) טיטרציה של מינונים הסימון הרדיואקטיבי של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב או 64 Cu-PTSM חשף השפעה שווה על כדאיות כפי שזוהו על ידי תיוג פוסט הרחקה trypan כחול 24 h. שימוש 0.7 MBq עבור תיוג תא מושרה הליקויים הנמוכים של הכדאיויות (ממוצע ± סטיית התקן באחוזים;. דמות זו שונתה אזכור 16, 17 (ג) טיטרציה של סימון הרדיואקטיבי לעשותSES של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב או 64 Cu-PTSM חשף ליקוי חזק של פונקציונליות לאחר 64 תיוג Cu-PTSM, כפי שזוהו על ידי IFN-γ תיוג פוסט ELISA 24 h. מנה גדל והולך של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב עבור תיוג התא לא היה משפיע על הפונקציונליות (ממוצע ± סטיית תקן באחוזים; הסטטיסטיקה: מבחן t; * p <0.05, ** p <0.01, ** * p <0.001; דמות זו שונתה אזכור 16, 17). (ד) מדידות בזרימה של תאי רדיואקטיבי (γ-יד נטויה) הראו יציבות תיוג גבוהות של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב לעומת 64 Cu-PTSM 5 h ו 24 שעות לאחר תיוג (ממוצע ± סטיית התקן באחוזים; סטטיסטיקה : מבחן t; *** p <0.001; דמות זו שונתה מ 17). (E) cytometry זרימה בהתאמה (PE-Annexin V) דיאגרמות מצביעים AP גבוהאינדוקציה optosis 24 שעות לאחר 64 תיוג Cu-PTSM לעומת 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-תיוג (דמות זו שונתה מההתייחסות 17). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
לאחר העברת המאמצת של 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו תאים Cova-TH1 לתוך חיות Cova-DTHR-חולה ובקרות מטופל, PET סטטי ברזולוציה גבוהה ותמונות CT אנטומיים נרכשו. לניתוח תמונה, תמונות היו התמזגו בתצוגת העטרה, צירית sagittal בעזרת נימי זכוכית המכילות כמות קטנה של 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב (איור 3A). VOIs צוירו על LNs ריאתי perithymic על תמונות חיות מחמד תיקן-ריקבון מנורמל כדי לחשב את אחוז מוזרק במינון לס"מ 3(איור 3B).
איור 3: PET / CT-שיתוף רישום וניתוח. (א) תמונות PET ו- CT היו שיתוף רשום תוכנת ניתוח תמונה. אם רישום אוטומטי על ידי התוכנה נכשל, התמונות היו התמזגו ידי שכיסה את אותות PET ו- CT של נימי זכוכית (סמנים), מלא רדיואקטיביות קבועה מתחת למיטה החיה. (ב) VOIs ממוקמת על אותות PET תקנו מנורמלים של LNs perityhmic ו ריאתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
נדידת תאים Cova-TH1 היה במעקב של LN ריאתי perithymic כאתרי Cova-מצגת DTHR בדרכי הנשימה. In de אותות vivo PETrived מ 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב-שכותרתו Cova-TH1 התאים היו גבוהות משמעותית אותות 64 Cu-PTSM שכותרתו תאים (איור 4A). ערכי ספיגת תא Cova-TH1 בתוך LNs ריאתי perithymic הוגדלו באופן משמעותי בחיות DTHR-חולות לעומת להמלטת קבוצת ביקורת (איור 4 ב).
איור 4: Cova-TH1 מעקב סלולרי במודל Airway DTHR ידי in vivo PET / CT. (א) בהתאמה PET / CT תמונות של adoptively העבירו תאים Cova-TH1, אשר תויגו בעבר עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב או 64 Cu-PTSM, לעכברים Cova-DTHR-חולה או מטופל. תאי Cova-TH1 הועבר התבייתו LNs ריאתי perithymic. (ב) ניתוח כמותי של אתרי הביות של תאי Cova-TH1 הוכיח ע"ה גבוהoming לרקמות מודלקות (ממוצע ± סטיית תקן; סטטיסטיקה: מבחן t; * p <0.05, ** p <0.01). תיוג עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב הוכיח רגישות גבוהה יותר (% הגדילה מזהה / ס"מ 3) לעומת 64 Cu-PTSM ב באתרי הביות שונים (ממוצע ± סטיית תקן, הסטטיסטיקה: הסטודנטים של מבחן t; # p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001). דמות זו שונתה מהתייחסות 16, 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה וקלה radiolabel תאים ביציבות למעקב in vivo על ידי PET. ניצול שיטה זו, תאי Cova-TH1, מבודד והרחיב במבחנה מעכברים התורם, יכול להיות רדיואקטיבי עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב ו הביות שלהם היה במעקב של LNs ריאתי perithymic כאתרים של המצגת Cova בתוך Cova מושרה DTHR בדרכי נשימה חריף.
השינוי של מב עם chelator דורש עבודה מהירה ויעילה ושימוש בפתרונות אולטרה טהורים ללא עקבות של אמינים. הפתרונים טופלו שרף חילוף יוני chelating כדי להבטיח נטייה תקינה של אסתר הפעיל DOTA-NHS כדי אמינות שאריות של מב. מב מצומדות chelator כקובץ radiolabel תאי יש מספר יתרונות על פני שימוש סוכני תיוג תא שאינם ספציפיים. ראשית, מב מספקת סגולית מצוין המאפשרים תיוג הממוקד של אוכלוסיית תא מוגדרת. מבכשלעצמו אינו ציטוטוקסיות אין כל השפעה מזיקה על כדאיות או פונקציונליות של תאים. בשלב בא, בזרימה של רדיואקטיביות מהתאים צומצמה באופן משמעותי לשיפור יחס האות-רקע תמונות חיות המחמד 17, 24. על ידי בחירת מב עם סגוליות שונות, שיטה זו היא להעברה בקלות אוכלוסיות תאים אחרות בעלי עניין כגון CD8 + TIL או CD14 + מונוציטים. יתר על כן, הגישה תיוג התא הזה יכול לשמש למחקרים מעקב תא במודלים של בעלי חיים שונים של מחלות אנושיות דלקתיות (למשל, דלקת מפרקים שגרונית אסטמה) או במודלים של בעלי חיים עבור סוגי סרטן אנושיים שונים. שיטת תיוג זה, עם זאת, הוא מרותק קולטנים או סמני בידול קרום הנכנס כמטרות מאז מבז אינו מפעפע באופן פסיבי על פני קרום התא. הפנמת מושרה ההפעלה של היעד או, בפשטות, קרום-דילוגים הוא יתרון. אשׁוֹקְקוּת גבוהה בין מב ואת היעד, לעומת זאת, יכולה גם להיות מספיק עבור הדמית in vivo, ואולי עם אות מופחתת יחס ברקע.
הבחירה של DOTA כמו chelator לניסויים שלנו התבססה על עבודתו המוקדמת באמצעות 64 Cu 25. עם זאת, בינתיים DOTA הוצגה לא להיות chelator אופטימלי עבור האיזוטופ הזה, שמוביל ספיגת פעילות גבוהה למדי בכבד ידי transchelation כדי דיסמוטאז סופראוקסיד 26. למרות באמצעות נוגדן רדיואקטיבי עבור תיוג במבחנה של תאים אשר אז adoptively המועבר אמור להקטין את הסיכון של 64 Cu שחרור והתחבורה אל הכבד, chelators המודרני מותאם במיוחד 64 Cu, כמו 1,4,7-triazacyclononane, 1-glutaric חומצה -4,7-אצטית חומצה (NODAGA) או 1,4,7-triazacyclononane-triacetic חומצה (NOTA), יכול לשמש רצוי עם השיטה שלנו כדי לשפר עוד יותר הספציפיות של נתונים המתקבלים 27 64 Cu (למשל N-chlorosuccinimide (NCS)) או איזוטופים אחרים, כגון 89 Zr (למשל desferrioxamine;. DFO).
הבחירה של 64 Cu כמו רדיואיזוטופיים התבססה על העובדה כי נדידת תאי vivo ו הביות הוא תהליך איטי למדי בהשוואה לשינויים מטבוליים בדרך כלל צלמו ידי PET. 64 Cu עם זמן מחצית חיים של 12.7 h מאפשר הדמיה החוזרת והנשנית של נדידת תאים מעל 48 שעות לאחר הזרקה. במשך 64 ייצור Cu, חשוב להשתמש בפתרונות בדרגה גבוהה ללא יונים של מתכות קורט כדי להבטיח את הטוהר של 64 Cu. יתר על כן, את הטוהר של 64 Cu הוא בעל חשיבות גבוהה עבור radiolabeling של DOTA-מב מאז זיהומים יון המתכת רב-ערכית עלול להוביל פעילות ספציפית מופחת של 64 הפתרון Cu לרמות ימנע radiolabeling חלבון ולכן הדמיה. למרות 64 Cu מייצרת סיאחוז gnificant של אלקטרונים אנרגטיים, ציטוטוקסיות אוז מאוד כאשר מתפוררים 28, מנה מתואמת של רדיואיזוטופיים נסבל היטב על ידי התאים כפי שהוא מיוצג על ידי השפעות מינימאליות על כדאיות ופונקציונליות ואינדוקצית אפופטוזיס נמוכה לאחר radiolabeling. אף על פי כן, זה ברור רצוי בתחילה לכיל מינון הפעילות המשמש radiolabeling עבור סוגי תאים אחרים ולהתאים את פרוטוקול radiolabeling. מהיר וקל בשיטות הערכה במבחנה הוכחו בפרוטוקול, לרבות קביעת הכדאיות ידי הדרה מכתים trypan כחול עם PE-Annexin V עבור קביעת שברים אפופטוטיים של תאים. שני השיטות הן יחסית זולות ולהשתמש בציוד מעבדה נגיש בקלות. PE-Annexin V מכתים שילוב עם צבע על האפליה של חיים ותאים מתים כגון D 7-aminoactinomycin (7-AAD) יאפשר קביעת הכדאיות אפופטוזיס ste הניסיוני אחדp. כחלופה להעריך את הכדאיות של תאי T שכותרתו, A 3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium (MTT-) assay יכול לשמש כדי להעריך את פעילות התא מטבולית. ההערכה של הערכים הספיגים בזרימה עם כיל מינון ו γ-נגד היא יותר מתקדמת אבל עדיין מהירה וזולה להשיג מאז כמעט בכל מעבדה לעבודה עם רדיואקטיביות יש את החומרה המתאימה באתר. ג'ין סדירה או שיטות מבוססי שבב אלקטרוני תניב נתונים מפורטים יותר. שיטות אלה, אולם, הם לא תמיד נגיש בקלות, צריך מומחיות מתאימה ביותר לעתים קרובות מקושרים עלויות גבוהות יותר.
למרות PET אינו מסוגל להגיע להחלטה הסלולר כמו שיטות הדמיה מיקרוסקופיות 29, זה מספק רגישות מעולה בטווח picomolar לאיתור אפילו של מספר קטן של תאים בתוך חיות או בני אדם 8. לעומת שיטות הדמיה בלתי פולשניות אחרות כגון אופטיקההדמית l, PET הוא כמוני, לא רק לעומק חדיר ומספקת תמונות באיכות גבוהה עם שלוש החלטות ממדים. שילוב הרגישות הגבוהה של PET עם דיוק אנטומי של CT מאפשר הדמית דיוק גבוהה של נדידת תאים. יתר על כן, בנתונים vivo ניתן תוקף בקלות על ידי מספר שיטות לשעבר vivo כולל γ-ספירה לניתוח biodistribution. Autoradiography של cryosections והכתים היסטולוגית עוקבות של cryosections יכול להיות מעולף כדי לתאם את מפת הפעילות autoradiographic עם מחלחל תא החיסון מזוהה על ידי hematoxylin והכתים eosin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים ד"ר ג'וליה מנהיים, וולטר Ehrlichmann, רמונה Stumm, Funda קיי, דניאל Bukala, מארן Harant כמו גם נטלי Altmeyer על התמיכה במהלך ניתוח ניסויים ונתונים. עבודה זו נתמכה על ידי ורנר סימנס-קרן, DFG דרך SFB685 (פרויקט B6) ומזל (2309-0-0).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | WKL | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitroevaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30 G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µL | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
- Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
- Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
- Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
- Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
- Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
- Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
- Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
- Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
- Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
- Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
- Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
- Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
- Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
- McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
- Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
- Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
- Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
- Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
- Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
- Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).
