Nach der Herstellung eines 64 Cu-modifizierte monoklonale Antikörperbindung an einem transgenen Maus - T - Zell - Rezeptor, sind T - Zellen radioaktiv markiert in vivo, analysiert auf ihre Lebensfähigkeit, Funktionalität, Etikettieren Stabilität und Apoptose und adoptiv transferiert in Mäuse mit einem Atemweg Allergien vom verzögerten Typ Reaktion zur nichtinvasiven Bildgebung durch Positronen-Emissions-Tomographie / Computertomographie (PET / CT).
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll stellt die Herstellung von 64 Cu und die Chelator Konjugation / radioaktive Markierung eines monoklonalen Antikörpers (mAb) , gefolgt von murine Lymphozyten - Zellkultur und 64 Cu-Antikörper - Rezeptor der Zellen abzielen. In - vitro - Bewertung der radioaktive Markierung und nicht-invasiven in vivo - Zellverfolgung in einem Tiermodell einer Atemwegs verzögerten Typ Überempfindlichkeitsreaktion (DTHR) von PET / CT beschrieben.
Im Detail wird die Konjugation eines mAb mit dem Chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) gezeigt. Nach der Herstellung von radioaktivem 64 Cu, radioaktiver Markierung der DOTA-konjugierten mAb beschrieben. Als nächstes werden die Erweiterung der Hühnerovalbumin (COVA) -spezifische CD4 + Interferon (IFN) -γ-produzierende T - Helferzellen (COVA-TH1) und die anschließende radioaktive Markierung der Cova-TH1 - Zellen dargestellt. Verschiedene in vitro - Techniken werden zur Veranschaulichung der ef auszuwertenkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf den Zellen, wie die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluß, die Färbung auf Apoptose mit Annexin V für die Durchflusszytometrie und die Beurteilung der Funktionalität , die durch IFN-γ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Darüber hinaus ist die Bestimmung der radioaktiven Aufnahme in die Zellen und die Markierungsstabilität im Detail beschrieben. Dieses Protokoll weiter beschrieben, wie Zell Tracking-Studien in einem Tiermodell für einen Atemweg DTHR und daher durchzuführen, die Induktion von COVA-induziertem akuten Atemweg DHTR in BALB / c-Mäusen ist enthalten. Schließlich ist eine robuste PET / CT-Workflow inklusive Bildaufnahme, Rekonstruktion und Analyse vorgestellt.
Der Cu-64 - Antikörper - Rezeptor - Targeting - Ansatz mit nachfolgender Rezeptor - Internalisierung hohe Spezifität und Stabilität, reduzierte zelluläre Toxizität bereitstellt, und niedrigen Efflux Raten im Vergleich zu herkömmlichem PET-Tracer für die Markierung von Zellen, beispielsweise 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazon) (64-PTSM Cu). Schließlich ermöglicht unser Ansatz nicht-invasive in vivo Zellverfolgung durch PET / CT mit einem optimalen Signal-Rausch - Verhältnis für 48 Stunden. Dieser experimentelle Ansatz kann auf verschiedenen Tiermodellen und Zelltypen mit membrangebundenen Rezeptoren übertragen werden, die internalisiert werden.
Einleitung
Nicht-invasive Zellverfolgung ist ein vielseitiges Werkzeug , Zellfunktion, Migration und Homing in vivo zu überwachen. Recent Zellverfolgung Studien haben sich auf mesenchymale 1, 2 oder Knochenmark stammende Stammzellen 3 im Rahmen der regenerativen Medizin, autologem peripherer weißer Blutzellen in einer Entzündung oder T - Lymphozyten in adoptiven Zelltherapien gegen Krebs 3, 4 konzentriert. Die Aufklärung der Wirkorte und die zugrunde liegenden biologischen Prinzipien der zellbasierten Therapien ist von großer Bed....
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Protokoll
Sicherheitshinweise: Bei der Radioaktivität Handhabung speichern 64 Cu hinter 2-Zoll dicken Bleiziegel und verwenden entsprechende Abschirmung für alle Schiffe , die Aktivität. Verwenden Sie geeignete Werkzeuge, um indirekt ungeschirmte Quellen verarbeiten zu direkten Handkontakt zu vermeiden und minimieren Exposition gegenüber radioaktivem Material. Tragen Sie immer Strahlendosimetrie Überwachung Abzeichen und persönliche Schutzausrüstung und prüfen Sie sich selbst und der Arbeitsbereich für Kontamination unverzüglich es zu adressieren. Entsorgen Sie möglicherweise kontaminierte persönliche Schutzausrüstung vor dem Verlassen den Bereichs, in dem radioakti....
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Ergebnisse
Abbildung 1 fasst die Etikettierung von COVA TH1-Zellen mit dem 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und der Versuchsplan für die in - vitro- und in - vivo - Studien in diesem Protokoll.
Abbildung 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb Etikettiervorgang & Experimentelles Design. .......
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Diskussion
Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige und einfache Methode zum stabilen Zellen für in vivo - Tracking von PET radioaktive Markierung. Unter Verwendung dieses Verfahrens COVA-TH1 - Zellen, isoliert und in vitro aus Spendermäusen erweitert, könnte mit 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und dessen homing wurde in einem die pulmonalen und perithymic LNs als Gebiete von COVA Präsentation nachgeführt radiomarkiert wird COVA-induzierten akuten Atemweg DTHR.
Die Modifikation des .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant sowie Natalie Altmeyer für die Unterstützung während der Experimente und Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung, die DFG durch den SFB685 (Projekt B6) und Fortuné (2309-0-0) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Deutschland | 1.00318< | sup>64Cu Herstellung |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Deutschland | 1.06007 | 64Cu Herstellung |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Deutschland | 1.0104 | 64Cu Herstellung |
| Pt/Ir (90/10) Platte | & Ouml; gussa | Sonderanfertigung | 64Cu Herstellung |
| PEEK Kammer | WKL | Sonderanfertigung | 64Cu Produktion |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu Herstellung | |
| Polygramm SIL G/UV 254 Platte | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu Herstellung |
| Ionenaustausch Ionenaustausch Säule | BioRad | AG1-X8 | 64Cu Herstellung |
| Festkörper-Target-System für PETtrace | WKL | customum made | 64Cu production |
| 64Cu Aufarbeitungsmodul | WKL | customum made | 64Cu Herstellung |
| Dosiskalibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace Zyklotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Makrozyklika | B-280 | DOTA-Konjugation |
| Anti-cOVA-TCR-Antikörper (KJ1-26) | Isoliert aus Hybridom-Zellkultur | DOTA-Konjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-Konjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-Konjugation |
| Amicon Ultra-15 Filtereinheit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-Konjugation |
| Rotipuran Reinstwasser | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-Konjugation |
| Ammoniumacetat | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-Konjugation |
| PBS | Universität Tübingen | DOTA-Konjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 Säule | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-Konjugation |
| Natriumcitrat | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-Konjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-Konjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | Zutat für T-Zell-Medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | Inhaltsstoff für T-Zell-Medium |
| Natriumpyruvat | Merck Millipore | L0473 | Inhaltsstoff für T-Zell-Medium |
| MEM-Aminosäuren | Merck Millipore | K0293 | Inhaltsstoff für T-Zell-Medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | Inhaltsstoff für T-Zell-Medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | Inhaltsstoff für T-Zell-Medium |
| 0,05 mM 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Inhaltsstoff für T-Zell-Medium |
| DO11.10 Mäuse | Inhouse-Züchtung | TH1 Zellkultur | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 Zellkultur |
| Zellsieb 40 µ M | Corning | 352340 | TH1 Zellkultur |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 Zellkultur |
| CD4 MicroBeads, Maus | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 Zellkultur |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 Zellkultur |
| LS Säule | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 Zellkultur |
| Anti-CD4-Antikörper (Gk1.5) | Isoliert aus Hybridom-Zellkultur | TH1-Zellkultur-Anti-CD8-Antikörper | |
| (5367.2) | Isoliert aus Hybridom-Zellkultur | TH1-Zellkultur | |
| Anti-Ratten-Antikörper (MAR18.5) | Isoliert aus Hybridom-Zellkultur | TH1-Zellkultur | |
| Kaninchen-Komplementär MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1-Zellkultur |
| Anti-IL-4 Antikörper (11B11) | Isoliert aus einer Hybridom-Zellkultur | TH1-Zellkultur | |
| cOVA 323-339-peptid | EMV-micro-collections | Sonderanfertigung | TH1 Zellkultur |
| CPG1668-Oligonukleotide | Eurofins MWG Operon | Sonderanfertigung | TH1 Zellkultur |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 Zellkultur |
| 96-Well-Platten | Greiner | 655180 | TH1 Zellkultur |
| 24-Well-Platten | Greiner | 662160 | TH1 |
| Zellkultur-Zellkulturflasche | Greiner | 660175 | TH1-Zellkultur |
| 48-Well-Platten | Greiner | 677 180 | Zellmarkierung |
| Gammacell 1000 | Beste Theratronics | via Anfrage | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via Anfrage | |
| Trypanblau | Merck Millipore | L6323 | in vitro Auswertung |
| Maus IFN-& gamma ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro Bewertung |
| PE Annexin V Apoptose-Nachweiskit | BD Biosciences | 559763 | in vitro Bewertung |
| Röhrchen 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro Bewertung |
| Röhrchen mit rundem Boden | BD Biosciences | 352008 | in vitro Auswertung |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro Auswertung |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro Auswertung |
| Mikroskop | Leica | via Anfrage | in vitro Auswertung |
| BD LSRII | BD Biosciences | via Anfrage | in vitroAuswertung |
| BALB/c Mäuse | Charles River | 028 | in vivo Zelltransport |
| Aluminiumgel | Serva Elektrophorese | 12261.01 | in vivo Zellhandel |
| Xylazin | Bayer HealthCare | Bestellt via Universitätsklinikum | in vivo Zellhandel |
| Ketamin | Ratiopharm | Bestellt via Universitätsklinik | in vivo Zelltransport |
| Isofluran | CP-Pharma | Bestellt via Universitätsklinikum | in vivo Zelltransport |
| 30 G Nadel | BD Biosciences | 304000 | in vivo Zellhandel Spritze |
| BD Biosciences | 11612491 | in vivo Zelltransport | |
| Kapillaren 10 & Mikro; L | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET-Scanner | Siemens Healthineers | nicht mehr lieferbar | in vivo Zellhandel, alternative Firmen: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT-Scanner | Siemens Healthineers | nicht mehr lieferbar | in vivo Zellhandel |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | Bildanalyse, alternative Software: Pmod |
Referenzen
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
