Summary
Suite à la préparation d'un 64 anticorps monoclonal Cu-modifié de liaison à un récepteur de cellule T murine transgénique, les cellules T sont radiomarqué in vivo, une analyse de la viabilité, la fonctionnalité, la stabilité du marquage et de l' apoptose, et par transfert adoptif dans des souris avec une voie aérienne d'hypersensibilité de type retardé réaction pour l'imagerie non invasive par tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (PET / CT).
Abstract
Ce protocole illustre la production de 64 Cu et la conjugaison chélateur / radiomarquage d'un anticorps monoclonal (mAb) , suivie d' une culture de cellules de lymphocytes murins et 64 récepteur Cu-anticorps ciblant des cellules. Dans l' évaluation in vitro du radiomarqueur et non-invasive dans le suivi des cellules in vivo dans un modèle animal d'une voie aérienne d' hypersensibilité retardée réaction (DTHR) par PET / CT sont décrites.
Dans le détail, la conjugaison d'un anticorps monoclonal avec l'agent chélatant acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA) est représenté. Suite à la production de 64 radioactif Cu, le radiomarquage de l'anticorps monoclonal DOTA-conjugué est décrite. Ensuite, l'expansion de l' ovalbumine de poulet (COVA) CD4 + interféron spécifique de (IFN) -γ-production de cellules T auxiliaires (Cova-TH1) et la radiomarquage subséquente des cellules Cova-TH1 sont représentés. Diverses techniques in vitro sont présentées pour évaluer l'effets de 64 Cu-radiomarquage sur les cellules, telles que la détermination de la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan, la coloration de l' apoptose avec l' Annexine V pour la cytométrie en flux, et l'évaluation de la fonctionnalité par un dosage immuno-enzymatique IFN-γ (ELISA) . En outre, la détermination de l'absorption radioactive dans les cellules et la stabilité de l'étiquetage sont décrites en détail. Ce protocole décrit en outre comment effectuer des études de suivi de cellules dans un modèle animal pour une DTHR des voies respiratoires et, par conséquent, l'induction de DHTR aiguë des voies aériennes induite par COVA dans des souris BALB / c est inclus. Enfin, un flux de travail TEP / CT robuste comprenant l'acquisition d'image, la reconstruction, et l'analyse est présentée.
Le 64 récepteur de Cu-anticorps approche de ciblage avec l' internalisation du récepteur ultérieur fournit une spécificité élevée et la stabilité, réduit la toxicité cellulaire, et de faibles taux d'efflux par rapport au PET traceurs communs pour le marquage cellulaire, par exemple 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-méthylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Enfin, notre approche permet non-invasive in vivo suivi des cellules en PET / CT avec un rapport optimal signal-sur-fond pendant 48 heures. Cette approche expérimentale peut être transférée à différents modèles animaux et types de cellules avec les récepteurs liés à la membrane qui sont internalisés.
Introduction
Le suivi des cellules non-invasive est un outil polyvalent pour surveiller la fonction cellulaire, la migration et homing in vivo. De récentes études de suivi de cellules se sont concentrées sur mésenchymateuses 1, 2 ou cellules souches dérivées de la moelle osseuse 3 dans le cadre de la médecine régénérative, les globules blancs périphériques autologues dans l' inflammation ou des lymphocytes T dans des thérapies cellulaires adoptifs contre le cancer 3, 4. L'élucidation des sites d'action et les principes biologiques sous-jacents des thérapies à base de cellules est d'une importance énorme. CD8 + lymphocytes T cytotoxiques, récepteur de l' antigène chimère génétiquement modifiées (CAR) des cellules T ou des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) ont été largement considéré comme l'étalon-or. Cependant, les cellules TH1 spécifiques de l' antigène associé à la tumeur se sont révélés être une option de traitement alternative efficace 4, </ sup> 5, 6, 7.
Comme les principaux acteurs dans l' inflammation, les maladies auto - immunes spécifiques d'organes (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde ou d' asthme bronchique), et les cellules de grand intérêt pour l' immunothérapie du cancer, il est important de caractériser les modes de distribution et de homing temporelles des cellules TH1. L' imagerie in vivo non invasive par TEP présente une quantitative, une méthode très sensible 8 pour examiner les schémas de migration des cellules, dans la prise d' origine in vivo, et les sites d'action des lymphocytes T et des réponses au cours de l' inflammation, les allergies, les infections ou le rejet de la tumeur 9, 10, 11.
Cliniquement, 111 In-oxine est utilisé pour la scintigraphie des leucocytes pour la discrimination de l' inflammation et de l' infection 12, tandis que le 2-désoxy-2- (18F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) est couramment utilisé pour les études de suivi des cellules en PET 3, 13. Un inconvénient majeur de ce traceur PET, cependant, est la courte demi-vie du radionucléide 18 F à 109,7 min et la faible stabilité intracellulaire qui empêche l' imagerie aux points de temps plus tard transfert post cellulaire adoptive. Pour plus long terme in vivo des études de suivi de cellules par PET, bien instable dans les cellules, 64 Cu-PTSM est fréquemment utilisé pour étiqueter de façon non spécifique des cellules 14, 15 avec des effets néfastes réduits au minimum sur la viabilité des cellules T et la fonction 16.
Ce protocole décrit un procédé pour réduire davantage les effets désavantageux sur la viabilité cellulaire et la fonction à l'aide d'un récepteur de cellule T (TCR) de mAb radiomarquée spécifique de. Premièrement, la production du radio - isotope 64 Cu, la conjugaison du mAb avec KJ1-26 ee chélateur DOTA, et le 64 Cu-radiomarquage ultérieur sont présentés. Dans une deuxième étape, l'isolement et l' expansion de cellules Cova-TH1 de souris donneuses DO11.10 et le radiomarquage avec sont décrits en détail 64 mAb conjugué DOTA-Cu chargé KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26). L'évaluation des valeurs absorption et l' efflux de la radioactivité avec un calibrateur de dose et par y-comptage, respectivement, ainsi que l'évaluation des effets de 64 Cu-radiomarquage sur la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan et de fonctionnalité avec ELISA de IFN-y sont présentés . Pour les non-invasive dans le suivi des cellules in vivo, le déclenchement d'un modèle de souris de DTHR voies aériennes aiguë induite par Cova et l' acquisition d' image par PET / CT après le transfert cellulaire adoptive sont décrits.
De plus, cette approche de l'étiquetage peut être transférée à différents modèles de la maladie, les cellules T de souris avec différentes cellules ou RLT d'intérêt général avec les récepteurs liés à la membrane ou l'expression markers membrane continue qui sous - tend la navette 17.
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Protocol
Mesures de sécurité: Lors de la manipulation de radioactivité, stocker 64 Cu derrière plomb de 2 pouces d'épaisseur des briques et utiliser un blindage respectif pour tous les navires transportant l' activité. Utiliser des outils appropriés pour gérer indirectement des sources non protégées pour éviter le contact direct des mains et de minimiser l'exposition aux matières radioactives. Portez toujours des badges de surveillance dosimétrique de rayonnement et de l'équipement de protection individuelle et de vérifier soi-même et la zone de travail de contamination pour répondre immédiatement. Jeter un équipement de protection personnelle potentiellement contaminés avant de quitter la zone où des matières radioactives est utilisé. Stocker l'ensemble des déchets radioactifs derrière le blindage de plomb jusqu'à ce que le 64 Cu est décomposé radioactive (environ 10 demi-vies = 127 h) avant l' élimination adéquate.
1. 64 Production de Cu
NOTE: Le radio - isotope 64 Cu est produit par l'intermédiaire du 64 Ni (p, n) 64 Cu réaction nucléaire en utilisant un Pettcyclotron de course selon un protocole modifié de McCarthy et al. 18.
- Pour 64 la production de Cu, Ni irradier 64, qui est électrodéposé sur une plaque de platine / iridium (90/10), avec 30 uA pendant 6 h avec un faisceau de protons de 12,4 MeV.
- Chauffer la cible de platine / iridium à 100 ° C dans une chambre polyétheréthercétone dédié (PEEK) et incuber dans 2 ml de HCl concentré pendant 20 min pour dissoudre 64 Cu / Ni 64.
- Ajouter un autre 1 ml de HCl concentré et incuber pendant 10 min.
- Evaporer HCl en utilisant un courant d'argon et refroidir la chambre à la température ambiante.
- Rincer la chambre avec 3 mL de 4% 0,2 M HCl et 96% de méthanol (v / v) et le transfert de cette solution à une colonne d'échange d'ions qui a été pré-conditionné avec 4% de 0,2 M HCl dans du methanol pendant au moins 15 min. L'écoulement peut être utilisée pour recycler 64 Ni.
- Laver le 64 Cu retenu dans la colonne avec 4% de HCl 0,2 M in methanol.
- Eluer avec 64 Cu 70% 1,3 M HCl / isopropanol 30% (v / v) dans un flacon de collecte, on évapore la solution dans un courant d'argon et on laisse le flacon refroidir à température ambiante.
- Dissoudre 64 Cu dans 140-210 ul de HCl 0,1 M.
2. Anticorps Conjugaison avec DOTA et ultérieure 64 Cu-radiomarquage
NOTE: Le chélateur DOTA sera lié à des groupes amino fonctionnels de la chimie de l' ester mAb par N-hydroxysuccinimide (NHS) et le conjugué radiomarqué sera par la suite avec 64 Cu 19.
- Régler la concentration de la KJ1-26-mAb à 8 mg / ml et diafiltrat 1 ml de solution de mAb contre 0,1 M de Na 2 HPO 4 pH 7,5 traitée avec 1,2 g / l d'une résine échangeuse d'ions chélatante en utilisant un poids moléculaire coupé ( MWCO 30 kDa) unité de filtre centrifuge. Appliquer 3 étapes de lavage ultérieures avec 14 ml du tampon. Après l'étape de lavage final,se concentrer à nouveau la solution à 1 ml. Quantifier la concentration d'anticorps par des mesures de DO à 280 nm.
- Préparer une solution DOTA-NHS dans l'eau ultra-pure ou de qualité PCR à une concentration de 10 mg / ml immédiatement avant utilisation. Laisser le flacon à régler la température ambiante avant de l'ouvrir pour éviter la condensation de l'eau, et enlever soigneusement DOTA-NHS à l'aide d'une spatule en plastique. Ajouter 216 pi de cette solution DOTA-NHS à 8 mg de la solution KJ1-26-mAb diafiltrées, bien mélanger et incuber pendant 24 heures à 4 ° C sur un mélangeur à tambour.
- Diafiltrat le DOTA-KJ1-26-mAb contre 0,25 M d'acétate d'ammonium, pH 7,0, on traite avec 1,2 g / l d'une résine échangeuse d'ions chélatante, en utilisant un seuil de poids moléculaire (MWCO 30 kDa) de l'unité de filtre centrifuge. Appliquer 7 étapes de lavage. Concentrer le mAb à un volume final de 1 ml et mesurer à nouveau la concentration en protéines par des mesures OD de 280 nm.
- Avant le radiomarquage, échanger le tampon du DOTA-KJ1-26-mAb de PBS par taille-HTChromatographie en utilisant des colonnes de lusion de filtration sur gel. Cela élimine également les impuretés de petites molécules potentielles.
- Préparer 100 MBq 64 solution de CuCl 2 dans 10 mM de HCl et ajuster le pH à 6-7 avec 10x PBS. Ajouter 200 pg de DOTA-KJ1-26-mAb. Incuber pendant 60 min à 37 ° C.
- Pour le contrôle de qualité, effectuer une Chromatographie en couche mince avec 0,1 M de citrate de sodium (pH 5) en tant que phase mobile et l'analyse par autoradiographie. Au moins 90% de l'activité doit être liée à l'anticorps et ainsi être détectée à l'endroit de départ. activité non liée est chélaté par la phase mobile à base de citrate et des stries à l'avant solvant. Pour référence, l'utilisation de 64 CuCl2 est conseillé.
3. poulet TH1 ovalbumine-spécifiques (Cova-TH1) Isolement et expansion de cellules
NOTE: La culture des cellules TH1 est décrit selon des études publiées antérieurement 16, 17.
- Isoler les rates et les ganglions lymphatiques extrapéritonéale (LNS) provenant de souris DO11.10.
- Sacrifiez la souris selon les règlements fédéraux. Désinfecter l'animal avec 70% d'éthanol et fixer avec du ruban adhésif pour l'ablation de la rate et de ganglions. Faire une incision médiane et séparer la peau du péritoine en la tirant latéralement sur chaque site.
- Localisez le col de l'utérus, axial, brachial et LNS inguinale. les enlever avec une pince émoussés et les placer dans 1% de sérum de veau foetal (FCS) / tampon PBS.
- Ouvrez le péritoine et de localiser la rate. Séparer la rate par le pancréas et le tissu conjonctif et le placer dans une mémoire tampon% de FCS / PBS. Pour plus de conseils, voir les références 20,21.
- rate et ganglions hachis à travers un filtre de 40 um dans un tube à bouchon à vis de 50 ml en utilisant le piston d'une seringue. Rincer le filtre avec 10 ml de 1% de FCS / PBS-tampon.
- Centrifuger à 400 g pendant 5 min et retirer le surnageant. Subsequently, effectuer la lyse des globules rouges en ajoutant un tampon de lyse de chlorure d'ammonium-potassium (ACK) (1,5 ml par animal donneur) pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 8,5 ml de 1% de FCS / PBS tampon (par animal donneur).
- Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 minutes et éliminer le surnageant. Laver les cellules dans 10 ml de 1% de FCS / PBS-tampon, centrifuger à 400 g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
- Pour la séparation magnétique de cellules, remettre en suspension les cellules dans 1% de FCS / PBS-tampon et ajouter CD4 + microbilles. Reportez - vous aux instructions du fabricant pour le volume tampon et la quantité de CD4 + microbilles à utiliser.
- Incuber pendant 20 min à 4 ° C. Puis ajouter 1% de FCS / PBS tampon jusqu'à 50 ml, centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 min, et retirer le surnageant.
- Continuer avec CD4 + isolement des cellules T en utilisant des colonnes de séparation magnétique commerciales et un support magnétique respectif selon le protocole du fabricant. Ajuster les cellules T CD4 + éluées à une concentration de 10 6 cellules / ml dans Modifié de Dulbecco du milieu de Eagle avec 10% inactivé par la chaleur de FCS, 2,5% de pénicilline / streptomycine, 1% de tampon HEPES, 1% MEM acides aminés, 1% de pyruvate de sodium et 0,2% de 2-mercaptoéthanol et de magasin les à 4 ° C.
- Recueillir la décharge de la colonne dans un tube à bouchon à vis de 50 ml pour préparer des cellules présentant l'antigène (APC). Centrifuger la décharge de la colonne à 400 g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
- Ajouter 10 pg / ml anti-CD4 (clone: GK1.5), 10 pg / ml anti-CD8 (clone: 5367,2) et la souris anti-rat-mAb (MAR18.5) 10 pg / ml et 1,5 ml complément de lapin. Incuber pendant 45 min à 37 ° C.
- Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min, retirer le surnageant et ajouter 3 ml de milieu. Irradier l'APC sur une source de rayons γ ou de rayons X avec 30 Gy au total. Ensuite, ajuster les APC à une concentration de 5 x 10 6 cellules / ml.
- Ajouter 100 ul de cellules T CD4 + et 100 pi de véhicules blindés sur un 96 puits plate avec 10 ug / mL cOVA-peptide 323-339, 10 pg / ml d'anti-IL-4-mAb, 0,3 uM d'oligonucléotides CPG1668 et 5 U / ml d'IL-2.
- Ajouter 50 U / ml d'IL-2 tous les deux jours. Après 3 - 4 jours, transférer les cellules à partir de plaques à 96 puits à des plaques à 24 puits. Moissonneuse 3-5 puits de la plaque à 96 puits dans un puits sur la plaque à 24 puits. Ajouter 100 IL-2 U / ml contenant du milieu dans un rapport 1: 1.
- Après encore 2-3 jours, transférer les cellules de la plaque à 48 puits à 175 cm 2 flacons de culture de cellules (1 x plaques à 48 puits par flacon). Remplir avec du milieu dans un rapport 1: 1. Ajouter 50 U / ml d'IL-2 tous les deux jours.
- Séparer les cellules selon la densité des cellules et ajouter 50 U / ml d'IL-2 tous les deux jours. De cette façon, la culture des cellules pendant encore 10 jours.
4. Cova-TH1 cellulaire radiomarquage
NOTE: Le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb sera appliqué à des cellules en culture Cova-TH1 pour permettre le marquage radioactif intracellulaire.
- Pour CE Cova-TH1ll radiomarquage, dessiner 37 MBq de l'radiomarqué 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb dans une seringue sans volume mort en utilisant un calibrateur de dose. Ajouter 1 ml de solution saline pour recevoir une solution à 37 MBq / mL.
- Suspension de cellules Cova-TH1 dans un milieu à 2 x 10 6 cellules / ml et ajouter 0,5 ml de la suspension cellulaire à chaque puits dans une plaque à 48 puits.
- Ajouter 20 ul de la fraîchement préparées 37 MBq / ml 64 de solution de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb à chaque puits de la plaque à 48 puits. Le rapport final de l'étiquetage est de 0,7 MBq par 10 6 cellules dans un volume de 520 ul. Incuber à 37 ° C et 7,5% de CO 2 pendant 30 minutes.
- Après incubation, la remise en suspension avec précaution les cellules dans chaque puits et transférer la suspension cellulaire à partir de la plaque à 48 puits dans un tube à bouchon à vis de 50 mL. Pour minimiser la perte de cellules, rincer chaque puits avec le milieu préchauffée.
- Centrifuger la suspension cellulaire Cova-TH1 à 400 xg pendant 5 minutes, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS préchauffé. Supprimer un aliquot de la suspension de cellules pour comptage de cellules. Répétez l'étape de lavage.
- Nombre de cellules viables Cova-TH1 dans une dilution appropriée avec coloration au bleu trypan.
- Ajuster la concentration cellulaire à 5 x 10 7 cellules / ml pour l' injection intraperitoneale (ip) de 10 7 cellules dans 200 ul de PBS.
- Répéter les étapes 4.3 à 4.5 pour radiomarquer les cellules Cova-TH1 avec des quantités croissantes de l' activité, par exemple, 1,4 ou 2,1 MBq MBq par 10 6 cellules.
- Pour radiomarquer les cellules avec 1,4 MBq par 10 6 cellules, en utilisant 40 ul de 37 MBq / ml de 64 solution de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et 60 ul de radiomarquage avec 2,1 MBq par 10 6 cellules. Effectuer les étapes 4.3 à 4.7 avec 0,7 MBq, 1,4 MBq et 2,1 MBq 64 Cu-PTSM mais augmenter le temps d'étiquetage à 3 h pour des études comparatives 17.
- Passez à l'étape 5 pour déterminer la quantité optimale de l'activité.
5. Evaluation in vitro de l'effet de la radioactivité sur les cellules Cova-TH1
REMARQUE: La caractérisation de l'influence du marqueur radioactif dans les cellules TH1 est effectuée par l' intermédiaire d' essai d'exclusion au bleu trypan pour la viabilité, ELISA de IFN-y pour l' évaluation de la fonctionnalité et de PE-annexine coloration de V pour l'induction de l' apoptose 16, 17. Détermination de l'absorption intracellulaire et l'efflux de radioactivité est également décrite ci-dessous. A titre de comparaison, 64 Cu-PTSM marqué les cellules Cova-TH1 peuvent également être utilisés.
- Effet sur la viabilité par exclusion du bleu trypan
- Ajuster au moins 18 x 10 6 cellules Cova-TH1 radiomarqués avec 0,7 MBq / 10 6 cellules, 1,4 MBq / 10 6 cellules et 2,1 MBq / 10 6 cellules respectivement à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml et effectuer les étapes 5.1. 2-5.1.7 pour chaque dose d'activité. Utilisez non radioactive KJ1-26-mAb marqué les cellules Cova-Th1 et les cellules non marquées Cova-TH1 en tant que contrôles.
- Pipeter 1 mL de la solution de cellules dans 9 puits d'une plaque à 24 puits.
- Recueillir le contenu des 3 puits en trois tubes séparés de bouchon à vis de 15 ml, 3 h après le radiomarquage initial.
- Rincer les puits vides maintenant avec un milieu préchauffé pour réduire au minimum la perte de cellules et ajouter le milieu des tubes à bouchon à vis de 15 ml respectives de l'étape 5.1.3.
- Centrifuger les tubes de 15 ml à 400 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire résultant dans 1 ml de milieu préchauffé.
- Compter à la fois viables et les cellules mortes en bleu trypan séparément pour chaque tube de 15 ml et calculer le pourcentage de cellules viables.
- Répéter les étapes 5.1.3-5.1.6 24 et 48 h après 64 radiomarquage Cu-DOTA-KJ1-26-mAb.
- Effets sur les fonctionnalités déterminées par ELISA de IFN-y
NOTE: Pour évaluer l'effet du 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb sur radiomarqueur productio IFN-γn comme marqueur de fonctionnalité, effectuer un test ELISA IFN-γ d'un fournisseur commercial et reportez-vous à la référence 17 pour plus de détails.- Disperser 10 5 cellules viables dans 100 ul de milieu sur une plaque à 96 puits, 3 h après 64 radiomarquage Cu-DOTA-KJ1-26 des cellules TH1 Cova-0,7 MBq, 1,4 MBq ou 2,1 MBq. Utilisation non marquées, non radioactives KJ1-26-mAb marqués ou 64 Cu-PTSM cellules marquées Cova-TH1 en tant que contrôles.
- Stimuler la production d' IFN-γ dans 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 dans 100 ul de milieu avec 10 ug / mL de peptide COVA, 5 U / ml d' IL-2 et 5x10 5 à 100 APC uL de milieu pendant 24 h à 37 ° C et 7,5% de CO 2. D'autres contrôles peuvent être les autres conditions sans addition du peptide Cova.
- Analyser le surnageant par ELISA selon les instructions du fabricant.
- Répétez l'étape 5.2.2. à 5.2.3. à 24 et 48 h après la procédure d'étiquetage.
- L' induction de l' apoptose déterminé par coloration PE-Annexine V pour la cytométrie de flux
NOTE: Pour évaluer l' apoptose induction par le 64 marqueur radioactif Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utiliser un kit disponible dans le commerce cytométrie en flux et préparer des échantillons de cellules selon les instructions du fabricant avant coloration avec l' Annexine V pour exposition phosphatidyl serine sur la membrane cellulaire .- A 3, 24 et 48 h après 64 radiomarquage Cu-DOTA-KJ1-26-mAb des cellules Cova-TH1, triple tache avec au moins 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 avec le kit Annexin V selon les instructions du fabricant et analyser dans l'heure suivante. Utilisation non radioactifs KJ1-26-marqués mAb, 64 Cu-PTSM marqués et non marqués cellules Cova-TH1 en tant que témoins. S'il vous plaît se référer à la référence 17 pour plus de détails.
- : Captage et efflux
NOTE: L'absorption du 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb dans les cellules est mesurée dans un étalonneur de dose et l'efflux de la radioactivité est mesurée dans un essai de γ-comptage 0, 5, 24 et 48 h après le radiomarquage.- Préparer dix tubes γ-comptage pour chacun 64 cellules TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués, et le surnageant respectif de l'étape de lavage.
- Transférer 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqué par les cellules Cova-TH1 dans 1 ml de milieu dans chacune des dix tubes γ-comptage directement après le radiomarquage. Pour chacun des points de temps 5, 24 et 48 h après le radiomarquage, conserver au moins 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 dans le milieu sur des plaques de culture cellulaire à 24 puits dans un incubateur à 37 ° C et 7,5% de CO 2.
- Centrifuger les tubes γ-comptage à 400 xg pendant 5 min et transférer le surnageant dans dix nouveaux tubes γ-comptage.
- Laver les cellules une fois dans 1 ml de milieu pour éliminer la fraction non liée de 64 un Cu-DOTA-KJ1-26-mAbD recueillir le surnageant dans dix nouveaux tubes γ-comptage.
- Ajouter 1 ml nouveau support aux cellules Cova-TH1 et déterminer la valeur d'absorption initiale dans un calibrateur de dose. Les tubes peuvent également être stockés dans un incubateur à 37 ° C et 7,5% de CO 2.
- Répéter les étapes 5.4.2 à 5.4.5 après 5, 24 et 48 h et de mesurer tous les tubes dans une γ-compteur selon le protocole du fabricant. Pour corriger la désintégration radioactive et pour l'analyse quantitative, utiliser un standard avec une dose définie de radioactivité.
6. OVA induite par voie aérienne aiguë RSDT
NOTE: La dynamique de la migration et les modèles de prise d' origine de adoptivement transférées et les cellules radiomarqué Cova-TH1 sur le site de l' inflammation sera visualisée et quantifiée dans un modèle animal pour voies respiratoires RSDT induite Cova 16, 17.
- Injecter 8 semaines âgés de souris BALB / c par voie ip avec un mélange de 150 ul aluminum gel / 50 uL Cova-solution (10 ug dans 50 ul de PBS) pour immuniser des souris.
- Deux semaines après l'immunisation, anesthésier les souris avec 100 mg / kg de kétamine et de 5 mg / kg de xylazine par injection ip. Placer les souris expérimentales sur le dos et pipeter lentement 100 ug Cova dissous dans 50 ul de PBS dans les narines de l'animal. Les animaux inhalent la chute de solution goutte à goutte.
- Répétez après 24 h. Pour inductions DTHR plus forts des voies respiratoires, répéter à nouveau après 48 h.
- Pour analyser la migration spécifique des cellules Cova-TH1 transférées, induisent des voies aériennes RSDT avec la dinde ou le faisan-OVA comme témoin. Par conséquent, répétez les étapes 06.01 à 06.03 en utilisant la OVA-protéine respective.
7. imagerie in vivo L' utilisation du PET / CT
Remarque: dans l' imagerie in vivo de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 chez des souris malades Cova-DTHR et la même portée de contrôle démontre la prise d' origine spécifique et la mila dynamique gration des cellules Cova-TH1. Par conséquent, l'acquisition de la TEP statique et CT anatomique balaye séquentiellement 3, 24 et 48 h transfert de cellules post-adoptive.
- Directement après le radiomarquage, d' ajuster les 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 à 5 x 10 7 cellules / ml pour l' injection ip de 10 7 cellules dans 200 ul.
- En utilisant une seringue de 1 mL et une aiguille de calibre 30, tracer 200 pi du 64 Cu-DOTA-KJ1-26-marqué mAb suspension cellulaire Cova-TH1 et injecter les cellules IP dans les animaux Cova-DTHR-malades entre le 4 e et 5 e mamelon. Pour déterminer la quantité de radioactivité totale injectée de, mesurer la seringue dans un calibreur de dose avant et après l'injection.
- Anesthésier les souris, 10 minutes avant l'heure de l'absorption désirée, avec 1,5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène (débit: 0,7 L / min) dans une zone de l'anesthésie à température contrôlée.
- En attendant, pour faciliter la co-registrationdes images TEP et CT lors de l' analyse d'image, fixer des capillaires en verre contenant 64 solution ou solution libre 64 CuCl 2 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb sous le lit de la souris.
- Par conséquent, préparer une solution de 0,37 MBq / ml et remplir les capillaires en verre d'un volume de 10 ul de cette solution. Les signaux de radioactivité provenant de cellules sont intrinsèquement faibles, ne pas utiliser de grandes quantités d'activité pour vous assurer que les marqueurs ne sont pas interférer avec les signaux dérivés de cellules chez les souris.
- Après avoir atteint la tolérance chirurgicale, comme indiqué par la perte du réflexe de retrait de la pédale de la patte postérieure, transférer la souris à un PET-CT-compatible et petit lit animal équipé d'un système de tubage adapté pour maintenir l'anesthésie.
- Immobiliser la souris sur le petit lit animal à l'aide de cotons-tiges et sparadrap. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement des yeux.
- Transférer le lit de la souris sur le scanner PET, centre du champ de vision avec un focus sur les poumons et d'acquérir un balayage PET statique de 20 min avec une fenêtre d'énergie de 350-650 keV.
- Transférer le lit de la souris sur le scanner CT. Via scout vue, centrer le champ de vision sur les poumons. Acquérir une image de CT plane par l'intermédiaire de 360 projections lors d'une rotation de 360 ° dans le mode « pas à pas et shoot » avec un temps d'exposition de 350 ms et binning facteur 4.
8. Analyse de l'image
- Reconstruire PET données en mode liste en appliquant la maximisation de l'espérance de sous-ensemble ordonné itérative statistique (OSEM) algorithme 2D et la tomodensitométrie en une image 3D avec une taille de pixel de 75 pm.
- Pour l' image co-inscription dans un logiciel d'analyse d'image appropriée (par exemple Inveon recherche en milieu de travail ou Pmod), utilisez l'outil de co-enregistrement automatique. Si cela échoue, utilisez les capillaires en verre sous le lit de la souris comme guide pour co-enregistrer les images TEP et TDM reconstruit dans l'espace dans le sens axial, et coronale sagittal.
- Corriger les images PETde la désintégration radioactive en utilisant la loi de désintégration radioactive et la mi-temps du 64 radionucléide Cu à 12,7 h. Pour la normalisation de l'image, choisir une image (A) comme référence et régler l'intensité de l'affichage de l'image dans le logiciel d'analyse d'image respective.
- En utilisant les valeurs simplement fixés pour l'image de référence (A), l'activité injectée (A) et de l'activité injectée pour les autres images (X), normaliser les autres images à l'aide de l'équation suivante: (activité injectée (X) / activité injectée ( A)) x valeurs d'intensité (A).
- Dessiner volumes 3D d'intérêt (VOI) du signal de PET normalisée des ganglions pulmonaires et périthymique.
- Déterminer la dose injectée en pourcentage par cm 3 (% ID / cm 3) en utilisant l'équation suivante: (moyenne activité en VOI / activité globale chez la souris) x 100. Pour d'autres orientations concernant l' analyse d'image, voir les références 22, 23.
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Representative Results
La figure 1 résume le marquage des cellules Cova-TH1 avec le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et la conception expérimentale pour l'in vitro et in vivo traitées dans ce protocole.
Figure 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb étiquetage Process & Experimental design. (A) Représentation schématique de marquage des cellules avec 64 radioactif Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. Le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb se lie aux récepteurs Cova-TCR sur la surface cellulaire des cellules TH1 et est internalise avec le récepteur dans les 24 h. Cova-RLT sont réexprimer 24 h après le radiomarquage. (B) des cellules T CD4 + ont été isolées, développées et radiomarquées avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in vitro. Et les valeurs recaptage efflux were déterminé par un calibreur de dose et γ-comptage. Les effets de l'anticorps radioactif sur la viabilité cellulaire a été évaluée par coloration au bleu trypan, la fonctionnalité d'ELISA de IFN-y, et induction de l'apoptose avec la phycoérythrine (PE) -Annexin de coloration V. (C) DHTR Cova-voies aériennes a été induite chez des souris femelles BALB / c. 10 7 cellules TH1 ont été transférés dans les animaux adoptivement Cova des voies aériennes DHTR-malade directement après le radiomarquage. images TEP / CT ont été acquises 3, 24 et 48 h transfert de cellules post-adoptive. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Le marquage intracellulaire réussie des cellules TH1 avec le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a été confirmée par immunohistochimie (Figure 2A). Les 64 anticorps Cu-DOTA-KJ1-26 (vert) a été co-localisée avecCD3 à la membrane cellulaire 3 h après le radiomarquage, tandis que le signal de l'anticorps monoclonal à la membrane cellulaire est seulement faible à 24 h (jaune). À 48 h après le radiomarquage, le complexe 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR a été internalisée par endocytose avec un signal fort dans le cytoplasme des cellules TH1. La dose radioactive appliquée de 0,7 MBq réduit la viabilité des cellules TH1 que de 8% , tandis que des doses plus élevées de 1,4 MBq et 2,1 MBq 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ont eu des effets plus prononcés. Par rapport à marquage radioactif avec 64 Cu-PTSM, cependant, aucun avantage significatif de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a été observée (figure 2B). 64 cellules radiomarquées Cu-anticorps ont montré peu de perte de fonctionnalité , comme indiqué par la sécrétion d' IFN-γ (Figure 2C), réduit l' efflux de la radioactivité (Figure 2D), et réduit l' induction de l' apoptose (Figure 2E) par rapport à 64 Cu-PTSM marqué TH1 cellules.
Figure 2: Evaluation in vitro de marquage des cellules TH1 radioactifs avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. (A) La microscopie confocale prouve l'absorption intracellulaire de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (vert) dans des cellules Cova-TH1 (membrane cellulaire; rouge) dans les 24 h après l' étiquetage initial (Cette figure a été modifié par la référence 17) . (B) Le titrage de doses de marquage radioactif de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou 64 Cu-PTSM a révélé une influence égale sur la viabilité telle que détectée par exclusion au bleu trypan 24 h après l' étiquetage. L'utilisation de 0,7 MBq pour le marquage cellulaire induite par les déficiences les plus faibles de la viabilité (moyenne ± SD en pour cent;. Cette figure a été modifié par les références 16, 17 (C) Titrage de marquage radioactif faireSES de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou 64 Cu-PTSM a révélé une forte altération de la fonction après l' étiquetage 64 Cu-PTSM, telle que détectée par ELISA de IFN-y 24 heures après l' étiquetage. Une augmentation de la dose de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb pour le marquage des cellules a eu aucune influence sur la fonctionnalité (moyenne ± SD en pour cent; statistiques: test t de Student; * p <0,05, ** p <0,01, ** * p <0,001; cette figure a été modifié par les références 16, 17). (D) des mesures efflux de cellules radiomarquées (γ-comptage) ont montré une stabilité de marquage plus élevé de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb contre 64 Cu-PTSM 5 h et 24 h étiquetage de poste (moyenne ± SD en pour cent; statistiques : test t de Student; *** p <0,001, ce chiffre a été modifié de 17). (E) des diagrammes de cytométrie de flux respective (PE-annexine V) indiquent un ap supérieurinduction de optosis 24 h après 64 l' étiquetage Cu-PTSM par rapport à 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-étiquetage (Cette figure a été modifié par la référence 17). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Après le transfert adoptif de 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 dans des animaux Cova-DTHR-malades et les témoins non traités, PET statique à haute résolution et des images anatomiques CT ont été acquises. Pour l' analyse d'image, les images ont été fusionnées dans la vue coronale, sagittale et axiale à l'aide de tubes capillaires en verre contenant une petite quantité de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (figure 3A). VOI ont été établis sur les ganglions pulmonaires et périthymique sur les corrigée désintégration et images TEP normalisée pour calculer le pourcentage dose injectée par cm 3(Figure 3B).
Figure 3: PET / CT-co-enregistrement et d' analyse. (A) des images TEP et CT ont été co-enregistrées dans le logiciel d'analyse d'image. Si l'enregistrement automatique par le logiciel a échoué, les images ont été fusionnés en superposant les signaux TEP et CT de capillaires en verre (marqueurs), remplis de radioactivité et fixes sous le lit de l'animal. (B) VOI sont placés sur les signaux de PET corrigées et normalisées des ganglions perityhmic et pulmonaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
la migration des cellules Cova-TH1 a été suivi à la LN pulmonaire et périthymique comme sites de présentation Cova dans RSDT des voies respiratoires. In vivo signaux de PET deRived à partir de 64 cellules Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués Cova-TH1 étaient considérablement plus élevés que les signaux provenant de 64 cellules Cu-PTSM marqués (figure 4A). Les valeurs d'absorption cellulaire Cova-TH1 dans les ganglions pulmonaires et périthymique ont été significativement augmentés dans DTHR-malades par rapport aux animaux témoins non traités de la même portée (figure 4B).
Figure 4: Suivi Cova-TH1 cellulaire dans les voies respiratoires DTHR Modèle in vivo par TEP / CT. (A) respectives des images PET / CT de transfert adoptif des cellules Cova-TH1, qui ont été préalablement marquées avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou 64 Cu-PTSM, à des souris Cova-DTHR-malades ou non traités. Les cellules Cova-TH1 transférés hébergés au LNS pulmonaires et périthymique. (B) Analyse quantitative des sites de prise d'origine des cellules Cova-TH1 prouvé un h supérieurenant aux tissus enflammés (moyenne ± écart type; statistiques: test t de Student; * p <0,05, ** p <0,01). Le marquage à 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a prouvé une sensibilité plus élevée (augmentation% ID / cm 3) par rapport à 64 Cu-PTSM dans les différents sites de homing (moyenne ± écart type, statistiques: test t de Student; # p <0,05, ## p <0,01, ### p <0,001). Ce chiffre a été modifié de référence 16, 17. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole présente une méthode fiable et facile à radiomarquer de manière stable des cellules pour le suivi in vivo par TEP. En utilisant cette méthode, les cellules Cova-TH1, isolé et élargi in vitro à partir de souris donneuses, pourrait être radiomarqués avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et leur prise d' origine a été suivi pour les ganglions pulmonaires et périthymique en tant que sites de présentation dans une Cova Cova induite par DTHR des voies aériennes aiguës.
La modification du mAb avec le chélateur exige un travail rapide et efficace et l'utilisation de solutions ultra-pures, sans traces d'amines. Les solutions ont été traitées avec une résine échangeuse d'ions chélatante pour assurer une bonne conjugaison de l'ester actif NHS-DOTA en amine des résidus de l'anticorps monoclonal. Le mAb conjugué chélateur comme un marqueur radioactif intracellulaire a plusieurs avantages par rapport à l'utilisation d'agents de marquage des cellules non spécifiques. Tout d'abord, le mAb offre une excellente spécificité permettant l'étiquetage ciblé d'une population de cellules définie. le mAbelle-même est non cytotoxique et n'a aucun effet néfaste sur la viabilité ou la fonctionnalité des cellules. Ensuite, l'écoulement de la radioactivité des cellules a été réduit de manière significative l' amélioration du rapport signal-sur-fond des images PET 17, 24. En choisissant un mAb avec une spécificité différente, cette méthode est facilement cessible à d' autres populations de cellules d'intérêt tels que CD8 + TIL ou monocytes CD14 +. De plus, cette approche de marquage cellulaire peut être utilisé pour des études de suivi des cellules dans divers modèles animaux de maladies humaines inflammatoires (par exemple, l' arthrite rhumatoïde et l' asthme bronchique) ou des modèles animaux pour différents types de cancer humain. Cette méthode d'étiquetage, cependant, se limite à des récepteurs liés à la membrane ou des marqueurs de différenciations comme cibles depuis les mAb ne diffusent pas de manière passive à travers la membrane cellulaire. L'internalisation de l'activation induite par de la cible ou, simplement, la membrane-vient est avantageuse. UNEavidité élevée entre l'anticorps monoclonal et la cible, cependant, peut également être suffisante pour l' imagerie in vivo, peut - être avec un signal réduit de bruit de fond.
Le choix de DOTA comme chélateur de nos expériences a été basée sur les premiers travaux en utilisant 64 Cu 25. Toutefois, dans l'intervalle DOTA a été montré pour ne pas être un chélateur optimale pour cet isotope, conduisant à l' absorption d'activité assez élevé dans le foie par transchélation à la superoxyde dismutase 26. Bien que l' utilisation de l'anticorps radiomarqué pour le marquage in vitro de cellules qui sont ensuite transférés de manière adoptive devrait réduire le risque de libération 64 Cu et le transport vers le foie, les chélateurs modernes optimisés pour 64 Cu, comme le 1,4,7-triazacyclononane, l' acide 1-glutarique -4,7-acétique acide (NODAGA) ou de l' acide 1,4,7-triazacyclononane-triacétique (NOTA), peut être utilisé de préférence avec notre procédé pour améliorer encore la spécificité des données obtenues 27 64 Cu (par exemple le N-chlorosuccinimide (NCS)) ou d' autres isotopes, tels que 89 Zr (par exemple , de la desferrioxamine;. MPO).
Le choix de 64 Cu en tant que radio - isotope a été basée sur le fait que dans la migration cellulaire in vivo et la prise d' origine est un processus relativement lent par rapport à des changements métaboliques généralement imagée par PET. 64 Cu avec un temps de demi-vie de 12,7 h permet à l'imagerie répétée de la migration des cellules de plus de 48 h après l' injection. 64 Cu production, il est important d'utiliser des solutions de haute qualité sans ions métalliques de trace pour assurer la pureté de 64 Cu. En outre, la pureté de 64 Cu est de grande importance pour le radiomarquage du DOTA-mAb depuis les impuretés d'ions métalliques multivalents pourrait conduire à une activité spécifique réduite de la solution 64 Cu à des niveaux qui empêchent le radiomarquage de protéines et par conséquent l' imagerie. Bien que 64 Cu produit un sipourcentage de gnificant, d' électrons Auger cytotoxiques de haute énergie lorsque la décomposition 28, une dose ajustée de la radio - isotope est bien toléré par les cellules comme cela est représenté par des effets minimes sur la viabilité et la fonctionnalité et à faible induction de l' apoptose après le radiomarquage. Néanmoins, il est clairement recommandé de titrer d'abord la dose d'activité utilisée pour le marquage radioactif pour d'autres types de cellules et d'ajuster le protocole de radiomarquage. Rapide et facile dans les méthodes d'évaluation in vitro ont été démontrés dans le protocole, y compris la détermination de la viabilité par exclusion au bleu trypan et coloration avec du PE-Annexine V pour la détermination des fractions apoptotiques de cellules. Les deux méthodes sont relativement pas cher et utiliser l'équipement de laboratoire facilement accessibles. La combinaison de la coloration PE-annexine V avec un colorant pour la discrimination de cellules vivantes et mortes telles que la 7-aminoactinomycine D (7-AAD) permettrait la détermination de la viabilité et de l'apoptose dans une ste expérimentalep. Comme alternative pour évaluer la viabilité des cellules T marquées, un dosage 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT-) peuvent être utilisés pour évaluer l'activité métabolique cellulaire. L'évaluation de l'absorption et les valeurs efflux avec un calibrateur de dose et γ-contre sont plus avancés mais toujours rapide et pas cher pour atteindre depuis presque tous les laboratoires travaillant avec la radioactivité a le matériel respectif sur place. Le séquençage des gènes ou des méthodes à base de puces électroniques produiraient des données plus détaillées. Ces méthodes, cependant, ne sont pas toujours facilement accessibles, ont besoin des compétences appropriées et sont le plus souvent liés à des coûts plus élevés.
Bien que le PET ne peut pas parvenir à une résolution cellulaire comme les techniques d'imagerie microscopique 29, il offre une excellente sensibilité dans la gamme picomoles pour la détection de même un petit nombre de cellules dans les animaux ou les humains 8. Par rapport à d'autres techniques d'imagerie non invasives telles que opticaImagerie l, PET est quantitative, ne se limite pas à la profondeur de pénétration et fournit des images de haute qualité avec trois résolutions dimensions. La combinaison de la haute sensibilité du PET avec la précision anatomique du CT permet pour l'imagerie de haute précision de la migration des cellules. De plus, des données in vivo peuvent être facilement validés par plusieurs procédés ex vivo , y compris γ-comptage pour l' analyse de biodistribution. Autoradiographie de coupes cryogéniques et coloration histologique des coupes cryogéniques peut être recouvert d'une corrélation entre la carte d'activité autoradiographique avec les infiltrats de cellules immunitaires identifiées par hématoxyline et éosine.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant ainsi que Natalie Altmeyer pour le soutien lors de l'analyse des expériences et des données. Ce travail a été soutenu par Werner Siemens-Fondation, la DFG par le SFB685 (projet B6) et FORTUNE (2309-0-0).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | WKL | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitroevaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30 G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µL | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
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