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Immunology and Infection

म्यूरीन लिम्फोसाइट लेबलिंग द्वारा Published: April 29, 2017 doi: 10.3791/55270
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

Summary

एक 64 Cu संशोधित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक ट्रांसजेनिक murine टी सेल रिसेप्टर के लिए बाध्य की तैयारी के बाद, टी कोशिकाओं विवो में radiolabeled हैं, व्यवहार्यता, कार्यक्षमता, लेबलिंग स्थिरता और apoptosis के लिए विश्लेषण किया, और adoptively एक airway देरी प्रकार अतिसंवेदनशीलता के साथ चूहों में स्थानांतरित गैर इनवेसिव पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी / अभिकलन टोमोग्राफी (पीईटी / सीटी) द्वारा इमेजिंग के लिए प्रतिक्रिया।

Abstract

यह प्रोटोकॉल 64 Cu के उत्पादन और chelator विकार / एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb) की radiolabeling murine लिम्फोसाइट सेल संस्कृति और 64 Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर कोशिकाओं को लक्ष्य करने के बाद दिखाता है। की radiolabel और इन विवो सेल ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव एक airway देरी प्रकार अतिसंवेदनशीलता रिएक्शन (DTHR) पीईटी / सी टी द्वारा का एक पशु मॉडल में वर्णित इन विट्रो मूल्यांकन में।

विस्तार में, chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic एसिड (DOTA) के साथ एक mAb के संयोजन दिखाया गया है। रेडियोधर्मी 64 Cu, DOTA-संयुग्मित mAb की radiolabeling के उत्पादन के बाद में वर्णित है। इसके बाद, चिकन ovalbumin (कोवा) विशिष्ट सीडी 4 + इंटरफेरॉन का विस्तार (IFN) -γ उत्पादक टी सहायक कोशिकाओं (कोवा-TH1) और कोवा-TH1 कोशिकाओं के बाद radiolabeling चित्रित कर रहे हैं। विभिन्न विट्रो तकनीक में एफई मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैंइस तरह के trypan नीले अपवर्जन द्वारा सेल व्यवहार्यता का निर्धारण, प्रवाह cytometry के लिए Annexin वी के साथ apoptosis के लिए धुंधला, और IFN-γ एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख द्वारा कार्यक्षमता के मूल्यांकन के रूप में कोशिकाओं पर 64 Cu-radiolabeling की fects, (एलिसा) । इसके अलावा, कोशिकाओं में रेडियोधर्मी तेज और लेबलिंग स्थिरता के निर्धारण के बारे में विस्तार से बताया गया है। यह प्रोटोकॉल आगे कैसे एक airway DTHR के लिए एक पशु मॉडल में सेल ट्रैकिंग अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए है और इसलिए, BALB / ग चूहों में कोवा प्रेरित तीव्र वायु-मार्ग DHTR के शामिल होने शामिल किया गया है वर्णन करता है। अंत में, छवि अधिग्रहण, पुनर्निर्माण, और विश्लेषण सहित एक मजबूत पीईटी / सी टी कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया है।

64 Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर बाद रिसेप्टर internalization के साथ लक्षित कर दृष्टिकोण, सेल लेबलिंग के लिए आम पीईटी ट्रेसर की तुलना में उच्च विशिष्टता और स्थिरता, कम सेलुलर विषाक्तता, और कम तपका दर प्रदान करता है जैसे 64 Cu-pyruvaldehyde बिस (एन 4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM)। अंत में, हमारे दृष्टिकोण 48 घंटे के लिए एक इष्टतम संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात के साथ पीईटी / सी टी द्वारा विवो सेल ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव सक्षम बनाता है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण झिल्ली से बंधा रिसेप्टर्स कि भाँति रहे हैं के साथ विभिन्न पशु मॉडल और प्रकार की कोशिकाओं को हस्तांतरित किया जा सकता है।

Introduction

गैर इनवेसिव सेल ट्रैकिंग सेल समारोह, विवो में प्रवास और होमिंग नजर रखने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है। हाल सेल ट्रैकिंग अध्ययन पुनर्योजी चिकित्सा, सूजन या कैंसर 3, 4 के खिलाफ दत्तक सेल चिकित्सा में टी लिम्फोसाइट्स ऑटोलॉगस परिधीय सफेद रक्त कोशिकाओं के संदर्भ में मेसेंकाईमल 1, 2 या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न स्टेम सेल 3 पर ध्यान केंद्रित किया। कार्रवाई की साइटों और सेल आधारित चिकित्सा के अंतर्निहित जैविक सिद्धांतों की व्याख्या जबरदस्त महत्व का है। CD8 + साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट्स, आनुवंशिक रूप से कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं या ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों (TILs) व्यापक रूप से सोने के मानक के रूप में माना जाता था इंजीनियर। हालांकि, ट्यूमर जुड़े विशिष्ट प्रतिजन TH1 कोशिकाओं के लिए एक प्रभावी वैकल्पिक उपचार विकल्प 4, साबित हुए हैं </ sup> 5, 6, 7।

कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा में उच्च ब्याज की कोशिकाओं सूजन में प्रमुख खिलाड़ियों, अंग-विशिष्ट स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों (जैसे, गठिया या ब्रोन्कियल अस्थमा), और रूप में, यह TH1 कोशिकाओं के अस्थायी वितरण और होमिंग पैटर्न चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अवेध्य में vivo इमेजिंग पीईटी द्वारा कोशिका प्रवास पैटर्न की जांच करने के लिए, विवो होमिंग में एक मात्रात्मक, अत्यधिक संवेदनशील तरीका 8 प्रस्तुत करता है, और सूजन, एलर्जी, संक्रमण या ट्यूमर अस्वीकृति 9, 10, 11 के दौरान टी सेल कार्रवाई और प्रतिक्रियाओं की साइटों।

चिकित्सकीय, 111 में oxine, सूजन और संक्रमण 12 के भेदभाव के लिए ल्युकोसैट सिन्टीग्राफी के लिए प्रयोग किया जाता है 2-डिओक्सी-2- (18 जबकिएफ) फ्लोरो डी ग्लूकोज (18 एफ FDG) आमतौर पर पीईटी 3, 13 से सेल ट्रैकिंग अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। इस पीईटी ट्रेसर में से एक प्रमुख नुकसान, हालांकि, 109.7 मिनट पर रेडियोन्यूक्लाइड 18 एफ और कम intracellular स्थिरता पोस्ट बाद में समय बिंदुओं पर इमेजिंग दत्तक सेल हस्तांतरण में बाधा उत्पन्न कि से कम आधा जीवन है। पीईटी द्वारा विवो सेल ट्रैकिंग अध्ययन में लंबी अवधि है, हालांकि कोशिकाओं में अस्थिर, 64 Cu-PTSM अक्सर करने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए nonspecifically कोशिकाओं 14, 15 टी सेल व्यवहार्यता पर कम से कम हानिकारक प्रभाव के साथ लेबल और 16 कार्य करते हैं।

यह प्रोटोकॉल एक विधि आगे एक टी सेल रिसेप्टर (TCR) विशिष्ट radiolabeled mAb का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता और समारोह पर प्रतिकूल प्रभाव को कम करने का वर्णन है। सबसे पहले, रेडियो आइसोटोप 64 Cu, वें के साथ mAb KJ1-26 के संयोजन के उत्पादनई chelator DOTA, और बाद में 64 Cu-radiolabeling दिखाए जाते हैं। एक दूसरे चरण में, अलगाव और DO11.10 दाता चूहों के कोवा-TH1 कोशिकाओं के विस्तार और 64 Cu-लोडेड DOTA-संयुग्मित mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) के साथ radiolabeling विस्तार से वर्णन किया गया है। तेज मूल्यों और एक खुराक अंशशोधक साथ रेडियोधर्मिता का तपका की और गामा गिनती द्वारा क्रमशः मूल्यांकन है, साथ ही trypan नीले अपवर्जन और साथ IFN-गामा एलिसा प्रस्तुत कर रहे हैं कार्यक्षमता द्वारा सेल व्यवहार्यता पर 64 Cu-radiolabeling के प्रभाव का मूल्यांकन । विवो सेल ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव के लिए, दत्तक सेल हस्तांतरण के बाद पीईटी / सी टी द्वारा कोवा प्रेरित तीव्र वायु-मार्ग DTHR और छवि अधिग्रहण के एक माउस मॉडल की निकालना वर्णित हैं।

इसके अलावा, इस लेबलिंग दृष्टिकोण अलग रोग मॉडल, विभिन्न TCRs या झिल्ली से बंधा रिसेप्टर्स या अभिव्यक्ति मार्च के साथ ब्याज की सामान्य कोशिकाओं के साथ murine टी कोशिकाओं को हस्तांतरित किया जा सकताkers निरंतर झिल्ली 17 चक्कर अंतर्निहित।

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Protocol

सुरक्षा सावधानियाँ: जब रेडियोधर्मिता से निपटने, 2 इंच मोटी नेतृत्व ईंटों के पीछे 64 Cu की दुकान और गतिविधि को ले जाने के सभी जहाजों के लिए संबंधित परिरक्षण का उपयोग करें। उचित उपकरणों का उपयोग करें परोक्ष रूप से अनारक्षित स्रोतों को संभालने के लिए सीधा हाथ संपर्क से बचने और रेडियोधर्मी पदार्थ के संपर्क में कम करने के लिए। हमेशा विकिरण मात्रामापी निगरानी बैज और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं और अपने आप को देखने के और प्रदूषण के लिए काम कर क्षेत्र तुरंत यह पता करने के लिए। संभावित दूषित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण त्यागें ऐसा क्षेत्र है जहां रेडियोधर्मी पदार्थ प्रयोग किया जाता है छोड़ने से पहले। नेतृत्व परिरक्षण के पीछे पूरे रेडियोधर्मी कचरे स्टोर तक रेडियोधर्मी 64 Cu पर्याप्त निपटान से पहले (लगभग 10 आधा जीवन = 127 ज) सड़ा हुआ है।

1. 64 Cu उत्पादन

नोट: रेडियो आइसोटोप 64 Cu 64 नी (पी, एन) 64 Cu परमाणु प्रतिक्रिया एक Pett का उपयोग कर के माध्यम से उत्पादन किया जाता हैदौड़ साइक्लोट्रॉन मैकार्थी एट अल का एक संशोधित प्रोटोकॉल के अनुसार। 18।

  1. 64 Cu उत्पादन के लिए, 64 नी, जो 12.4 एमईवी की एक प्रोटॉन बीम के साथ 6 घंटे के लिए 30 μA के साथ, एक प्लैटिनम / इरिडियम प्लेट (90/10) पर electroplated है चमकाना।
  2. एक समर्पित polyetheretherketone (तिरछी नज़र) कक्ष में 100 डिग्री सेल्सियस के प्लैटिनम / इरिडियम लक्ष्य गर्म करें और 20 मिनट के लिए केंद्रित एचसीएल के 2 एमएल में सेते 64 Cu / 64 नी भंग करने के लिए।
  3. केंद्रित एचसीएल की एक और 1 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. आर्गन की एक धारा का उपयोग कर एचसीएल लुप्त हो और कमरे के तापमान को शांत चैम्बर।
  5. 4% 0.2 एम एचसीएल और 96% मेथनॉल (v / v) के 3 एमएल के साथ चैम्बर फ्लश और एक आयन एक्सचेंज स्तंभ था के लिए इस समाधान हस्तांतरण कम से कम 15 मिनट के लिए मेथनॉल में 4% 0.2 एम एचसीएल के साथ पहले से वातानुकूलित। प्रवाह के माध्यम से 64 नी पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
  6. धो 64 Cu 4% 0.2 एम एचसीएल मैं के साथ स्तंभ में बनाए रखाn मेथनॉल।
  7. एक संग्रह शीशी में 1.3 एम एचसीएल / 30% isopropanol (v / v) Elute 70% के साथ 64 Cu, आर्गन की एक धारा में समाधान लुप्त हो और शीशी कमरे के तापमान को शांत करते हैं।
  8. 0.1 एम एचसीएल के 140-210 μL में 64 Cu भंग।

2. DOTA साथ एंटीबॉडी संयुग्मन और इसके बाद 64 Cu-radiolabeling

नोट: chelator DOTA एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर रसायन विज्ञान के द्वारा mAb के कार्यात्मक अमीनो समूहों से लिंक किया जाएगा और बाद में संयुग्म 64 Cu 19 के साथ radiolabeled कर दिया जाएगा।

  1. 8 मिलीग्राम / एमएल के लिए KJ1-26-mAb की एकाग्रता समायोजित करें और diafiltrate 1 mAb की एमएल के खिलाफ 0.1 एम ना 2 HPO 4 पीएच 7.5 से 1.2 ग्राम आणविक भार का उपयोग कर एक chelating आयन एक्सचेंज राल की / एल के साथ इलाज समाधान काट ( MWCO 30 केडीए) केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट। बफर के 14 एमएल के साथ 3 बाद धोने चरणों को लागू करें। अंतिम चरण धोने के बाद,समाधान 1 एमएल के लिए फिर से ध्यान केंद्रित। आयुध डिपो 280nm मापन के द्वारा एंटीबॉडी एकाग्रता यों।
  2. 10 मिलीग्राम / एमएल से ठीक पहले प्रयोग की एकाग्रता पर ultrapure या पीसीआर ग्रेड पानी में एक DOTA-एन एच एस समाधान तैयार करें। शीशी खोलने से पहले कमरे के तापमान को समायोजित पानी संक्षेपण से बचने के लिए, और ध्यान से एक प्लास्टिक लेपनी का उपयोग कर DOTA-एन एच एस को दूर करते हैं। diafiltrated KJ1-26-mAb समाधान के 8 मिलीग्राम को यह DOTA-एन एच एस समाधान के 216 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण है, और एक लुढ़क मिक्सर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. 0.25 एम अमोनियम एसीटेट, पीएच 7.0, एक chelating आयन एक्सचेंज राल के 1.2 ग्राम / एल के साथ इलाज के खिलाफ DOTA-KJ1-26-mAb Diafiltrate, एक आणविक भार काट (MWCO 30 केडीए) केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई का उपयोग कर। 7 धोने चरणों को लागू करें। 1 एमएल के अंतिम मात्रा के mAb ध्यान लगाओ और फिर से आयुध डिपो 280nm मापन के द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापने।
  4. Radiolabeling से पहले, आकार-exc के माध्यम से पीबीएस को DOTA-KJ1-26-mAb के बफर का आदान-प्रदानlusion क्रोमैटोग्राफी जेल निस्पंदन स्तंभों का उपयोग। यह भी संभावित छोटे अणु दोष निकाल देता है।
  5. 10 मिमी एचसीएल में 100 MBq 64 CuCl 2 समाधान तैयार और 10x पीबीएस के साथ 6-7 पीएच को समायोजित करें। DOTA-KJ1-26-mAb के 200 माइक्रोग्राम जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, 0.1 एम सोडियम साइट्रेट (पीएच 5) मोबाइल चरण के रूप में साथ पतली परत क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन और autoradiography द्वारा विश्लेषण। कम से कम गतिविधि के 90% एंटीबॉडी के लिए बाध्य किया जाना चाहिए और इस प्रकार प्रारंभिक स्थान पर पता लगाया जा। अनबाउंड गतिविधि साइट्रेट आधारित मोबाइल चरण और विलायक सामने धारियाँ से chelated है। एक संदर्भ के लिए, 64 CuCl 2 के उपयोग की सलाह दी है।

3. चिकन ovalbumin विशेष TH1 (कोवा-TH1) सेल अलगाव और विस्तार

नोट: TH1 कोशिकाओं की संस्कृति, 17 पहले से प्रकाशित अध्ययन के अनुसार 16 में वर्णित है।

  1. Spleens और DO11.10 चूहों से Extraperitoneal लिम्फ नोड्स (LNS) को अलग।
    1. संघीय नियमों के अनुसार माउस बलिदान। 70% इथेनॉल के साथ पशु कीटाणुरहित और प्लीहा और LNS को हटाने के लिए चिपकने वाला टेप के साथ यह fixate। एक मंझला चीरा बनाने और पार्श्व प्रत्येक साइट के लिए यह खींच कर पेरिटोनियम से त्वचा को अलग।
    2. गर्भाशय ग्रीवा, अक्षीय, बाहु और वंक्षण LNS का पता लगाएँ। उन्हें कुंद संदंश के साथ निकालें और उन्हें 1% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) / पीबीएस बफर में जगह।
    3. पेरिटोनियम खोलें और तिल्ली का पता लगाने। अग्न्याशय और संयोजी ऊतक से तिल्ली अलग करें और 1% FCS / पीबीएस बफर में रखें। आगे मार्गदर्शन के लिए, संदर्भ 20,21 देखें।
  2. कीमा प्लीहा और LNS एक 50 एमएल में एक 40 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से एक सिरिंज के सवार का उपयोग कर टोपी ट्यूब पेंच। 10 एमएल 1% FCS / पीबीएस-बफर के साथ फिल्टर रिंस करें।
  3. 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने। Subsequently, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अमोनियम क्लोराइड-पोटेशियम (एसीके) lysis बफर (दाता पशु प्रति 1.5 एमएल) जोड़कर एरिथ्रोसाइट्स की lysis प्रदर्शन करते हैं। 8.5 एमएल 1% FCS / पीबीएस-बफर (दाता पशु प्रति) जोड़ें।
  4. 5 मिनट के लिए 400 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने। कोशिकाओं 10 एमएल 1% FCS / पीबीएस-बफर में, 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र धो लें और सतह पर तैरनेवाला हटाने।
  5. चुंबकीय सेल जुदाई के लिए, 1% FCS / पीबीएस-बफर में कोशिकाओं resuspend और CD4 + microbeads जोड़ें। बफर मात्रा और सीडी 4 + microbeads की राशि का उपयोग करने के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। फिर 1% FCS जोड़ने / 50 एमएल अप करने के लिए पीबीएस-बफ़र, 5 मिनट के लिए 400 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटाने।
  7. वाणिज्यिक चुंबकीय जुदाई स्तंभों और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक संबंधित चुंबक स्टैंड का उपयोग कर CD4 + T कोशिकाओं अलगाव के साथ आगे बढ़ें। एक सह करने के लिए eluted सीडी 4+ टी कोशिकाओं को समायोजित करेंncentration के 10 6 कोशिकाओं Dulbecco संशोधित ईगल के 10% गर्मी निष्क्रिय FCS, 2.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% HEPES बफर, 1% सदस्य अमीनो एसिड, 1% सोडियम पाइरूवेट, और 0.2% 2-मर्केप्टोइथेनाल और दुकान के साथ मध्यम में / एमएल उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  8. प्रतिजन-प्रस्तोता कोशिकाओं (APCs) तैयार करने के लिए एक 50 एमएल पेंच टोपी ट्यूब में स्तंभ मुक्ति इकट्ठा। 5 मिनट के लिए 400 XG में स्तंभ निर्वहन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने।
  9. , 10 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी CD8 (क्लोन: 5367.2) और 10 माइक्रोग्राम / एमएल माउस विरोधी चूहे mAb (MAR18.5) और 1.5 एमएल खरगोश पूरक: 10 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी सीडी 4 (Gk1.5 क्लोन) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. , 5 मिनट के लिए 400 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला हटाने और 3 एमएल मध्यम जोड़ें। कुल में 30 Gy के साथ एक γ-रे या एक्स-रे स्रोत पर APCs चमकाना। बाद में, 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए APCs समायोजित करें।
  11. एक 96 अच्छी तरह से pla पर 100 सीडी 4+ टी की μL कोशिकाओं और APCs के 100 μL जोड़ें10 माइक्रोग्राम / एमएल कोवा 323-339 पेप्टाइड, 10 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी आईएल 4-mAb, 0.3 माइक्रोन CPG1668-ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स और 5 यू / एमएल IL-2 के साथ एक साथ ते।
  12. 50 यू / एमएल IL-2 हर दूसरे दिन जोड़ें। 3 के बाद - 4 दिन, 24-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 96-अच्छी तरह प्लेटों से कोशिकाओं को हस्तांतरण। 24-अच्छी तरह से थाली पर एक अच्छी तरह से में 96-अच्छी तरह थाली से 3-5 कुओं को संयुक्त करें। : 1 अनुपात में एक 1 में 100 यू / एमएल IL-2 युक्त माध्यम जोड़ें।
  13. एक और 2-3 दिनों के बाद, 175 सेमी 2 सेल संस्कृति बोतल (फ्लास्क प्रति 1 x 48 अच्छी तरह से थाली) के लिए 48 अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं को हस्तांतरण। : 1 अनुपात में एक 1 में माध्यम के साथ भरें। 50 यू / एमएल IL-2 हर दूसरे दिन जोड़ें।
  14. सेल घनत्व के अनुसार कोशिकाओं को विभाजित और 50 यू / एमएल IL-2 हर दूसरे दिन जोड़ें। इस फैशन में, संस्कृति एक और 10 दिनों के लिए कोशिकाओं।

4. कोवा-TH1 सेल radiolabeling

नोट: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb intracellular रेडियोधर्मी लेबलिंग सक्षम करने के लिए सुसंस्कृत कोवा-TH1 कोशिकाओं को लागू किया जाएगा।

  1. Cova-TH1 ce के लिएll radiolabeling, मृत मात्रा एक खुराक अंशशोधक का उपयोग किए बिना एक सिरिंज में radiolabeled 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 37 MBq आकर्षित। जोड़े 1 एमएल खारा एक 37 MBq / एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए।
  2. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर मध्यम में कोवा-TH1 कोशिकाओं को निलंबित और एक 48-अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 0.5 एमएल जोड़ें।
  3. / एमएल 64 48-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए Cu-DOTA-KJ1-26-mAb समाधान ताज़ा तैयार 37 MBq के 20 μL जोड़ें। लेबलिंग के लिए अंतिम अनुपात 520 μL की मात्रा में 10 6 कोशिकाओं प्रति 0.7 MBq है। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 7.5% सीओ 2।
  4. ऊष्मायन के बाद, ध्यान से प्रत्येक में कोशिकाओं अच्छी तरह से resuspend और एक 50 एमएल में 48 अच्छी तरह से थाली से सेल निलंबन हस्तांतरण टोपी ट्यूब पेंच। सेल नुकसान को कम करने के लिए, पूर्व गर्म माध्यम के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला।
  5. 5 मिनट के लिए 400 XG में कोवा-TH1 सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, और कोशिकाओं 10 में एमएल prewarmed पीबीएस resuspend। एक एक निकालेंसेल गिनती के लिए सेल निलंबन की liquot। कपड़े धोने की प्रक्रिया दोहराएं।
  6. trypan नीले रंग धुंधला के साथ एक उपयुक्त कमजोर पड़ने में व्यवहार्य कोवा-TH1 कोशिकाओं की गणना करें।
  7. 5 x 10 7 कोशिकाओं को सेल एकाग्रता समायोजित / इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) 200 μL पीबीएस में 10 7 कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए एमएल।
  8. चरण दोहराएं 4.3-4.5 गतिविधि की मात्रा में, उदाहरण के लिए, 1.4 MBq या 10 6 कोशिकाओं प्रति 2.1 MBq में वृद्धि के साथ कोवा-TH1 कोशिकाओं radiolabel करने के लिए।
    1. 10 6 कोशिकाओं प्रति 1.4 MBq साथ कोशिकाओं radiolabel करने के लिए, 10 6 कोशिकाओं प्रति 2.1 MBq साथ radiolabeling के लिए 37 MBq / एमएल 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb समाधान और 60 μL के 40 μL का उपयोग करें। 0.7 MBq, 1.4 MBq और 2.1 MBq 64 Cu-PTSM साथ चरणों 4.3-4.7 प्रदर्शन करना लेकिन तुलनात्मक जांच 17 के लिए 3 एच के लेबलिंग के समय में वृद्धि।
    2. चरण 5 गतिविधि की सर्वोत्कृष्ट मात्रा निर्धारित करने के लिए आगे बढ़ें।

5. कोवा-TH1 कोशिकाओं पर Radiolabel का प्रभाव की इन विट्रो मूल्यांकन में

नोट: TH1 कोशिकाओं पर radiolabel के प्रभाव के लक्षण वर्णन व्यवहार्यता के लिए trypan नीले अपवर्जन परख के माध्यम से किया जाता है, कार्यक्षमता का आकलन और apoptosis 16, 17 के शामिल होने के लिए पीई-Annexin वी धुंधला के लिए IFN-गामा एलिसा। intracellular तेज और रेडियोधर्मिता का तपका का निर्धारण भी नीचे वर्णित है। तुलना के लिए, 64 Cu-PTSM लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. Trypan नीले अपवर्जन द्वारा व्यवहार्यता पर प्रभाव
    1. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए क्रमश: कम से कम 18 x 10 6 कोवा-TH1 कोशिकाओं 0.7 MBq / 10 6 कोशिकाओं, 1.4 MBq / 10 6 कोशिकाओं और 2.1 MBq / 10 6 कोशिकाओं के साथ radiolabeled समायोजित करें और 5.1 चरणों को पूरा करने। प्रत्येक गतिविधि खुराक के लिए 2-5.1.7। गैर radioacti का प्रयोग करेंve KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं और लेबल हटाया गया कोवा-TH1 कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में।
    2. एक 24 अच्छी तरह से थाली के 9 कुओं में सेल समाधान के Pipet 1 एमएल।
    3. में 3 अलग 15 एमएल टोपी ट्यूबों, प्रारंभिक radiolabeling के बाद 3 घंटे पेंच 3 कुओं की सामग्री इकट्ठा।
    4. पूर्व गर्म माध्यम के साथ अब खाली कुओं कुल्ला सेल नुकसान को कम करने और संबंधित 15 एमएल के माध्यम से जोड़ने के लिए कदम 5.1.3 से टोपी ट्यूब पेंच।
    5. 5 मिनट के लिए 400 XG पर 15 एमएल ट्यूबों अपकेंद्रित्र और पूर्व गर्म माध्यम के 1 एमएल में जिसके परिणामस्वरूप सेल गोली resuspend।
    6. प्रत्येक 15 एमएल ट्यूब के लिए अलग से trypan नीले रंग में दोनों व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं की गणना करें और व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत की गणना।
    7. दोहराएँ 5.1.3-5.1.6 24 और 48 घंटे के बाद 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiolabeling कदम दूर है।
  2. प्रभाव कार्यक्षमता पर IFN-गामा एलिसा द्वारा निर्धारित
    नोट: IFN-γ productio पर 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiolabel के प्रभाव का आकलन करने के लिएn कार्यशीलता का एक मार्कर के रूप में, एक व्यावसायिक आपूर्तिकर्ता से एक IFN-γ एलिसा करते हैं और अधिक जानकारी के लिए संदर्भ के लिए 17 देखें।
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली, 3 ज पद 64 0.7 MBq, 1.4 MBq या 2.1 MBq साथ कोवा-TH1 कोशिकाओं के Cu-DOTA-KJ1-26 radiolabeling पर मध्यम के 100 μL में 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं को तितर-बितर। नियंत्रण के रूप में लेबल नहीं किया गया, गैर रेडियोधर्मी KJ1-26-mAb लेबल या 64 Cu-PTSM लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं का प्रयोग करें।
    2. 10 माइक्रोग्राम / कोवा पेप्टाइड, 5 यू / एमएल IL-2 और 5x10 में 5 APCs 100 के एमएल के साथ 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल 100 μL माध्यम में कोवा-TH1 कोशिकाओं में IFN-γ उत्पादन को प्रोत्साहित 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मध्यम और 7.5% सीओ 2 की μL। इसके अलावा नियंत्रण कोवा पेप्टाइड के अलावा बिना अन्य शर्तों हो सकता है।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलिसा से सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण करें।
    4. दोहराएँ कदम 5.2.2। 5.2.3 करने के लिए। 24 और 48 घंटे लेबलिंग प्रक्रिया के बाद में।
  3. Apoptosis की प्रेरण फ्लो के लिए पीई-Annexin वी धुंधला द्वारा निर्धारित
    नोट: कोशिका झिल्ली पर phosphatidyl सेरीन प्रदर्शनी के लिए Annexin वी के साथ धुंधला हो जाना से पहले 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiolabel द्वारा apoptosis प्रेरण का आकलन, प्रवाह cytometry के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग और सेल के नमूने तैयार करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
    1. 3, 24 और 48 घंटे के बाद 64 कोवा-TH1 कोशिकाओं के Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiolabeling, कम से कम 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल के साथ कोवा-TH1 कोशिकाओं के साथ दाग triplicates पर निर्माता के निर्देशों को और अनुसार Annexin वी किट अगले एक घंटे में विश्लेषण। नियंत्रण के रूप में गैर रेडियोधर्मी KJ1-26-mAb लेबल, 64 Cu-PTSM लेबल और लेबल-रहित कोवा-TH1 कोशिकाओं का प्रयोग करें। अधिक जानकारी के लिए संदर्भ के लिए 17 देखें।
  4. तेज और तपका
    नोट: 64 Cu-DOTA- की तेजकोशिकाओं में KJ1-26-mAb radiolabeling के बाद 48 घंटे के एक खुराक अंशशोधक में मापा जाता है और रेडियोधर्मिता का तपका एक γ गिनती परख 0, 5, 24 में मापा जाता है, और।
    1. 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं, संबंधित सतह पर तैरनेवाला और धोने कदम के लिए दस γ गिनती ट्यूबों प्रत्येक तैयार करें।
    2. स्थानांतरण 10 6 64 माध्यम के 1 एमएल में दस γ गिनती ट्यूबों में से प्रत्येक में सीधे radiolabeling के बाद Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं। 5, 24 और radiolabeling के बाद 48 घंटे के समय अंक में से प्रत्येक के लिए, 37 पर एक इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों पर कम से कम 10 मध्यम में 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं रखने डिग्री सेल्सियस और 7.5% सीओ 2।
    3. 5 मिनट के लिए 400 XG में γ गिनती ट्यूबों अपकेंद्रित्र और दस नए γ गिनती नलियों में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
    4. 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb एक की अबाध अंश को हटाने के लिए 1 एमएल मध्यम में एक बार कोशिकाओं को धो लेंd दस नए γ गिनती ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
    5. Cova-TH1 कोशिकाओं को 1 एमएल नए माध्यम जोड़ें और एक खुराक अंशशोधक में प्रारंभिक तेज मूल्य निर्धारण करते हैं। ट्यूब भी 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है और 7.5% सीओ 2।
    6. चरण दोहराएं 5.4.2 निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक γ-काउंटर में 5, 24 और 48 घंटे के बाद 5.4.5 और सभी ट्यूबों को मापने के लिए। रेडियोधर्मी क्षय के लिए और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सही करने के लिए, रेडियोधर्मिता का एक परिभाषित खुराक के साथ एक मानक का उपयोग करें।

6. ओवीए प्रेरित तीव्र Airway DTHR

नोट: माइग्रेशन गतिशीलता और सूजन की साइट के लिए adoptively हस्तांतरित और radiolabeled कोवा-TH1 कोशिकाओं के होमिंग पैटर्न कल्पना और कोवा प्रेरित एयरवे-DTHR 16, 17 के लिए एक पशु मॉडल में मात्रा निर्धारित की जाएगी।

  1. 8 सप्ताह की उम्र में BALB / ग चूहों इंजेक्षन 150 μL अल का एक मिश्रण के साथ आईपीuminum जेल / 50 μL कोवा-समाधान (50 μL पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम) चूहों रक्षित करने के लिए।
  2. दो हफ्ते टीकाकरण के बाद, आईपी इंजेक्शन द्वारा 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 5 मिलीग्राम / किग्रा xylazine के साथ चूहों anesthetize। उनकी पीठ पर प्रयोगात्मक चूहों रखें और धीरे से 100 माइक्रोग्राम कोवा जानवरों की नाक में 50 μL पीबीएस में भंग pipet। जानवरों गिरावट के समाधान ड्रॉप श्वास होगा।
  3. 24 घंटे के बाद दोहराएँ। मजबूत एयरवे DTHR inductions के लिए, 48 घंटे के बाद फिर से दोहराएँ।
  4. हस्तांतरित कोवा-TH1 कोशिकाओं के विशिष्ट प्रवास का विश्लेषण करने के लिए, नियंत्रण के रूप में तुर्की-या तीतर-ओवीए साथ एयरवे-DTHR प्रेरित करते हैं। इसलिए, दोहराने संबंधित ओवीए प्रोटीन का उपयोग करके 6.1-6.3 कदम दूर है।

7. विवो इमेजिंग में पीईटी / सी टी का उपयोग करना

नोट: 64 कोवा-DTHR में Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं के vivo इमेजिंग में रोगग्रस्त चूहों और नियंत्रण littermates विशिष्ट होमिंग और मील दर्शाता हैCova-TH1 कोशिकाओं के Gration गतिशीलता। इसलिए, स्थिर पीईटी स्कैन प्राप्त और संरचनात्मक सीटी क्रमिक रूप से 3, 24 और 48 घंटे के बाद दत्तक सेल हस्तांतरण स्कैन करता है।

  1. सीधे radiolabeling के बाद, 200 μL में 10 7 कोशिकाओं के आईपी इंजेक्शन के लिए 5 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं को समायोजित करें।
  2. एक 1 एमएल सिरिंज और एक 30 गेज सुई का प्रयोग, 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 सेल निलंबन के 200 μL आकर्षित और इंजेक्षन कोशिकाओं 4 के बीच कोवा-DTHR-रोगग्रस्त पशुओं में आईपी वें और 5 वीं निपल। रेडियोधर्मिता की कुल इंजेक्शन राशि निर्धारित करने के लिए, पहले और इंजेक्शन के बाद एक खुराक अंशशोधक में सिरिंज को मापने।
  3. एक तापमान नियंत्रित संज्ञाहरण बॉक्स में: 100% ऑक्सीजन में 1.5% isoflurane के साथ चूहों, वांछित तेज समय से पहले 10 मिनट के चतनाशून्य, (0.7 एल / मिनट प्रवाह दर)।
  4. इस बीच, सह पंजीकरण की सुविधा के लिएछवि विश्लेषण के दौरान पीईटी और सीटी छवियों की, कांच 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb समाधान या माउस बिस्तर के नीचे मुक्त 64 CuCl 2 समाधान युक्त केशिकाओं को ठीक।
    1. इसलिए, 0.37 MBq / एमएल का एक समाधान तैयार करने और इस समाधान के साथ 10 μL की मात्रा के साथ कांच केशिकाओं भरें। चूंकि सेल व्युत्पन्न रेडियोधर्मिता संकेत स्वाभाविक कमजोर कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करें कि मार्कर चूहों में सेल व्युत्पन्न संकेतों के साथ हस्तक्षेप नहीं कर रहे हैं बनाने के लिए गतिविधि की उच्च मात्रा का उपयोग नहीं करते।
  5. शल्य सहिष्णुता तक पहुँचने के बाद, के रूप में हिंद अंग की पेडल वापसी पलटा के नुकसान ने संकेत दिया, संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए एक उपयुक्त ट्यूबिंग प्रणाली से लैस एक पीईटी और सीटी-संगत छोटे पशु बिस्तर पर माउस स्थानांतरित करें।
  6. कपास के फाहे और शल्य चिकित्सा टेप का इस्तेमाल छोटे पशु बिस्तर पर माउस को स्थिर। आँख मरहम लागू आँखों के सूखने से बचने के लिए।
  7. , पीईटी स्कैनर के लिए माउस बिस्तर स्थानांतरण एक केंद्रित के साथ दृश्य के क्षेत्र केंद्रफेफड़ों पर है और 350-650 कीव के एक ऊर्जा खिड़की के साथ एक 20 मिनट के स्थिर PET स्कैन प्राप्त।
  8. सीटी स्कैनर के लिए माउस बिस्तर पर स्थानांतरित करें। स्काउट दृश्य के माध्यम से, फेफड़ों पर दृश्य के क्षेत्र पर केंद्रित हों। एक 360 डिग्री 350 एमएस की एक प्रदर्शनी समय और कारक 4 binning के साथ "कदम और गोली मार" मोड में रोटेशन के दौरान 360 अनुमानों के माध्यम से एक समतल सीटी छवि प्राप्त।

8. छवि विश्लेषण

  1. 75 सुक्ष्ममापी के एक पिक्सेल आकार के साथ एक 3 डी छवि में सांख्यिकीय पुनरावृत्ति आदेश दिया सबसेट उम्मीद अधिकतमकरण (OSEM) 2 डी एल्गोरिथ्म और सीटी स्कैन लगाने से पीईटी सूची मोड डेटा को फिर से संगठित।
  2. एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में छवि सह पंजीकरण (जैसे Inveon रिसर्च कार्यस्थल या Pmod) के लिए, स्वत: सह पंजीकरण उपकरण का उपयोग। इस विफल रहता है, मार्गदर्शन के रूप में माउस बिस्तर के नीचे कांच केशिकाओं का उपयोग स्थानिक सह रजिस्टर करने के लिए पुनर्निर्मित किया पीईटी और सीटी छवियों अक्षीय, राज्याभिषेक और बाण ध्यान में रखते हुए।
  3. पीईटी छवियों को ठीक करेंरेडियोधर्मी क्षय रेडियोधर्मी क्षय कानून और 12.7 घंटे में रेडियोन्यूक्लाइड 64 Cu के आधे समय प्रयोग करने के लिए। छवि सामान्यीकरण के लिए, एक संदर्भ के रूप में एक छवि (ए) का चयन और संबंधित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में छवि प्रदर्शन की तीव्रता को समायोजित करें।
    1. अन्य चित्रों के लिए मूल्यों को सिर्फ संदर्भ छवि (ए) के लिए निर्धारित करते हैं, इंजेक्शन गतिविधि (ए) और इंजेक्शन गतिविधि (एक्स), निम्न समीकरण का उपयोग अन्य छवियों को सामान्य उपयोग: (इंजेक्शन गतिविधि (एक्स) / इंजेक्शन गतिविधि ( ए)) x तीव्रता मूल्यों (ए)।
  4. फेफड़े और perithymic LNS की सामान्यीकृत पीईटी संकेत पर ब्याज (VOI) के 3 डी की मात्रा ड्रा।
  5. निर्धारित सेमी 3 (% आईडी / सेमी 3) निम्न समीकरण का उपयोग कर प्रति प्रतिशत इंजेक्शन की खुराक: (माउस में VOI / समग्र गतिविधि में कार्य करना हो) x 100 आगे मार्गदर्शन के लिए छवि विश्लेषण के विषय में, संदर्भ 22 देखते हैं, 23।

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Representative Results

चित्रा 1 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb और इन विट्रो के लिए और इन विवो इस प्रोटोकॉल में शामिल किया गया अध्ययन में प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ कोवा-TH1 कोशिकाओं की लेबलिंग का सारांश है।

आकृति 1
चित्रा 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबलिंग प्रक्रिया और प्रायोगिक डिजाइन। 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb साथ रेडियोधर्मी सेल लेबलिंग के (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb TH1 कोशिकाओं की कोशिका की सतह पर कोवा-TCR रिसेप्टरों को बांध और 24 घंटे के भीतर रिसेप्टर के साथ भली भाँति है। Cova-TCRs radiolabeling के बाद फिर से व्यक्त कर रहे हैं 24 घंटे। (बी) सीडी 4+ टी कोशिकाओं, पृथक विस्तार किया है और साथ 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb इन विट्रो radiolabeled रहे थे। तेज और तपका मूल्यों werई एक खुराक अंशशोधक और γ गिनती द्वारा निर्धारित किया। सेल व्यवहार्यता पर रेडियोधर्मी एंटीबॉडी का प्रभाव phycoerythrin (पीई) -Annexin वी धुंधला के साथ apoptosis के शामिल होने पर IFN-गामा एलिसा के साथ, trypan नीले रंग धुंधला के साथ आकलन किया गया कार्यक्षमता पर, और। (सी) कोवा-वायु-मार्ग DHTR महिला BALB / ग चूहों में प्रेरित किया गया था। 10 7 TH1 सेल adoptively सीधे radiolabeling के बाद कोवा-वायु-मार्ग DHTR-रोगग्रस्त पशुओं में स्थानांतरित किया गया। पीईटी / सी टी छवियों 3, 24 और 48 घंटे के बाद दत्तक सेल हस्तांतरण प्राप्त हुए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb साथ TH1 कोशिकाओं के सफल intracellular लेबलिंग इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री (चित्रा 2A) द्वारा पुष्टि की गई। 64 Cu-DOTA-KJ1-26 एंटीबॉडी (हरा) के साथ सह-स्थानीयकृत थाradiolabeling के बाद कोशिका झिल्ली 3 h की रफ्तार से CD3, जबकि कोशिका झिल्ली पर mAb का संकेत 24 घंटे (पीला) पर केवल बेहोश था। Radiolabeling के बाद 48 घंटे में 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR जटिल TH1 कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य में एक मजबूत संकेत के साथ endocytosis के माध्यम से भली भाँति किया गया था। 0.7 MBq केवल 8% तक कम TH1 कोशिकाओं की व्यवहार्यता, जबकि 1.4 MBq और 2.1 MBq 64 की अधिक मात्रा Cu-DOTA-KJ1-26-mAb और अधिक स्पष्ट प्रभाव पड़ा की लागू किया रेडियोधर्मी खुराक। 64 Cu-PTSM, तथापि, 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb का कोई महत्वपूर्ण लाभ मनाया गया (चित्रा 2 बी) के साथ radiolabeling की तुलना में। 64 Cu-एंटीबॉडी radiolabeled कोशिकाओं कार्यक्षमता में थोड़ा नुकसान से पता चला है के रूप में कम रेडियोधर्मिता का तपका (चित्रा 2 डी), IFN-γ स्राव (चित्रा 2C) द्वारा दिखाए गए, और कम apoptosis (चित्रा 2 ई) के शामिल होने 64 Cu-PTSM लेबल TH1 की तुलना कोशिकाओं।


चित्र 2: रेडियोधर्मी TH1 सेल लेबलिंग की इन विट्रो मूल्यांकन में 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb साथ। (ए) Confocal माइक्रोस्कोपी 64 कोवा-TH1 कोशिकाओं में Cu-DOTA-KJ1-26-MABS (हरा) (कोशिका झिल्ली, लाल) के intracellular तेज साबित होता है 24 घंटे के प्रारंभिक लेबलिंग के बाद भीतर (यह आंकड़ा संदर्भ 17 से संशोधित किया गया है) । (बी) 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb या 64 Cu-PTSM के रेडियोधर्मी लेबलिंग खुराक की अनुमापन व्यवहार्यता पर एक समान प्रभाव के रूप में trypan नीले अपवर्जन 24 घंटे के बाद लेबलिंग द्वारा पता लगाया का पता चला। सेल लेबलिंग के लिए 0.7 MBq के उपयोग व्यवहार्यता का सबसे कम दोष प्रेरित (प्रतिशत में ± एसडी मतलब;। यह आंकड़ा संदर्भ 16, 17 से संशोधित किया गया है (सी) रेडियोधर्मी लेबलिंग का अनुमापन करना64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb या 64 Cu-PTSM के सत्र के रूप में IFN-गामा एलिसा 24 घंटे के बाद लेबलिंग द्वारा पता लगाया, 64 Cu-PTSM लेबलिंग के बाद कार्यशीलता का एक मजबूत हानि का पता चला। 64 सेल लेबलिंग के लिए Cu-DOTA-KJ1-26-mAb की बढ़ती खुराक कार्यक्षमता पर कोई प्रभाव पड़ता है था (± प्रतिशत में एसडी मतलब; आंकड़े: विद्यार्थी t- परीक्षण, * पी <0.05, ** p <0.01, ** * पी <0.001, यह आंकड़ा, संदर्भ 16 से संशोधित किया गया है 17)। Radiolabeled कोशिकाओं (γ-गिनती जारी है) (डी) तपका माप 64 Cu-PTSM 5 घंटे और 24 घंटे के बाद लेबलिंग की तुलना में 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb के एक उच्च लेबलिंग स्थिरता से पता चला है (± प्रतिशत में एसडी मतलब; आँकड़े : विद्यार्थी t- परीक्षण; *** पी <0.001, यह आंकड़ा 17 से संशोधित किया गया है)। (ई) संबंधित फ्लो (पीई-Annexin वी) आरेख एक उच्च एपी से संकेत मिलता हैoptosis प्रेरण 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-लेबलिंग की तुलना में 24 घंटे 64 Cu-PTSM लेबलिंग के बाद (यह आंकड़ा संदर्भ 17 से संशोधित किया गया है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Cova-DTHR-रोगग्रस्त पशुओं और अनुपचारित नियंत्रण, उच्च संकल्प स्थिर पीईटी और संरचनात्मक सीटी छवियों में 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के बाद प्राप्त हुए थे। छवि विश्लेषण के लिए, छवियों गिलास 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (चित्रा 3 ए) की एक छोटी राशि युक्त केशिकाओं की मदद से, कोरोनल अक्षीय और सैजिटल ध्यान में रखते हुए आपस में जुड़े थे। VOIs प्रतिशत की गणना करने के क्षय-ठीक किया और सामान्यीकृत पीईटी छवियों पर फेफड़े और perithymic LNS पर तैयार किये गए थे सेमी 3 प्रति इंजेक्शन की खुराक(चित्रा 3 बी)।

चित्र तीन
चित्र 3: पीईटी / सी टी-सह-पंजीकरण और विश्लेषण। (ए) पीईटी और सीटी छवियों छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सह दर्ज किए गए थे। सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित पंजीकरण विफल है, तो छवियां कांच केशिकाओं (मार्कर), रेडियोधर्मिता से भरा है और पशु बिस्तर के नीचे तय की पीईटी और सीटी संकेतों ओवरले करके जुड़े हुए थे। (बी) VOIs perityhmic और फेफड़े के LNS की सुधारा और सामान्यीकृत पीईटी संकेतों पर रखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Cova-TH1 कोशिका प्रवास एयरवे DTHR में कोवा प्रस्तुति साइटों के रूप में फेफड़े और perithymic एल.एन. को ट्रैक किया गया था। विवो पीईटी संकेत डी में64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb लेबल कोवा-TH1 कोशिकाओं से rived 64 Cu-PTSM लेबल कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) से संकेत की तुलना में काफी अधिक थी। फेफड़े और perithymic LNS में कोवा-TH1 सेल तेज मूल्यों में काफी अनुपचारित नियंत्रण littermates (चित्रा 4 बी) की तुलना में DTHR-रोगग्रस्त पशुओं में वृद्धि हुई थी।

चित्रा 4
चित्र 4: इन विवो पीईटी / सी टी द्वारा Airway DTHR मॉडल में कोवा-TH1 सेल ट्रैकिंग। (ए) adoptively के संबंधित पीईटी / सी टी छवियों का तबादला कोवा-TH1 कोशिकाओं है, जो पहले 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb या 64 Cu-PTSM के साथ लेबल रहे थे कोवा-DTHR-रोगग्रस्त या अनुपचारित चूहों में,। हस्तांतरित कोवा-TH1 कोशिकाओं फेफड़े और perithymic LNS करने असर पड़ा। (बी) कोवा-TH1 कोशिकाओं के होमिंग साइटों के मात्रात्मक विश्लेषण एक उच्च ज साबित कर दियासूजन के ऊतकों को oming (± एसडी मतलब; आंकड़े: विद्यार्थी t- परीक्षण, * पी <0.05, ** p <0.01)। 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb साथ लेबलिंग एक उच्च संवेदनशीलता साबित कर दिया (वृद्धि हुई% आईडी / सेमी 3) विभिन्न होमिंग साइटों में 64 Cu-PTSM की तुलना में (± एसडी, आंकड़ों का क्या अर्थ: विद्यार्थी t- परीक्षण; # पी <0.05, ## p <0.01, ### पी <0.001)। यह आंकड़ा संदर्भ 16, 17 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय और आसान तरीका स्थिरतापूर्वक पीईटी द्वारा इन विवो ट्रैकिंग के लिए कोशिकाओं radiolabel को प्रस्तुत करता है। इस विधि, कोवा-TH1 कोशिकाओं, पृथक और दाता चूहों से इन विट्रो में विस्तार का उपयोग, 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb और उनके होमिंग साथ radiolabeled हो सकता है एक में कोवा प्रस्तुति की साइटों के रूप में फेफड़े और perithymic LNS को ट्रैक किया गया था Cova प्रेरित तीव्र वायु-मार्ग DTHR।

chelator साथ mAb के संशोधन तीव्रता और कुशलता से काम करने और amines के निशान के बिना अल्ट्रा शुद्ध समाधान के उपयोग की आवश्यकता। समाधान एक chelating आयन एक्सचेंज राल के साथ इलाज किया गया DOTA-एन एच एस सक्रिय एस्टर का उचित संयोजन सुनिश्चित करने के लिए mAb के अवशेषों amine करने के लिए। एक intracellular radiolabel रूप chelator-संयुग्मित mAb गैर विशिष्ट सेल लेबलिंग एजेंटों के उपयोग पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, mAb उत्कृष्ट विशिष्टता एक परिभाषित सेल आबादी का निशाना बनाया लेबलिंग के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है। mAbखुद साइटोटोक्सिक नहीं है और व्यवहार्यता या सेल की कार्यक्षमता पर कोई हानिकारक प्रभाव पड़ता है। इसके बाद, कोशिकाओं से रेडियोधर्मिता का तपका काफी पीईटी छवियों 17, 24 का संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात में सुधार कम हो गया था। एक अलग विशिष्टता के साथ एक mAb का चयन करके, इस विधि को आसानी से इस तरह के CD8 + टीआईएल या CD14 + monocytes के रूप में ब्याज की अन्य सेल आबादी के हस्तांतरणीय है। इसके अलावा, इस सेल लेबलिंग दृष्टिकोण भड़काऊ मानव रोगों (जैसे, गठिया और ब्रोन्कियल अस्थमा) या विभिन्न मानव प्रकार के कैंसर के लिए पशु मॉडल के विभिन्न पशु मॉडल में सेल ट्रैकिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह लेबलिंग विधि, तथापि, झिल्ली से बंधा रिसेप्टर्स या लक्ष्य के रूप में differentiations मार्कर तक ही सीमित है के बाद से MABS निष्क्रिय कोशिका झिल्ली में फैलाना नहीं है। लक्ष्य या, की सक्रियता प्रेरित internalization बस, झिल्ली चक्कर लाभदायक है। एmAb और लक्ष्य के बीच उच्च उत्सुकता है, तथापि, यह भी में vivo इमेजिंग के लिए पर्याप्त हो सकता है, संभवतः पृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए एक कम संकेत के साथ।

हमारे प्रयोगों के लिए एक chelator के रूप में DOTA के चुनाव जल्दी काम 64 Cu 25 के प्रयोग पर आधारित था। हालांकि, इस बीच में DOTA इस आइसोटोप के लिए एक इष्टतम chelator नहीं हो सकता है, सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस 26 transchelation द्वारा यकृत में नहीं बल्कि उच्च गतिविधि तेज करने के लिए अग्रणी दिखाया गया था। कोशिकाओं है कि उसके बाद adoptively जिगर को 64 Cu जारी है और परिवहन के खतरे को कम करना चाहिए स्थानांतरित कर रहे हैं की इन विट्रो लेबलिंग के लिए radiolabeled एंटीबॉडी का उपयोग हालांकि, आधुनिक chelators 64 Cu के लिए अनुकूलित, 1,4,7-triazacyclononane, 1-glutaric एसिड की तरह -4,7-एसिटिक एसिड (NODAGA) या 1,4,7-triazacyclononane-triacetic एसिड (नोटा), खासकर हमारे विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता आगे प्राप्त डेटा 27 की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए 64 Cu (जैसे एन chlorosuccinimide (NCS)) या अन्य आइसोटोप, जैसे 89 Zr (।; डीएफओ जैसे desferrioxamine) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

रेडियो आइसोटोप के रूप में 64 Cu के चुनाव तथ्य विवो सेल प्रवास और होमिंग में चयापचय परिवर्तन आमतौर पर पीईटी ने उतारी की तुलना में एक नहीं बल्कि धीमी प्रक्रिया है कि पर आधारित था। 12.7 घंटा की आधा जीवन समय के साथ 64 Cu 48 घंटे के बाद इंजेक्शन से अधिक कोशिका प्रवास के बार-बार इमेजिंग सक्षम बनाता है। 64 Cu उत्पादन के लिए, यह धातु का पता लगाने आयनों के बिना उच्च ग्रेड समाधान का उपयोग करने के लिए 64 Cu की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, 64 Cu की शुद्धता का स्तर है कि प्रोटीन radiolabeling और फलस्वरूप इमेजिंग में बाधा के लिए 64 Cu समाधान का एक कम विशिष्ट गतिविधि का नेतृत्व कर सकेगी multivalent धातु आयन दोष के बाद से DOTA-mAb की radiolabeling के लिए उच्च महत्व का है। हालांकि 64 Cu एक सी पैदा करता हैबेहद ऊर्जावान, साइटोटोक्सिक बरमा इलेक्ट्रॉन के gnificant प्रतिशत जब 28 खस्ताहाल, रेडियो आइसोटोप का एक समायोजित खुराक अच्छी तरह से कोशिकाओं द्वारा सहन के रूप में radiolabeling के बाद व्यवहार्यता और कार्यक्षमता और कम apoptosis प्रेरण पर न्यूनतम प्रभाव का प्रतिनिधित्व करती है। फिर भी, यह शुरू में गतिविधि अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए radiolabeling के लिए इस्तेमाल किया खुराक अनुमापन और radiolabeling प्रोटोकॉल समायोजित करने के लिए स्पष्ट रूप से सलाह दी जाती है। इन विट्रो मूल्यांकन विधियों में तीव्र और आसान प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया गया है, कोशिकाओं की अपोप्तोटिक अंशों के निर्धारण के लिए trypan नीले अपवर्जन और पीई-Annexin वी के साथ धुंधला द्वारा व्यवहार्यता का निर्धारण भी शामिल है। दोनों ही तरीकों से अपेक्षाकृत सस्ती हैं और आसानी से सुलभ प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करें। रहने और इस तरह के 7-Aminoactinomycin (7-एएडी) के रूप में मृत कोशिकाओं के भेदभाव के लिए एक डाई के साथ संयोजन पीई-Annexin वी धुंधला एक प्रयोगात्मक काएं में व्यवहार्यता और apoptosis के निर्धारण के लिए अनुमति होगीपी। एक वैकल्पिक लेबल टी कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के रूप में, एक 3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT-) परख सेल चयापचय गतिविधि का आकलन किया जा सकता है। एक खुराक अंशशोधक और γ-काउंटर के साथ तेज और तपका मूल्यों के मूल्यांकन और अधिक उन्नत, लेकिन अभी भी तेजी से और सस्ते प्राप्त करने के लिए के बाद से लगभग हर रेडियोधर्मिता के साथ काम कर प्रयोगशाला साइट पर संबंधित हार्डवेयर है कर रहे हैं। जीन अनुक्रमण या माइक्रोचिप आधारित विधियों अधिक विस्तृत डेटा प्राप्त करेगी। इन विधियों, हालांकि, हमेशा आसानी से सुलभ है, उचित विशेषज्ञता की जरूरत है और सबसे अधिक बार उच्च लागत से जुड़ी हैं।

हालांकि पीईटी सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक 29 की तरह एक सेलुलर संकल्प तक पहुँचने में सक्षम नहीं है, यह जानवरों या मनुष्यों 8 के भीतर कोशिकाओं की भी कम संख्या का पता लगाने के लिए picomolar रेंज में उत्कृष्ट संवेदनशीलता प्रदान करता है। इस तरह के ऑप्टिकल के रूप में अन्य गैर इनवेसिव इमेजिंग तकनीक की तुलना मेंएल इमेजिंग, पीईटी मात्रात्मक, प्रवेश गहराई में सीमित और उच्च गुणवत्ता छवियों तीन आयामी प्रस्तावों के साथ प्रदान करता है नहीं है। सीटी के संरचनात्मक सटीकता के साथ पीईटी की उच्च संवेदनशीलता का मेल सेल प्रवास के उच्च परिशुद्धता इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इन विवो डेटा आसानी से कई पूर्व विवो तरीकों biodistribution विश्लेषण के लिए γ गिनती सहित द्वारा मान्य किया जा सकता है। cryosections और cryosections के बाद ऊतकीय धुंधला की autoradiography hematoxylin और eosin धुंधला से पहचान प्रतिरक्षा सेल पैठ के साथ autoradiographic गतिविधि नक्शा सहसंबंधी आच्छादित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों प्रयोगों और डेटा विश्लेषण के दौरान समर्थन के लिए डॉ जूलिया मैनहेम, वॉल्टर एहरलिचमैन, रमोना स्टम, Funda रेती, डेनियल बुकाला, मारेन हारांट के साथ-साथ नेताली एल्टमेयर धन्यवाद। इस काम वार्नर सीमेन्स-फाउंडेशन, SFB685 के माध्यम से DFG (परियोजना बी -6) और भाग्य (2309-0-0) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber WKL Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 mL Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitroevaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30 G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µL VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 122 छोटे पशु इमेजिंग सेल लेबलिंग गैर इनवेसिव पीईटी / सीटी TH1 टी कोशिकाओं वायु-मार्ग देरी प्रकार अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया
म्यूरीन लिम्फोसाइट लेबलिंग द्वारा<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर के लिए लक्ष्य निर्धारण<em&gt; में विवो</em&gt; पीईटी / सी टी द्वारा सेल तस्करी
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Hoffmann, S. H. L., Maurer, A.,… More

Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

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