Summary
生存能力、機能、ラベリング安定性およびアポトーシスについて分析し、そして養子気道遅延型過敏症を有するマウスに移し、トランスジェニックマウスのT細胞受容体に結合する64のCu修飾モノクローナル抗体の調製後、T細胞は、in vivoで放射性標識されています陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影法（PET / CT）によって非侵襲的イメージングのための反応。
Abstract
このプロトコルは、64 Cuおよびマウスリンパ球細胞培養および細胞の標的64のCu-抗体受容体続いモノクローナル抗体（mAb）のキレート剤結合体/放射性標識の製造を示します。 PET / CTによって過敏反応（DTHR）型遅延気道の動物モデルにおけるインビボ細胞追跡における放射性標識および非侵襲性のインビトロ評価に記載されています。
詳細には、キレート剤1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA）とのmAbの結合が示されています。放射性64のCuの製造以下、DOTA共役mAbの放射性標識が記載されています。次に、ニワトリオボアルブミンの膨張（コバ）特異的CD4 +インターフェロン（IFN）-γを産生するTヘルパー細胞（コバ-TH1）とコバ-TH1細胞のその後の放射標識が示されています。様々なインビトロ技術は、EFを評価するために提示されていますフローサイトメトリーのために、トリパンブルー排除により、細胞生存率の決意のような細胞上の64のCu-放射標識のfects、アネキシンVとアポトーシスの染色、およびIFN-γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）による機能の評価。さらに、細胞内への放射性取り込みおよび標識安定性の決意は、詳細に記載されています。このプロトコルは、更に、従って、BALB / cマウスにおけるコバ誘発性急性気道DHTRの誘導が含まれる、気道DTHRの動物モデルにおける細胞追跡研究を実行する方法について説明します。最後に、画像収集、再建、および分析を含む強固なPET / CTのワークフローが提示されます。
その後の受容体内在64のCu-抗体受容体標的化アプローチは、細胞標識のための一般的なPET-トレーサーと比較して高い特異性および安定性、低下細胞毒性、及び低い流出速度を提供し、例えば 64銅-pyruvaldehydeビス（N4メチルチオ）（64のCu-PTSM）。最後に、我々のアプローチは、48時間、最適な信号対バックグラウンド比PET / CTによってインビボ細胞追跡に非侵襲可能。この実験的アプローチは、内在化された膜結合型受容体とは異なる動物モデルおよび細胞型に転送することができます。
Introduction
非侵襲性細胞の追跡は、in vivoで細胞機能、遊走及びホーミングを監視するための多目的なツールです。最近の細胞追跡研究は再生医療、がん3、4に対する養子細胞療法における炎症またはTリンパ球における自己末梢白血球の文脈では、間葉系1、2または骨髄由来幹細胞3に焦点を当てています。作用部位および細胞ベースの治療の基本的な生物学的原則の解明は途方もない重要です。 CD8 +細胞傷害性Tリンパ球、遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（CAR）T細胞または腫瘍浸潤リンパ球（TILを）が広くゴールドスタンダードと考えられました。しかしながら、腫瘍関連抗原特異的Th1細胞は、<、有効な代替治療選択肢4であることが証明されています/ SUP> 5、6、7。
炎症におけるキープレーヤー、器官特異的自己免疫疾患（ 例えば 、慢性関節リウマチや気管支喘息）、および癌免疫療法における関心の高い細胞としては、TH1細胞の時間的分布とホーミングパターンを特徴付けることが重要です。 PETによる非侵襲性インビボイメージングは、in vivoホーミングにおいて 、細胞遊走パターンを調べるために、定量的、高感度法8を提示し、炎症、アレルギー、感染または腫瘍拒絶9、10、11の間にT細胞作用および応答の部位。
臨床的には、インオキシン111は 、2-デオキシ-2-（18ながら、炎症及び感染12の識別のための白血球シンチグラフィーのために使用されますF）フルオロ-D-グルコース（18 F-FDG）は、一般にPET 3,13によって細胞追跡研究のために使用されます。このPETトレーサーの1つの主要な欠点は、しかし、109.7分で放射性核種18 Fと後の時点でイメージングは養子細胞移入を投稿妨げ低細胞内安定性の半減期が短いです。細胞中で不安定であるがPETによるインビボ細胞追跡研究における長期のために、64のCu-PTSMは、しばしば非特異的T細胞生存率に対する最小に有害な影響を有するセル14、15をラベル16を機能するために使用されます。
このプロトコルは、さらに、T細胞受容体（TCR）に特異的な放射性標識モノクローナル抗体を用いて細胞生存率および機能に不利な影響を低減する方法が記載されています。まず、放射性同位体64にCu、THとのmAb KJ1-26のコンジュゲートの製造Eキレート剤DOTA、およびそれに続く64のCu-放射標識が示されています。第二ステップでは、単離およびDO11.10ドナーマウスのコバ-TH1細胞の増殖及び64のCu-ロードDOTA-結合mAb KJ1-26（64のCu-DOTA-KJ1-26）による放射性標識は、詳細に記載されています。それぞれ線量キャリブレータを有するとγカウンティングによる取り込み値と放射能の流出の評価、ならびにIFN-γELISAでトリパンブルー排除および機能によって細胞生存率に対して64のCu-放射標識の効果の評価が提示されます。 インビボ細胞追跡に非侵襲のために、養子細胞移入後のPET / CTによるコバ誘発性急性気道DTHRと画像取得のマウスモデルの誘発が記載されています。
また、この標識アプローチは、異なる疾患モデル、別のTCR又は膜結合受容体又は発現MARを関心のある一般的な細胞とマウスT細胞に伝達することができますKERSは、連続膜17を往復の基礎となります。
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Protocol
安全上のご注意：2インチ厚の鉛レンガの後ろの放射能、店舗64にCuを処理し、活動を運ぶすべての船舶のためのそれぞれのシールドを使用します。間接的に直接手で直接触れることは避け、放射性物質への暴露を最小限にするためにシールドされていないソースを処理するために適切なツールを使用してください。常に放射線線量測定モニタリングバッジや個人用保護具を着用し、自分自身をチェックし、汚染の作業領域は、すぐにそれに対処します。前放射性物質が使用されているエリアを残すに汚染された可能性個人用保護具を捨てます。放射性64 Cuは十分な処分前（約10半減期= 127時間）に減衰するまでのリードシールドの後ろに全体の放射性廃棄物を格納します。
1. 64銅生産
注：64 Cuを64のNi（P、N）PETtを用いて64 Cuの核反応を介して生成される放射性同位体マッカーシーらの改変プロトコールに従ってレースサイクロトロン。 18。
- 64銅の生産のために、12.4 MeV級の陽子ビームを6時間30μAで、白金/イリジウム板上に電気めっきされる64のNi、（90/10）を照射します。
- 専用ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）チャンバー内で100°Cに白金/イリジウムターゲットを加熱して64のCu / 64ニッケルを溶解するために20分間の濃HCl 2mLにインキュベートします。
- 濃HClの別の1 mLを加え、10分間インキュベートします。
- アルゴンの流れを利用してのHClを蒸発させ、室温にチャンバを冷却します。
- 3 4％0.2 MのHClのmLおよび96％メタノール（v / v）を用いてチャンバを洗浄し、少なくとも15分間、メタノール中4％0.2 M HClで予め調整したイオン交換カラムにこの溶液を移します。フロースルー64のNiをリサイクルするために使用することができます。
- 64 Cuは4％0.2 M HClで私とカラムに保持洗いますn個のメタノール。
- 収集バイアル中に70％1.3 MのHCl / 30％イソプロパノール（v / v）を用いて64のCuが溶出、アルゴン気流中で溶液を蒸発させ、室温までバイアルを冷まします。
- 0.1 M HClを140から210μLで64のCuを溶解します。
DOTA 2.抗体のコンジュゲーションおよびその後の64のCu-放射標識
注：キレート剤は、DOTAは、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル化学によりmAbの官能アミノ基に連結され、複合体は、その後、64銅19で放射性標識されるであろう。
- 8 mg / mlとし、1.2グラム分子量カットオフを使用してキレートイオン交換樹脂/ L（で処理し、0.1MのNa 2 HPO 4 pHが7.5に対するmAb溶液のダイアフィルトレーション1mlにKJ1-26-mAbの濃度を調整しますMWCO 30 kDaの）遠心分離フィルターユニット。緩衝液14 mLで3つの後続の洗浄工程を適用します。最終洗浄工程の後、1 mLに再び溶液を濃縮。 OD 280nmの測定により抗体濃度を定量化します。
- 使用直前に10mg / mLの濃度で超高純度でDOTA-NHS溶液またはPCRグレードの水を準備します。バイアルは水の凝縮を避けるために、開口部の前に室温に調整し、かつ慎重にプラスチック製のヘラを使用してDOTA-NHSを削除してみましょう。 、ダイアフィルトレーションKJ1-26-MAb溶液の8 mgのこのDOTA-NHS溶液の216μLを加える十分に混合し、タンブルミキサー上で4℃で24時間インキュベートします。
- 分子量カットオフ（MWCO 30 kDaの）遠心フィルターユニットを用いて、キレートイオン交換樹脂を1.2g / Lので処理し、0.25M酢酸アンモニウム、pHは7.0、に対してDOTA-KJ1-26-のmAbをダイアフィルトレート。 7回の洗浄工程を適用します。 1 mLの最終体積に対するmAbを濃縮し、再度のOD 280nmの測定によってタンパク質濃度を測定します。
- 放射性標識の前に、サイズEXC を介して PBSにDOTA-KJ1-26-mAbのバッファを交換ゲル濾過カラムを用いてlusionクロマトグラフィー。これはまた、潜在的な小分子の不純物を除去します。
- 10mMのHCl中100 MBqの64のCuCl 2溶液を調製し、10×PBSを用いてpHを6〜7に調整します。 DOTA-KJ1-26-mAbの200μgのを追加します。 37℃で60分間インキュベートします。
- 品質管理のために、移動相として0.1 Mクエン酸ナトリウム（pHは5）で薄層クロマトグラフィーを実行し、オートラジオグラフィーにより分析します。活性の少なくとも90％が抗体に結合しなければならないので、出発地点で検出します。非結合活性は溶媒先端にクエン酸ベースの移動相および筋によってキレート化されます。参考のために、64のCuCl 2を使用することが勧められます。
3.ニワトリオボアルブミン特異的Th1（コバ-TH1）細胞の単離および拡張
注：TH1細胞の培養は、以前発表された研究16、17に従って記述されています。
- DO11.10マウスから脾臓及び腹膜外リンパ節（LNS）を単離します。
- 連邦政府の規制に従ってマウスを生け贄に捧げます。 70％エタノールで動物を駆除し、脾臓とLNSの除去のために粘着テープで固定させます。正中切開を作成し、横方向に各サイトにそれを引っ張って腹膜から皮膚を分離。
- 子宮頸、軸、上腕および鼠径部のLNを探します。鈍鉗子でそれらを削除し、1％ウシ胎児血清（FCS）/ PBSバッファーでそれらを置きます。
- 腹膜を開き、脾臓を検索します。膵臓および結合組織から脾臓を分離し、1％FCS / PBS緩衝液中に置き。さらにガイダンスについては、参考文献20,21を参照してください。
- 50mlに40μmのフィルターを通してミンチ脾臓とLNSは、シリンジのプランジャーを用いてキャップチューブスクリュー。 10mLの1％FCS / PBS緩衝液でフィルターをすすぎます。
- 5分間400×gで遠心分離し、上清を除去します。 SubsequenTLY、室温で5分間アンモニウム塩化カリウム（ACK）溶解緩衝液（ドナー動物あたり1.5 ml）を添加することにより赤血球の溶解を行います。 （ドナー動物当たり）8.5 mLを1％FCS / PBS緩衝液を加えます。
- 5分間400×gで細胞を遠心分離し、上清を除去します。 、10mLの1％FCS / PBS緩衝液で細胞を洗浄し、5分間400×gで遠心分離し、上清を除去します。
- 磁気細胞分離のために、1％FCS / PBS緩衝液で細胞を再懸濁し、CD4 +マイクロビーズを加えます。バッファボリュームおよび使用するCD4 +マイクロビーズの量については、製造元の説明書を参照。
- 4℃で20分間インキュベートします。次いで、1％FCS / 50 mlまでPBS緩衝液、遠心分離5分間400×gで細胞を追加し、そして上清を除去します。
- 製造業者のプロトコルに従って商用の磁気分離カラムを用いてCD4 + T細胞単離及び各マグネットスタンドを続けます。共に溶出したCD4 + T細胞を調節します10個の6細胞を10％熱不活性化FCS、2.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％HEPES緩衝液、1％MEMアミノ酸、1％ピルビン酸ナトリウム、および0.2％2-メルカプトエタノール及びストアとダルベッコ変法イーグル培地中/ mLでのncentration 4°Cでそれら。
- 抗原提示細胞（APC）を調製し、50mLのスクリューキャップチューブにカラム放電を集めます。 5分間400×gでカラム放電を遠心分離し、上清を除去します。
- 、を10μg/ mLの抗CD8（クローン：5367.2）を10μg/ mLの抗CD4（GK1.5クローン）を追加および10μg/ mlのマウス抗ラットモノクローナル抗体（MAR18.5）及び1.5 mLのウサギ補体。 37°Cで45分間インキュベートします。
- 、5分間400×gで細胞を遠心分離し、上清を除去し、3mLの培地を加えます。合計30 Gyを有するγ線又はX線源でAPCを照射します。その後、5×10 6細胞/ mLの濃度になるようにAPCを調節します。
- 96ウェルPLAにCD4 + T細胞の100μLを加え、APCの100μLTE一緒に10μg/ ムル・コバ 323-339ペプチドを10μg/ mLの抗IL-4 mAbを、0.3μMのCPG1668オリゴヌクレオチド及び5 U / mLのIL-2を有します。
- 一日おきに50 U / mLのIL-2を追加します。 3後 - 4日間、24ウェルプレートに96ウェルプレートから細胞を移します。 24ウェルプレートに1つのウェルで96ウェルプレートから3-5ウェルを組み合わせます。 1：1の比で100 U / mLのIL-2含有培地を加えます。
- さらに2-3日後、175cm 2の細胞培養フラスコ（フラスコ当たり1×48ウェルプレート）を48ウェルプレートから細胞を移します。 1：1の比率で媒体を記入してください。一日おきに50 U / mLのIL-2を追加します。
- 細胞密度に従って細胞を分割し、一日おきに50 U / mLのIL-2を追加します。このように、別の10日間の培養細胞を。
4. COVA-Th1細胞放射性標識
注：64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbは細胞内の放射性ラベル付けを可能にするために、培養コヴァ-TH1細胞に適用されます。
- COVA-TH1 CE用LLの放射標識は、投与量キャリブレータを使用してデッドボリュームずに注射器で放射性標識された64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbの37 MBqのを描きます。 37 MBqの/ mL溶液を受信するために1 mLの生理食塩水を加えます。
- 2×10 6細胞/ mLで培地中コバ-TH1細胞を懸濁し、48ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液0.5 mLを加え。
- 48ウェルプレートの各ウェルに、新たに調製した37 MBqの/ mLの64のCu-DOTA-KJ1-26-MAb溶液の20μLを加えます。標識のための最終的な比率は、520μLの容量において10 6個の細胞あたり0.7 MBqです。 37℃で30分間インキュベートし、7.5％CO 2。
- インキュベーション後、注意深く各ウェル中の細胞を再懸濁し、50mlに48ウェルプレートから細胞懸濁液を転送キャップチューブスクリュー。細胞の損失を最小限にするために、予め温めた培地を各ウェルをリンスします。
- 、5分間400×gでコバ-TH1細胞懸濁液を遠心し、上清を捨て、そしてmLのPBSを予熱10で細胞を再懸濁します。 Aを削除します細胞計数のための細胞懸濁液のliquot。洗浄工程を繰り返します。
- トリパンブルー染色と適切な希釈で実行可能なコヴァ-TH1細胞を数えます。
- 5×10 7細胞に細胞濃度を調整/ mLの200μLのPBS中の10個の7細胞の腹腔内（ip）注射しました。
- 繰り返しますが、 例えば 、活動の量の増加に伴って1.4 MBqのか、10個の6細胞あたり2.1 MBqでのコヴァ-TH1細胞を放射標識するために4.3から4.5を繰り返します。
- 10 6個の細胞あたり1.4 MBqので細胞を放射標識するために、10個の6細胞あたり2.1 MBqので放射標識37 MBqの/ mLの64のCu-DOTA-KJ1-26-MAb溶液および60μLの40μLを使用します。ステップを0.7 MBqの、1.4 MBqの2.1 MBqの64のCu-PTSMと4.3から4.7までを実行するが、比較検討のために17 3 hに標識時間を増加させます。
- 活動の最適量を決定するためにステップ5に進みます。
COVA-TH1細胞に対する放射性標識の効果のin vitro評価5.
注：TH1細胞に対する放射性標識の影響の特性をIFN-γELISAの機能評価およびアポトーシス16、17を誘導するためのPE-アネキシンV染色のために、生存率をトリパンブルー排除アッセイを介して行われます。細胞内取り込みや放射能の流出の決意は、以下に説明されます。比較として、64のCu-PTSM標識コバ-TH1細胞を使用することもできます。
- トリパンブルー排除による生存率に及ぼす影響
- 2×10 6細胞/ mLの濃度になるように、それぞれ0.7 MBqの/ 10 6細胞を、1.4 MBqの/ 10 6細胞および2.1 MBqの/ 10 6細胞で放射性標識は、少なくとも18×10 6コバ-TH1細胞を調整し、5.1の手順を実行します。各アクティビティの用量のために2-5.1.7。非radioactiを使用しますKJ1-26-mAbは対照としてコバ-TH1細胞と非標識コバ-TH1細胞を標識しまし。
- 24ウェルプレートの9つのウェルに細胞溶液のピペットで1 mLです。
- 、3本の別々の15mLのスクリューキャップチューブに初期放射性標識した後、3時間を3つのウェルのコンテンツを集めます。
- 細胞の損失を最小化し、それぞれ15 mLに媒体を追加するために、予め温めておいた培地を空のウェルをすすぎステップ5.1.3からキャップチューブスクリュー。
- 5分間400×gで15 mLの試験管を遠心分離し、予め温めておいた培地1mLに得られた細胞ペレットを再懸濁します。
- 各15 mLチューブに対して別々にトリパンブルー中の生細胞および死細胞の両方をカウントし、生存細胞の割合を計算します。
- 繰り返し5.1.3-5.1.6 24および48時間後に64のCu-DOTA-KJ1-26-モノクローナル抗体の放射性標識ステップ。
- IFN-γELISAにより決定した機能への影響
注：IFN-γproductio上の64のCu-DOTA-KJ1 26-のmAb放射性標識の効果を評価するために、N機能のマーカーとして、商業的供給業者からのIFN-γELISAを実行し、詳細については17を参照する参照。- 96ウェルプレート上の培地100μL中に10個の5生存細胞、0.7 MBqの、1.4 MBqの又は2.1 MBqのとコバ-TH1細胞の3時間後に64のCu-DOTA-KJ1-26の放射性標識を分散させます。対照として非標識、非放射性KJ1-26-mAbを標識又は64のCu-PTSM標識コバ-TH1細胞を用います。
- 100でコバペプチドを10μg/ mLの、5 U / mLのIL-2及び5×10 5のAPCと100μL培地において10 5 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞におけるIFN-γ産生を刺激します37℃で24時間、培地、7.5％CO 2のμL。さらなるコントロールは、コバのペプチドを添加することなく、他の条件であってもよいです。
- 製造元の指示に従ってELISAによって上清を分析します。
- 繰り返しステップ5.2.2。 5.2.3へ。標識手順後24および48時間で。
- フローサイトメトリー用にPE-アネキシンV染色によって決定アポトーシスの誘導
注：細胞膜上のホスファチジルセリン博覧会のためにアネキシンVで染色する前に、製造業者の説明書に従って、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbでの放射性標識によるアポトーシス誘導を評価するため、フローサイトメトリーのための市販のキットを使用して、細胞試料を調製するために。- 3、24及び48時間後に64コバ-TH1細胞のCu-DOTA-KJ1-26-mAbでの放射性標識、と少なくとも10 6 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞と染色三連でアネキシンVキットメーカーの指示に従って、次の時間以内に分析します。対照として、非放射性KJ1-26-mAbで標識した、64のCu-PTSM標識および非標識コバ-TH1細胞を用います。詳細は17を参照するために参照してください。
- 取り込みおよび流出
注：64のCu-DOTA-の取り込みKJ1-26-mAbの細胞への用量キャリブレーターで測定された放射能の排出は、γ-計数アッセイ0で測定され、5、24、及び放射性標識の48時間後。- 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞、それぞれの上清および洗浄工程のために10γ計数管各々を準備します。
- 直接放射性標識後10γ計数管のそれぞれに転送10 6 64培地1mL中のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞。放射性標識後の時間点5、24及び48時間のそれぞれについて、37℃インキュベーター中、24ウェル細胞培養プレート上の培地中で少なくとも10 7 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞を維持します℃、7.5％CO 2。
- 5分間400×gでγ計数管を遠心し、10新規γ計数管に上清を移します。
- 64のCu-DOTA-KJ1-26-のmAb ANの非結合画分を除去するために、1mLの培地中で細胞を1回洗浄10新γ計数管に上清を回収dは。
- コバ-TH1細胞に1mLの新たな培地を追加し、ドーズキャリブレータにおける初期取り込み値を決定します。管はまた、37℃でインキュベーター、7.5％CO 2に格納することができます。
- 繰り返しは、製造業者のプロトコルに従ってγカウンターですべての管を5、24および48時間後5.4.5および5.4.2測定するステップ。放射性崩壊のために及び定量分析を補正するために、放射能の定義された用量で標準を使用します。
6. OVA誘発性急性気道DTHR
注：炎症の部位への移行の動力学及び養子移入及び放射性標識コバ-TH1細胞のホーミングパターンはコバ誘発性気道DTHR 16、17の動物モデルで可視化し、定量化します。
- 150μLアルの混合物を腹腔 8週齢のBALB / cマウスを注入しますuminumゲル/ 50μLコバ溶液（50μLのPBS中10μg）を、マウスを免疫します。
- 二週間の免疫化後、 腹腔内注射により100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンでマウスを麻酔。彼らの背中に実験用マウスを置き、ゆっくりと動物の鼻孔に50μLのPBSに溶解した100μgののCOVAをピペット。動物が落下して溶液のドロップを吸入します。
- 24時間後に繰り返します。強い気道DTHRの誘導のために、48時間後に再度繰り返します。
- 転送コバ-TH1細胞の特異的遊走を分析するために、七面鳥、または対照としてキジ-OVAと気道DTHRを誘導します。そのため、繰り返しは、それぞれのOVAタンパク質を使用して6.1から6.3を繰り返します。
PET / CTを使用したin vivoイメージング7.
注：64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-DTHR罹患マウスにおけるコバ-TH1細胞およびコントロール同腹子のインビボイメージングにおいて特定のホーミングおよびMIを実証COVA-TH1細胞のgrationダイナミクス。したがって、静的PETスキャンを獲得し、解剖学的CTを順次3、24及び48時間後養子細胞移入を走査します。
- 直接放射性標識した後、200μLで10個の7細胞の腹腔内注射のために、5×10 7細胞/ mLに64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞を調節します。
- 1mlシリンジと30ゲージ針を使用して、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞懸濁液200μLを描画し、細胞を4との間のコバ-DTHR罹患動物に腹腔注射目と5 回目の乳首。放射能の総注入量を決定するために、注射前後の用量キャリブレーターでシリンジを測定します。
- 温度制御された麻酔ボックスで100％酸素中の1.5％イソフルランを用いて、マウス、前所望の取り込み時間に10分を麻酔（0.7リットル/分の流量）。
- 一方、共同登録を容易にするために、画像分析中PETとCT画像のうち、64のCu-DOTA-KJ1-26-MAb溶液またはマウスベッドの下自由64のCuCl 2溶液を含有するガラスキャピラリーを固定します。
- したがって、0.37 MBqの/ mlの溶液を調製し、この溶液10μLの容量でガラスキャピラリーを満たします。細胞由来の放射能信号は本質的に弱いので、マーカーは、マウスにおける細胞由来の信号に干渉していないことを確認するために活動を大量に使用しないでください。
- 外科公差に達した後、後肢のペダル引っ込め反射の喪失によって示されるように、麻酔を維持するための適切な配管システムを備えたPET-CTと互換小動物床にマウスを転送します。
- 綿棒や手術用テープを使用した小動物のベッドの上でマウスを固定します。目の乾燥を防ぐために眼軟膏を適用します。
- focuと視野の中心、PETスキャナにマウスベッドを転送します肺のS及び350から650 keVのエネルギーウィンドウで20分間静的PETスキャンを取得します。
- CTスキャナにマウスのベッドを転送します。スカウトビューを経由して、肺に視野を中央に配置します。 350ミリ秒の露出時間で「ステップと撮影」モードで360°回転する間に360個の突起を介して平面CT画像を取得し、因子4ビニング。
8.画像解析
- 75ミクロンの画素サイズを有する3D画像に統計的反復順序付けサブセット期待値最大化（OSEM）2DアルゴリズムとCTスキャンを適用することにより、PETリストモードデータを再構成します。
- 適切な画像解析ソフトウェア（ 例えば Inveon研究職場やPMOD）の画像の同時登録のために、自動コ登録ツールを使用します。これが失敗した場合、軸方向、冠状および矢状ビューで空間的に再構成しPETとCTの画像を一緒に登録するガイダンスとして、マウスのベッドの下にガラスキャピラリーを使用します。
- PET画像を修正12.7時間後に放射性崩壊法と放射性核種64のCuのハーフタイムを使用して放射性崩壊のために。画像正規化のために、参照として一つの画像（A）を選択し、それぞれの画像解析ソフトウェアでの画像表示の輝度を調整します。
- （（注入活性（X）/注入アクティビティだけ参照画像（A）、注入された活性（A）と他の画像（X）のための注入活性について設定された値を利用して、以下の式を使用して他の画像を正規化A））×強度値（A）。
- 肺およびperithymicのLNの正規化されたPET信号に関心のある3Dボリューム（VOI）を描きます。
- 以下の式を用いてcm 3の率（％ID / cm 3）をあたりのパーセンテージ注入用量を決定する：（マウスにおけるVOI /全体的な活性の活性を意味する）参照22、23を参照して、画像解析に関するさらなるガイダンスについて×100。
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Representative Results
図1は、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbおよびインビトロおよびこのプロトコルで覆われたインビボ研究の実験設計とコバ-TH1細胞の標識を要約します。
図1：64のCu-DOTA-KJ1-26-モノクローナル抗体ラベリング処理＆実験デザイン。 （A）64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbによる放射性細胞標識の略図。 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbがTH1細胞の細胞表面上のコバ-TCR受容体に結合し、24時間以内受容体内在化されます。コバ-TCRは、放射性標識の24時間後に再発現されます。 （B）CD4 + T細胞を、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbのインビトロで、単離された拡張および放射性標識しました。取り込みおよび流出値WEReは投与量キャリブレータおよびγ計数によって決定します。細胞生存率に対する放射性抗体の効果は、IFN-γELISAと機能上、およびフィコエリトリン（PE）-Annexin V染色でアポトーシスの誘導に、トリパンブルー染色を用いて評価しました。 （C）コバ気道DHTR雌BALB / cマウスにおいて誘導しました。 10 7 TH1細胞は、養子直接放射標識後コバ気道DHTR罹患動物に移しました。 PET / CT画像は3、24及び48時間後に養子細胞移入を取得しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbでのTh1細胞の成功した細胞内標識は免疫組織化学（ 図2A）によって確認しました。 64のCu-DOTA-KJ1-26抗体（緑）と共局在しました細胞膜におけるmAbの信号は、24時間（黄色）にのみ微弱であった放射性標識後の細胞膜3時間でCD3、。放射性標識後48時間で、64のCu-DOTA-KJ1-26-TCR複合体は、TH1細胞の細胞質に強い信号とエンドサイトーシスを介して内在化しました。 1.4 MBqの2.1 MBqの64の高用量は、Cu-DOTA-KJ1-26-mAbは、より顕著な効果を有していたわずか8％のTH1細胞の生存率を低下させた0.7 MBqでの適用放射性用量。 64のCu-PTSM、しかし、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbの有意な利点は観察されなかった（ 図2B）で放射性標識に比べ。 64のCu-PTSM標識TH1と比較して、IFN-γ分泌（ 図2C）、放射能の減少流出（ 図2D）、およびアポトーシスの減少誘導（ 図2E）によって示されるように64のCu-抗体放射性標識細胞は、機能的にはほとんど損失を示しました細胞。
図2：64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbによる放射性Th1細胞標識のin vitro評価。 （この図は、基準17から変更されている）最初の標識後24時間以内に、（A）共焦点顕微鏡は、コバ-TH1細胞（赤血球膜）64のCu-DOTA-KJ1-26-モノクローナル抗体（緑色）の細胞内取り込みを証明します。トリパンブルー排除24時間後に標識によって検出されるように64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbまたは64のCu-PTSMの放射性標識用量の（B）滴定は、生存率に等しい影響を明らかにしました。生存率の最も低い障害を誘導した細胞標識のために0.7 MBqでの使用は、（パーセントで平均±SD;この図は参考文献16、17から変更された放射性標識の（C）滴定を行いますIFN-γELISA 24時間後に標識によって検出されるように64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbまたは64のCu-PTSMのSESは、64のCu-PTSM標識後の機能の強力な障害を明らかにしました。スチューデントのt検定; * P <0.05、** P <0.01、**：統計;細胞標識のための64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbの用量の増加は、（パーセントで平均±SD機能には影響がなかったです* P <0.001;この図は、参考文献16から17に変更されています）。統計;放射性標識された細胞（γ計数）の（D）流出測定は、64のCu-PTSM 5時間および24時間後標識（パーセントで平均±SDと比較して、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbのより高い標識安定性を示しました。 ：スチューデントのt検定; *** P <0.001;この数字が17から変更されています）。 （E）は、それぞれのフローサイトメトリー（PE-アネキシンV）の図は、より高いAPを示します64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識に比べ64のCu-PTSM標識後optosis誘導24時間（この図では、基準17から変更されています）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
コバ-DTHR罹患動物および未処理対照に10 7 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞の養子移入した後、高解像度静的PETおよび解剖学的CT画像を取得しました。画像分析のために、画像は64のCu-DOTA-KJ1-26-のmAb（ 図3A）を少量含むガラスキャピラリーの助けを借りて、冠状軸方向及びサジタルビューに融合させました。 VOIは1cm 3当たりパーセンテージ注入量を算出する減衰補正及び正規化されたPET画像上の肺及びperithymic LNSで描かれました（ 図3B）。
図3：PET / CT-CO-登録と分析。 （A）PET及びCT画像は画像解析ソフトに同時登録されました。ソフトウェアによる自動登録が失敗した場合、画像は、放射能を充填し、動物のベッドの下に固定され、ガラスキャピラリー（マーカー）のPET及びCT信号を重ね合わせることによって融合させました。 （B）のVOIはperityhmicおよび肺のLNの補正及び正規化されたPET信号上に配置されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
COVA-TH1細胞の遊走は、気道DTHRでCOVA-プレゼンテーション部位として肺とperithymic LNに追跡しました。 インビボ PET信号デで64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbを標識コバ-TH1細胞からrived 64のCu-PTSM標識細胞（ 図4A）からの信号よりもかなり高かったです。肺およびperithymic LNにおけるコバ-TH1細胞取り込み値は有意未処理の対照同腹子（ 図4B）と比較DTHR罹患動物で増加しました。
図4： インビボ PET / CTによる気道DTHRモデルにおけるコバ-TH1細胞トラッキング。 （A）養子の各PET / CT画像は、以前コバ-DTHR罹患または未処理マウスに、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbまたは64のCu-PTSMで標識したコバ-TH1細胞を移しました。転送コバ-TH1細胞は、肺とperithymic LNSにホーミング。 （B）コバ-TH1細胞のホーミング部位の定量分析は、より高い時間を証明し炎症組織にoming（平均±SD;統計：スチューデントのt検定; * P <0.05、** P <0.01）。 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbによる標識は異なるホーミングサイトに64のCu-PTSMに比べて高感度（増加％のID / cm 3で ）証明（SD、統計平均±：スチューデントのt検定;＃pを<0.05、## p <0.01、### p <0.001）。この図は、参照16、17から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは安定PETによるインビボ追跡のために、細胞を放射標識するための信頼性と簡単な方法を提示します。この方法を利用し、ドナーマウスから単離し、in vitroで増殖コバ-TH1細胞は、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbで放射性標識することができ、それらのホーミングがでコバプレゼンテーションの部位として肺およびperithymic LNSに追跡しました。コヴァ誘発性急性気道DTHR。
キレート剤とのmAbの変更は、迅速かつ効率的な作業とアミン類の痕跡なしに超高純度のソリューションを使用する必要があります。溶液は、mAbの残基をアミンにDOTA-NHS活性エステルの適切な結合を確実にするために、キレートイオン交換樹脂で処理しました。細胞内の放射性標識のようなキレート剤 - 結合mAbは、非特異的な細胞標識剤の使用を超えるいくつかの利点を有します。まず、mAbが定義された細胞集団の標的にラベル付けを可能に優れた特異性を提供します。モノクローナル抗体それ自体は細胞毒性ではなく、細胞の生存率や機能に有害な影響を与えません。次に、細胞からの放射能の排出を大幅にPET画像17、24の信号対バックグラウンド比を改善減少しました。異なる特異性を有するモノクローナル抗体を選択することによって、この方法は、CD8 + TILまたはCD14 +単球のような関心のある他の細胞集団に容易に転送可能です。また、この細胞標識アプローチは、異なるヒト癌タイプの炎症性ヒト疾患（ 例えば 、関節リウマチおよび気管支喘息）または動物モデルの種々の動物モデルにおける細胞追跡研究のために使用することができます。 mAbが受動的に細胞膜を横切って拡散しないので、この標識方法は、しかしながら、膜結合受容体または標的として分化マーカーに限定されます。活性化誘導性標的の内在又は、単に、膜シャトリングが有利です。 AmAbおよびターゲットとの間の高い親和性は、しかし、また、おそらくは背景比が低減された信号を用いて、in vivoイメージングのために十分であるかもしれません。
我々の実験のためのキレート剤としてDOTAの選択は、64銅25を使用して初期の作品に基づいていました。しかし、その間にDOTAは、スーパーオキシドジスムターゼ26にトランスキレーションによって肝臓でかなり高い活性の取り込みを導く、この同位体のための最適なキレート化剤ではないことが示されました。次いで養子移入された細胞のインビトロ標識のために放射性標識抗体を使用して肝臓への64のCu放出および輸送のリスクを低減すべきであるが、1,4,7-トリアザシクロノナン、1-グルタル酸のような64のCuのために最適化された近代的なキレート剤、 -4,7-酢酸（NODAGA）または1,4,7-トリアザシクロノナン三酢酸（NOTA）、好ましくは、得られたデータ27の特異性を高めるために、我々の方法で使用することができ、64のCu（ 例えば 、N-クロロスクシンイミド（NCS））または他の同位体、例えば89のZr（。; DFO 例えばデスフェリオキサミン）のために使用することができます。
放射性同位元素として64のCuの選択は、インビボ細胞遊走及びホーミングに通常PETによって撮像された代謝変化と比較してかなり遅いプロセスであるという事実に基づいていました。 12.7時間の半減時間で64 Cuは48時間後に注射上細胞移動の繰り返し撮像を可能にします。 64銅の生産のために、64のCuの純度を確保するために、微量金属イオンのない高品位のソリューションを使用することが重要です。多価金属イオン不純物がタンパク質放射標識し、その結果イメージングを妨げるレベルに64のCu溶液の還元比活性につながる可能性があるので、64のCuの純度は、DOTA-mAbの放射性標識のために非常に重要です。 64 Cuは、SIを生成するが放射性標識後の生存率および機能性および低いアポトーシス誘導に対する最小の効果によって表されるように高エネルギー、細胞毒性オージェ電子のgnificantパーセンテージ28を減衰する、放射性同位体の調節投与量は、十分に細胞によって許容されます。それにもかかわらず、最初は他の細胞型のための放射性標識化のために使用され活動量を滴定し、放射性標識プロトコルを調整することが明らかに賢明です。 インビトロ評価方法で迅速かつ簡単には、細胞のアポトーシス分画の決意のためにPE-アネキシンVとトリパンブルー排除染色による生存率の決意を含むプロトコルで実証されています。どちらの方法は、比較的安価であり、簡単にアクセスできる実験装置を使用しています。リビングや、7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）などの死細胞の識別のための染料と組み合わせるPE-アネキシンV染色は、1つの実験STEにおける生存率およびアポトーシスの決意を可能にしますP。標識されたT細胞の生存率を評価するための代替物として、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT-）アッセイは、細胞の代謝活性を評価するために使用することができます。投与量キャリブレータおよびγ-カウンターでの取り込みと排出値の評価は、放射能を扱うほぼすべての研究室では、サイト上の各ハードウェアを持っているので、達成するために、より高度な、まだ速くて安いです。遺伝子配列決定またはマイクロチップベースの方法は、より詳細なデータをもたらすであろう。しかし、これらの方法は、常に簡単にアクセスすることはできません適切な専門知識を必要とし、ほとんどの場合、コスト高にリンクされています。
PETは、顕微鏡イメージング技術29のようなセルラー解像度に達することができないが、それは動物またはヒト8内の細胞の小さな数を検出するためのピコモル範囲で優れた感度を提供します。例えばopticaなどの他の非侵襲的イメージング技術と比較L画像、PETは、定量的である侵入深さに限定されず、三次元解像度で高品質の画像を提供します。 CTの解剖学的精度でPETの高い感度を組み合わせて細胞移動の高精度なイメージングを可能にします。また、in vivoデータを容易に生体内分布分析用γ計数を含むいくつかのエクスビボ方法によって検証することができます。凍結切片および凍結切片のその後の組織学的染色のオートラジオグラフィーは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって同定免疫細胞浸潤とオートラジオグラフィーアクティビティマップを相関させるために重ねることができます。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、実験とデータ分析の際に支援するために博士はジュリア・マンハイム、ウォルター・エリッチマン、ラモナシュトゥンム、Fundaケイ、ダニエル・ブカラ、マレン・ハラントだけでなく、ナタリー・アルトメイヤー感謝します。この作品は、SFB685（プロジェクトB6）と富（2309-0-0）を通じてヴェルナーシーメンス財団、DFGによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | WKL | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitroevaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30 G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µL | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
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