Summary
Bir transgenik fare, T hücresi reseptörüne bağlanan bir 64Cu-modifiye edilmiş monoklonal antikorun hazırlanmasını takiben, T hücreleri, canlılık, fonksiyonellik, etiketleme stabilitesi ve apoptoz için analiz, in vivo olarak radyoaktif işaretli olan ve adoptif bir nefes yolu gecikmeli tipte aşırı duyarlılık ile farelere aktarıldı pozitron emisyon tomografisi / bilgisayarlı tomografi (PET / BT) ile invazif olmayan görüntüleme için reaksiyon.
Abstract
Bu protokol, 64Cu üretimini ve kemirgen lenfosit hücre kültürü ve hücre hedefleme 64Cu-reseptörün ardından bir monoklonal antikor (mAb) şelatlayıcı çekimi / Radyo-etiketlenmesi göstermektedir. PET / CT ile bir hava yolu gecikmiş tip aşın duyarlılık reaksiyonunda (DTHR) bir hayvan modelinde radyo-etiket, ve in vivo hücre takibi yayılmayan açıklanmaktadır in vitro değerlendirilmesi.
Ayrıntılı olarak, şelatlayıcı 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit (DOTA) bir mAb konjugasyon gösterilmiştir. Radyoaktif 64 Cu, DOTA-konjuge mAb'nin radyoaktif üretimini sonra tarif edilmektedir. Daha sonra, tavuk ovalbumin (cova) e özgü CD4 + interferon genişlemesi (IFN) -γ-üreten T yardımcı hücreleri (cova-TH1) ve cova-TH1 hücrelerinin daha sonra, radyo-etiketleme olarak gösterilmiştir. Çeşitli in vitro teknikler ef değerlendirmek için sunulmuşturtripan mavi dışlama hücre canlılığının belirlenmesi, akış sitometrisi için Annexin V ile apoptosis için boyama ve IFN-γ enzime bağlı immünosorban tahliliyle özelliklerin değerlendirilmesi gibi hücreler üzerinde 64Cu-radyo sınıflandırılmasıyla tama yaptığı, (ELISA) . Bundan başka, hücre içine radyoaktivite alımının ve markalama kararlılığının belirlenmesi detaylı olarak tarif edilmektedir. Bu protokol daha nedenle, BALB / c farelerinde cova kaynaklı akut solunum yolu DHTR indüksiyonu dahil, bir hava yolu DTHR için bir hayvan modeli olarak, hücre izleme çalışmaları yapmak ve açıklamaktadır. Son olarak, görüntü elde etme, yeniden yapılanma, ve analizi dahil sağlam PET / BT iş akışı sunulmuştur.
Daha sonra alıcı içselleştirme 64 Cu-antikor reseptörü hedefleyen bir yaklaşım, hücre etiketlenmesi için ortak PET izleyiciler kıyasla yüksek spesifite ve stabilite, düşük hücre toksisitesi ve düşük akış oranlarını sağlar, örneğin, 64Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Son olarak, yaklaşım, 48 saat için optimum sinyal-zemin oranı PET / CT ile in vivo hücre takibi yayılmayan sağlar. Bu deneysel yaklaşım içselleştirilir membrana bağlı reseptör ile hayvan modelleri ve hücre tipleri farklı transfer edilebilir.
Introduction
Invazif olmayan hücre takibi, in vivo olarak, hücre fonksiyonu, göç ve homing izlemek için çok yönlü bir araçtır. Son hücre takibi çalışmaları rejeneratif tıpta, kanser, 3, 4 karşı adoptif hücre tedavileri enflamasyonun veya T lenfositleri otolog periferik beyaz kan hücreleri bağlamında mesenkimal 1, 2 ya da kemik iliği kökenli kök hücreleri 3 üzerine odaklanmıştır. eylem siteleri ve hücre tabanlı tedaviler yatan biyolojik ilkelerin aydınlatılması muazzam öneme sahiptir. CD8 + sitotoksik T lenfositleri, genetik olarak yaygın altın standart olarak kabul edilmiştir kimerik antijen reseptörü (CAR), T hücreleri ya da tümör infiltre edici lenfositler (TILler) tasarlanmıştır. Bununla birlikte, tümör bağlantılı antijen-spesifik Th1 hücrelerinin <etkili bir tedavi seçeneği 4, olduğu kanıtlanmıştır/ sup> 5, 6, 7.
Anahtar iltihaplanmada oyuncuların organa özgü otoimmün bir hastalık (örneğin, romatoid artrit veya bronşiyal astım) ve kanser immünoterapisi yüksek ilgi hücreleri gibi, TH1 hücre zamansal dağılımı ve yerleşme kalıpları karakterize etmek için önemlidir. PET ile invaziv olmayan in vivo görüntüleme in vivo hominginde, hücre göçü modellerini incelemek için bir nicel, çok hassas bir yöntem 8. sunulur, ve iltihap, alerji, enfeksiyon ya da tümör rejeksiyon 9, 10, 11 sırasında T hücresi eylem ve tepkilerinin siteleri.
Klinik olarak, In-oksin 111 2-deoksi-2- (18 ise, iltihap ve enfeksiyon 12 ayrımı için lökosit sintigrafisi için kullanılırF)-floro-D-glükoz (18F-FDG) genellikle PET 3, 13 ile hücre izleme çalışmaları için kullanılır. Bu PET tracer önemli bir dezavantajı, ancak, 109.7 dk'da radyonüklid 18F ve daha sonraki zaman noktalarında görüntüleme adoptif hücre transferi sonrası engelleyen düşük hücre içi stabilite kısa yarılanma ömrü. Hücrelerde kararsız olmasına rağmen, 64Cu-PTSM sık sık kullanılan PET ile in vivo hücre takibi çalışmalarında uzun vadede için, spesifik olmayan bir hücre 14, T hücre canlılığı üzerindeki minimize zararlı etkiler ile 15 etiket ve 16 işlev görmektedir.
Bu protokol, ayrıca bir T hücre reseptörü (TCR) e özgü radyo-etiketli mAb kullanılarak hücre canlılığı ve işlevi üzerinde dezavantajlı etkileri azaltmak için bir yöntemi tarif etmektedir. İlk olarak, radyoizotop 64 Cu, inci ile mAb KJ1-26 konjüge üretimiE şelatör DOTA, ve daha sonra 64 Cu, radyo-etiketleme gösterilmiştir. İkinci bir aşamada, izolasyon ve DO11.10 donör farelerin cova-TH1 hücrelerinin genişlemesi ve 64Cu yüklü DOTA-konjuge mAb KJ1-26 (64Cu-DOTA-KJ1-26) ile radyo işaretli ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Uptake'leri ve bir doz kalibratörle radyoaktivite efflux sırasıyla y-sayımı ile değerlendirme, hem de IFN-y ELISA ile sunulmuştur tripan mavi dışlama ve işlevselliği ile hücre canlılığı üzerindeki 64Cu-radyoaktif etkilerinin değerlendirilmesi . In vivo hücre takibi yayılmayan için adoptif hücre transferi sonrası PET / CT tarafından cova kaynaklı akut solunum yolu DTHR ve görüntü elde olan bir fare modeli ortaya çıkarma açıklanmaktadır.
Ayrıca, bu markalama yaklaşım, farklı hastalık modellerinde farklı TCRler veya membrana bağlı reseptörlere veya ekspresyon mar ile ilgili genel hücreleri ile fare T hücreleri aktarılabilirkers sürekli zar 17 mekik yatan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Güvenlik önlemleri: radyoaktivite kullanırken, 2-inç kalınlığında kurşun tuğla arkasında 64 Cu depolamak ve aktivitesini taşıyan gemiler için ilgili ekranlama kullanın. dolaylı dolaysız el temasını önlemek ve radyoaktif madde maruziyeti en aza indirmek için korumasız kaynaklar işlemek için uygun araçları kullanın. Her zaman radyasyon dozimetre izleme rozetleri ve kişisel koruma ekipmanları giymek ve kendini kontrol ve kirlenme için çalışma alanı hemen ele almak. önce radyoaktif madde kullanılır bölgeyi terk etmek potansiyel olarak kirlenmiş kişisel koruma ekipmanı atın. Radyoaktif 64Cu yeterli bertaraf edilmeden önce (yaklaşık 10 yarı-ömürleri, = 127 h) çürümüş kadar kurşun koruyucu örtünün arkasına tüm radyoaktif atık saklayın.
1. 64 Cu Üretim
Not: 64Cu 64 Ni (p, n) 64Cu nükleer reaksiyon, bir PETT kullanılarak üretilmiş olan radyoizotopMcCarthy ve arkadaşlarının modifiye edilmiş bir protokole göre yarış siklotron. 18.
- 64Cu üretimi için, 12.4 MeV bir proton demeti ile 6 saat boyunca 30 uA olan bir platin / iridyum plakasına (90/10) üzerine elektroliz 64 Ni, ışınlanması.
- Özel bir polietereterketon (PEEK) bölmesi içinde 100 ° C'ye kadar, platin / iridyum hedef ısıtın ve 64 Cu / 64 Ni çözünmesi için 20 dakika boyunca konsantre HCI 2 mL inkübe edin.
- konsantre HCI başka 1 mL ekleyin ve 10 dakika kuluçkada bırakın.
- bir argon akışı kullanılarak HCI buharlaştırın ve oda sıcaklığına bölmeyi soğutmak.
- % 4, 0.2 M HCI ve% 96 metanol (hac / hac), 3 mL odasını yıkayın ve olduğu bir iyon değişim sütununa bu çözüm transferi en az 15 dakika boyunca metanol içinde% 4, 0.2 M HCI ile ön işleme tabi. Akış 64 Ni geri dönüşüm için kullanılabilir.
- 64Cu% 4, 0.2 M HCI i ile kolon içinde alıkonur yıkayınn, metanol.
- Bir toplama şişe içine% 70 ile 64 CU 1.3 M HCI /% 30 izopropanol (h / h) Zehir, bir argon akımında solüsyonu buharlaştırarak ve oda sıcaklığına soğutun şişe sağlar.
- 0.1 M HCI 140-210 uL 64 Cu çözülür.
DOTA 2. Antikor çekimi ve sonraki 64 Cu-radyo işaretli
Not: şelatlayıcı DOTA, N-hidroksisüksinimid (NHS) ester kimyası ile mAb fonksiyonel amino grupları ile bağlantılı olacak ve konjügat daha sonra 64 Cu 19 ile radyoaktif olarak işaretlendi olacaktır.
- (8 mg / ml olacak şekilde KJ1-26-mAb konsantrasyonu ayarlamak ve diafiltrate 1 ml mAb 1.2 g, molekül ağırlığı ile bir kenetleme iyon değiştirme reçinesi / L ile muamele 0.1 M Na 2 HPO 4, pH 7.5'e karşı çözelti kesilmiş MWCO 30 kDa) santrifüj filtre ünitesi. tampon 14 mL 3 müteakip yıkama adımları uygulanır. Son yıkama aşamasından sonra,1 mL tekrar çözelti konsantre edilir. OD 280nm ölçümleri ile antikor konsantrasyonunu ölçmek.
- 10 mg / ml hemen önce kullanım konsantrasyonunda ultra saf ya da PCR dereceli su içerisinde DOTA-NHS çözeltisi hazırlayın. Şişe su yoğuşmayı önlemek için açıklığın önce oda sıcaklığına ayarlayın ve dikkatli bir şekilde plastik bir spatula kullanılarak, DOTA-NHS kaldırmak olsun. , Diya-filtreden KJ1-26 mAb çözeltisi 8 mg bu DOTA-NHS çözeltisi 216 uL ekleyin iyice karıştırın ve bir döner karıştırıcı üzerinde 4 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edilir.
- kesmeyle bir moleküler ağırlığa (MWCO 30 kDa), santrifüj filtre birimi kullanılarak, bir kenetleme iyon değiştirme reçinesi, 1.2 g / L ile muamele 0.25 M amonyum asetat, pH 7.0, karşısında DOTA-KJ1-26-mAb Diafiltrate. 7 yıkama adımları uygulanır. 1 ml'lik bir son hacme kadar mAb konsantre edilir ve tekrar OD 280nm ölçümleri ile protein konsantrasyonu ölçülür.
- Radyoaktif önce, boyut exc ile PBS'ye DOTA-KJ1-26-mAb tampon alışverişijel filtrasyonu sütunu kullanılarak lusion kromatografisi. Bu, aynı zamanda, potansiyel küçük moleküllü yabancı maddeleri temizler.
- 10 mM HCl 100 MBq 64 CuCl2 çözelti hazırlanır ve 10x PBS ile pH'ı 6-7'ye ayarlamak. DOTA-KJ1-26-mAb 200 mikrogram ekleyin. 37 ° C'de 60 dakika süreyle inkübe edilir.
- Kalite kontrolü için, mobil faz olarak 0.1 M sodyum sitrat (pH 5) ile ince tabaka kromatografisi gerçekleştirmek ve otoradyografi ile analiz edin. En azından aktivitesinde% 90 antikora bağlı olması ve bu nedenle başlangıç noktada tespit edilebilir. Bağlanmamış aktivitesi çözücü ön sitrat bazlı mobil faz ve çizgiler ile kenetlenmiştir. Bir Referans için, 64 CuCI 2'nin kullanılması tavsiye edilir.
3. tavuk ovalbumin-spesifik Th1 (cova-TH1) Hücre İzolasyonu ve Genişleme
Not: TH1 hücrelerinin kültür, 17 daha önce yayınlanmış çalışmalar 16'ya göre tarif edilmektedir.
- Dalakları ve DO11.10 farelerden periton lenf düğümleri (LN) izole edilir.
- federal düzenlemelere göre fare Kurban. % 70 etanol ile hayvan dezenfekte ve dalak ve LN çıkarılması için yapışkan bantla sabitleştirmek. Bir medyan kesi yapın ve yanal her siteye çekerek periton cilt ayırmak.
- servikal, eksensel, brakial ve inguinal LN bulun. künt forseps ile çıkarın ve% 1 fetal buzağı serumu (FCS) / PBS tamponu içine yerleştirin.
- periton açın ve dalak bulun. Pankreas bağ dokusu dalak ayrılır ve% 1 FCS / PBS tamponu içinde yerleştirin. Daha fazla rehberlik için, referanslar 20,21 bakın.
- 50 mL'lik bir 40 um'lik bir filtreden kıyma dalak ve lenf nodları bir şırınga pistonu kullanarak vida başlıklı bir tüp. 10 mL% 1 FCS / PBS-tamponu ile durulayın.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve supernatant çıkarın. Subsequently'ait, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca amonyum-klorür-potasyum (ACK) liziz tamponu (donör hayvan başına 1.5 mL) ilave edilerek eritrositlerin liziz gerçekleştirin. (Donör hayvan başına) 8.5 mL% 1 FCS / PBS-tamponu ilave edin.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de hücreler santrifüj ve supernatant çıkarın. 5 dakika boyunca 400 x g'de, 10 mL% 1 FCS / PBS-tamponu içinde santrifüj hücreleri yıkanır ve supernatant çıkarın.
- Manyetik hücre ayrılması için,% 1 FCS / PBS-tamponu içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve CD4 + mikroboncuklar ekleyin. Tampon hacmi ve kullanımı CD4 + mikro boncuklar miktarı için üreticinin talimatlarına bakın.
- 4 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra,% 1 FCS / ekleme, 50 mL kadar PBS-tampon, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve supernatant çıkarın.
- Ticari manyetik ayırma kolonları ve üreticinin protokolüne uygun olarak bir ilgili mıknatıs standı kullanılarak CD4 + T hücresi izolasyon devam edin. Bir yardımcı elüe CD4 + T hücreleri ayarlama% 10 ısıyla inaktive edilmiş FCS% 2.5 Penisilin / Streptomisin,% 1 HEPES tamponu,% 1 MEM amino asitler,% 1 sodyum piruvat ve% 0.2 2-mersaptoetanol ve mağaza ile Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı içinde ncentration 10 6 hücre / mL bunları 4 ° C'de ilave edildi.
- antijen sunan hücreler (APCler) hazırlamak için 50 mL vida kapaklı bir tüp içerisinde kolon akıntısı toplayın. 5 dakika boyunca 400 x g'de kolon akıntısı santrifüj ve supernatant çıkarın.
- , 10 ug / ml anti-CD8 (klon: 5367,2) ve 10 ug / mL fare anti-sıçan mAb (MAR18.5) ve 1.5 ml tavşan tamamlayıcı: 10 ug / ml anti-CD4 (klon GK1.5) ekleyin. 37 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe edilir.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de hücreleri Santrifüj süpernatantı kaldırmak ve 3 mL orta ekleyin. toplam 30 Gy ile γ-ışını ya da x-ışını kaynağı ile APC'leri ışın tedavisi. Daha sonra, 5 x 10 6 hücre / mL konsantrasyonda APC'leri ayarlayın.
- 96 çukurlu bir pla 100 uL, CD4 + T hücreleri ve APC '100 mcLte birlikte 10 ug / mL cOVA 323-339-peptid, 10 ug / mL anti-IL-4-mAb, 0.3 uM CPG1668-oligonükleotitler ve 5 U / ml IL-2 ile.
- 50 U / ml IL-2 her iki günde bir ekleyin. Sonra 3 - 4 gün, 24 oyuklu plakalara 96 oyuklu plakalar hücreleri aktarın. 24 oyuklu bir plaka üzerinde, bir oyuk 96 oyuklu plaka 3-5 kuyu birleştirin. 1: 1 oranında 100 U / ml IL-2 içeren ortam ekleyin.
- 2-3 gün daha sonra 175 cm2 hücre kültürü şişeleri (kap başına 1 x 48-yuvalı plaka) 48 gözlü levhadan hücreleri transferi. 1: 1 oranında ortam ile doldurun. 50 U / ml IL-2 her iki günde bir ekleyin.
- hücre yoğunluğuna göre hücreler bölme ve 50 U / ml IL-2, her iki gün ekleyin. Bu şekilde, kültür başka bir 10 gün süreyle hücreleri.
4. cova-TH1 hücre radyo-etiketlenmesi,
Not: 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb hücre içi radyoaktif etiketleme sağlamak için kültürlenmiş cova-, TH1 hücreleri ile uygulanacaktır.
- Cova-TH1 ce içinll radyoaktif işaretleme, bir doz kalibratörü ile ölü hacim olmayan bir şırınga içinde radyo etiketli 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 37 MBq çizin. 37 MBq / ml solüsyon almak için 1 ml tuzlu su ekleyin.
- 2 x 10 6 hücre / mL ortam içinde cova-TH1 hücreleri süspansiyon halinde tutulur ve bir 48-kuyulu bir levhadaki her kuyuya, hücre süspansiyonu, 0.5 ml.
- Yeni hazırlanmış 37 MBq 20 mcL / ml 64 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, Cu-DOTA-KJ1-26 mAb çözeltisi. Etiketleme için nihai oran 520 uL'lik bir hacim içinde 10 6 hücre başına 0.7 MBq olup. 30 dakika boyunca CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 7.5.
- İnkübasyondan sonra, dikkatli bir şekilde her bir hücrelerin tekrar süspansiyon ve 50 mL'lik 48 gözlü levhadan hücre süspansiyonu transfer vida başlıklı bir tüp. hücre kaybını en aza indirmek için, önceden ısıtılmış ortam maddesi ile iyice her yıkayın.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de cova-TH1 hücre süspansiyonu santrifüj supernatant atmak ve ml PBS önceden ısıtılmış 10 hücreleri tekrar süspansiyon. bir a kaldırmaHücre sayımı için hücre süspansiyonu liquot. Yıkama adımı tekrar edin.
- Tripan mavisi ile, uygun bir seyreltme viyabl cova-TH1 hücreleri sayın.
- 5 x 10 7 hücreleri hücre konsantrasyonunu ayarlamak / ml 200 uL PBS içerisinde 10 7 hücre intraperitonal (ip) olarak enjeksiyon için.
- Tekrar, örneğin etkinlik miktarda, 1.4 MBq veya 10 6 hücre başına 2.1 MBq artan cova-TH1 hücreleri radyolabel 4.3-4.5 adımları tekrarlayın.
- 10 6 hücre başına 1.4 MBq ile hücreler radyolabel, 10 6 hücre başına 2.1 MBq ile radyo-etiketleme için 37 MBq / ml 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb çözeltisi ve 60 uL 40 uL kullanımı. 0.7 MBq, 1.4 MBq ve 2.1 64Cu-PTSM MBq ile adımları 4.3-4.7 gerçekleştirmek ancak karşılaştırma araştırmaların 17 için 3 saat için etiketleme süresi artar.
- faaliyetin en iyi miktarını belirlemek için adım 5'e geçin.
Cova-, Th1 hücreleri üzerinde radyo-etiket Etkisinin Değerlendirilmesi İn Vitro 5.
NOT: Th1 hücreleri üzerinde radyo-etkilerini karakterize canlılığı tripan mavisi eksklüzyon tahlili ile gerçekleştirilir, apoptoz 16, 17 uyarılması için işlevsellik değerlendirme ve PE-Annexin V boyaması için ELISA IFN-y. hücre içi alımı ve radyoaktivite dışa akımı tayini aynı zamanda, aşağıda tarif edilmektedir. Karşılaştırma olarak, 64Cu-PTSM etiketli cova-TH1 hücreleri de kullanılabilir.
- Tripan mavi dışlama canlılığı üzerindeki etki
- 2 x 10 6 hücre / mL 'lik bir konsantrasyona, sırasıyla 0.7 MBq / 10 6 hücre, 1.4 MBq / 10 6 hücre ve 2.1 MBq / 10 6 hücre ile radyo-etiketli en az 18 x 10 6 cova-TH1 hücreleri ayarlamak ve 5.1 adımları. her faaliyet dozu 2-5.1.7. olmayan radioacti kullanınKJ1-26-mAb denetimleri gibi Cova-TH1 hücreleri ve etiketsiz Cova-TH1 hücreleri etiketli ettik.
- 24 kuyucuklu bir plakanın 9 kuyu içine hücre çözeltisinin pipetleyin 1 ml.
- Ayrı 15 ml kap tüpleri, ilk radyoaktif 3 saat sonra vida 3'e 3 kuyu içeriğini toplamak.
- Hücre kaybı en aza indirmek ve ilgili 15 mL ortam ilave adım 5.1.3 başlığın tüpleri vida önceden ısıtılmış ortam ile artık boş kuyu durulayın.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de 15 ml tüpler santrifüj ve önceden ısıtılmış bir ortamda 1 mL çıkan hücre pelletini.
- Her bir 15 ml tüp için ayrı ayrı tripan mavisi içinde uygulanabilir ve ölü hücreleri sayın ve yaşayabilir hücrelerin yüzdesi hesaplanır.
- Tekrar 5.1.3-5.1.6 24 ve 48 saat sonra 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb radyo işaretleme adımları tekrarlayın.
- Işlevselliği üzerindeki etkisi, IFN-y ELISA ile tespit
NOT: IFN-γ productio 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radyoetiketin etkisini değerlendirmek içinn, işlevselliği bir işaretleyici olarak, ticari bir tedarikçiden bir IFN-γ ELISA'yı gerçekleştirmek ve daha fazla ayrıntı için 17 referans bakın.- 96 oyuklu bir plaka, 3 saat sonra 64 0.7 MBq, 1.4 MBq veya 2.1 MBq ile cova-TH1 hücrelerinin Cu-DOTA-KJ1-26 radyo işaretleme, ortamın 100 uL 10 5 canlı hücreleri dağıtılır. Kontroller olarak etiketsiz, radyoaktif olmayan KJ1-26-mAb etiketli veya 64 Cu-PTSM etiketli Cova-TH1 hücreleri kullanın.
- / Ml 5 U / ml IL-2 ve 5x10 5 APCler 100 cova peptit, 10 ug 100 uL ortam içinde 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücrelerinde IFN-γ üretimini teşvik 37 ° C'de 24 saat boyunca, orta ve% 7.5 CO2 uL. Daha fazla kontrol cova peptit ilavesi olmadan diğer koşullar olabilir.
- Üreticinin talimatlarına göre ELISA ile süpernatant analiz edin.
- Adımı tekrarlayın 5.2.2. 5.2.3 için. etiketleme işleminden sonra, 24 ve 48 saat ısıtıldı.
- Akış sitometrisi için PE-Annexin V boyanması yolu ile tayin apoptosis
NOT: hücre membranında fosfatidil serin maruz için Annexin V ile boyamadan önce, imalatçının talimatlarına uygun olarak, 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb radyo-apoptoz indüksiyonunu değerlendirmek akış sitometrisi için ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanımı ve hücre örnekleri hazırlamak için .- 3, 24 ve 48 saat sonra 64 cova-TH1 hücrelerinin Cu-DOTA-KJ1-26 mAb, radyo-etiketleme, en az 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücreleri ile leke üç kopya halinde de ve üretici talimatlarına göre Annexin V seti bir saat içinde analiz eder. Kontrolleri gibi radyoaktif KJ1-26-mAb etiketli, 64 Cu-PTSM etiketli ve etiketsiz Cova-TH1 hücreleri kullanın. Daha fazla detay için 17 başvuru bakınız.
- Alım ve dışa akım
NOT: 64 Cu-DOTA- alımıhücrelere KJ1-26-mAb dozu kalibratördeki ölçülür ve radyoaktivite akış bir γ-sayma deneyi 0, 5, 24 ölçülür ve radyoaktif 48 saat sonra.- 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücrelerinin, ilgili yüzer tabakanın ve yıkama basamağı için on γ-sayım tüpler her hazırlayın.
- 6 64 Transferi 10 direkt olarak, radyo-etiketleme sonra on γ-sayım tüplerin her birine orta 1 mL cova-TH1 hücreleri Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli. Zaman noktalarında 5, 24 ve radyoaktif 48 saat sonra her biri için, 37 ° C'da bir kuluçka makinesi içinde, 24 gözlü hücre kültür levhaları üzerinde ortam içinde en az 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücreleri tutmak ° C ve% 7.5 CO2.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de γ-sayım tüpleri santrifüj ve on yeni γ-sayma tüplerine süpernatant aktarın.
- 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb An bağlanmamış bölümünü çıkarmak için 1 ml ortamda bir kez hücre yıkayınon yeni γ-sayma tüplerine supernatant toplamak d.
- cova-, TH1 hücreleri ile 1 ml yeni ortamı ilave edin ve bir doz kalibratördeki ilk çekme değerinin belirlenmesi. Borular, aynı zamanda CO2, 37 ° C'de bir inkübatör içinde depolanır ve% 7.5 olabilir.
- Tekrar üretici protokolüne göre bir γ-sayacında tüpleri 5, 24 ve 48 saat sonra 5.4.5 ve ölçmek için 5.4.2 adımları tekrarlayın. radyoaktif bozunma ve kantitatif analiz için düzeltmek için, radyoaktivite, belirli bir dozdaki bir standart kullanır.
6. Akut Solunum Yolu DTHR OVA-kaynaklı
Not: Göç dinamikleri ve inflamasyon bölgesine adoptif transfer edilir ve radyo-etiketli cova-TH1 hücrelerinin hedef arama desenler görünür hale getirildi ve cova ile indüklenmiş solunum yolları-DTHR 16, 17 için bir hayvan modeli olarak hesaplanacaktır.
- 8 haftalık BALB / c fareleri enjekte 150 uL al oluşan bir karışım ile ipuminum jeli / 50 uL cova-çözeltisi (50 uL PBS içinde 10 ug) fareleri immünize etmek üzere.
- İki hafta immünizasyondan sonra, ip enjeksiyonu ile 100 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ile anestezi fareler. sırtlarında deney fareler yerleştirin ve yavaş yavaş hayvanların burun deliklerine 50 uL PBS içinde çözülmüş 100 ug cova pipetleyin. hayvanlar damla çözüm damla teneffüs edecektir.
- 24 saat sonra tekrarlayın. Güçlü hava yolu DTHR indüksiyonların için, 48 saat sonra yeniden tekrarlayın.
- transfer cova-TH1 hücrelerinin spesifik taşıma analiz etmek için, kontrol olarak hindi veya sülün-OVA ile hava yolu DTHR indükler. Bu nedenle, tekrar, ilgili OVA-protein kullanılarak 6.1-6.3 adımları tekrarlayın.
PET / BT kullanarak Canlı Üzerinde Görüntüleme 7.
Not: cova-DTHR 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücrelerinin in vivo görüntülemede hastalıklı fareleri ve kontrol litermatlarının belirli homing ve mil gösteriyorcova-TH1 hücrelerinin Entegrasyonu'dur dinamiği. Bu nedenle, statik PET görüntüleri ve anatomik BT sırasıyla 3, 24 ve 48 saat sonra adoptif hücre transferi tarar.
- Doğrudan radyoaktif sonra, 200 uL, 10 7 hücre ip enjeksiyonu için, 5 x 10 7 hücre / mL'ye 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücreleri ayarlayın.
- 1 ml şırınga ve bir tane 30-gauge iğne kullanılarak, 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücre süspansiyonu, 200 uL çekmek ve hücreler, 4 ila cova-DTHR-hastalıklı hayvanların içine ip enjekte ve 5. meme. toplam radyoaktivite enjekte miktarını belirlemek için, önce ve enjeksiyondan sonra bir doz kalibratördeki şırınga ölçer.
- sıcaklık kontrollü bir anestezi kutusunda:% 100 oksijen% 1.5 izofluran ile, fareler, önce arzu edilen madde alımı zamana 10 dakika anestezisi (0.7 L / dakika akış hızı).
- Bu arada, birlikte kaydedilmesini kolaylaştırmak içingörüntü analizi sırasında PET ve BT görüntüleri, fare yatağın altında 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb çözelti veya serbest 64 CuCl2 çözeltisi ihtiva eden bir cam kılcal düzeltin.
- Bu nedenle, 0.37 MBq / mL'lik bir çözelti hazırlamak ve bu çözeltiye, 10 uL hacimde cam kılcal doldurun. hücre kökenli radyoaktivite sinyalleri doğal olarak zayıf olduğu için, belirteçler farelerde hücre kökenli sinyallere müdahale olmadığından emin olmak için yüksek aktivite miktarda kullanmayın.
- Cerrahi tolerans ulaştıktan sonra, arka bacak pedalı geri çekme refleksi kaybı ile gösterildiği gibi, anesteziyi muhafaza etmek üzere, uygun bir boru sistemi ile donatılmış bir PET ve BT uyumlu küçük hayvan yatağa fare aktarın.
- Pamuklu çubuk ve cerrahi bant kullanarak küçük hayvan yatağı üzerinde fareyi hareketsiz. gözlerin kurumasını önlemek için göz merhemi sürün.
- PET tarayıcı fare yatak aktarın bir Focu ile görüş alanını ortalamakakciğer ile ilgili ve 350-650 keV bir enerji penceresi ile 20 dk statik PET tarama kazanır.
- CT tarayıcıya fare yatak aktarın. İzci görünümü sayesinde, akciğerler üzerinde görüş alanını ortalamak. bir fuar 350 ms'lik zaman ve faktör 4 kümeleştirme ile "aşaması ve filiz" modunda 360 ° dönüşü sırasında 360 parçalan üzerinden düzlemsel bir CT görüntüsünün elde edin.
8. Resim Analizi
- 75 um piksel boyutu ile 3 boyutlu bir görüntü halinde istatistiksel yinelemeli sıralı alt kümesi beklenti en (OSEM) 2D algoritmasını ve BT taramaları uygulanarak PET listesi modu verileri yeniden yapılandırma.
- Uygun bir görüntü analiz yazılımı görüntü birlikte kaydedilmesi (örneğin Inveon Araştırma İşyeri veya PMOD) için, otomatik birlikte kayıt aracını kullanın. Bu başarısız olursa, aksiyel, koronal ve sagittal görünümde mekansal yeniden PET ve BT görüntüleri birlikte kaydetmek için yol gösterici olarak fare yatağın altında cam kılcal kullanın.
- PET görüntüleri düzeltinradyoaktif bozunma kanun ve 12.7 h radyonüklid 64 Cu yarı süresi kullanılarak radyoaktif bozunma için. görüntü normalleştirme için, bir referans olarak bir resim (A) tercih ve ilgili görüntü analiz yazılımı görüntü ekranı yoğunluğunu ayarlayın.
- ((Enjekte edilen aktivite (X) / enjekte aktivitesi: diğer görüntüler sadece referans görüntü (A) için belirlenen değerler, enjekte faaliyeti (A) ve enjekte edilen aktiviteyi (X), aşağıdaki denklem kullanılarak, diğer görüntü normalize kullanılması A)) x yoğunluk değerlerinin (A).
- pulmoner ve perithymic LN normalleştirilmiş PET sinyali faiz (VOI) 3D hacimleri çizin.
- Cm3 (% ID / cm3), aşağıdaki denklem kullanılarak yüzde oranı enjekte edilen doz belirleme: (farede VOI / toplam aktiviteye bir etkinlik anlamına), referanslar 23 22, bkz görüntü analizi ile ilgili daha fazla yönlendirme için x 100..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, 64, Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ve in vitro ve bu protokol kaplı vivo çalışmalarda deney tasarımı ile cova-TH1 hücrelerinin etiketlenmesi özetlemektedir.
Şekil 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb Etiketleme Proses ve Deney Tasarımı. 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ile radyoaktif etiketleme hücre (A) şematik temsili. 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb TH1 hücrelerinin hücre yüzeyi üzerinde cova-TCR reseptörlerine bağlanır ve 24 saat içinde reseptör ile yerleştirilebilir. cova-TCR'ler radyo etiketlenmesi 24 saat sonra yeniden ifade edilmiştir. (B), CD4 + T hücreleri izole edilmiş, genişletilmiş ve 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb in vitro ile radyoaktif olarak işaretlendi. Alım ve dışa akım değerleri werE, bir doz kalibratör ve γ-ölçümü ile belirlenmiştir. hücre canlılığı üzerinde radyoaktif antikorun etkisi ELISA IFN-y ile ilgili işlevselliği, tripan mavi boyama ile değerlendirilebilir ve Fikoeritrin (PE) -Annexin V boyama ile apoptosis üzerindeki edildi. (C) cova solunum yolu DHTR dişi BALB / c farelerinde indüklenmiştir. 10 7, TH1 hücre adoptif, doğrudan radyo etiketlenmesi sonra cova solunum yolu DHTR-hastalıklı hayvanların içine transfer edilmiştir. PET / BT görüntüleri 3, 24 ve 48 saat sonra adoptif hücre transferi elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ile TH1 hücrelerinin başarılı hücre içi etiketli immünohistokimyasal (Şekil 2A) ile teyit edilmiştir. 64Cu-DOTA-KJ1-26 antikoru (yeşil) ile birlikte lokalize olduğunuhücre membranında mAb'nin sinyali 24 saat (sarı) sadece zayıf iken radyoaktif sonra hücre zarı 3 h CD3. Radyoaktif sonra 48 saat sonra, 64Cu-DOTA-KJ1-26-TCR kompleksi TH1 hücrelerinin sitoplazması içinde güçlü bir sinyal ile endositoz vasıtasıyla internalize edildi. 1.4 MBq ve 2.1 MBq 64 daha yüksek dozlarda, Cu-DOTA-KJ1-26 mAb daha belirgin etkileri vardı, sadece% 8 TH1 hücrelerinin canlılığı azaltılmış 0.7 MBq uygulanan radyoaktif dozu. 64Cu-PTSM Ancak, 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb'nin önemli bir avantaj gözlendi (Şekil 2B) ile radyo-etiketleme ile karşılaştırıldığında. IFN-γ salgılanması (Şekil 2C) ile gösterilen radyoaktivite dışa akımını (Şekil 2D), düşük ve 64Cu-PTSM etiketli TH1 göre apoptoz (Şekil 2E) indüksiyonunu düşük 64 Cu-antikor radyoetiketli hücreler işlevsellik az kayıp göstermiştir hücreler.
Şekil 2: Radyoaktif TH1 hücre Etiketleme Vitro Değerlendirilmesi 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ile. (A) eş odaklı mikroskop incelemesi cova-TH1 hücrelerinde 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (yeşil) (hücre membranı; kırmızı) hücre içi alımını kanıtlar ilk etiketleme sonra 24 saat içinde (Bu şekil, başvuru 17 değişiklikler yapılarak elde edilmiş) . Tripan mavi eksklüzyonu 24 saat sonra etiketleme ile tespit edildiği üzere 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ya da 64Cu-PTSM radyoaktif etiketleme dozlarının (B) titrasyon canlılığı üzerinde eşit etki göstermiştir. Hücre etiketlenmesi için 0.7 MBq kullanım canlılığının düşük bozuklukları bağlı (yüzde olarak ortalama ± SD;. Bu şekil referans 16, 17 değişiklikler yapılarak elde edilmiş olan (radyoaktif etiketleme C) titrasyon yapmakELISA 24 saat sonra etiketleme IFN-y ile tespit edildiği üzere 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ya da 64Cu-PTSM arasında ses, 64Cu-PTSM etiketleme sonra işlevsellik daha güçlü bir bozulma göstermiştir. Hücre etiketlenmesi için 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb'nin bir artan doz çalışmasına herhangi bir etkileri vardı (yüzde olarak ortalama ± SD; istatistikleri: Student t-testi; * p <0.05, ** p <0.01, ** * p <0.001; bu rakam, referanslar 16 17 tadil edilmiş olan). Radyo işaretli hücreler (γ-sayım) (D) Dışa Akımı ölçümleri 64Cu-PTSM 5 saat ve 24 saat sonra etiketleme ile karşılaştırıldığında 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb'nin daha yüksek bir etiketleme stabilite göstermiştir (yüzde olarak ortalama ± SD; istatistikleri : Student t-testi; *** p <0,001, bu şekil) 17 ile modifiye edilmiştir. (E) İlgili akış sitometrisi (PE-Annexin V) diyagramları daha yüksek bir ap göstermektediroptosis indüksiyon 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb etiketleme ile karşılaştırıldığında 64 Cu-PTSM etiketleme 24 saat sonra (Bu şekil, başvuru 17 değişiklikler yapılarak elde edilmiş). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Cova-DTHR-hastalıklı hayvan ve işlenmemiş denetimleri, yüksek çözünürlüklü statik PET ve anatomik BT görüntüleri içine 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb etiketli Cova-TH1 hücrelerinin evlatlık transferinden sonra satın alındı. Görüntü analizi için, görüntü 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (Şekil 3A) bir miktar ihtiva eden bir cam kılcal yardımıyla, koronal eksenel ve sagital görünüm içinde birleştirildi. Cm3 başına enjekte edilen dozun VOI'ler yüzdesini hesaplamak için bozunma düzeltilmiş ve normalize PET görüntüleri pulmoner ve perithymic LN çizildi(Şekil 3B).
Şekil 3: PET / BT-ko-kayıt ve analiz. (A) PET ve BT görüntüleri görüntü analiz yazılımı eş kaydedildi. yazılım tarafından otomatik kayıt başarısız olursa, görüntüler cam kılcal (belirteçleri), hayvan yatağın altında radyoaktivite ile dolu ve sabit PET ve BT sinyallerini üst üste koyan birleştirilmiştir. (B) VOI'ler perityhmic ve pulmoner LN düzeltilmiş ve normalize PET sinyalleri üzerine yerleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Cova-TH1 hücre göçü hava yolu DTHR içinde Cova-sunum siteleri gibi pulmoner ve perithymic LN için takip edilmiştir. In vivo PET sinyalleri de içinde64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücrelerinden yarıp 64Cu-PTSM etiketli hücreleri (Şekil 4A) gelen sinyallere göre önemli ölçüde daha yüksek idi. akciğer ve perithymic LN cova-TH1 hücre alımı değerleri anlamlı muamele edilmemiş kontrol farelerinde (Şekil 4B) ile karşılaştırıldığında DTHR-hastalıklı hayvanlarda artmıştır.
Şekil 4: İn Vivo PET / CT ile hava yolu DTHR Modelinde cova-TH1 hücre Takip. (A), adoptif arasında İlgili PET / BT görüntüleri önceden cova-DTHR-hastalıklı ya da tedavi edilmemiş farelere, 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ya da 64Cu-PTSM ile etiketlenmiştir cova-TH1 hücreleri, transfer edilmiştir. transfer cova-TH1 hücreleri, pulmoner ve perithymic LN için bağlantılı. (B) cova-TH1 hücrelerinin homing siteleri kantitatif analizi daha yüksek bir saat olduiltihaplı dokulara oming (ortalama ± SD; istatistik: Student t-testi; * p <0.05, ** p <0.01). 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ile etiketleme, farklı hedef arama sitelerinde 64Cu-PTSM göre (artmış% ID / cm3) (SD, istatistik ortalama ± daha yüksek bir hassasiyet oldu: Öğrenci t-testi; * p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001). Bu şekil, referans 16, 17 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, stabil bir şekilde PET in vivo izlenmesi için hücreler radyolabel güvenilir ve kolay bir yöntem sunulur. 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ve homing ile de radyo-etiketlenebilir, cova-TH1 hücreleri, izole edilmiş ve donör farelerden in vitro olarak genişletilebilir, bu yöntem olabilir kullanan bir Cova sunum siteleri gibi pulmoner ve perithymic LN için takip edilmiştir akut solunum yolu DTHR cova kaynaklı.
çelatör mAb modifikasyonu hızlı ve verimli bir şekilde çalışmasını ve aminlerin izleri olmadan ultra saf çözeltilerin kullanımını gerektirir. çözeltiler mAb kalıntıları amin DOTA-NHS aktif esterin uygun konjugasyon sağlamak için bir kenetleme iyon değiştirme reçinesi ile muamele edilmiştir. hücre içi bir radyolojik etiket olarak şelatlayıcı-konjuge mAb spesifik olmayan hücre etiketleme maddelerin kullanımı ile birçok avantaj vardır. İlk olarak, mAb tanımlanmış bir hücre popülasyonunun hedeflenen etiketleme sağlayan mükemmel özgünlük sağlar. mAbkendisi sitotoksik değildir ve hücre canlılığı veya işlevselliğini herhangi bir zararlı etkisi vardır. Daha sonra, hücreler radyoaktivite akış önemli ölçüde PET görüntüleri 17, 24, sinyal-arka plan oranını geliştirmek indirgenmiştir. Farklı özgüllüğü olan bir mAb seçerek, bu yöntem, CD8 + TIL veya CD14 + monositleri gibi ilgi konusu diğer hücre popülasyonları kolayca aktarılabilir olduğu. Ayrıca, bu hücre etiketleme yaklaşım, farklı insan kanser türleri için enflamatuar insan hastalıkları (örneğin romatoid artrit ve bronşiyal astım) ya da hayvan modellerinde çeşitli hayvan modellerinde, hücre izleme çalışmaları için kullanılabilir. mAb'ler pasif hücre zarı boyunca yaygın olmadığı Bu etiketleme yöntemi olup, bununla birlikte, zara bağlı reseptörleri veya hedefler olarak farklılaşmaları belirteçleri ile sınırlıdır. hedef ya da, aktivasyonu ile uyarılan içselleştirme sadece, zar-mekik avantajlıdır. birmAb ile hedef arasında yüksek aviditeli, ancak, aynı zamanda, muhtemelen arka oranı azalmış bir sinyal ile, in vivo görüntüleme için yeterli olabilir.
Bizim deneyler için bir kıskaç olarak DOTA seçimi 64 Cu 25 kullanılarak erken çalışmalarına dayanıyordu. Bununla birlikte, bu arada DOTA süperoksit dismutaz 26 transchelation karaciğerde oldukça yüksek aktivite alımına yol açan, bu izotopun için optimal bir şelatör vermeye gösterilmiştir. Uyarlayıcı karaciğere 64Cu serbest bırakılması ve taşıma riski daha düşük olmalıdır aktarılır hücrelerinin in vitro etiketleme için radyoaktif olarak işaretlenmiş bir antikor kullanılarak da, modern bir kenetleme maddeleri 1,4,7-triazasiklononan, 1-glutarik asit gibi, 64 Cu için optimize -4,7-asetik asit (NODAGA) ya da 1,4,7-triazasiklononan-triasetik asit (nota), tercihen ayrıca elde edilen veriler 27 özgüllüğünün arttırılması için bir yöntem ile birlikte kullanılabilir 64Cu (örneğin, N-klorosüksinimid (NCS)) ya da diğer izotoplar, örneğin 89 Zr (.; DFO örneğin desferrioksamin) için de kullanılabilir.
Radyoizotop olarak 64 Cu seçimi in vivo hücre göçü ve homing genellikle PET ile görüntülenmiş metabolik değişikliklere kıyasla oldukça yavaş bir süreçtir gerçeğine dayanmaktadır. 12.7 saatlik bir yarı-ömür ile 64Cu 48 saat sonra enjeksiyon içinde hücre göçü tekrar görüntülenmesine olanak sağlar. 64Cu üretimi için, 64 Cu saflığı sağlamak için eser metal iyonları olmadan yüksek kaliteli çözüm kullanılması önemlidir. Bundan başka, 64 Cu saflığı proteini, radyo-etiketleme ve buna bağlı olarak görüntüleme engel seviyelere 64Cu çözeltisinin daha düşük bir özgül etkinliğe yol açabilecek çok değerlikli metal iyonu kirliliklerine yana DOTA-mAb'nin radyoaktif için büyük önem taşımaktadır. 64 Her ne kadar Cu bir si üretirradyo etiketlenmesi sonra canlılığı ve fonksiyonelliği ve düşük apoptosis teşviki üzerindeki en az etki ile temsil edildiği gibi yüksek enerjili, sitotoksik Auger elektron gnificant yüzde 28 bozulması, radyoizotop ayarlanmış bir dozu iyi hücreler tarafından iyi tolere edilir. Bununla birlikte, başlangıçta diğer hücre tipleri için radyoaktif işaretleme için kullanılan aktivite dozunu titre ve radyo işaretleme protokolünü ayarlamak için açıkça tavsiye edilir. In vitro değerlendirme yöntemleri hızlı ve kolay hücrelerin apoptotik fraksiyonların belirlenmesi için PE-Annexin V ile tripan mavisiyle çıkarma ve boyama ile canlılığının belirlenmesi de dahil olmak üzere, protokolde gösterilmiştir. Her iki yöntem nispeten ucuz ve kolay erişilebilir laboratuar ekipmanı kullanın. Canlı ve örneğin 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ölü hücrelerin ayırt edilmesi için bir boya PE-Annexin V boyası birleştiren bir deney ste yaşayabilirlik ve apoptoz belirlenmesi için izins. etiketli T hücrelerinin canlılığını değerlendirmek için bir alternatif olarak, bir 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) deneyi, hücre metabolik aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Bir doz kalibratör ve γ-sayaç ile alımı ve dışa akım değerlerinin değerlendirilmesi radyoaktivite ile çalışan neredeyse her laboratuar sitesinde ilgili donanıma sahiptir beri ulaşmak için daha gelişmiş ama hala hızlı ve ucuz. Gen sekanslama ya da mikro çip bazlı yöntem daha ayrıntılı veriler verecektir. Ancak bu yöntemler, her zaman kolayca erişilebilir değildir uygun uzmanlığa ihtiyaç ve en sık yüksek maliyetler ile bağlantılıdır.
PET mikroskopik görüntüleme teknikleri 29 gibi bir selüler çözüme ulaşmak mümkün değildir, ancak, bu hayvanlar ya da insanlar 8 içindeki hücrelerin daha az sayıda tespiti için pikomolar aralığında mükemmel hassasiyet sağlamaktadır. örneğin optika gibi diğer invaziv olmayan görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığındal görüntüleme, PET, kantitatif penetrasyon derinliği sınırlıdır ve üç boyutlu çözünürlük ile yüksek kaliteli görüntüler verebilmesini değildir. CT anatomik doğrulukla PET yüksek hassasiyet birleştiren hücre göçü yüksek hassasiyetli görüntüleme için izin verir. Ayrıca, in vivo veriler kolayca biyolojik dağılım analizi için γ-sayımı da dahil olmak üzere pek çok ex vivo yöntemler ile doğrulanabilir. cryosections ve cryosections müteakip histolojik boyama otoradyografisi hematoksilen ve eozin boyama tarafından tanımlanan immün hücre infiltrasyonu olan otoradyografik aktivite ilk ilişkilendirmek için bindirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar deneyleri ve veri analizi sırasında destek için Dr. Julia Mannheim Walter Ehrlichmann Ramona Stumm, Funda Cay Daniel Bukala, Maren Harant yanı sıra Natalie Altmeyer teşekkür ederim. Bu çalışma Werner Siemens-Vakfı, SFB685 aracılığıyla DFG (proje B6) ve fal (2309-0-0) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | WKL | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitroevaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30 G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µL | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
- Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
- Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
- Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
- Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
- Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
- Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
- Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
- Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
- Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
- Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
- Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
- Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
- Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
- McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
- Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
- Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
- Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
- Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
- Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
- Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).
