Summary
بعد إعداد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 64 النحاس تعديل ملزم لالفئران المعدلة وراثيا مستقبلات الخلايا التائية والخلايا T هي رديولبلد في الجسم الحي، وتحليلها للبقاء، وظائف، والاستقرار ووضع العلامات وموت الخلايا المبرمج، ونقلت adoptively في الفئران مع مجرى الهواء من نوع تأخر فرط الحساسية رد فعل للتصوير غير الغازية التي كتبها التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي (PET / CT).
Abstract
يوضح هذا البروتوكول إنتاج 64 النحاس وخالب اقتران / radiolabeling من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) تليها زراعة الخلايا اللمفاوية الفئران ومستقبلات 64 النحاس والأجسام المضادة التي تستهدف الخلايا. في تقييم المختبر من موصوفة في radiolabel وغير الغازية في تعقب خلية الجسم الحي في نموذج حيواني لمجرى الهواء من نوع تأخر فرط الحساسية رد فعل (DTHR) من خلال PET / CT.
في التفاصيل، يظهر الاقتران من ماب مع خالب حمض 1،4،7،10-tetraazacyclododecane-1،4،7،10-tetraacetic (DOTA). بعد إنتاج المشع 64 النحاس، radiolabeling من ماب DOTA مترافق يوصف. التالي، والتوسع في ألبومين البيض الدجاج (كوفا) CD4 + محددة فيروسات (IFN) -γ المنتجة وصفت خلايا T المساعدة (كوفا-TH1) وradiolabeling اللاحقة من الخلايا كوفا-TH1. وتعرض مختلف في المختبر تقنيات لتقييم القوة التنفيذيةتأثيرات سلبية من 64 النحاس وradiolabeling على الخلايا، مثل تحديد بقاء الخلية التي الاستبعاد التريبان الأزرق، وتلطيخ لموت الخلايا المبرمج مع Annexin V لالتدفق الخلوي، وتقييم الأداء الوظيفي عن طريق الإنترفيرون جاما فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) . علاوة على ذلك، وصف تقرير لامتصاص المشع في الخلايا والاستقرار وصفها بالتفصيل. يصف هذا البروتوكول كذلك كيفية تنفيذ دراسات تتبع خلية في نموذج حيواني لDTHR مجرى الهواء، وبالتالي، يتم تضمين تحريض الناجم عن كوفا-DHTR الهوائية الحاد في BALB / ج الفئران. وأخيرا، قدم قوي PET / CT سير العمل بما في ذلك الحصول على الصور، وإعادة الإعمار، والتحليل.
مستقبلات استهداف نهج 64 النحاس والأجسام المضادة مع استيعاب مستقبلات لاحق يوفر خصوصية عالية والاستقرار، وانخفاض السمية الخلوية، ومعدلات هروب رأس المال منخفضة مقارنة PET-استشفاف مشتركة لوضع العلامات الخلية، وعلى سبيل المثال 64 النحاسمكرر -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 النحاس وPTSM). وأخيرا، نهجنا تمكن غير الغازية في تعقب خلية الحي بواسطة PET / CT مع النسبة المثلى الإشارة إلى خلفية لمدة 48 ساعة. يمكن نقل هذا المنهج التجريبي لنماذج حيوانية وأنواع مختلفة من الخلايا مع مستقبلات محددة غشاء التي يتم استيعابها.
Introduction
تتبع الخلية غير الغازية هو أداة مرنة لمراقبة وظيفة الخلية والهجرة وصاروخ موجه في الجسم الحي. وقد ركزت دراسات تتبع الخلية الأخيرة على الوسيطة 1 أو 2 أو نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة 3 في سياق الطب التجديدي، ذاتي الطرفية خلايا الدم البيضاء في التهاب أو الخلايا الليمفاوية T في العلاج بالخلايا بالتبني ضد السرطان 3 و 4. توضيح من مواقع العمل والمبادئ البيولوجية الكامنة وراء العلاجات المستندة إلى الخلايا له أهمية هائلة. CD8 + T السامة للخلايا الليمفاوية، وراثيا خيالية مستضد مستقبلات (CAR) خلايا T أو الخلايا الليمفاوية التسلل الورم (TILs) اعتبرت على نطاق واسع عن معيار الذهب. ومع ذلك، فقد أثبتت خلايا TH1 مستضد معين المرتبطة الورم ليكون خيار علاجي بديل فعال 4، </ sup> في 5 و 6 و 7.
كما دورا رئيسيا في التهاب وأمراض المناعة الذاتية، جهاز معين (على سبيل المثال، والتهاب المفاصل أو الربو القصبي)، وخلايا الفائدة المرتفعة في العلاج المناعي السرطان، من المهم أن تميز التوزيع وصاروخ موجه الأنماط الزمنية من خلايا TH1. موسع في الجسم الحي التصوير بواسطة PET يعرض الكمي، طريقة حساسة للغاية 8 لدراسة أنماط هجرة الخلية، في صاروخ موجه الجسم الحي، ومواقع عمل الخلايا T والاستجابات أثناء الالتهاب، والحساسية، والالتهابات أو الرفض الورم 9 و 10 و 11.
سريريا، و 111 في وoxine يستخدم لمضان الكريات البيض لتمييز الالتهاب والعدوى 12، في حين أن 2-ديوكسي-2- (18يستخدم F) الفلوري-D-الجلوكوز (18 F-FDG) عادة للدراسات تتبع الخلية PET 3، 13. واحد العيب الرئيسي لهذا التتبع PET، ومع ذلك، هو نصف عمر قصير من النويدات المشعة 18 F في 109.7 دقيقة والاستقرار داخل الخلايا المنخفض الذي يعوق التصوير في نقاط زمنية لاحقة نشر نقل خلية بالتبني. لفترة أطول في دراسات تتبع خلية الجسم الحي بواسطة PET، على الرغم من عدم الاستقرار في الخلايا، وكثيرا ما يستخدم 64 النحاس وPTSM إلى nonspecifically تسمية الخلايا 14 و 15 مع التقليل من الآثار الضارة على الخلايا T الجدوى وتعمل 16.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لزيادة خفض آثار غير مواتية على بقاء الخلية وظيفة باستخدام مستقبلات الخلايا التائية (TCR) محددة رديولبلد ماب. أولا، وإنتاج النظائر المشعة 64 النحاس، والاقتران من ماب KJ1-26 مع الوتظهر البريد خالب DOTA، واللاحقة 64 النحاس وradiolabeling. في الخطوة الثانية، يتم وصف العزلة وتوسيع خلايا كوفا-TH1 من الفئران المانحة DO11.10 وradiolabeling مع 64 تحميل النحاس و-DOTA مترافق ماب KJ1-26 (64 النحاس وDOTA-KJ1-26) بالتفصيل. تقييم القيم امتصاص وهروب رأس المال من الإشعاعي مع معاير جرعة وجاما العد والفرز، على التوالي، فضلا عن تقييم آثار 64 النحاس وradiolabeling على بقاء الخلية التي الاستبعاد التريبان الأزرق وظائف مع تعرض ELISA-جاما IFN . لغير الغازية في تعقب الخلايا في الجسم الحي، وصفت الاستنباط من نموذج الفأر من الناجم عن كوفا-الهوائية الحاد DTHR والحصول على الصور من قبل PET / CT بعد نقل الخلايا بالتبني.
وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج وضع العلامات يمكن نقلها إلى نماذج مرضية مختلفة، وخلايا T الفئران مع TCRs مختلفة أو خلايا العامة في المصالح مع مستقبلات غشاء محدد أو مارس التعبيراستعادة الطاقة الحركية الأساسية غشاء المستمر في رحلات مكوكية 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
احتياطات السلامة: عند التعامل مع النشاط الإشعاعي، وتخزين 64 النحاس وراء الطوب بنتيجة 2 بوصة سميكة واستخدام الدروع منها لجميع السفن التي تحمل النشاط. استخدام الأدوات المناسبة للتعامل بشكل غير مباشر المصادر دون رادع لتجنب الاتصال المباشر جهة والحد من التعرض للمواد المشعة. دائما ارتداء شارات الإشعاع مراقبة قياس الجرعات ومعدات الحماية الشخصية وتحقق الذات ومجال العمل للتلوث لمعالجة ذلك فورا. تجاهل معدات الحماية الشخصية التي قد تكون ملوثة قبل مغادرة المنطقة حيث يتم استخدام المواد المشعة. تخزين النفايات المشعة كلها وراء الرصاص التدريع حتى يتم التهاوي في المشع 64 النحاس (حوالي 10 نصف يفس-= 127 ساعة) قبل التخلص منها كاف.
1. 64 النحاس الإنتاج
ملاحظة: النظائر المشعة ويتم إنتاج 64 النحاس عبر 64 ني (ع، ن) 64 تفاعل نووي النحاس يستخدم PETTسيكلوترون سباق وفقا لبروتوكول معدلة من مكارثي وآخرون. 18.
- 64 إنتاج النحاس، النيكل أشرق 64، التي مطلي على طبق من البلاتين / الايريديوم (90/10)، مع 30 أمبير لمدة 6 ساعات مع شعاع بروتون 12.4 إلكترون فولت.
- تسخين الهدف البلاتين / الايريديوم إلى 100 درجة مئوية في غرفة polyetheretherketone مخصص (نظرة خاطفة)، واحتضان في 2 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز لمدة 20 دقيقة لإذابة النحاس 64/64 ني.
- إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز أخرى واحتضان لمدة 10 دقيقة.
- تتبخر حمض الهيدروكلوريك باستخدام تيار من الأرجون وتبريد الغرفة إلى درجة حرارة الغرفة.
- تدفق غرفة مع 3 مل من 4٪ 0.2 M حمض الهيدروكلوريك و 96٪ الميثانول (ت / ت) ونقل هذا الحل إلى عمود التبادل الأيوني الذي كان قبل مكيفة مع 4٪ 0.2 M حمض الهيدروكلوريك في الميثانول لمدة 15 دقيقة على الأقل. يمكن استخدام من خلال تدفق لإعادة تدوير 64 ني.
- يغسل 64 النحاس الاحتفاظ بها في العمود مع 4٪ 0.2 M حمض الهيدروكلوريك طن الميثانول.
- أزل 64 النحاس مع 70٪ 1.3 M حمض الهيدروكلوريك / 30٪ الأيزوبروبانول (ت / ت) في قارورة جمع وتتبخر الحل في تيار من الأرجون والسماح للقارورة باردة لدرجة حرارة الغرفة.
- حل 64 النحاس في 140-210 ميكرولتر من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك.
2. الجسم المضاد الإقتران DOTA مع واللاحقة 64 النحاس وradiolabeling
ملاحظة: سيتم ربط خالب DOTA للجماعات الأمينية الوظيفية للماب التي كتبها N-hydroxysuccinimide (NHS) استر الكيمياء والمترافقة سيتم رديولبلد في وقت لاحق مع 64 النحاس 19.
- ضبط تركيز KJ1-26-ماب إلى 8 ملغ / مل وdiafiltrate 1 مل من محلول ماب ضد 0.1 M نا 2 هبو 4 درجة الحموضة 7.5 تعامل مع 1.2 غرام / لتر من راتنج التبادل الأيوني مخلبية باستخدام الوزن الجزيئي قطع ( MWCO 30 كيلو دالتون) وحدة تصفية الطرد المركزي. تطبيق 3 خطوات غسل لاحقة مع 14 مل من العازلة. بعد الخطوة غسل النهائي،التركيز الحل مرة أخرى إلى 1 مل. قياس تركيز الأجسام المضادة من قبل القياسات 280nm OD.
- يعد حل DOTA-NHS في النقاوة أو المياه PCR-الصف بتركيز 10 ملغ / مل مباشرة قبل الاستعمال. دعونا القارورة ضبط درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح لتجنب تكثيف الماء، وإزالة بعناية DOTA-NHS باستخدام ملعقة بلاستيكية. إضافة 216 ميكرولتر من هذا الحل DOTA-NHS إلى 8 ملغ من حل KJ1-26-ماب diafiltrated، تخلط جيدا، واحتضان لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية على خلاط تعثر.
- Diafiltrate في DOTA-KJ1-26-ماب ضد 0.25 M خلات الأمونيوم، ودرجة الحموضة 7.0، وتعامل مع 1.2 غرام / لتر من راتنج التبادل الأيوني مخلبية، وذلك باستخدام الوزن الجزيئي قطع (MWCO 30 كيلو دالتون) وحدة تصفية الطرد المركزي. تطبيق 7 خطوات الغسيل. تركيز ماب إلى الحجم النهائي من 1 مل، ومرة أخرى قياس تركيز البروتين عن طريق القياسات 280nm OD.
- قبل radiolabeling، تبادل المخزن المؤقت للDOTA-KJ1-26-ماب لبرنامج تلفزيوني عبر الحجم غير شاملlusion اللوني باستخدام أعمدة الترشيح هلام. هذا يزيل أيضا الشوائب جزيء صغير المحتملة.
- إعداد 100 من MBq 64 CuCl 2 الحل في 10 ملم حمض الهيدروكلوريك وضبط درجة الحموضة إلى 6-7 مع 10x PBS. إضافة 200 ميكروغرام من DOTA-KJ1-26-ماب. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- لمراقبة الجودة، أداء رقيقة اللوني طبقة مع 0.1 M سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5) كمرحلة النقالة وتحليل من قبل تصوير الإشعاع الذاتي. على الأقل يجب أن يكون منضما 90٪ من هذا النشاط إلى الأجسام المضادة وبالتالي يتم الكشف على الفور البداية. وبالكلاب النشاط غير منضم قبل مرحلة والشرائط المحمول القائم على سترات للجبهة المذيبات. للإشارة، ينصح باستخدام 64 CuCl 2.
TH1 3. الدجاج ألبومين البيض محددة (كوفا-TH1) عزل الخلايا والتوسع
ملاحظة: يتم وصف ثقافة خلايا TH1 وفقا لدراسة نشرت سابقا 16 و 17.
- عزل الطحال والغدد الليمفاوية خارج الصفاق (LNS) من الفئران DO11.10.
- التضحية الماوس وفقا للوائح الفيدرالية. تعقيم الحيوانات مع 70٪ من الإيثانول ويحملق مع شريط لاصق لإزالة الطحال وLNS. جعل شق متوسط وفصل الجلد من البريتوني عن طريق سحب أفقيا لكل موقع.
- حدد موقع عنق الرحم، ومحوري، العضدية وLNS الأربية. إزالتها بالملقط حادة ووضعها في 1٪ مصل العجل الجنين (FCS) / العازلة في برنامج تلفزيوني.
- فتح الغشاء البريتوني وتحديد الطحال. فصل الطحال من البنكرياس والأنسجة الضامة ووضعه في 1٪ العازلة FCS / برنامج تلفزيوني. لمزيد من الإرشادات، انظر المراجع 20،21.
- اللحم المفروم الطحال وLNS خلال 40 ميكرون مرشح في 50 مل المسمار أنبوب الغطاء باستخدام المكبس من حقنة. شطف تصفية مع 10 مل 1٪ FCS / PBS عازلة.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. SubsequenTLY، نفذ تحلل كريات الدم الحمراء عن طريق إضافة الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل العازلة (1.5 مل لكل حيوان المانحة) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 8.5 مل 1٪ FCS / PBS عازلة (لكل حيوان المانحة).
- الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. غسل الخلايا في 10 مل 1٪ FCS / PBS عازلة، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
- لفصل الخلايا المغناطيسي، وإعادة تعليق الخلايا في 1٪ FCS / PBS عازلة وإضافة CD4 + ميكروبيدات. الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة لحجم العازلة وكمية من CD4 + ميكروبيدات للاستخدام.
- احتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. ثم يضاف 1٪ FCS / PBS-عازلة تصل إلى 50 مل، الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف.
- تواصل مع CD4 + T العزلة الخلية باستخدام أعمدة الفصل المغناطيسي التجارية وموقف المغناطيس المعنية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ضبط خلايا CD4 + T مزال إلى التعاونncentration 10 6 خلية / مل في متوسطة Dulbecco لتعديل النسر مع 10٪ 2.5٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ العازلة HEPES، 1٪ الأحماض FCS، الحرارة المعطل MEM الأمينية، 1٪ البيروفات الصوديوم، و 0.2٪ 2-المركابتويثانول وتخزين لهم في 4 درجات مئوية.
- جمع إفرازات عمود في أنبوب 50 مل غطاء لولبي لإعداد الخلايا المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). أجهزة الطرد المركزي لتصريف عمود في 400 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
- إضافة 10 ميكروغرام / مل مكافحة CD4 (استنساخ: Gk1.5) ميكروغرام 10 / مل مكافحة CD8 (استنساخ: 5367،2) و10 ميكروغرام / مل الماوس مكافحة الفئران ماب (MAR18.5) و 1.5 مل أرنب تكملة. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف وإضافة 3 مل المتوسطة. أشرق ناقلات الجنود المدرعة على مصدر أشعة γ أو الأشعة السينية مع 30 غراي في المجموع. بعد ذلك، وضبط ناقلات الجنود المدرعة إلى تركيز 5 × 10 6 خلية / مل.
- إضافة 100 ميكرولتر من CD4 + T خلايا و 100 ميكرولتر من ناقلات الجنود المدرعة على جيش التحرير الشعبى الصينى 96-جيداالشركة المصرية للاتصالات جنبا إلى جنب مع 10 ميكروغرام / مل كوفا 323-339 الببتيد، 10 ميكروغرام / مل مكافحة IL-4-ماب، 0.3 ميكرومتر CPG1668-أليغنوكليوتيد] و 5 U / مل IL-2.
- إضافة 50 U / مل IL-2 كل يوم الثاني على التوالي. بعد 3-4 أيام، ونقل الخلايا من لوحات 96-جيدا ل24 لوحات جيدا. الجمع بين 3-5 الآبار من لوحة 96-جيدا في بئر واحدة على 24 لوحة جيدا. إضافة 100 U / مل IL-2 تحتوي على المتوسط في نسبة 1: 1.
- بعد 2-3 أيام أخرى، نقل الخلايا من لوحة 48-جيدا إلى 175 سم 2 قوارير زراعة الخلايا (1 × 48-جيدا لوحة في قارورة). ملء مع المتوسط في نسبة 1: 1. إضافة 50 U / مل IL 2 كل يومين.
- انقسام الخلايا وفقا لكثافة الخلايا وإضافة 50 U / مل IL-2 كل يوم الثاني على التوالي. على هذا النحو، ثقافة الخلايا لمدة 10 يوما أخرى.
4. كوفا-TH1 Radiolabeling خلية
ملاحظة: سيتم تطبيق 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب لخلايا كوفا-TH1 مثقف لتمكين وضع العلامات المشعة داخل الخلايا.
- لكوفا-TH1 مليرة لبنانية radiolabeling، رسم 37 من MBq من رديولبلد 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب في حقنة دون حجم القتلى باستخدام تدريج الجرعة. إضافة 1 مل المالحة للحصول على حل 37 من MBq / مل.
- تعليق الخلايا كوفا-TH1 في المتوسط بنسبة 2 × 10 6 خلية / مل وإضافة 0.5 مل من خلية إلى تعليق كل بئر في لوحة 48-جيدا.
- إضافة 20 ميكرولتر من الطازجة 37 من MBq / مل 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب حل كل بئر من لوحة جيدا 48. نسبة النهائية لوضع العلامات من MBq هو 0.7 لكل 10 6 خلايا في حجم 520 ميكرولتر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 7.5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
- بعد الحضانة، وإعادة تعليق بعناية الخلايا في كل بئر ونقل تعليق خلية من لوحة 48-جيدا الى 50 مل المسمار أنبوب الغطاء. للحد من فقدان الخلية، وشطف كل جيدا مع المتوسط قبل تحسنت.
- الطرد المركزي تعليق خلية كوفا-TH1 في 400 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل طاف، و resuspend الخلايا في 10 مل قبل تحسنت PBS. إزالة لliquot لتعليق الخلية لعد الخلايا. كرر الخطوة الغسيل.
- عد الخلايا كوفا-TH1 قابلة للحياة في التخفيف المناسبة مع تلطيخ التريبان الأزرق.
- ضبط تركيز الخلية إلى 5 × 10 7 خلية / مل للداخل الصفاق (IP) حقن من 10 7 الخلايا في 200 ميكرولتر PBS.
- كرر الخطوات من 4،3-4،5 لradiolabel الخلايا كوفا-TH1 مع كميات متزايدة من النشاط، على سبيل المثال، 1.4 أو 2.1 من MBq من MBq في 10 6 خلايا.
- لradiolabel الخلايا مع 1.4 من MBq في 10 6 خلايا، استخدم 40 ميكرولتر من 37 من MBq / مل 64 حل النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب و 60 ميكرولتر لradiolabeling 2.1 من MBq في 10 6 خلايا. نفذ الخطوات 4،3-4،7 مع 0.7 من MBq، 1.4 و 2.1 من MBq من MBq 64 النحاس وPTSM لكن زيادة الوقت وضع العلامات 3 ساعات للتحقيقات النسبية 17.
- انتقل إلى الخطوة 5 لتحديد المبلغ الأمثل من النشاط.
5. في المختبر تقييم تأثير من Radiolabel على خلايا كوفا، TH1
ملاحظة: توصيف التأثيرات من radiolabel على خلايا TH1 تتم عن طريق التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة لقدرتها على البقاء، IFN-جاما ELISA لتقييم الأداء الوظيفي وPE-Annexin V تلطيخ لاستحثاث موت الخلايا المبرمج 16 و 17. كما وصف تقرير لامتصاص الخلايا وهروب رأس المال من النشاط الإشعاعي أدناه. ومقارنة، ويمكن أيضا الخلايا المسمى النحاس وPTSM-64-كوفا TH1 استخدامها.
- تأثير على قابلية كتبها الأزرق الاستبعاد التريبان
- ضبط لا يقل عن 18 × 10 6 خلايا كوفا-TH1 رديولبلد مع 0.7 من MBq / 10 6 خلايا، و 1.4 من MBq / 10 6 خلايا و 2.1 من MBq / 10 6 خلايا على التوالي إلى تركيز 2 × 10 6 خلية / مل وتنفيذ الخطوات 5.1. 2-5.1.7 لكل جرعة النشاط. استخدام غير radioacti-لقد KJ1-26-ماب المسمى خلايا كوفا-TH1 والخلايا كوفا-TH1 غير المسماة كما الضوابط.
- الماصة 1 مل من محلول الخلية إلى 9 آبار لوحة 24-جيدا.
- جمع المحتوى من 3 آبار في 3 منفصلة 15 مل المسمار الأنابيب وكأب، 3 ساعات بعد radiolabeling الأولية.
- شطف الآبار الآن فارغة مع المتوسط قبل تحسنت إلى تقليل فقدان الخلية وإضافة المتوسطة إلى 15 مل منها المسمار أنابيب غطاء من الخطوة 5.1.3.
- أجهزة الطرد المركزي ال 15 مل أنابيب في 400 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه الخلية مما أدى إلى 1 مل من المتوسط قبل تحسنت.
- عد الخلايا على حد سواء وقابلة للحياة ميتة باللون الأزرق التريبان بشكل منفصل لكل أنبوب 15 مل وحساب النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة.
- كرر الخطوات من 5.1.3-5.1.6 24 و 48 ساعة بعد 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب radiolabeling.
- آثار على وظيفة تحددها-جاما IFN ELISA
ملاحظة: لتقييم تأثير 64 النحاس وDOTA-KJ1 26-ماب radiolabel على الانتاج: الإنترفيرون جامان كعلامة من وظائف، إجراء ELISA-IFN جاما من مورد التجاري والرجوع إلى مرجع 17 لمزيد من التفاصيل.- تفريق 10 5 خلايا قابلة للحياة في 100 ميكرولتر من المتوسط على لوحة 96-جيدا، 3 ساعة بعد 64 النحاس وDOTA-KJ1-26 radiolabeling الخلايا كوفا-TH1 مع 0.7 من MBq، 1.4 أو 2.1 من MBq من MBq. استخدام غير المسماة وغير المسماة المشعة KJ1-26-ماب أو 64 خلايا كوفا، TH1-PTSM المسمى النحاس كما الضوابط.
- تحفيز إنتاج الإنترفيرون γ في 10 5 خلايا كوفا-TH1 المسمى النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب-64 في 100 ميكرولتر المتوسطة مع 10 ميكروغرام / مل من كوفا الببتيد، 5 U / مل IL-2 و 5 ناقلات الجنود المدرعة 5X10 في 100 ميكرولتر من المتوسطة 24 ساعة عند 37 ° C و 7.5٪ CO +2. قد تكون الضوابط مزيد من الشروط الأخرى دون إضافة الببتيد كوفا.
- تحليل طاف بواسطة ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- كرر الخطوة 5.2.2. إلى 5.2.3. في 24 و 48 ساعة بعد العملية وضع العلامات.
- استحثاث موت الخلايا المبرمج من قبل PE-Annexin V تلطيخ المحددة لالتدفق الخلوي
ملاحظة: تقييم استحثاث موت الخلايا المبرمج من قبل radiolabel 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب، واستخدام عدة متاحة تجاريا لالتدفق الخلوي وإعداد عينات من الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة قبل تلطيخ مع Annexin V لالفوسفاتيديل سيرين المعرض على غشاء الخلية .- في 3 و 24 و 48 وظيفة ح 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب radiolabeling الخلايا كوفا-TH1، يثلث وصمة عار مع لا يقل عن 10 6 المسمى النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب-64 خلايا كوفا-TH1 مع عدة Annexin V وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتحليل غضون ساعة القادمة. استخدام المسمى KJ1-26-ماب، 64 خلايا كوفا-TH1 غير المسماة غير المشعة النحاس وPTSM وصفت ووالضوابط. يرجى الرجوع إلى مرجع 17 لمزيد من التفاصيل.
- امتصاص وهروب رأس المال
ملاحظة: الإقبال على 64 النحاس وDOTA-يتم قياس KJ1-26-ماب إلى الخلايا في تدريج جرعة ويقاس هروب رأس المال من النشاط الإشعاعي في فحص γ العد 0، 5، 24، و 48 ساعة بعد radiolabeling.- إعداد عشرة أنابيب العد جاما كل ل64 DOTA-KJ1-26-ماب المسمى النحاس خلايا كوفا-TH1، طاف منها، والخطوة غسل.
- نقل 10 6 64-النحاس-DOTA KJ1-26-ماب المسمى خلايا كوفا-TH1 في 1 مل من المتوسط في كل من العشرة أنابيب عد جاما مباشرة بعد radiolabeling. لكل نقطة من النقاط الزمنية 5 و 24 و 48 ساعة بعد radiolabeling، والحفاظ على ما لا يقل عن 10 وصفت النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب 7 64 خلايا كوفا-TH1 في المتوسط على 24 لوحات جيدة زراعة الخلايا في حاضنة عند 37 ° C و 7.5٪ CO 2.
- أنابيب الطرد المركزي γ العد والفرز في 400 x ج لمدة 5 دقائق ونقل طاف في عشرة أنابيب γ العد جديدة.
- غسل الخلايا مرة واحدة في 1 مل المتوسطة لإزالة جزء غير منضم من 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب لد جمع طاف في عشرة أنابيب γ العد جديدة.
- إضافة 1 مل الوسيلة الجديدة للخلايا كوفا-TH1 وتحديد قيمة امتصاص الأولية في تدريج الجرعة. ويمكن أيضا أن أنابيب يتم تخزينها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 7.5٪ CO 2.
- كرر الخطوات من 5.4.2 إلى 5.4.5 بعد 5 و 24 و 48 ساعة وقياس جميع الأنابيب في γ مكافحة فقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لتصحيح الاضمحلال الإشعاعي والتحليل الكمي، واستخدام معيار مع جرعة محددة من النشاط الإشعاعي.
6. OVA التي يسببها الحاد مجرى الهواء DTHR
ملاحظة: ديناميات الهجرة وأنماط صاروخ موجه من الخلايا رديولبلد كوفا-TH1 نقل adoptively وإلى الموقع من التهاب سوف تصور وكميا في نموذج حيواني لالناجم عن كوفا-مجرى الهواء-DTHR 16 و 17.
- حقن 8 أسابيع من العمر الفئران BALB / ج IP بمزيج من 150 ميكرولتر اللهuminum هلام / 50 ميكرولتر كوفا-حل (10 ميكروغرام في 50 ميكرولتر PBS) لتحصين الفئران.
- بعد أسبوعين من التحصين، تخدير الفئران مع 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين عن طريق الحقن الملكية الفكرية. وضع فئران التجارب على ظهورهم والماصة ببطء 100 كوفا ميكروغرام المذاب في 50 ميكرولتر PBS في فتحتي الأنف من الحيوانات. فإن الحيوانات يستنشق انخفاض حل قطرة.
- كرر بعد 24 ساعة. لالحث DTHR الهوائية أقوى، أكرر مرة أخرى بعد 48 ساعة.
- لتحليل الهجرة معينة من الخلايا كوفا-TH1 نقل، لحث الشعب الهوائية، DTHR مع تركيا أو الدراج-OVA عن السيطرة. لذلك، كرر الخطوات من 6،1-6،3 باستخدام المعنية OVA البروتين.
7. في فيفو التصوير عن طريق PET / CT
ملاحظة: في التصوير المجراة من 64 DOTA-KJ1-26-ماب المسمى النحاس خلايا كوفا-TH1 في كوفا-DTHR الفئران المريضة وتتزاحم السيطرة يدل على صاروخ موجه محددة وميلديناميات جريشن للخلايا كوفا-TH1. لذلك، والحصول على مسح PET الثابتة والتشريحية CT بمسح بالتتابع 3 و 24 و 48 ساعة بعد نقل الخلايا بالتبني.
- مباشر بعد radiolabeling، وضبط 64 خلايا كوفا-TH1-DOTA-KJ1-26-ماب المسمى النحاس إلى 5 × 10 7 خلية / مل للحقن الملكية الفكرية من 10 7 الخلايا في 200 ميليلتر.
- باستخدام حقنة 1 مل و إبرة عيار 30، واستخلاص 200 ميكرولتر من تعليق خلية كوفا-TH1 المسمى النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب-64 وحقن الخلايا الملكية الفكرية في الحيوانات كوفا-DTHR-المريضة بين 4 عشر والحلمة ال 5. لتحديد إجمالي كمية حقن من النشاط الإشعاعي، وقياس حقنة في تدريج جرعة قبل وبعد الحقن.
- تخدير الفئران، 10 دقيقة قبل الوقت امتصاص المطلوب، مع 1.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ (معدل التدفق: 0.7 لتر / دقيقة) في مربع التخدير التحكم في درجة حرارته.
- في هذه الأثناء، لتسهيل المشارك التسجيلصور PET CT وخلال تحليل الصور، وتحديد الشعيرات الدموية الزجاج التي تحتوي على 64 حل النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب أو مجانا 64 CuCl 2 الحل تحت السرير الماوس.
- ولذلك، يعد حل من 0.37 من MBq / مل وملء الشعيرات الدموية الزجاج مع حجم 10 ميكرولتر مع هذا الحل. منذ الإشارات الإشعاعية المستمدة من الخلايا ضعيفة بطبيعتها، لا تستخدم كميات عالية من النشاط للتأكد من أن العلامات لا تتداخل مع اشارات المشتقة من الخلايا في الفئران.
- بعد أن وصلت التسامح الجراحية، كما يدل على ذلك فقدان المنعكس انسحاب دواسة من أطرافهم الخلفية، ونقل الماوس إلى السرير الحيوانات الصغيرة PET-CT ومتوافق مع مجهزة بنظام أنابيب مناسبة للحفاظ على التخدير.
- لشل حركة الماوس على السرير حيوان صغير باستخدام قطعة قطن والشريط الجراحية. تطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العينين.
- نقل السرير الماوس إلى الماسح الضوئي PET، مركز مجال الرؤية مع focuالصورة على الرئتين والحصول على 20 دقيقة مسح PET ثابت مع نافذة الطاقة من 350-650 كيلو.
- نقل السرير الماوس لالماسح الضوئي CT. عبر الكشفية الرأي، مركز مجال الرؤية على الرئتين. الحصول على صورة مستو CT عبر 360 التوقعات خلال دوران 360 درجة في وضع "خطوة وتبادل لاطلاق النار" مع وقت المعرض من 350 مللي وbinning عامل 4.
تحليل 8. صورة
- إعادة بناء البيانات القائمة وضع PET من خلال تطبيق إحصائية تكرارية أمر فرعية توقع تعظيم (OSEM) خوارزمية 2D و الأشعة المقطعية في صورة 3D مع حجم بكسل من 75 ميكرون.
- للحصول على صورة المشارك التسجيل في برنامج تحليل الصور المناسب (على سبيل المثال Inveon مكان العمل البحوث أو PMOD)، استخدم أداة المشارك التسجيل التلقائي. وإذا فشل ذلك، استخدم الشعيرات الدموية زجاج تحت السرير الماوس كما توجيهات للمشاركة في إعادة بنائها تسجيل PET CT وصور مكانيا في محوري، وعرض الاكليلية والسهمي.
- تصحيح الصور PETلالاضمحلال الإشعاعي باستخدام قانون الاضمحلال الإشعاعي ونصف الوقت من النويدات المشعة 64 النحاس في 12.7 ساعة. للتطبيع صورة، اختر صورة واحدة (A) كمرجع وضبط كثافة عرض الصورة في برنامج تحليل الصور منها.
- استخدام مجموعة القيم فقط للصورة المرجع (A)، والنشاط حقن (A) والنشاط حقن للصور الأخرى (X)، وتطبيع الصور الأخرى باستخدام المعادلة التالية: (النشاط حقن (X) / النشاط حقن ( A)) قيم س كثافة (A).
- رسم مجلدات 3D من الفائدة (أصوات العراق) على إشارة PET تطبيع من LNS الرئوية وperithymic.
- تحديد نسبة حقن جرعة لكل سم 3 (٪ ID / سم 3) باستخدام المعادلة التالية: (متوسط النشاط في أصوات العراق / النشاط الكلي في الماوس) × 100. للمزيد من التوجيه بشأن تحليل الصور، انظر المراجع 22 و 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويلخص الشكل 1 وضع العلامات الخلايا كوفا-TH1 مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب والتصميم التجريبي للفي المختبر، والدراسات المجراة المشمولة في هذا البروتوكول.
الشكل 1: 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب وسمها عملية وتصميم التجارب. (A) تمثيل تخطيطي لوضع العلامات الخلايا المشع مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب. 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب تربط لمستقبلات كوفا، TCR على سطح خلية من خلايا TH1 والمنضوية مع مستقبلات خلال 24 ساعة. كوفا-TCRs يعاد أعرب 24 ساعة بعد radiolabeling. تم عزل (B) خلايا CD4 + T، توسعت ورديولبلد مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب في المختبر. ور امتصاص وهروب رأس المال القيمالبريد تقرره تدريج جرعة وγ العد. تم تقييم الآثار المترتبة على الأجسام المضادة المشعة على بقاء الخلية مع تلطيخ التريبان الأزرق، على وظيفة مع الإنترفيرون جاما ELISA، وعلى استحثاث موت الخلايا المبرمج مع فيكوإيريترين (PE) -Annexin V تلطيخ. وكان المستحث (C) كوفا-مجرى الهواء DHTR في الإناث BALB الفئران / ج. تم نقل 10 7 خلية TH1 adoptively في كوفا-مجرى الهواء DHTR-المريضة الحيوانات مباشرة بعد radiolabeling. تم الحصول على صور PET / CT 3 و 24 و 48 ساعة بعد نقل الخلايا بالتبني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تأكيد وضع العلامات الخلايا الناجح للخلايا TH1 مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب التي كتبها المناعية (الشكل 2A) وكان النحاس وDOTA-KJ1-26 الأجسام المضادة 64 (الأخضر) شارك المترجمة مع CD3 في الخلية غشاء 3 ساعات بعد radiolabeling، بينما كانت إشارة من ماب في غشاء الخلية باهتة فقط في 24 ساعة (الصفراء). في 48 ساعة بعد radiolabeling، وقد استوعبت مجمع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-TCR عبر الإلتقام مع إشارة قوية في سيتوبلازم خلايا TH1. الجرعة الإشعاعية التطبيقية 0.7 من MBq خفض قابلية للخلايا TH1 بنسبة 8٪ فقط، بينما جرعات أعلى من 1.4 و 2.1 من MBq من MBq 64 زيارتها النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب الآثار أكثر وضوحا. مقارنة مع radiolabeling 64 النحاس وPTSM، ومع ذلك، لم يلاحظ أي ميزة كبيرة من النحاس و64 DOTA-KJ1-26-ماب (الشكل 2B). وأظهرت 64 خلايا رديولبلد النحاس والأجسام المضادة فقدان القليل في وظائف كما يتضح من إفراز الإنترفيرون γ (الشكل 2C)، وانخفاض هروب رأس المال من النشاط الإشعاعي (الشكل 2D)، وانخفاض استحثاث موت الخلايا المبرمج (الشكل 2E) مقارنة ب 64 TH1 المسمى النحاس وPTSM- الخلايا.
المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2: في المختبر تقييم المشعة TH1 وسمها الخليوي مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب. (A) متحد البؤر المجهري يثبت امتصاص الخلايا من 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-MABS (الخضراء) في خلايا كوفا-TH1 (غشاء الخلية؛ أحمر) خلال 24 ساعة بعد وضع العلامات الأولي (تم تعديل هذا الرقم من مرجع 17) . (B) معايرة الجرعات الإشعاعية وضع العلامات من 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب أو 64 النحاس وPTSM كشفت تأثير متساو على جدوى كما الكشف عنها بواسطة التريبان الأزرق الإقصاء 24 ساعة بعد وضع العلامات. استخدام 0.7 من MBq لوصفها الخلايا التي يسببها أدنى العاهات من جدوى (يعني ± SD في المئة؛ وهذا الرقم قد تم تعديلها من المراجع 16، 17 (C) المعايرة لوضع العلامات المشعة تفعلكشفت إس إي إس 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب أو 64 النحاس وPTSM ضعف أقوى من وظيفة بعد 64 النحاس وPTSM وضع العلامات، والكشف عنها من قبل IFN-جاما ELISA 24 ساعة بعد وضع العلامات. كان جرعة زيادة من 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب لوصفها خلية لا يؤثر على وظيفة (يعني ± SD في المئة، والإحصاءات: الطالب اختبار t؛ * ف <0.05، ** ف <0.01، ** * ع <0.001، وقد تم تعديل هذا الرقم من المراجع 16، 17). القياسات (D) الدفق الخلايا رديولبلد (γ العد) أظهرت استقرار وضع العلامات أعلى من 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب مقارنة ب 64 النحاس وPTSM 5 ساعات و 24 ساعة بعد وضع العلامات (يعني ± SD في المئة، والإحصاءات : الطالب اختبار t؛ *** ع <0.001، وقد تم تعديل هذا الرقم من 17). (E) كل منها التدفق الخلوي (PE-Annexin V) الرسوم البيانية تشير إلى وجود أب أعلىoptosis تحريض 24 ساعة بعد 64-النحاس PTSM وضع العلامات مقارنة ب 64 النحاس وDOTA-KJ1-26، ماب وضع العلامات (تم تعديل هذا الرقم من مرجع 17). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد نقل بالتبني من 10 7 64 خلايا كوفا-TH1-DOTA-KJ1-26-ماب المسمى النحاس في الحيوانات كوفا-DTHR-المريضة والضوابط غير المعالجة، وارتفاع القرار PET ثابت والصور CT التشريحية تم الحصول عليها. لتحليل الصور، وتنصهر الصور في عرض الاكليلية، المحوري وسهمي مع مساعدة من الشعيرات الدموية زجاجية تحتوي على كمية صغيرة من النحاس و64 DOTA-KJ1-26-ماب (الشكل 3A). ووضعت VOIS على LNS الرئوية وperithymic على الصور لتصحيح الاضمحلال وPET تطبيع لحساب النسبة المئوية حقن جرعة لكل سم 3(الشكل 3B).
الشكل 3: PET / CT-المشارك التسجيل والتحليل. (A) PET CT والصور وشارك المسجلين في برنامج تحليل الصور. إذا كان التسجيل الآلي من قبل البرنامج فشل، وتنصهر الصور التي تتراكب الإشارات PET CT ومن الزجاج الشعيرات الدموية (علامات) مليئة النشاط الإشعاعي والثابتة تحت السرير الحيوانات. وضعت (B) VOIS على الاشارات PET تصحيح وتطبيع للLNS perityhmic والرئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد تعقب كوفا-TH1 الهجرة الخلية إلى LN الرئوي وperithymic كمواقع كوفا-عرض في DTHR مجرى الهواء. في الجسم الحي إشارات PET ديكانت rived من 64 خلايا كوفا-TH1-DOTA-KJ1-26-ماب المسمى النحاس أعلى بكثير من الإشارات من 64 الخلايا المسمى النحاس وPTSM (الشكل 4A). وزادت كوفا-TH1 القيم امتصاص الخلية في LNS الرئوية وperithymic بشكل كبير في DTHR-المريضة الحيوانات مقارنة تتزاحم السيطرة غير المعالجة (الشكل 4B).
الشكل 4: كوفا-TH1 تتبع الخلايا في مجرى الهواء DTHR النموذجي في فيفو PET / CT. (A) الخاصة بكل الصور PET / CT من adoptively نقل خلايا كوفا-TH1، التي وصفت سابقا مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-MAB أو 64 النحاس وPTSM، في الفئران كوفا-DTHR-المريضة أو غير المعالجة. الخلايا كوفا-TH1 نقل المخزن إلى LNS الرئوية وperithymic. (B) التحليل الكمي للمواقع صاروخ موجه من الخلايا كوفا-TH1 أثبت ح أعلىoming إلى الأنسجة الملتهبة (يعني ± SD، والإحصاءات: الطالب اختبار t؛ * ف <0.05، ** ف <0.01). وضع العلامات مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب أثبت حساسية العليا (زيادة٪ ID / سم 3) مقارنة ب 64 النحاس وPTSM في مواقع مختلفة صاروخ موجه (يعني ± SD، والاحصاءات: طالب اختبار t؛ # ص <0.05، ## ف <0.01، ### ص <0.001). تم تعديل هذا الرقم من إشارة 16 و 17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعرض هذا البروتوكول طريقة موثوقة وسهلة لradiolabel مستقر الخلايا في الجسم الحي تتبع من قبل PET. باستخدام هذه الطريقة، وخلايا كوفا-TH1، معزولة وتوسعت في المختبر من الفئران المانحة، يمكن أن يكون رديولبلد مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب وصاروخ موجه من كانت تتبع لLNS الرئوية وperithymic كمواقع العرض كوفا في كوفا الناجم عن DTHR الهوائية الحادة.
تعديل على ماب مع خالب يتطلب العمل بسرعة وكفاءة واستخدام حلول فائقة نقية بدون آثار الأمينات. وعولج الحلول مع مخلبية راتنج التبادل الأيوني لضمان تصريف السليم للاستر DOTA-NHS نشط إلى amine مخلفات ماب. وماب-خالب مترافق باعتبارها radiolabel داخل الخلايا لديها العديد من المزايا أكثر من استخدام وكلاء خلية العلامات غير محددة. أولا، يوفر ماب خصوصية ممتازة السماح لوضع العلامات التي تستهدف السكان خلية محددة. ومابفي حد ذاته ليس السامة للخلايا وليس لديها تأثير ضار على سلامة أو وظيفة الخلايا. بعد ذلك، تم تخفيض هروب رأس المال من النشاط الإشعاعي من الخلايا بشكل ملحوظ تحسين نسبة الإشارة إلى خلفية الصور PET 17 و 24. عن طريق اختيار ماب مع خصوصية مختلفة، وهذه الطريقة للتحويل بسهولة إلى السكان الخلية الأخرى ذات الأهمية مثل CD8 + سمسم أو CD14 + حيدات. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج وضع العلامات خلية يمكن أن تستخدم للدراسات تتبع خلية في مختلف النماذج الحيوانية من الأمراض الالتهابية الإنسان (على سبيل المثال، والتهاب المفاصل والربو القصبي) أو نماذج حيوانية لمختلف أنواع سرطانية بشرية. هذه الطريقة وضع العلامات، ومع ذلك، يقتصر على مستقبلات غشاء محدد أو التفرقة علامات كأهداف منذ MABS لا منتشر بشكل سلبي عبر غشاء الخلية. تدخيل الناجم عن تفعيل الهدف أو، ببساطة، غشاء مكوكية هو مفيد. االطمع عال بين ماب والهدف، ومع ذلك، قد يكون أيضا كاف لتصوير في الجسم الحي، وربما مع انخفاض إشارة إلى نسبة الخلفية.
واستند اختيار DOTA باعتباره خالب للتجاربنا على العمل في وقت مبكر باستخدام 64 النحاس 25. ومع ذلك، في هذه الأثناء ظهر DOTA أن لا يكون خالب الأمثل لهذا النظير، مما يؤدي إلى استيعاب النشاط عالية نوعا ما في الكبد عن طريق transchelation لالفائق 26. على الرغم من استخدام الأجسام المضادة رديولبلد لفي المختبر وسم الخلايا التي ثم يتم نقلها adoptively يجب أن تقلل من خطر 64 الافراج عن النحاس والنقل إلى الكبد، chelators الحديثة الأمثل ل64 النحاس، مثل 1،4،7-triazacyclononane، حامض 1-الغلوتاريك -4،7-حمض الخليك (NODAGA) أو حامض 1،4،7-triazacyclononane-triacetic (NOTA)، ويمكن استخدامها ويفضل مع طريقة لزيادة تعزيز خصوصية البيانات التي تم الحصول عليها 27 64 النحاس (مثل N-chlorosuccinimide (NCS)) أو نظائر أخرى، مثل 89 عنصر الزركون (على سبيل المثال ديفيروكسامين؛ DFO).
واستند اختيار 64 النحاس باسم النظائر المشعة على حقيقة أن في الهجرة خلية الجسم الحي وصاروخ موجه هو عملية بطيئة نوعا ما مقارنة مع التغيرات الأيضية تصويرها عادة PET. 64 النحاس مع الوقت نصف عمر 12.7 ساعة تمكن التصوير المتكرر للهجرة الخلية أكثر من 48 ساعة بعد الحقن. 64 إنتاج النحاس، فمن المهم استخدام حلول عالية الجودة دون أيونات المعادن النزرة لضمان نقاء 64 النحاس. وعلاوة على ذلك، ونقاء 64 النحاس ذو أهمية عالية لradiolabeling من DOTA-ماب منذ الشوائب أيون الفلز متعددي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض نشاط معين من الحل النحاس 64 إلى المستويات التي تحول دون radiolabeling البروتين وبالتالي التصوير. على الرغم من أن 64 النحاس تنتج الاشتراكيةنسبة gnificant من حيوية للغاية، الإلكترونات أوجيه السامة للخلايا عندما المتحللة 28، جرعة المعدلة من النظائر المشعة وجيد التحمل من قبل الخلايا ممثلا الحد الأدنى من الآثار على سلامة وظائف وانخفاض تحريض الخلايا بعد radiolabeling. ومع ذلك، فمن المستحسن بوضوح إلى يعاير في البداية جرعة الأنشطة المستخدمة لradiolabeling لأنواع أخرى من الخلايا وضبط بروتوكول radiolabeling. أثبتت سريعة وسهلة في أساليب تقييم المختبر في البروتوكول، بما في ذلك تحديد الجدوى من الاستبعاد التريبان الأزرق وتلطيخ مع PE-Annexin V لتحديد الكسور أفكارك الخلايا. كلا أساليب رخيصة نسبيا وتستخدم معدات المختبرات الوصول إليها بسهولة. الجمع بين PE-Annexin V تلطيخ مع صبغة للتمييز المعيشة والخلايا الميتة مثل 7-D aminoactinomycin (7-AAD) تسمح لتحديد جدوى وموت الخلايا المبرمج في الظريف تجريبية واحدةص. كبديل لتقييم جدوى خلايا T المسمى، و3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium (MTT-) الفحص يمكن استخدامها لتقييم النشاط الأيضي الخلية. تقييم القيم امتصاص وهروب رأس المال مع تدريج جرعة وγ مكافحة هم أكثر تقدما ولكن لا يزال سريعة ورخيصة لتحقيق منذ ما يقرب من كل مختبر العمل مع النشاط الإشعاعي لديه الأجهزة المعنية في الموقع. أن التسلسل الجيني أو أساليب تعتمد على رقاقة تسفر عن بيانات أكثر تفصيلا. هذه الطرق، ومع ذلك، ليست دائما الوصول إليها بسهولة، تحتاج الخبرة المناسبة وغالبا ما يرتبط ارتفاع التكاليف.
وعلى الرغم من PET غير قادر على التوصل إلى حل الخلوي مثل تقنيات التصوير المجهري 29، فإنه يوفر حساسية ممتازة في نطاق بيكو مولي للكشف عن حتى أعداد صغيرة من الخلايا داخل الحيوانات أو البشر 8. بالمقارنة مع تقنيات التصوير غير الغازية الأخرى مثل البصريل التصوير، PET والكمي، لا تقتصر في عمق الاختراق ويوفر صور عالية الجودة مع ثلاثة قرارات الابعاد. الجمع بين حساسية عالية من PET مع دقة التشريحية CT يسمح للتصوير عالية الدقة للهجرة الخلية. وعلاوة على ذلك، في الجسم الحي البيانات يمكن التحقق من صحة بسهولة عن طريق عدة طرق المجراة سابقا بما في ذلك γ العد والفرز لتحليل biodistribution. تصوير الإشعاع الذاتي من cryosections وتلطيخ النسيجي لاحقة من cryosections يمكن مضافين لربط الخريطة النشاط autoradiographic مع تتسرب الخلايا المناعية التي حددها الهيماتوكسيلين وتلطيخ يوزين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب أشكر الدكتورة جوليا مانهايم، ووالتر إهرليشمان، رامونا ستوم، فوندا كاي، دانيال بوكالا، مارين هارانت وكذلك ناتالي ألتمير للدعم خلال تحليل التجارب والبيانات. وأيد هذا العمل من قبل فيرنر سيمنس-مؤسسة، وDFG من خلال SFB685 (B6 المشروع) والثروة (2309-0-0).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | WKL | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitroevaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30 G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µL | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
- Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
- Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
- Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
- Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
- Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
- Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
- Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
- Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
- Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
- Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
- Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
- Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
- Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
- McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
- Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
- Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
- Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
- Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
- Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
- Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).
