Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Murine Lymfocytter Merking av Published: April 29, 2017 doi: 10.3791/55270
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

Summary

Etter fremstillingen av en 64 Cu-modifisert monoklonalt antistoff-binding til et transgen murin T-celle-reseptor, T-celler er radiomerket in vivo, analysert for levedyktighet, funksjonalitet, merking stabilitet og apoptose, og adoptivt overført til mus med en luftveier forsinket-type hypersensitivitet reaksjonen for ikke-invasiv avbildning av positron emisjon tomografi / beregnet tomografi (PET / CT).

Abstract

Denne protokollen illustrerer fremstilling av 64 Cu og chelatoren konjugering / radiomerking av et monoklonalt antistoff (mAb), etterfulgt av murin lymfocytt cellekultur og 64 Cu-antistoff-reseptor målsøking av cellene. In vitro-evalueringen av den radiomarkør og ikke-invasiv in vivo-celle-sporing i en dyremodell av en luftvei forsinket type hypersensitivitetsreaksjon (DTHR) av PET / CT, er beskrevet.

I detalj er konjugering av et mAb med chelatoren 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraeddiksyre (DOTA) vist. Etter produksjon av radioaktivt 64 Cu, radioaktiv merking av det DOTA-konjugert mAb er beskrevet. Deretter utvidelse av kylling ovalbumin (Cova) -spesifikk CD4 + interferon (IFN) -γ-produserende T-hjelperceller (Cova-TH 1) og påfølgende radiomerking av Cova-TH1-celler er vist. Forskjellige in vitro teknikker er presentert for å evaluere effects av 64 Cu-radiomerking på cellene, slik som bestemmelse av cellelevedyktigheten ved trypan blå eksklusjon, fargingen for apoptose med annexin V for flowcytometri, og vurderingen av funksjonalitet av IFN-γ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Videre er bestemmelsen av det radioaktive opptak inn i cellene og merking stabilitet er beskrevet i detalj. Denne protokollen beskriver videre hvordan man utfører celle sporing studier i en dyremodell for en luftvei DTHR og, derfor, er induksjonen av Cova-fremkalt akutt luftveis DHTR i BALB / c-mus inkludert. Til slutt blir en robust PET / CT-arbeidsflyt herunder bildeinnsamling, ombygging, og analysen presentert.

64 Cu-antistoff-reseptor målretting tilnærming med påfølgende reseptor internalisering gir høy spesifisitet og stabilitet, nedsatt cellulær toksisitet og lav-avgivelseshastigheter i forhold til vanlige PET-tracere for cellemerking, for eksempel 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Til slutt, vår tilnærming gjør det mulig ikke-invasiv in vivo celle sporing av PET / CT med et optimalt signal-til-støy-forhold i 48 timer. Denne eksperimentelle fremgangsmåte, kan overføres til forskjellige dyremodeller og celletyper med membran-bundne reseptorer som er internalisert.

Introduction

Ikke-invasiv celle-sporing er en allsidig verktøy for å overvåke cellefunksjon, migrasjon og homing in vivo. Nyere celle sporing studier har fokusert på mesenchymale 1, 2 eller benmarg avledede stamceller 3 i sammenheng med regenerativ medisin, autologe perifere hvite blodceller i betennelse eller T-lymfocytter in adoptive cellen terapi mot kreft 3, 4. Klarlegging av områder av handling og de underliggende biologiske prinsipper for celle-baserte terapier er av enorm betydning. CD8 + cytotoksiske T-lymfocytter, genetisk konstruert kimære antigen-reseptor (CAR) T-celler eller tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss) ble ansett som gullstandarden. Imidlertid har tumor-assosierte antigen-spesifikke TH1-celler vist seg å være et effektivt behandlingsalternativ 4, </ sup> 5, 6, 7.

Som sentrale aktører i inflammasjon, organspesifikke autoimmune sykdommer (for eksempel revmatoid artritt eller astma bronkiale), og celler av høy interesse i cancer immunoterapi, er det viktig å karakterisere de temporale fordeling og homing mønstre av TH1-celler. Noninvasive in vivo avbildning av PET presenterer en kvantitativ, meget følsom fremgangsmåte 8 for å undersøke cellemigreringsmønstre, in vivo homing, og de områder av T-celle responser og handling i løpet av betennelser, allergier, infeksjoner eller tumor avvisning 9, 10, 11.

Klinisk, 111 In-oksin brukes for leukocytt-scintigrafi for diskriminering av betennelse og infeksjon 12, mens 2-deoksy-2- (18F) fluor-D-glukose (18F-FDG) blir ofte brukt for celle sporing studier av PET-3, 13. En stor ulempe med denne PET tracer, er imidlertid den korte halveringstid av radionukliden 18 F ved 109,7 minutter, og den lave intracellulære stabilitet som hindrer avbildning på senere tidspunkter etter adoptiv overføring celle. For lengre sikt in vivo-celle sporing studier av PET, men ustabil i cellene, er 64 Cu-PTSM ofte brukt for å spesifikt merke celler 14 og 15 med minimale skadelige effekter på T-celle-levedyktighet og funksjon 16.

Denne protokollen beskriver en metode for å redusere uheldige virkninger på cellenes levedyktighet og funksjon ved hjelp av en T-celle-reseptor (TCR) -spesifikk radioaktivt merket mAb. Først, produksjon av radioisotopen 64 Cu, konjugering av mAb KJ1-26 med the chelator DOTA, og den påfølgende 64 Cu-radiomerkings er vist. I et andre trinn, blir den isolasjon og utvidelse av Cova-TH1 celler av DO11.10 donormus og radiomerking med 64 Cu-lastet DOTA-konjugert mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) som er beskrevet i detalj. Vurderingen av opptaksverdier og utstrømning av radioaktivitet med en dosekalibratoren og ved y-telling, henholdsvis, så vel som vurdering av virkningene av 64 Cu-radiomerking på cellelevedyktigheten ved trypan blå eksklusjon og funksjonalitet med IFN-y-ELISA presenteres . For ikke-invasiv in vivo celle sporing, er det utløsning av en musemodell for Cova-fremkalt akutt luftveis DTHR og bilde-innhentings av PET / CT etter adoptiv overføring celle beskrevet.

Videre kan denne etikettmetoden kan overføres til forskjellige sykdomsmodeller, murine T-celler med forskjellige TCR eller generelle celler av interesse med membranbundne reseptorer eller uttrykk markers bakenforliggende sammenhengende membran skyt 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sikkerhets forholdsregler: Ved håndtering av radioaktivitet, lagre 64 Cu bak to-tommers tykt bly klosser og bruk respektive skjerming for alle fartøyer som frakter aktivitet. Bruk passende verktøy for indirekte å håndtere uskjermede kilder for å unngå direkte hudkontakt og minimalisere eksponering for radioaktivitet. Bruk alltid strålingsdosimetri overvåkingsskilt og personlig verneutstyr og sjekk selv og arbeidsområdet for forurensning til umiddelbart å løse det. Kast eventuelt forurenset personlig beskyttelsesutstyr, før den forlater det området der radioaktivt materiale anvendes. Lagre hele radioaktivt avfall bak bly skjerming inntil den radioaktive 64 Cu blir nedbrutt (ca. 10 halveringstider = 127 h) før tilstrekkelig disposisjon.

1. 64 Cu Produksjons

MERK: radioisotop 64 Cu blir dannet via 64 Ni (p, n) 64 Cu kjernereaksjon ved anvendelse av en Pettrase syklotron i henhold til en modifisert protokoll av McCarthy et al. 18.

  1. For 64 Cu produksjon, strålebehandling 64 Ni, som er elektropletteres på en platina / iridium plate (90/10) med 30 uA i 6 timer med en protonstråle på 12,4 MeV.
  2. Varm opp platina / iridium target til 100 ° C i en dedikert polyetereterketon (PEEK) kammeret og inkuber i 2 ml konsentrert HCl i 20 minutter for å oppløse 64 Cu / 64 Ni.
  3. Legg til en annen 1 ml konsentrert HCI, og inkuber i 10 min.
  4. Fordamp HCl under anvendelse av en strøm av argon og avkjøles i kammeret til romtemperatur.
  5. Skyll kammer med 3 ml 4% 0,2 M HCl, og 96% methanol (v / v), og overføre denne løsning til en ionebytter-kolonne som var forbehandlet med 4% 0,2 M HCl i metanol i minst 15 min. Gjennomstrømnings kan brukes til å resirkulere 64 Ni.
  6. Vask 64 Cu holdt tilbake i kolonnen med 4% 0,2 M HCl in metanol.
  7. Det elueres 64 med Cu 70% 1,3 M HCl / 30% isopropanol (v / v) i et oppsamlingsbeger, fordamper oppløsningen i en strøm av argon og la glasset avkjøles til romtemperatur.
  8. Oppløs 64 Cu i 140-210 ul 0,1 M HCl.

2. Antistoff Konjugering med DOTA og etterfølgende 64 Cu-radioaktiv merking

MERK: chelatoren DOTA vil være knyttet til funksjonelle aminogrupper av mAb med N-hydroksysuccinimid (NHS) ester kjemi og konjugatet blir deretter radioaktivt merket med 64 Cu-19.

  1. Juster konsentrasjonen av KJ1-26-mAb til 8 mg / ml og 1 ml diafiltrat av mAb løsning mot 0,1 M Na 2HPO 4, pH 7,5 ble tilsatt 1,2 g / l av et chelaterende ionebytter-harpiks ved anvendelse av en molekylvekt cut off ( MWCO 30 kDa) sentrifugal-filter enhet. Legg 3 etterfølgende vasketrinn med 14 ml av bufferen. Etter den siste vasketrinnkonsentrer løsningen igjen til 1 ml. Kvantifisere antistoffkonsentrasjon ved OD 280 nm målinger.
  2. Fremstill en DOTA-NHS-løsning i ultrarent eller PCR-grad vann ved en konsentrasjon på 10 mg / ml umiddelbart før bruk. La hetteglasset justeres til romtemperatur før den åpnes for å unngå vannkondensering, og fjern forsiktig DOTA-NHS med en plastsparkel. Legg 216 ul av denne DOTA-NHS-løsning til 8 mg av den diafUtreres KJ1-26-mAb oppløsning, bland godt, og inkuber i 24 timer ved 4 ° C på en trommelblander.
  3. Diafiltrat den DOTA-KJ1-26-mAb mot 0,25 M ammoniumacetat, pH 7,0, behandlet med 1,2 g / l av et chelaterende ionebytterharpiks, ved anvendelse av en molekylvekt cut off (MWCO 30 kDa) sentrifugal-filter enhet. Påfør 7 vasketrinn. Konsentrer mAb til et sluttvolum på 1 ml og igjen måle proteinkonsentrasjonen ved OD 280 nm målinger.
  4. Før radioaktiv merking, utveksle bufferen av DOTA-KJ1-26-mAb mot PBS via størrelse-EXClusion kromatografi under anvendelse av gelfiltreringskolonner. Dette fjerner også eventuelle lavmolekylære urenheter.
  5. Forbered 100 MBq 64 CuCl2 oppløsning i 10 mM HCl og justere pH til 6-7 med 10x PBS. Tilsett 200 ug av DOTA-KJ1-26-mAb. Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C.
  6. For kvalitetskontroll, utføre tynnsjiktskromatografi med 0,1 M natriumcitrat (pH 5) som den mobile fase og analysere ved hjelp av autoradiografi. Minst 90% av den aktivitet bør være bundet til antistoffet, og således detekteres ved start sted. Ubundet aktivitet er chelatert ved den citrat-baserte mobil fase og striper til løsningsmiddelfronten. For en referanse, er bruken av 64 CuCl2 rådet.

3. kylling ovalbumin-spesifikk TH1 (Cova-TH1) celleisolasjon og utvidelses

MERK: Kulturen av TH1-celler som beskrevet i henhold til tidligere publiserte studier 16, 17.

  1. Isoler milter og extraperitoneal lymfeknuter (LNS) fra DO11.10 mus.
    1. Ofre mus i henhold til føderale forskrifter. Desinfisere dyret med 70% etanol, og fikserer den med selvklebende tape for fjerning av milten og LNS. Lag en median snitt og skille huden fra peritoneum ved lateralt å trekke det for hvert område.
    2. Finn den cervikale, aksiale, brachial og inguinal LNS. Fjerne dem med butt pinsett og plassere dem i 1% føtalt kalveserum (FCS) / PBS-buffer.
    3. Åpne peritoneum og finn milt. Separer den milt fra bukspyttkjertelen og bindevev og plassere den i 1% FCS / PBS-buffer. For ytterligere veiledning, se referanser 20,21.
  2. Hakke milt og LNS gjennom et 40 um filter inn i en 50 ml skrukork ved hjelp av stempelet i en sprøyte. Skyll filteret med 10 ml 1% FCS / PBS-buffer.
  3. Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten. .etterfølgendetly, utføre lysering av erytrocytter ved tilsetning av ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringsbuffer (1,5 ml pr donor dyr) i 5 minutter ved romtemperatur. Legg 8,5 ml 1% FCS / PBS-buffer (pr donor dyr).
  4. Sentrifuger cellene ved 400 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten. Vask cellene i 10 ml 1% FCS / PBS-buffer, sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten.
  5. For magnetisk celleseparasjon, resuspender cellene i 1% FCS / PBS-buffer og legge til CD4 + mikrokuler. Referer til produsentens instruksjoner for buffervolumet og mengden CD4 + mikrokuler som skal brukes.
  6. Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C. Deretter legger 1% FCS / PBS-buffer inntil 50 ml, sentrifugere cellene ved 400 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten.
  7. Fortsett med CD4 + T-celleisolering ved bruk av kommersielle magnetiske separasjonskolonner og en respektiv magnet stativ i henhold til produsentens protokoll. Juster de eluerte CD4 + T-celler til en koncentration av 10 6 celler / ml i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 10% varme-inaktivert FCS, 2,5% penicillin / streptomycin, 1% HEPES-buffer, 1% MEM aminosyrer, 1% natriumpyruvat og 0,2% 2-mercaptoethanol og lagre dem ved 4 ° C.
  8. Samle kolonnen utladning i en 50 ml skrukork for å fremstille antigen-presenterende celler (APC). Sentrifuger kolonnen utladning ved 400 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten.
  9. Tilsett 10 ug / ml anti-CD4 (klon: Gk1.5), 10 ug / ml anti-CD8 (klon: 5367,2) og 10 ug / ml muse-anti-rotte-mAb (MAR18.5) og 1,5 ml kaninkomplement. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C.
  10. Sentrifuger cellene ved 400 xg i 5 minutter, fjern supernatanten og tilsett 3 ml medium. Bestråle APC på en γ-ray eller røntgenkilde med 30 Gy totalt. Deretter justerer APC-ene til en konsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml.
  11. Tilsett 100 ul av CD4 + T-celler og 100 ul av APCer på en 96-brønn plate sammen med 10 mikrogram / mL cOVA 323-339-peptid, 10 ug / ml anti-IL-4-mAb, 0,3 ^ M CPG1668-oligonukleotider og 5 U / ml IL-2.
  12. Tilsett 50 U / ml IL-2 annenhver dag. Etter 3 - 4 dager, overføres cellene fra 96-brønners plater i 24-brønners plater. Kombiner 3-5 brønner fra den 96-brønns plate i en brønn på 24-brønners plate. Tilsett 100 U / mL IL-2-inneholdende medium i en 1: 1-forhold.
  13. Etter ytterligere 2-3 dager, overføres cellene fra en 48-brønners plate til 175 cm2 cellekulturflasker (1 x 48-brønners plate per kolbe). Fyll med medium i et 1: 1-forhold. Tilsett 50 U / ml IL-2 annenhver dag.
  14. Splitte cellene ifølge celletetthet og tilsett 50 U / ml IL-2 annenhver dag. På denne måten, kultur cellene i ytterligere 10 dager.

4. Cova-TH1 celleRadioMerking

MERK: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb vil bli brukt til dyrkede Cova-TH1-celler for å muliggjøre intracellulær radioaktiv merking.

  1. For Cova-TH1 cell radioaktiv merking, trekker 37 MBq av det radioaktivt merkede 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i en sprøyte uten dødvolum ved hjelp av en dosekalibratoren. Tilsett 1 ml saltoppløsning for å motta en 37 MBq / ml oppløsning.
  2. Susp Cova-TH1-celler i medium ved 2 x 10 6 celler / ml og tilsett 0,5 ml av cellesuspensjon til hver brønn i en 48-brønners plate.
  3. Tilsett 20 ul av de nylagde 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-løsning til hver brønn på 48-brønners plate. Endelig forhold for merking er 0,7 MBq per 10 6 celler i et volum på 520 ul. Inkuber ved 37 ° C og 7,5% CO2 i 30 minutter.
  4. Etter inkubering nøye resuspender cellene i hver brønn og overføre cellesuspensjon fra en 48-brønns plate i et 50 ml rør med skrukork. For å minimere celletap, skylle hver brønn med forvarmet medium.
  5. Sentrifuger Cova-TH1 cellesuspensjonen ved 400 xg i 5 minutter, kaste supernatanten og resuspender cellene i 10 ml forvarmet PBS. Fjern en aliquot av cellesuspensjon for celletelling. Gjenta vasketrinn.
  6. Antall levedyktige Cova-TH1-celler i en passende fortynning med trypan blå farging.
  7. Juster cellekonsentrasjonen til 5 x 10 7 celler / ml for intraperitoneal (ip) injeksjon av 10 7 celler i 200 ul PBS.
  8. Gjenta trinn 4,3-4,5 å radio Cova-TH1-celler med økende mengder aktivitet, for eksempel, 1,4 MBq eller 2,1 MBq per 10 6 celler.
    1. For å radio cellene med 1,4 MBq per 10 6-celler ved å bruke 40 ul av 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-løsning og 60 ul for radiomerking med 2,1 MBq per 10 6 celler. Utfør trinnene 4,3-4,7 med 0,7 MBq, 1.4 MBq og 2.1 MBq 64 Cu-PTSM men øker merking tid til 3 timer for sammenlignende undersøkelser 17.
    2. Fortsett til trinn 5 for å bestemme den optimale mengden av aktivitet.

5. In vitro evaluering av effekten av radiomarkøren på Cova-Th1-celler

MERK: karakterisering av påvirkninger av den radioaktive merking på Th1-celler blir utført via trypanblått eksklusjonsanalyse for levedyktighet, IFN-y ELISA for funksjonalitet vurdering og PE-Annexin V-farging for induksjon av apoptose 16, 17. Bestemmelse av den intracellulære opptaket og utstrømningen av radioaktivitet er også beskrevet nedenfor. Som sammenligning kan 64 Cu-PTSM-merket Cova-TH1-celler også anvendes.

  1. Effekt på levedyktighet ved trypan blå eksklusjon
    1. Juster på minst 18 x 10 6 Cova-TH1-celler radiomerket med 0,7 MBq / 10 6-celler, 1,4 MBq / 10 6 celler og 2.1 MBq / 10 6 celler henholdsvis til en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler / ml og utføre trinn 5.1. 2-5.1.7 for hver aktivitet dose. Bruke ikke-radioactive KJ1-26-mAb merket Cova-TH1-celler og ikke-merkede Cova-TH1-celler som kontrollene.
    2. Pipetter 1 ml av celleløsningen inn i 9 brønner på en 24-brønners plate.
    3. Samle innholdet av 3 brønner inn i tre separate 15 ml skrukork, 3 timer etter den innledende radioaktiv merking.
    4. Skyll den nå tomme brønner med forvarmet medium for å redusere celletap og tilsett medium til de respektive 15 ml skrukork fra trinn 5.1.3.
    5. Sentrifuger 15 ml rør ved 400 xg i 5 minutter og suspendere den resulterende cellepelleten i 1 ml forvarmet medium.
    6. Telle både levedyktige og døde celler i trypanblå separat for hver 15 ml rør og beregne hvor stor andel av levedyktige celler.
    7. Gjenta trinn 5.1.3-5.1.6 24 og 48 timer etter 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radioaktiv merking.
  2. Effekter på funksjonalitet bestemmes av IFN-y ELISA
    NB: For å vurdere effekten av den 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomarkør på IFN-γ produn som en markør av funksjonalitet, utføre en IFN-γ ELISA fra en kommersiell leverandør og refererer til referanse 17 for ytterligere detaljer.
    1. Disperse 10 5 levedyktige celler i 100 ul medium på en 96-brønns plate, 3 timer etter 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomerking av Cova-TH1-celler med 0,7 MBq, 1,4 MBq eller 2,1 MBq. Bruke umerket, ikke-radioaktive KJ1-26-mAb-merket eller 64 Cu-PTSM-merkede Cova-TH1-celler som kontrollene.
    2. Stimulere IFN-γ produksjon i 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler i 100 ul medium med 10 pg / ml Cova peptid, 5 U / mL IL-2 og 5x10 5 APCer i 100 ul av medium i 24 timer ved 37 ° C og 7,5% CO2. Ytterligere kontroller kan være de øvrige betingelser uten tilsetning av Cova peptidet.
    3. Analyser supernatanten ved ELISA i henhold til produsentens instruksjoner.
    4. Gjenta trinn 5.2.2. til 5.2.3. ved 24 og 48 timer etter den merkningsmetode.
  3. Induksjon av apoptose bestemt ved hjelp av PE-Annexin V-farging for flowcytometri
    NB: For å evaluere apoptose-induksjon ved 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarkør, bruke et kommersielt tilgjengelig kit for flowcytometri og forberede celleprøver i henhold til produsentens instruksjoner før farging med annexin V for fosfatidylserin utstilling på cellemembranen .
    1. Ved 3, 24 og 48 timer etter 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomerking av Cova-TH1-celler, flekk triplikater med minst 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler med den Annexin V-kit ifølge produsentens instruksjoner og analysere i løpet av den neste timen. Bruke ikke-radioaktive KJ1-26-mAb-merkede, 64 Cu-PTSM-merkede og umerkede Cova-TH1-celler som kontroller. Vennligst referer til referanse 17 for ytterligere detaljer.
  4. Opptak og effluks
    MERK: Opptaket av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb inn i cellene ble målt i en dosekalibratoren og utstrømningen av radioaktiviteten måles i en γ-telling assay 0, 5, 24 og 48 timer etter radiomerkingen.
    1. Forbered ti γ-tellerør for hver 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler, de respektive supernatant og vasketrinnet.
    2. Overføring 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merket Cova-TH1-celler i 1 ml medium i hver av de ti γ-tellerør direkte etter radioaktiv merking. For hvert av tidspunktene 5, 24 og 48 timer etter radiomerking, holde minst 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler i medium på 24-brønners cellekulturplater i en inkubator ved 37 ° C og 7,5% CO2.
    3. Sentrifuger γ-tellerør ved 400 xg i 5 minutter og overføres supernatanten til ti nye γ-tellerør.
    4. Vask cellene en gang i 1 ml medium for å fjerne ubundne fraksjonen av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb end samle supernatanten i ti nye γ-tellerør.
    5. Tilsett 1 ml nytt medium for å Cova-TH1-celler og bestemmelse av initialopptak i en dosekalibratoren. Rørene kan også være lagret i en inkubator ved 37 ° C og 7,5% CO2.
    6. Gjenta trinn 5.4.2 til 5.4.5 etter 5, 24 og 48 timer og måle alle rør i en γ-teller i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. For å korrigere for radioaktiv nedbrytning og for kvantitativ analyse ved å bruke en standard med en definert dose av radioaktivitet.

6. OVA-indusert akutt luftveis DTHR

MERK: migrasjon dynamikk og homing mønstre av adoptivt overført og radiomerket Cova-TH1-celler til inflammasjonsstedet vil bli visualisert og kvantifisert i en dyremodell for Cova-indusert luftveis-DTHR 16, 17.

  1. Injiser 8 uker gamle BALB / c-mus ip med en blanding av 150 ul aluminum gel / 50 ul Cova-oppløsning (10 ug i 50 ul PBS) for å immunisere musene.
  2. To uker etter immuniseringen, bedøve musene med 100 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin ved ip injeksjon. Plasser de eksperimentelle mus på ryggen og langsomt Pipetter 100 ug Cova oppløst i 50 ul PBS inn i neseborene til dyrene. Dyrene vil inhalere løsningen dråpe for dråpe.
  3. Gjenta etter 24 timer. For sterkere luftveis DTHR induksjoner, gjentar igjen etter 48 timer.
  4. For å analysere den spesifikke migrasjon av de overførte Cova-TH1-celler, induserer luftvei-DTHR med kalkun-eller fasan-OVA som kontroll. Derfor, gjenta trinn 6,1-6,3 ved hjelp av respektive OVA-protein.

7. In vivo avbildning ved hjelp PET / CT

MERK: In vivo avbildning av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler i Cova-DTHR syke mus og kontroll kullet demonstrerer spesifikk homing og migration dynamikken i Cova-TH1-celler. Derfor skaffe statiske PET og anatomisk CT-avsøker i rekkefølge 3, 24 og 48 timer etter adoptiv overføring celle.

  1. Direkte etter radioaktiv merking, justere 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler til 5 x 10 7 celler / ml for ip injeksjon av 10 7 celler i 200 ul.
  2. Ved hjelp av en 1 mL sprøyte og en 30-gauge nål, tegne 200 mL av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merket Cova-TH1 cellesuspensjon og injisere cellene ip inn i Cova-DTHR-syke dyr mellom 4 og 5. nippel. Å bestemme den totale injiserte mengden av radioaktivitet, måle sprøyten i en dosekalibratoren før og etter injeksjon.
  3. Bedøve mus, 10 minutter før den ønskede opptak tid, med 1,5% isofluran i 100% oksygen (strømningshastighet: 0,7 l / min) i en temperaturkontrollert anestesi boksen.
  4. I mellomtiden, for å lette co-registreringav PET og CT-bilder ved bildeanalyse, feste glasskapillærer som inneholdt 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb løsning eller fri 64 CuCl2 løsning under musen sengen.
    1. Derfor fremstille en løsning av 0,37 MBq / ml og fylle glasskapillærer med et volum på 10 ul med denne løsningen. Siden celle-avledet radioaktivitet signaler som er iboende svake, ikke bruker store mengder av aktivitet for å sørge for at markørene ikke er i konflikt med celle-avledede signaler i mus.
  5. Etter å ha nådd kirurgisk toleranse, som indikert ved tap av pedalen tilbaketrekking refleks av bakfoten, overføre mus til en PET-og CT-kompatibel små dyr seng utstyrt med et passende rørsystem for å opprettholde anestesi.
  6. Immobilisere musen på små dyr seng bruke bomullspinner og kirurgisk tape. Påfør øye salve for å unngå uttørking av øynene.
  7. Overføre mus sengen til PET-skanneren, sentrerer synsfelt med en focus på lungene og skaffe en 20 min statisk PET scan med et energivindu fra 350 til 650 keV.
  8. Overfør musen sengen til CT-skanner. Via speider utsikt, sentrere synsfeltet på lungene. Erverve et plant CT-bilde via 360 anslag i løpet av en 360 ° rotasjon i "trinnet og shoot" -metoden med en utstilling tid på 350 ms og binning faktor 4.

8. Bildeanalyse

  1. Rekonstruere PET liste-modusdata ved å anvende statistisk iterativ beordret delsett forventning maksimering (OSEM) 2D algoritme og CT-skanninger inn i et 3D-bilde med en pikselstørrelse på 75 pm.
  2. For bilde ko-registrering i en passende bildeanalyseprogramvare (f.eks Inveon Forskning på arbeidsplassen eller Pmod), bruke den automatiske samregistrering verktøyet. Hvis dette ikke lykkes, å bruke glasskapillærer under muse sengen som veiledning til å co-register rekonstruert PET- og CT-bilder romlig i aksial, koronal og sagital visning.
  3. Korriger PET-bilderfor radioaktiv nedbrytning ved hjelp av radioaktiv nedbrytning lov og den halve tiden av radionukleidet 64 Cu på 12,7 timer. For bilde normalisering, velge ett bilde (A) som en referanse, og justere intensiteten av bildeskjermen i de respektive bildeanalyseprogramvare.
    1. Ved hjelp av de verdier som nettopp er angitt for referansebildet (A), den injiserte aktivitet (A) og den injiserte aktivitet for de andre bilder (X), normalisere de andre bildene ved hjelp av følgende ligning: (injisert aktivitet (X) / injisert aktivitet ( A)) x intensitetsverdier (A).
  4. Tegne 3D-volumer av interesse (VOI) på det normaliserte signal PET av pulmonal og perithymic LNS.
  5. Bestemme den prosentvise injiserte dose pr cm3 (% ID / cm3) ved hjelp av følgende ligning: (gjennomsnittlig aktivitet i VOI / total aktivitet i mus) x 100. For ytterligere veiledning angående bildeanalyse, se referansene 22, 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 oppsummerer merking av Cova-TH1-celler med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb og eksperimentell design for in vitro og in vivo studier som omfattes i denne protokollen.

Figur 1
Figur 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb etiketteringsprosessen & Experimental Design. (A) Skjematisk representasjon av radioaktiv cellemerking med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb binder til Cova-TCR-reseptorer på celleoverflaten av Th1-celler og internaliseres med reseptoren i løpet av 24 timer. Cova-TCR er re-uttrykkes 24 timer etter radiomerking. (B) CD4 + T-celler ble isolert, ekspandert og radiomerket med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in vitro. Opptaks og efflux verdier were bestemmes av en dosekalibratoren og γ-telling. Virkningene av den radioaktive antistoff på cellelevedyktigheten ble bedømt med trypanblåfarging, på funksjonalitet med IFN-y-ELISA, og ved induksjon av apoptose med Phycoerythrin (PE) -Annexin V farging. (C) Cova-luftvei DHTR ble indusert i Balb / C-mus. 10 7 TH1 celle ble adoptivt overført til Cova-veis DHTR-syke dyr direkte etter radioaktiv merking. PET / CT-bildene ble anskaffet 3, 24 og 48 timer etter adoptiv overføring celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den vellykkede intracellulære merking av TH1-celler med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ble bekreftet ved immunohistokjemi (figur 2A). 64 Cu-DOTA-KJ1-26 antistoff (grønn) ble co-lokalisert medCD3 på cellemembranen 3 timer etter radiomerkingen, mens signalet fra mAb ved cellemembranen var bare svak ved 24 timer (gul). Ved 48 timer etter radioaktiv merking ble 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR-komplekset internaliseres via endocytose med et sterkt signal i cytoplasma av Th1-celler. Den påførte radioaktiv dose på 0,7 MBq redusert levedyktighet av TH1-celler med kun 8%, mens høyere doser på 1,4 MBq og 2.1 MBq 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb var mer uttalte effekter. Sammenlignet med radiomerking med 64 Cu-PTSM, imidlertid ble det ikke observert noen signifikant fordel med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (figur 2B). 64 Cu-antistoff radioaktivt merkede celler viste lite tap av funksjonalitet som vist med IFN-γ sekresjon (figur 2C), redusert utstrømning av radioaktivitet (figur 2D), og redusert induksjon av apoptose (figur 2E) sammenlignet med 64 Cu-PTSM-merket TH1 celler.


Figur 2: In vitro-evaluering av radioaktivt TH1 cellemerking med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. (A) Konfokalmikroskopi beviser det intracellulære opptaket av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAbs (grønn) i Cova-TH1-celler (cellemembran, rød) innen 24 timer etter den innledende merking (Dette tallet har blitt forandret fra referanse 17) . (B) Titrering av radioaktive merking doser av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM avslørte en like stor innflytelse på levedyktighet som detektert ved hjelp av trypanblått-eksklusjon 24 timer etter merking. Bruken av 0,7 MBq for cellemerking indusert lavest svekkelser av levedyktighet (gjennomsnitt ± standardavvik i prosent;. Dette tallet er blitt modifisert fra referansene 16, 17 (C) Titrering av radioaktiv merking gjøreses av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM viste en sterkere nedsettelse av funksjonalitet etter 64 Cu-PTSM merking, som detektert av IFN-y-ELISA 24 timer etter merking. En økende dose av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb for cellemerking hadde ingen påvirkning på funksjonalitet (gjennomsnitt ± standardavvik i prosent; statistikk: t-test; * p <0,05, ** p <0,01, ** * p <0,001, og dette tall er blitt modifisert fra referansene 16, 17). (D) utstrømning målinger av radioaktivt merkede celler (γ-telling) viste en høyere stabilitet merking av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb sammenlignet med 64 Cu-PTSM 5 timer og 24 timer etter merking (gjennomsnitt ± standardavvik i prosent; statistikk : t-test; *** p <0,001, og dette tall er blitt modifisert fra 17). (E) Respektive strømningscytometri (PE-Annexin V) diagrammer indikerer en høyere apoptosis induksjon 24 timer etter 64 Cu-PTSM merking sammenlignet med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merking (Dette tallet har blitt forandret fra referanse 17). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter adoptiv overføring av 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler i Cova-DTHR-syke dyr og ubehandlede kontroller, med høy oppløsning statisk PET og anatomiske CT-bildene ble anskaffet. For bildeanalyse, ble bilder smeltet i den koronale, aksiale og sagittal vis med hjelp av glasskapillærer som inneholder en liten mengde av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (figur 3A). Vois ble trukket på lunge og perithymic LNS om desintegrasjons-korrigerte og normalisert PET-bilder for å beregne den prosentvise injiserte dose pr cm3(Figur 3B).

Figur 3
Figur 3: PET / CT-ko-registrering og analyse. (A) PET- og CT-bildene ble samtidig registrert i programvare for bildeanalyse. Ved automatiske registrering av programvaren sviktet ble bildene smeltet sammen ved å legge over PET- og CT-signaler på glasskapillærer (markører), fylt med radioaktivitet og faste under dyret sengen. (B) Vois plasseres over de korrigerte og normaliserte PET signalene for perityhmic og pulmonale LNS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Cova-TH1 cellemigrering ble sporet til det pulmonale og perithymic LN som Cova-presentasjons steder i luftveiene DTHR. In vivo PET signaler derived fra 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-merkede Cova-TH1-celler som var betydelig høyere enn signalene fra 64 Cu-PTSM-merkede celler (figur 4A). Cova-TH 1 celle-opptaksverdier i lungene og perithymic LNS var signifikant økt i DTHR-syke dyr sammenlignet med ubehandlede kontroll littermates (figur 4B).

Figur 4
Figur 4: Cova-TH1 celle sporing i Airway DTHR Model ved in vivo PET / CT. (A) De respektive PET / CT-bilder av adoptiv overført Cova-TH1-celler, som tidligere var merket med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM, inn Cova-DTHR-syke eller ubehandlede mus. De overførte Cova-TH1 celler omplassert til lungene og perithymic LNS. (B) Kvantitativ analyse av homing områder av Cova-TH1-celler viste seg å være en høyere homing til betent vev (gjennomsnitt ± SD; statistikk: t-test; * p <0,05, ** p <0,01). Merkingen med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb viste en høyere følsomhet (økt% ID / cm3) sammenlignet med 64 Cu-PTSM i de forskjellige målsøkende områder (gjennomsnitt ± SD, statistikk: t-test; # p <0,05, ## p <0,01, ### p <0,001). Dette tallet er blitt modifisert fra referanse 16, 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir en pålitelig og enkel metode for stabilt å radiomerke celler for in vivo sporing av PET. Ved hjelp av denne metode, Cova-TH1-celler, isolert og ekspandert in vitro fra donormus, kan merkes radioaktivt med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb og deres homing ble sporet til lungene og perithymic LNS som områder av Cova presentasjon i en Cova-fremkalt akutt luftveis DTHR.

Modifiseringen av mAb med chelatoren krever hurtig og effektivt arbeid og bruken av ultra-rene oppløsninger uten spor av aminer. Løsningene ble behandlet med en chelaterende ionebytterharpiks for å sikre riktig konjugering av DOTA-NHS aktiv ester til amin rester av mAb. Den chelator-konjugert mAb som et intracellulært radiomerket substans har flere fordeler i forhold til bruken av ikke-spesifikk celle-merkende midler. For det første gir den mAb utmerket spesifisitet muliggjør målrettet merking av en definert cellepopulasjon. den mAbi seg selv ikke er cytotoksisk og ikke har noen skadelig virkning på levedyktigheten eller funksjonaliteten av cellene. Deretter blir utstrømningen av radioaktivitet fra cellene ble betydelig redusert å forbedre signal-til-støy-forhold av PET-bildene 17, 24. Ved å velge et mAb med en annen spesifisitet, er denne metode lett overførbar til andre cellepopulasjoner av interesse som CD8 + CD14 + TIL eller monocytter. Dessuten kan denne cellemerking tilnærming bli anvendt for celle sporing studier i forskjellige dyremodeller av humane inflammatoriske sykdommer (for eksempel revmatoid artritt og astma bronkiale) eller dyremodeller for forskjellige humane krefttyper. Denne merkingsmetode er imidlertid begrenset til membranbundne reseptorer eller differensiering markører som mål siden mAb ikke passivt diffundere over cellemembranen. Aktiverings-induserte internalisering av målet, eller simpelthen, er membran-skytteltrafikk fordelaktig. ENhøy aviditet mellom mAb og målet, kan imidlertid også være tilstrekkelig for in vivo avbildning, og eventuelt med et redusert signal til støy-forhold.

Valget av DOTA som en chelator for våre forsøk var basert på tidlige arbeid med 64 Cu 25. Men i mellomtiden DOTA ble vist å ikke være en optimal chelator for denne isotopen, som fører til temmelig høy aktivitet opptak i leveren ved transchelatering til superoksyddismutase 26. Selv ved anvendelse av det radiomerkede antistoff for in vitro-merking av celler som er så adoptivt overført skal redusere risikoen for 64 Cu frigivelse og transport til leveren, moderne chelatorer som er optimalisert for 64 Cu, som 1,4,7-triazacyklononan, 1-glutarsyre -4,7-eddiksyre (NODAGA) eller 1,4,7-triazacyklononan-trieddiksyre (NOTA), kan fortrinnsvis anvendes sammen med vår metode for å ytterligere øke spesifisiteten av de oppnådde data 27 64 Cu (for eksempel N-klorsuccinimid (NCS)) eller andre isotoper, slik som 89 Zr (f.eks desferrioksamin;. DFO).

Valget av 64 Cu som den radioaktive isotop er basert på det faktum at in vivo cellemigrasjon og homing er en ganske langsom prosess sammenlignet med metabolske forandringer vanligvis fotografert av PET. 64 Cu med en halveringstid på 12,7 timer muliggjør gjentatt avbildning av cellemigrering i løpet av 48 timer etter injeksjon. For 64 Cu produksjon, er det viktig å benytte høyverdige løsninger uten spormetallioner for å sikre renhet av 64 Cu. Videre er renheten av 64 Cu av stor betydning for radiomerking av DOTA-mAb siden multivalent metallion-urenheter som kan føre til en redusert spesifikk aktivitet av 64 Cu løsning til et nivå som utelukker proteiner radiomerking og følgelig bildebehandling. Selv om 64 Cu bringer en sibetydelige materielle prosentandel av høyenergetiske, cytotoksiske Auger-elektroner når råtnende 28, en justert dose av den radioaktive isotop er godt tolerert av cellene som representeres av minimale virkninger på levedyktighet og funksjon og lav apoptoseinduksjon etter radioaktiv merking. Ikke desto mindre er det klart tilrådelig først å titrere aktivitet dose som anvendes for radiomerking for andre celletyper og justere radiomerkingsprotokollen. Rask og enkel in vitro evalueringsmetoder er blitt demonstrert i protokollen, herunder bestemmelse av levedyktighet ved trypan blå eksklusjon og farging med PE-Annexin V for bestemmelse av apoptotiske fraksjoner av cellene. Begge metodene er relativt billig og bruke lett tilgjengelig laboratorieutstyr. Ved å kombinere PE-Annexin V farging med et fargestoff for diskriminering av levende og døde celler, slik som 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) ville tillate for bestemmelse av levedyktigheten og apoptose i en eksperimentell stes. Som et alternativ for å vurdere levedyktigheten av merkede T-celler, kan en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT-) assay brukes for å vurdere celle metabolsk aktivitet. Evalueringen av opptak og efflux verdier med en dose kalibrator og γ-telleren er mer avansert, men likevel rask og billig å oppnå siden nesten alle laboratorier som arbeider med radioaktivitet har det respektive maskinvare på stedet. Gene sekvensering eller mikrobrikke-baserte metoder vil gi mer detaljerte data. Disse metodene er imidlertid ikke alltid lett tilgjengelig, må riktig kompetanse og er oftest knyttet til høyere kostnader.

Selv om PET er ikke i stand til å nå en celleoppløsning som mikroskopisk avbildningsteknikker 29, og det gir utmerket følsomhet i pikomolare området for påvisning av selv små antall av celler i løpet av dyr eller mennesker 8. Sammenlignet med andre ikke-invasive avbildningsteknikker så som optical avbildning, PET er kvantitative, ikke er begrenset i penetrasjonsdybde og gir bilder av høy kvalitet med tredimensjonale oppløsninger. Ved å kombinere den høye følsomheten til PET med den anatomiske nøyaktigheten av CT tillater høy presisjon avbildning av cellemigrering. Dessuten kan in vivo-data lett bli validert av flere ex vivo metoder, inkludert γ-telling for biodistribusjon analyse. Autoradiografi av frysesnitt og påfølgende histologisk farging av frysesnitt kan overlappes for å korrelere den autoradioaktiviteten kartet med immun celleinfiltrater identifisert ved hematoxylin og eosin-farging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Julia Heim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant samt Natalie Altmeyer for støtte under eksperimenter og dataanalyse. Dette arbeid ble støttet av Werner Siemens-Foundation, DFG gjennom SFB685 (prosjekt B6) og Fortune (2309-0-0).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber WKL Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 mL Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitroevaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30 G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µL VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Tags

Immunology utgave 122 Small dyr avbildning cellemerking ikke-invasiv PET / CT TH1 T-celler luftvei forsinket-type hypersensitivitetsreaksjon
Murine Lymfocytter Merking av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistoff Reseptor for målretting<em&gt; In Vivo</em&gt; Celletrafikken av PET / CT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffmann, S. H. L., Maurer, A.,… More

Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter