Summary
Efter framställningen av en 64 Cu-modifierad monoklonal antikropp som binder till en transgen murin T-cellsreceptor, T-celler är radiomärkta in vivo, analyserades för livsduglighet, funktionalitet, stabilitet och apoptos märkning, och adoptivt överförd in i möss med en luftväg fördröjd överkänslighet reaktion för icke-invasiv avbildning genom positronemissionstomografi / datortomografi (PET / CT).
Abstract
Detta protokoll illustrerar framställningen av 64 Cu och kelatorn konjugering / radiomärkning av en monoklonal antikropp (mAb) följt av murin lymfocyt cellkultur och 64 Cu-antikroppreceptor målsökning av cellerna. In vitro-utvärdering av den radioaktiva märkningen och icke-invasiv in vivo cellspårning i en djurmodell av en luftväg fördröjd typ hypersensitivitetsreaktion (DTHR) med PET / CT beskrivs.
I detalj är konjugering av en mAb med kelator 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraättiksyra (DOTA) som visas. Efter produktionen av radioaktivt 64 Cu, radiomärkning av DOTA-konjugerad mAb beskrivs. Nästa, expansionen av kyckling ovalbumin (Cova) -specifika CD4 + interferon (IFN) -γ-producerande T-hjälparceller (Cova-TH1) och den efterföljande radiomärkning av de Cova-TH1-celler är avbildade. Olika in vitro-tekniker presenteras för att utvärdera effekter av 64 Cu-radiomärkning på cellerna, såsom bestämning av cellviabilitet genom trypanblått-uteslutning, den färgning för apoptos med Annexin V för flödescytometri, och bedömningen av funktionalitet genom IFN-γ enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) . Vidare är bestämningen av den radioaktivt upptag in i cellerna och stabiliteten märkning beskrivas i detalj. Detta protokoll beskriver vidare hur man utför spårningscell studier i en djurmodell för en luftvägs DTHR och, därför, är induktionen av Cova-inducerad akut luftvägs DHTR i BALB / c-möss ingår. Slutligen är en robust PET / CT arbetsflöde inklusive bildtagning, rekonstruktion och analys presenteras.
Den 64 Cu-antikroppreceptor targeting tillvägagångssätt med efterföljande receptorinterna ger hög specificitet och stabilitet, reducerad cellulär toxicitet, och låga utflödeshastigheter jämfört med vanliga PET-spårämnen för cellmärkning, t ex 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-metyltiosemikarbazon) (64 Cu-PTSM). Slutligen, vårt tillvägagångssätt möjliggör icke-invasiv in vivo cellspårning av PET / CT med en optimal signal-till-bakgrund-förhållande för 48 timmar. kan överföras detta experimentella tillvägagångssätt för olika djurmodeller och celltyper med membranbundna receptorer som intern.
Introduction
Icke-invasiv cell spårning är ett mångsidigt verktyg för att övervaka cellfunktion, migration och homing in vivo. Senaste spårningscell studier har fokuserat på mesenkymala 1, 2 eller benmärg härledda stamceller 3 i samband med regenerativ medicin, autologa perifera vita blodkroppar i inflammation eller T-lymfocyter i adoptiv cellterapier mot cancer 3, 4. Den klarläggande av platserna handlings och de underliggande biologiska principer cellbaserade terapier är av enorm betydelse. CD8 + cytotoxiska T-lymfocyter, genetiskt manipulerade chimära antigenreceptorn (CAR) T-celler eller tumörinfiltrerande lymfocyter (TIL) var allmänt betraktas som den gyllene standarden. Emellertid, har tumörassocierade antigenspecifika TH1-celler visat sig vara ett effektivt alternativ behandlingsalternativ 4, </ sup> 5, 6, 7.
Som viktiga aktörer för inflammation, organspecifika autoimmuna sjukdomar (t ex reumatoid artrit eller bronkial astma) och celler av högt intresse i cancerimmunterapi, är det viktigt att karakterisera de tidsmässig utbredning och homing mönster av TH1-celler. Icke-invasiv in vivo-avbildning genom PET presenterar en kvantitativ, mycket känslig metod 8 för att undersöka cellmigrationsmönster, in vivo homing, och ställena för T-cellverkan och svaren under inflammation, allergier, infektioner eller tumöravstötnings 9, 10, 11.
Kliniskt, 111 In-oxin används för leukocyt scintigrafi för diskriminering av inflammation och infektion 12, medan 2-deoxi-2- (18F) fluor-D-glukos (18 F-FDG) används vanligen för spårning cellstudier med PET 3, 13. En stor nackdel med denna PET-spårämne, är emellertid den korta halveringstiden av radionukliden 18 F vid 109,7 min och den låga intracellulära stabilitet som hindrar avbildning vid senare tidpunkter efter adoptiv cellöverföring. För längre sikt in vivo spårningscell studier av PET, även om instabil i cellerna, är 64 Cu-PTSM ofta används för att icke-specifikt märka celler 14, 15 med minimerade negativa effekter på T-celllivsduglighet och funktion 16.
Detta protokoll beskriver en metod för att ytterligare minska ofördelaktiga effekter på cellviabilitet och funktion med hjälp av en T-cellreceptor (TCR) -specifika radiomärkt mAb. Först, produktion av radioisotopen 64 Cu, konjugering av mAb KJ1-26 med the kelator DOTA, och den efterföljande 64 Cu-radiomärkning är visade. I ett andra steg, är isoleringen och expansion av Cova-TH1 celler av DO11.10 donatormöss och radiomärkning med 64 Cu-loaded DOTA-konjugerad mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) beskrivas i detalj. Bedömningen av upptagsvärden och utflödet av radioaktivitet med en dos kalibrator och genom y-räkning, respektive, liksom utvärderingen av effekterna av 64 Cu-radiomärkning på cellviabilitet genom trypanblått-uteslutning och funktionalitet med IFN-y ELISA presenteras . För icke-invasiv in vivo cellspårning, är framkallandet av en musmodell för Cova-inducerad akut luftvägs DTHR och bild förvärv av PET / CT efter adoptiv cellöverföring beskrivits.
Dessutom, kan överföras till olika sjukdomsmodeller, murina T-celler med olika TCR eller allmänna celler av intresse med membranbundna receptorer eller expressions mar denna märkning tillvägagångssättkers underliggande kontinuerligt membran shuttling 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Säkerhetsåtgärder: Vid hantering av radioaktivitet, lagra 64 Cu bakom 2-tums-tjock bly tegel och använda respektive avskärmning för alla fartyg med aktivitet. Använd lämpliga verktyg för att indirekt hantera oskärmade källor för att undvika direkt handkontakt och minimera exponeringen för radioaktivt material. Alltid bära strålningsdosimetri övervaknings märken och personlig skyddsutrustning och kontrollera sig själv och arbetsområdet för föroreningar att omedelbart ta itu med det. Kassera potentiellt kontaminerad personlig skyddsutrustning innan de lämnar det område där radioaktivt material används. Lagra hela radioaktivt avfall bakom blyskydd tills den radioaktiva 64 Cu skämda (approximativt 10 halveringstider = 127 h) innan adekvat bortskaffande.
1. 64 Cu Produktion
OBS: Den radioisotop 64 Cu produceras via 64 Ni (p, n) 64 Cu kärnreaktion med användning av en Pettras cyklotron enligt ett modifierat protokoll av McCarthy et al. 18.
- För 64 Cu produktion, bestråla 64 Ni, som elektropläteras på en platina / iridium platta (90/10), med 30 | iA för sex timmar med en protonstråle på 12,4 MeV.
- Värma platina / iridium målet till 100 ° C i en dedicerad polyetereterketon (PEEK) kammare och inkubera i 2 ml koncentrerad HCl under 20 min för att lösa upp 64 Cu / 64 Ni.
- Lägga till ytterligare en ml koncentrerad HCl och inkubera i 10 min.
- Indunsta HCl med användning av en ström av argon och kyla kammaren till rumstemperatur.
- Spola kammaren med 3 ml 4% 0,2 M HCl och 96% metanol (volym / volym) och överför denna lösning till en jonbytarkolonn som var pre-konditionerade med 4% 0,2 M HCl i metanol under åtminstone 15 min. Genomflödet kan användas för att återvinna 64 Ni.
- Tvätta 64 Cu kvarhålles i kolonnen med 4% 0,2 M HCl in metanol.
- Eluera 64 Cu med 70% 1,3 M HCl / 30% isopropanol (volym / volym) i ett uppsamlingskärl, indunsta lösningen i en ström av argon och låt flaskan svalna till rumstemperatur.
- Lös upp 64 Cu i 140-210 ul av 0,1 M HCl.
2. Antikropp Konjugering med DOTA och efterföljande 64 Cu-radiomärkning
OBS: kelator DOTA kommer att kopplas till funktionella aminogrupper av mAb genom N-hydroxisuccinimid (NHS) -ester kemi och konjugatet kommer att därefter radioaktivt med 64 Cu 19.
- Justera koncentrationen av KJ1-26-mAb till 8 mg / ml och diafiltrat 1 ml av mAb lösningen mot 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 behandlades med 1,2 g / L av ett kelatbildande jonbytarharts med användning av en molekylviktsgräns ( MWCO 30 kDa) centrifugal filterenhet. Applicera 3 efterföljande tvättsteg med 14 ml av bufferten. Efter det slutliga tvättsteget,koncentrera lösningen igen till 1 ml. Kvantifiera antikroppskoncentrationen genom OD 280 nm mätningar.
- Förbereda en DOTA-NHS-lösning i ultrarent eller PCR-kvalitet vatten vid en koncentration av 10 mg / ml omedelbart före användning. Låt flaskan anpassa sig till rumstemperatur innan den öppnas för att undvika vattenkondensation, och försiktigt bort DOTA-NHS med användning av en plastspatel. Lägga 216 mikroliter av denna DOTA-NHS-lösning till 8 mg av den diafiltrerade KJ1-26-mAb-lösning, blanda väl, och inkubera i 24 h vid 4 ° C på en trumblandare.
- Diafiltratet DOTA-KJ1-26-mAb mot 0,25 M ammoniumacetat, pH 7,0, behandlades med 1,2 g / L av ett kelatbildande jonbytarharts, med användning av en molekylviktsgräns (MWCO 30 kDa) centrifugal filterenhet. Applicera 7 tvättsteg. Koncentrera mAb till en slutlig volym av 1 ml och återigen mäta proteinkoncentration av OD 280 nm mätningar.
- Före radiomärkning, byta ut bufferten för DOTA-KJ1-26-mAb till PBS via storlek-exclusion kromatografi med användning av gel-filtreringskolonner. Detta avlägsnar också potentiella småmolekylära föroreningar.
- Förbereda 100 MBq 64 CuCl 2 lösning i 10 mM HCl och justera pH till 6-7 med 10x PBS. Tillsätt 200 mikrogram av DOTA-KJ1-26-mAb. Inkubera i 60 min vid 37 ° C.
- För kvalitetskontrollen, utföra tunnskiktskromatografi med 0,1 M natriumcitrat (pH 5) som mobil fas och analysera med autoradiografi. Åtminstone bör vara bunden 90% av aktiviteten till antikroppen och sålunda detekteras vid startpunkten. Obunden aktivitet kelaterad av den citrat-baserade mobila fasen och strimmor till lösningsmedelsfronten. För en referens, är användningen av 64 CuCl 2 rekommenderas.
3. Kyckling Ovalbumin-specifika TH1 (Cova-TH1) Cell Isolering och Expansion
OBS: Den kultur av TH1-celler beskrives enligt tidigare publicerade studier 16, 17.
- Isolera mjältar och extraperitoneal lymfkörtlar (LNS) från DO11.10 möss.
- Offra musen enligt federala regler. Desinficera djuret med 70% etanol och fixera den med tejp för avlägsnandet av mjälten och LNS. Gör en median snitt och separera huden från bukhinnan genom sidled dra den till varje plats.
- Lokalisera hals-, axiella, brachialis och inguinala LNS. Ta bort dem med trubbig pincett och placera dem i en% fetalt kalvserum (FCS) / PBS-buffert.
- Öppna bukhinnan och leta mjälten. Separera mjälten från bukspottkörteln och bindväv och placera den i en% FCS / PBS-buffert. För ytterligare vägledning, se referenser 20,21.
- Färs mjälte och LNS genom ett 40 pm filter i en 50 ml skruvlock rör med hjälp av kolven hos en spruta. Skölj filtret med 10 ml 1% FCS / PBS-buffert.
- Centrifugera vid 400 xg under 5 min och avlägsna supernatanten. Subsequently, utföra lys av erytrocyter genom tillsats ammonium-klorid-kalium (ACK) lysbuffert (1,5 ml per donatordjuret) under 5 min vid rumstemperatur. Lägga 8,5 ml 1% FCS / PBS-buffert (per donator djur).
- Centrifugera cellerna vid 400 xg under 5 min och avlägsna supernatanten. Tvätta cellerna i 10 ml 1% FCS / PBS-buffert, centrifugera vid 400 xg under 5 min och avlägsna supernatanten.
- För magnetisk cellseparation, resuspendera cellerna i 1% FCS / PBS-buffert och till CD4 + mikropärlor. Se tillverkarens instruktioner för buffertvolym och mängden av CD4 + mikrokulor att använda.
- Inkubera i 20 min vid 4 ° C. Lägg sedan till en% FCS / PBS-buffert upp till 50 ml, centrifugera cellerna vid 400 xg under 5 min och avlägsna supernatanten.
- Fortsätta med CD4 + T-cellisolering med användning av kommersiella magnetiska separationskolonner och en respektive magnet Stativ enligt tillverkarens protokoll. Justera de eluerade CD4 + -T-celler till en concentration av 10 6 celler / ml i Dulbeccos modifierade Eagles medium med 10% värmeinaktiverat FCS, 2,5% penicillin / streptomycin, 1% HEPES-buffert, 1% MEM aminosyror, 1% natriumpyruvat och 0,2% 2-merkaptoetanol och lagra dem vid 4 ° C.
- Samla kolumnurladdning i en 50 ml skruvkapsylröret för att framställa antigenpresenterande celler (APC). Centrifugera kolonnen urladdning vid 400 xg under 5 min och avlägsna supernatanten.
- Lägg 10 | ig / ml anti-CD4 (klon: GK1.5), 10 | ig / ml anti-CD8 (klon: 5367,2) och 10 | ig / ml mus-anti-rått-mAb (MAR18.5) och 1,5 ml kaninkomplement. Inkubera i 45 min vid 37 ° C.
- Centrifugera cellerna vid 400 xg under 5 min, avlägsna supernatanten och tillsätt 3 ml medium. Bestråla APC på en γ-stråle eller röntgenkälla med 30 Gy totalt. Efteråt justera APC till en koncentration av 5 x 10 6 celler / ml.
- Tillsätt 100 | il av CD4 + T-celler och 100 mikroliter av APC på en 96-brunnars plate tillsammans med 10 | ig / mL cOVA 323-339-peptid, 10 | ig / ml anti-IL-4-mAb, 0,3 pM CPG1668-oligonukleotider och 5 U / ml IL-2.
- Lägg 50 U / ml IL-2 varannan dag. Efter 3 - 4 dagar, överföra celler från 96-brunnsplattor till 24-brunnsplattor. Kombinera 3-5 brunnar från 96-brunnsplatta i en brunn på 24-brunnars platta. Lägg 100 U / ml IL-2-innehållande medium i en 1: 1-förhållande.
- Efter ytterligare 2-3 dagar, överföra celler från 48-brunnars platta till 175 cm 2 cellodlingsflaskor (1 x 48-brunnars platta per kolv). Fyll med medium i en 1: 1-förhållande. Lägg 50 U / ml IL-2 varannan dag.
- Dela upp cellerna enligt celltäthet och tillsätt 50 U / ml IL-2 varannan dag. På detta sätt, odla cellerna i ytterligare 10 dagar.
4. Cova-TH1 Cell Radiomärkning
OBS: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb kommer att tillämpas på odlade Cova-TH1-celler för att möjliggöra intracellulär radioaktiv märkning.
- För Cova-TH1 cell radiomärkning, rita 37 MBq den radiomärkta 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i en spruta utan död volym med användning av en dos kalibrator. Lägg 1 ml koksaltlösning för att få en 37 MBq / ml lösning.
- Suspendera Cova-TH1-celler i medium vid 2 x 10 6 celler / ml och tillsätt 0,5 ml av cellsuspensionen till varje brunn i en 48-brunnsplatta.
- Lägga 20 mikroliter av de nyberedd 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-lösning till varje brunn i 48-brunnsplatta. Det slutliga förhållandet för märkningen är 0,7 MBq per 10 6 celler i en volym av 520 | il. Inkubera vid 37 ° C och 7,5% CO2 under 30 min.
- Efter inkubation, försiktigt återsuspendera cellerna i varje brunn och överföra cellsuspensionen från 48-brunnar i en 50 ml skruvkapsylröret. För att minimera cellförlust, skölj varje brunn med förvärmt medium.
- Centrifugera Cova-TH1 cellsuspensionen vid 400 xg under 5 min, kasta supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml förvärmd PBS. Ta en aliquot av cellsuspensionen för cellräkning. Upprepa tvättsteget.
- Räkna viabla Cova-TH1-celler i en lämplig utspädning med trypanblått-färgning.
- Justera cellkoncentrationen till 5 x 10 7 celler / ml för intraperitoneal (ip) injektion av 10 7-celler i 200 mikroliter PBS.
- Upprepa steg 4,3-4,5 för att radiomärka Cova-TH1-celler med ökande mängder av aktivitet, t ex 1,4 MBq eller 2,1 MBq per 10 6 celler.
- Att radioaktivt märka cellerna med 1,4 MBq per 10 6 celler, använda 40 mikroliter av de 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-lösning och 60 | il för radiomärkning med 2,1 MBq per 10 6 celler. Utföra stegen 4,3-4,7 med 0,7 MBq, 1,4 MBq och 2,1 MBq 64 Cu-PTSM men öka tiden märkning till 3 h för jämförande undersökningar 17.
- Fortsätt till steg 5 för att bestämma den optimala mängden av aktivitet.
5. In vitro-utvärdering av effekten av den radioaktiva markören på Cova-TH1-celler
OBS: Karakteriseringen av påverkan av radiomarkören på TH1 cellerna utförs via exklusion med trypanblått för viabilitet, IFN-y ELISA för funktionalitet bedömning och PE-Annexin V-färgning för induktionen av apoptos 16, 17. Fastställande av det intracellulära upptaget och utflödet av radioaktivitet beskrivs också nedan. Som jämförelse kan 64 Cu-PTSM-märkt Cova-TH1-celler också användas.
- Påverkan på lönsamheten genom trypanblåexklusion
- Justera åtminstone 18 x 10 6 Cova-TH1-celler radiomärkta med 0,7 MBq / 10 6 celler, 1,4 MBq / 10 6 celler och 2,1 MBq / 10 6 celler respektive till en koncentration av 2 x 10 6 celler / ml och utför steg 5.1. 2-5.1.7 för varje verksamhet dos. Använda icke-radioactive KJ1-26-mAb märkt Cova-TH1-celler och omärkta Cova-TH1-celler som kontrollerna.
- Pipett 1 ml cellösningen i 9 brunnar i en 24-brunnsplatta.
- Samla innehållet i 3 brunnar i tre separata 15 ml rör med skruvkork, 3 h efter initial radiomärkning.
- Skölj nu tomma brunnar med förvärmda medium för att minimera cellförlust och tillsätt mediet till respektive 15 ml skruvlock rör från steg 5.1.3.
- Centrifugera 15 ml rör vid 400 xg under 5 min och resuspendera den resulterande cellpelleten i 1 ml förvärmt medium.
- Räkna både viabla och döda celler i trypanblått separat för varje 15 ml rör och beräkna procentandelen av livsdugliga celler.
- Upprepa steg 5.1.3-5.1.6 24 och 48 timmar efter 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomärkning.
- Effekter på funktionalitet bestäms av IFN-y-ELISA
OBS: För att bedöma effekten av 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomärkta på IFN-γ production som en markör av funktionalitet, utföra en IFN-γ ELISA från en kommersiell leverantör och se hänvisnings 17 för ytterligare detaljer.- Dispergera 10 5 viabla celler i 100 | il av medium på en 96-brunnars platta, 3 h efter 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomärkning av de Cova-TH1-celler med 0,7 MBq, 1,4 MBq eller 2,1 MBq. Använda omärkta, icke-radioaktiva KJ1-26-mAb-märkta eller 64 Cu-PTSM-märkta Cova-TH1-celler som kontrollerna.
- Stimulera IFN-γ-produktion i 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler i 100 mikroliter medium med 10 | ig / ml Cova peptid, 5 U / ml IL-2 och 5x10 5 APC i 100 il av medium under 24 h vid 37 ° C och 7,5% CO2. Ytterligare kontroller kan vara de andra villkoren utan tillsats av Cova peptiden.
- Analysera supernatanten genom ELISA enligt tillverkarens anvisningar.
- Upprepa steg 5.2.2. 5.2.3. vid 24 och 48 h efter märkningsförfarandet.
- Induktion av apoptos bestämdes genom PE-Annexin V-färgning för flödescytometri
OBS: För att bedöma apoptosinduktion genom 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarkör, använda ett kommersiellt tillgängligt kit för flödescytometri och förbereda cellprover i enlighet med tillverkarens instruktioner innan färgning med annexin V med avseende på fosfatidylserin utläggning på cellmembranet .- Vid 3, 24 och 48 h efter 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomärkning av de Cova-TH1-celler, fläck triplikat med minst 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler med Annexin V kit enligt tillverkarens anvisningar och analysera inom den närmaste timmen. Använda icke-radioaktiva KJ1-26-mAb-märkta, 64 Cu-PTSM-märkta och omärkta Cova-TH1-celler som kontroller. Se referens 17 för ytterligare information.
- Upptag och utflöde
OBS: upptag av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i cellerna mäts i en doskalibrator och utflödet av radioaktiviteten mäts i en γ-räkningsanalys 0, 5, 24, och 48 h efter radiomärkning.- Förbereda tio γ-räknings rör vardera under 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler, respektive supernatanten och tvättsteget.
- Överföring 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkt Cova-TH1-celler i 1 ml medium i var och en av de tio γ-räkningsrören direkt efter radiomärkning. För var och en av tidpunkterna 5, 24 och 48 h efter radiomärkning, hålla minst 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler i medium på 24-brunnars cellodlingsplattor i en inkubator vid 37 ° C och 7,5% CO2.
- Centrifugera γ-räknings rören vid 400 xg under 5 min och överför supernatanten till tio nya γ-räknings rör.
- Tvätta cellerna en gång i 1 ml medium för att avlägsna obundna fraktionen av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb end samla supernatanten i tio nya γ-räknings rör.
- Lägg 1 ml nytt medium till Cova-TH1-celler och bestämma den initiala upptagsvärdet i en dos kalibrator. Rören kan också lagras i en inkubator vid 37 ° C och 7,5% CO2.
- Upprepa steg 5.4.2 till 5.4.5 efter 5, 24 och 48 h och mäta alla rör i en γ-räknare enligt tillverkarens protokoll. Att korrigera för radioaktivt sönderfall och för kvantitativ analys används en standard med en definierad dos av radioaktivitet.
6. OVA-inducerad Acute Airway DTHR
OBS: Migreringsdynamik och homing mönster av adoptivt överförda och radiomärkt Cova-TH1-celler till inflammationsstället kommer att visualiseras och kvantifieras i en djurmodell för Cova-inducerad luftväg-DTHR 16, 17.
- Injicera 8 veckor gamla BALB / c-möss ip med en blandning av 150 mikroliter aluminum gel / 50 pl Cova-lösning (10 ^ g i 50 mikroliter PBS) för att immunisera mössen.
- Två veckor efter immuniseringen, söva mössen med 100 mg / kg ketamin och 5 mg / kg xylazin genom ip-injektion. Placera de experimentella möss på sina ryggar och långsamt pipettera 100 pg Cova upplöst i 50 mikroliter PBS i näsborrarna på djuren. Djuren kommer andas lösningen droppe för droppe.
- Upprepa efter 24 timmar. För starkare luftvägs DTHR induktioner, upprepa igen efter 48 timmar.
- Att analysera den specifika migrationen av de överförda Cova-TH1-celler, inducerar luftvägarna-DTHR med kalkon eller fasan-OVA som kontroll. Därför, upprepa steg 6,1-6,3 genom användning av respektive OVA-protein.
7. In vivo Imaging Använda PET / CT
OBS: In vivo avbildning av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler i Cova-DTHR sjuka möss och kontrollkull demonstrerar den specifika målsökande och mitionsprogrammen dynamik Cova-TH1-celler. Därför förvärva statiska PET och anatomiska CT skannar sekventiellt 3, 24 och 48 h efter adoptiv cellöverföring.
- Direkt efter radiomärkning, justera de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler till 5 x 10 7 celler / ml för ip-injektion av 10 7 celler i 200 mikroliter.
- Med användning av en 1 ml spruta och en 30-gauge nål, rita 200 mikroliter av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkt Cova-TH1-cellsuspension och injicera cellerna ip in i Cova-DTHR-sjuka djur mellan 4 e och 5: e nippeln. Att bestämma den totala insprutade mängden radioaktivitet, mäta sprutan i en dos kalibrator före och efter injektion.
- Söva mössen, 10 minuter före den önskade upptagningen tiden, med 1,5% isofluran i 100% syre (flödeshastighet: 0,7 L / min) i en temperaturstyrd anestesi rutan.
- Under tiden, för att underlätta samarbetet registreringav PET- och CT-bilder under bildanalys, fixa glaskapillärer innehållande 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-lösning eller fri 64 CuCl 2 lösning under musen sängen.
- Därför bereda en lösning av 0,37 MBq / ml och fyll glaskapillärer med en volym på 10 mikroliter med denna lösning. Eftersom cellhärledda radioaktivitetssignalerna är i sig svaga, inte använder höga mängder av aktivitet för att vara säker på att markörerna inte stör cellhärledda signalerna i möss.
- Efter att ha nått kirurgisk tolerans, såsom indikeras av förlusten av pedaltillbakadragande reflexen i bakbenet, överföra musen till en PET-och CT-kompatibel litet djur säng utrustad med ett lämpligt slangsystem för att upprätthålla anestesi.
- Immobilisera musen på den lilla djuret sängen med bomullspinnar och kirurgtejp. Applicera ögonsalva för att undvika uttorkning av ögonen.
- Överför musen sängen till PET scanner, centrera synfältet med en focus på lungorna och förvärva en 20 min statisk PET scan med en energifönster 350-650 keV.
- Överför musen sängen till datortomografen. Via scout anser centrera synfältet på lungorna. Förvärva en plan CT-bild via 360 projektioner under en 360 ° rotation i "steg och tryck" -läge med en exponeringstid på 350 ms och binning faktor fyra.
8. Bildanalys
- Rekonstruera PET lista-modsdata genom att applicera statistiska iterativ beordrade delmängd förväntan maxime (Osem) 2D algoritm och CT-scanning in i en 3D-bild med en pixelstorlek på 75 um.
- För bild co-registrering i ett lämpligt bildanalysprogram (t.ex. Inveon Research arbetsplats eller PMOD), använda den automatiska co-registrering verktyg. Om detta misslyckas, använd glaskapillärer under musen sängen som vägledning till co-registrera de rekonstruerade PET- och CT-bilder spatialt i axiell, koronala och sagittala vy.
- Rätta PET bilderför radioaktivt sönderfall med användning av radioaktivt sönderfall lagen och halv-tid av radionukliden 64 Cu vid 12,7 h. För bild normalisering, välja en bild (A) som en referens och justera intensiteten av bildpresentations i respektive bildanalysmjukvara.
- Användning av de värden bara fastställts för referensbilden (A), den injicerade aktivitets (A) och den injicerade aktiviteten för de andra bilderna (X), normalisera de andra bilder med hjälp av följande ekvation: (injicerad aktivitet (X) / injicerad aktivitet ( A)) x intensitetsvärden (A).
- Rita 3D volymer av intresse (VOI) på den normaliserade PET-signalen av lung och perithymic LNS.
- Bestämma procent injicerad dos per cm 3 (% ID / cm 3) med användning av följande ekvation: (genomsnittlig aktivitet i VOI / totala aktiviteten i mus) x 100. För ytterligare vägledning om bildanalys, se referenser 22, 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 sammanfattar märkning av Cova-TH1-celler med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb och den experimentella utformningen för in vitro och in vivo-studier som omfattas i detta protokoll.
Figur 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb Märkning Process & Experimental Design. (A) Schematisk representation av radioaktiv cellmärkning med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. Den 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb binder till Cova-TCR-receptorer på cellytan av de TH1 cellerna och internalis med receptorn inom 24 timmar. Cova-TCRs åter uttrycks 24 h efter radiomärkning. (B) CD4 + T-celler isolerades, expanderades och radioaktivt med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in vitro. Upptag och utflödesvärden were bestäms av en doskalibrator och γ-räkning. Effekter av den radioaktiva antikroppen på cellviabiliteten utvärderades med trypanblått-färgning, på funktionalitet med IFN-y ELISA och på induktion av apoptos med fykoerytrin (PE) -Annexin V färgning. (C) Cova-airway DHTR inducerades i BALB / c-möss. 10 7 TH1 cell adoptivt överföras till Cova-luftvägs DHTR-sjuka djur direkt efter radiomärkning. PET / CT-bilder förvärvades 3, 24 och 48 h efter adoptiv cellöverföring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den framgångsrika intracellulära märkning av TH1-celler med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb bekräftades genom immunohistokemi (Figur 2A). Den 64 Cu-DOTA-KJ1-26 antikropp (grön) var samlokaliserade medCD3 vid cellmembranet 3 h efter radiomärkning, medan signalen av mAb vid cellmembranet var endast svagt vid 24 h (gula). Vid 48 h efter radiomärkning, var 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR-komplexet internalis via endocytos med en stark signal i cytoplasman av de TH1-celler. Den applicerade radioaktiva dosen av 0,7 MBq reducerade viabiliteten hos TH1-celler med endast 8%, medan högre doser av 1,4 MBq och 2,1 MBq 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb hade mer uttalade effekter. Jämfört med radiomärkning med 64 Cu-PTSM ades emellertid ingen signifikant fördel av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb observerades (Figur 2B). 64 Cu-antikroppsradiomärkta celler visade liten förlust i funktionalitet såsom visas av IFN-γ-utsöndring (figur 2C), reducerat utflöde av radioaktivitet (figur 2D), och minskad induktion av apoptos (Figur 2E) jämfört med 64 Cu-PTSM-märkt TH1 celler.
Figur 2: In vitro utvärdering av radioaktivt TH1 Cell Märkning med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. (A) Konfokalmikroskopi bevisar det intracellulära upptaget av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAbs (grön) i Cova-TH1-celler (cellmembranet; röd) inom 24 h efter initial märkning (Denna figur har modifierats referens 17) . (B) Titrering av radioaktiva märknings doser av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM avslöjade en lika stor inverkan på viabiliteten såsom detekteras genom trypanblåexklusion 24 h efter märkning. Användningen av 0,7 MBq för cellmärkning inducerade de lägsta försämringar av viabiliteten (medelvärde ± SD i procent,. Denna figur har modifierats referenser 16, 17 (C) Titrering av radioaktiv märkning görses av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM avslöjade en starkare försämring av funktionalitet efter 64 Cu-PTSM märkning, såsom detekteras av IFN-y-ELISA 24 h efter märkning. En ökande dos av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb för cellmärkning hade inga influenser på funktionalitet (medelvärde ± SD i procent, statistik: t-test, * p <0,05, ** p <0,01, ** * p <0,001; denna figur har modifierats referenser 16, 17). (D) efflux mätningar av radiomärkta celler (γ-räknings) uppvisade en högre stabilitet märkning av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb jämfört med 64 Cu-PTSM 5 h och 24 h efter märkning (medelvärde ± SD i procent; statistik : t-test; *** p <0,001; denna figur har modifierats 17). (E) Respektive flödescytometri (PE-Annexin V) diagrammen indikerar en högre apoptosis induktion 24 h efter 64 Cu-PTSM märkning jämfört med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkning (Denna figur har modifierats referens 17). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter adoptiv överföring av 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler till Cova-DTHR-sjuka djur och obehandlade kontroller, hög upplösning statisk PET och anatomiska CT-bilder förvärvades. För bildanalys, var bilderna smälts i den koronala, axiella och sagittalvy med hjälp av glaskapillärer innehållande en liten mängd av 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (figur 3A). Vois drogs på de pulmonella och perithymic LNS på sönderfalls-korrigerat och normaliserade PET bilder för att beräkna den procentuella injicerade dosen per cm 3(Figur 3B).
Figur 3: PET / CT-co-registrering och analys. (A) PET och CT-bilder var co-registrerade i bildanalysprogram. Om automatisk registrering av mjukvaran misslyckades, var bilderna fuserades genom att överlagra de PET- och CT signaler av glaskapillärer (markörer), fylld med radioaktivitet och fixerade under djuret sängen. (B) vois är placerade på de korrigerade och normaliserade PET signalerna för de perityhmic och lung LNS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Cova-TH1 cellmigration spårades till lung och perithymic LN som Cova-presentations platser i luftvägs DTHR. In vivo PET signaler derived från 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-märkta Cova-TH1-celler var betydligt högre än signaler från 64 Cu-PTSM-märkta celler (Figur 4A). Cova-TH1-cellupptagsvärden i de pulmonella och perithymic LNS ökade signifikant i DTHR-sjuka djur jämfört med obehandlade kontrollkull (Figur 4B).
Figur 4: Cova-TH1 Cell Tracking i Airway DTHR Model av In Vivo PET / CT. (A) Respektive PET / CT-bilder av adoptivt överförd Cova-TH1-celler, vilka tidigare märkta med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM, in Cova-DTHR-sjuka eller obehandlade möss. De överförda Cova-TH1-celler homing till de pulmonella och perithymic LNS. (B) Kvantitativ analys av de målsökande ställena i Cova-TH1-celler visade en högre homing till inflammerade vävnader (medelvärde ± SD; statistik: t-test, * p <0,05, ** p <0,01). Märkning med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb visade sig vara en högre känslighet (ökad% ID / cm 3) jämfört med 64 Cu-PTSM i de olika homing ställen (medel ± SD, statistik: t-test; # p <0,05, ## p <0,01, ### p <0,001). Denna figur har modifierats referens 16, 17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll presenteras en tillförlitlig och enkel metod att stabilt radiomärka celler för in vivo-spårning av PET. Användning av denna metod, Cova-TH1-celler, isoleras och expanderas in vitro från donatormöss, kunde vara radioaktivt med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb och deras homing spårades till de pulmonella och perithymic LNS som områden av Cova presentation i en Cova-inducerad akut luftvägs DTHR.
Modifieringen av mAb med kelator kräver snabb och effektiv arbete och användning av ultrarena lösningar utan spår av aminer. Lösningarna behandlades med ett kelatbildande jonbytarharts för att säkerställa korrekt konjugation av DOTA-NHS aktiv ester till aminrester av mAb. Kelator-konjugerad mAb som en intracellulär radiomarkör har flera fördelar jämfört med användning av icke-specifika cellmärkningsmedel. Först ger mAb utmärkt specificitet möjliggör riktade märkning av en definierad cellpopulation. mAbi sig är inte cytotoxiskt och har ingen skadlig effekt på viabiliteten eller funktionalitet av cellerna. Nästa, utflödet av radioaktivitet från cellerna minskade signifikant förbättra förhållandet signal-till-bakgrund av PET-bilderna 17, 24. Genom att välja en mAb med en annan specificitet, är denna metod lätt överföras till andra cellpopulationer av intresse såsom CD8 + TIL eller CD14 + monocyter. Dessutom kan användas här cellmärkning tillvägagångssätt för att spåra cell studier i olika djurmodeller av inflammatoriska humana sjukdomar (t ex reumatoid artrit och bronkial astma) eller djurmodeller för olika humana cancertyper. Denna märkningsmetod, emellertid, är begränsad till membranbundna receptorer eller indelningar markörer som mål eftersom mAbs inte passivt diffunderar över cellmembranet. Aktiveringen inducerad internalisering av målet eller, helt enkelt, är membran skytteltrafik fördelaktig. enhög aviditet mellan mAb och målet, kan dock också vara tillräcklig för in vivo avbildning, eventuellt med en reducerad signal till bakgrundsförhållande.
Valet av DOTA som kelator för våra experiment baserades på tidiga verk med hjälp av 64 Cu 25. Emellertid, under tiden DOTA visades inte vara en optimal kelator för denna isotop, vilket leder till ganska hög aktivitet upptag i levern av transchelation till superoxiddismutas 26. Även om användning av den radiomärkta antikroppen för in vitro-märkning av celler som sedan adoptivt överförda bör minska risken för 64 Cu frisättning och transport till levern, moderna kelatorer optimerade för 64 Cu, som 1,4,7-triazacyklononan, 1-glutarsyra -4,7-ättiksyra (NODAGA) eller 1,4,7-triazacyklononan-triättiksyra (NOTA), kan företrädesvis användas med vår metod för att ytterligare öka specificiteten hos de erhållna data 27 64 Cu (t.ex. N-klorsuccinimid (NCS)) eller andra isotoper, såsom 89 Zr (t.ex. desferrioxamin;. DFO).
Valet av 64 Cu som radioisotopen grundades på det faktum att in vivo-cellmigrering och homing är en ganska långsam process jämfört med metabola förändringar vanligtvis avbildas med PET. 64 Cu med en halv-livslängd på 12,7 h möjliggör upprepad avbildning av cellmigrering över 48 h efter injektion. För 64 Cu produktion, är det viktigt att använda högvärdiga lösningar utan spårmetalljoner för att säkerställa renheten hos 64 Cu. Vidare är renheten av 64 Cu av stor betydelse för radiomärkning av DOTA-mAb sedan multivalent metalljonföroreningar skulle kunna leda till en reducerad specifik aktivitet av 64 Cu lösningen till nivåer som utesluter proteinradiomärkning och följaktligen avbildning. Även om 64 Cu producerar en significant procentandel av högenergetisk, cytotoxiska Augerelektroner när ruttnande 28, en justerad dos av radioisotopen tolereras väl av cellerna såsom representeras av minimala effekter på viabilitet och funktionalitet och låg apoptosinduktion efter radiomärkning. Det är dock helt klart lämpligt att först titrera aktivitets dos som används för radiomärkning för andra celltyper och justera radiomärkning protokollet. Snabb och enkel in vitro-metoder för utvärdering har visats i protokollet, inklusive fastställandet av viabilitet genom trypanblå uteslutning och färgning med PE-Annexin V för bestämning av de apoptotiska fraktioner av cellerna. Båda metoderna är relativt billiga och använder lättillgängliga laboratorieutrustning. Kombinera PE-Annexin V-färgning med ett färgämne för diskriminering av levande och döda celler, såsom 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) skulle tillåta för bestämning av viabiliteten och apoptos i en experimentell stes. Som ett alternativ för att bedöma viabiliteten hos märkta T-celler, kan en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT-) analys användas för att bedöma cell metabolisk aktivitet. Utvärderingen av upptagnings- och utflödesvärden med doskalibrator och γ-counter är mer avancerade, men ändå snabbt och billigt att uppnå eftersom nästan varje laboratorium som arbetar med radioaktivitet har respektive hårdvara på plats. Gen sekvensering eller mikrochipsbaserade metoder skulle ge mer detaljerade uppgifter. Dessa metoder är dock inte alltid lättillgänglig, behöver lämplig kompetens och är oftast kopplade till högre kostnader.
Även om PET inte kan nå en cellulär upplösning som mikroskopiska avbildningstekniker 29, det ger utmärkt känslighet i pikomolar intervallet för detektering av även ett litet antal celler inom djur eller människor 8. Jämfört med andra icke-invasiva avbildningstekniker såsom optical avbildning, PET kvantitativ, inte begränsad i penetrationsdjup och ger bilder av hög kvalitet med tredimensionella upplösningar. Kombinerar den höga känsligheten av PET med den anatomiska noggrannhet CT möjliggör hög precision avbildning av cellmigration. Dessutom kan in vivo-data lätt valideras av flera ex vivo-metoder inklusive γ-räkning för biodistribution analys. Autoradiografi av kryosnitt och efterföljande histologiska färgning av kryosnitt kan överlagras för att korrelera den autoradiografiska kartan aktivitet med immun cellinfiltrat identifierade genom hematoxylin och eosin-färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant liksom Natalie Altmeyer för stödet under experiment och dataanalys. Detta arbete stöddes av Werner Siemens-Foundation, DFG genom SFB685 (projekt B6) och rikedom (2309-0-0).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | WKL | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitroevaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30 G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µL | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
- Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
- Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
- Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
- Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
- Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
- Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
- Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
- Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
- Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
- Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
- Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
- Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
- Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
- McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
- Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
- Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
- Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
- Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
- Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
- Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).
