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Immunology and Infection

Murina de linfocitos Etiquetado por Published: April 29, 2017 doi: 10.3791/55270
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

Summary

Después de la preparación de un anticuerpo monoclonal modificado-Cu 64 la unión a un receptor de células T murino transgénico, las células T son radiomarcado in vivo, se analizaron para viabilidad, la funcionalidad, la estabilidad etiquetado y apoptosis, y adoptivamente transferidas en ratones con una vía aérea hipersensibilidad de tipo retardado reacción para formación de imágenes no invasiva mediante tomografía de emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT).

Abstract

Este protocolo ilustra la producción de 64 Cu y el quelante de conjugación / radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal (mAb), seguido de cultivo de células de linfocitos murinos y receptor 64 Cu-anticuerpo dirigido de las células. Evaluación in vitro de se describen el radiomarcador y no invasiva en el rastreo de células in vivo en un modelo animal de una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado de la vía aérea (DTHR) por PET / CT.

En detalle, se muestra la conjugación de un mAb con el quelante de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA). Después de la producción de radioactivo 64 Cu, radiomarcaje del mAb DOTA-conjugado se describe. A continuación, la expansión de la ovoalbúmina de pollo (COVA) CD4 específica de + interferón (IFN) -γ productoras se representan las células T helper (cova-Th1) y el posterior radiomarcaje de las células cova-TH1. Diversas técnicas in vitro se presentan para evaluar la efefec- de 64 Cu-radiomarcaje en las células, tales como la determinación de la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano, la tinción para la apoptosis con Anexina V para citometría de flujo, y la evaluación de la funcionalidad mediante la enzima de ensayo inmunoabsorbente ligado a IFN-γ (ELISA) . Además, la determinación de la absorción radiactiva en las células y la estabilidad de etiquetado se describen en detalle. Este protocolo describe además cómo realizar estudios de seguimiento de células en un modelo animal para una DTHR las vías respiratorias y, por lo tanto, se incluye la inducción de la vía aérea DHTR aguda inducida por cova en ratones BALB / c. Por último, se presenta un robusto flujo de trabajo de PET / CT incluyendo la adquisición de imágenes, reconstrucción y análisis.

El enfoque dirigido a un receptor 64 Cu-anticuerpo con la subsiguiente internalización del receptor proporciona una alta especificidad y estabilidad, la reducción de la toxicidad celular, y las bajas tasas de flujo de salida en comparación con PET comunes trazadores para el etiquetado de células, por ejemplo 64 Cubis -pyruvaldehyde (N4-metiltiosemicarbazona) (64 Cu-PTSM). Por último, nuestro enfoque permite no invasivo en el seguimiento in vivo de células mediante PET / CT con una relación óptima de señal a fondo durante 48 h. Este enfoque experimental se puede transferir a diferentes modelos animales y tipos de células con receptores unidos a la membrana que se internalizan.

Introduction

Seguimiento de células no invasiva es una herramienta versátil para controlar la función celular, la migración y homing in vivo. Recientes estudios de seguimiento celular se han centrado en mesenquimales 1, 2 o de médula ósea las células madre derivadas de 3 en el contexto de la medicina regenerativa, las células blancas de la sangre periférica autólogas en la inflamación o linfocitos T en las terapias con células adoptivas contra el cáncer de 3, 4. La elucidación de los sitios de acción y los principios biológicos subyacentes de las terapias basadas en células es de tremenda importancia. Linfocitos T citotóxicos CD8 +, por ingeniería genética del receptor de antígeno quimérico (CAR) las células T o linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) fueron consideradas ampliamente como el estándar de oro. Sin embargo, las células TH1 específicos de antígeno asociado a tumores han demostrado ser una opción de tratamiento alternativa efectiva 4, </ sup> 5, 6, 7.

Como actores clave en la inflamación, enfermedades autoinmunes específicas de órganos (por ejemplo, la artritis reumatoide o el asma bronquial), y células de gran interés en la inmunoterapia del cáncer, es importante para caracterizar los patrones de distribución y homing temporales de células TH1. No invasiva in vivo de formación de imágenes por PET presenta un método cuantitativo, altamente sensible 8 para examinar los patrones de migración de células, en homing vivo, y los sitios de acción y las respuestas de células T durante la inflamación, alergias, infecciones o el rechazo del tumor 9, 10, 11.

Clínicamente, 111 In-oxina se utiliza para la gammagrafía de leucocitos para la discriminación de la inflamación y la infección 12, mientras que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucosa (18 F-FDG) se utiliza comúnmente para estudios de seguimiento celular por PET 3, 13. Una desventaja importante de este trazador PET, sin embargo, es la corta vida media del radionúclido 18 F a 109,7 min y la baja estabilidad intracelular que impide de formación de imágenes en los puntos de tiempo posteriores poste de transferencia de células adoptivas. Para más largo plazo en los estudios de seguimiento de células in vivo por PET, aunque inestable en las células, 64 Cu-PTSM se utiliza con frecuencia para etiquetar de manera no específica las células 14, 15 con efectos perjudiciales minimizadas en la viabilidad de las células T y la función 16.

Este protocolo describe un método para reducir aún más efectos desventajosos sobre la viabilidad celular y la función utilizando un receptor de células T (TCR) mAb radiomarcado específico de. En primer lugar, la producción del radioisótopo 64 Cu, la conjugación del mAb KJ1-26 con ésimoe quelante DOTA, y la posterior 64 Cu-radiomarcaje se muestran. En una segunda etapa, el aislamiento y la expansión de las células cova-TH1 de ratones donantes DO11.10 y el radiomarcado con 64 cargado-Cu DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) se describen en detalle. La evaluación de los valores de captación y de flujo de salida de la radiactividad con un calibrador de dosis y por gamma-conteo, respectivamente, así como la evaluación de los efectos de 64 Cu-radiomarcaje sobre la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano y la funcionalidad con se presentan IFN-gamma ELISA . Para no invasivo en el seguimiento de células in vivo, se describen la obtención de un modelo de ratón de inducida por COVA vías respiratorias aguda DTHR y Adquisición de imágenes por PET / CT después de la transferencia celular adoptiva.

Además, este enfoque de etiquetado puede ser transferido a diferentes modelos de enfermedad, las células T murinas con diferentes TCR o células generales de interés con los receptores unidos a la membrana o mar expresiónkers subyacente membrana continua shuttling 17.

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Protocol

Precauciones de seguridad: Al manipular la radiactividad, almacenar 64 Cu detrás de ladrillos de plomo 2 pulgada de grosor y utilizar respectivo blindaje para todos los buques que llevan actividad. Utilizar las herramientas adecuadas para manejar indirectamente fuentes sin blindaje para evitar el contacto directo de las manos y reducir al mínimo la exposición a material radiactivo. Siempre use insignias de monitoreo dosimetría de radiación y equipo de protección personal y comprobar uno mismo y la zona de trabajo para la contaminación de abordar inmediatamente. Desechar el equipo de protección personal potencialmente contaminado antes de salir de la zona donde se utiliza material radiactivo. Almacenar toda los residuos radiactivos detrás de blindaje de plomo hasta que el radiactiva 64 Cu se han debilitado (aproximadamente 10 vidas medias = 127 h) antes de su eliminación adecuada.

1. 64 Cu Producción

NOTA: El radioisótopo 64 Cu se produce a través de la 64 Ni (p, n) 64 Cu reacción nuclear utilizando un Pettciclotrón carrera de acuerdo con un protocolo modificado de McCarthy et al. 18.

  1. Por 64 la producción de Cu, irradiar 64 Ni, que se galvaniza en un plato de platino / iridio (90/10), con 30 μA durante 6 h con un haz de protones de 12,4 MeV.
  2. Calentar el objetivo de platino / iridio a 100 ° C en una cámara de polieteretercetona dedicado (PEEK) y se incuban en 2 ml de HCl concentrado durante 20 min para disolver 64 Cu / 64 Ni.
  3. Añadir otro 1 ml de HCl concentrado y se incuba durante 10 min.
  4. Evaporar HCl utilizando una corriente de argón y se enfría la cámara a temperatura ambiente.
  5. Enjuague la cámara con 3 ml de 4% M HCl 0,2 y 96% de metanol (v / v) y la transferencia de esta solución a una columna de intercambio de iones que fue pre-acondicionado con 4% de HCl 0,2 M en metanol durante al menos 15 min. El flujo a través se puede utilizar para reciclar 64 Ni.
  6. Lavar el 64 Cu retenido en la columna con 4% 0,2 M HCl in metanol.
  7. Eluir 64 Cu con 70% M HCl 1,3 / 30% isopropanol (v / v) en un vial de recogida, se evapora la solución en una corriente de argón y dejar que el vial enfriar a temperatura ambiente.
  8. Disolver 64 Cu en 140-210 l de HCl 0,1 M.

2. Anticuerpo conjugación con DOTA y posterior 64 Cu-radiomarcaje

NOTA: El quelante DOTA estará vinculado a grupos amino funcionales del mAb por N-hidroxisuccinimida (NHS) química éster y el conjugado se pueden radiomarcar subsiguientemente con 64 Cu 19.

  1. Ajustar la concentración de la KJ1-26-mAb a 8 mg / ml y diafiltrado 1 ml de mAb solución contra 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 se trató con 1,2 g / L de una resina de intercambio de iones quelante usando un corte de peso molecular ( MWCO 30 kDa) unidad de filtro centrífugo. Aplicar 3 etapas de lavado subsiguientes con 14 ml del tampón. Después de la etapa de lavado final,concentrar la solución de nuevo a 1 ml. Cuantificar la concentración de anticuerpo mediante mediciones de DO 280 nm.
  2. Preparar una solución de DOTA-NHS en ultrapura o agua de calidad para PCR a una concentración de 10 mg / ml inmediatamente antes del uso. Deje el vial ajustar a la temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación de agua, y cuidadosamente eliminar DOTA-NHS usando una espátula de plástico. Añadir 216! L de esta solución de DOTA-NHS a 8 mg de la solución diafiltrada KJ1-26-mAb, mezclar a fondo, y se incuba durante 24 horas a 4 ° C en un mezclador de tambor.
  3. Diafiltrado la DOTA-KJ1-26-mAb frente a acetato de amonio 0,25 M, pH 7,0, se trató con 1,2 g / L de una resina de intercambio de iones quelante, usando un corte de peso molecular (MWCO 30 kDa) unidad de filtro centrífugo. Aplicar 7 etapas de lavado. Se concentra el mAb a un volumen final de 1 ml y de nuevo medir la concentración de proteína mediante medidas de 280 nm de DO.
  4. Antes de radiomarcaje, intercambiar el tampón de la DOTA-KJ1-26-mAb a PBS a través de tamaño-exccromatografía lusion usando columnas de filtración en gel. Esto también elimina posibles impurezas de molécula pequeña.
  5. Preparar 100 MBq solución 64 CuCl 2 en HCl 10 mM y ajustar el pH a 6-7 con 10x PBS. Añadir 200 g de DOTA-KJ1-26 mAb. Incubar durante 60 min a 37 ° C.
  6. Para el control de calidad, lleve a cabo cromatografía en capa fina con citrato de sodio 0,1 M (pH 5) como fase móvil y analizar por autorradiografía. Al menos el 90% de la actividad debe ser unido al anticuerpo y por lo tanto ser detectada en el punto de partida. actividad no unido se quelado por la fase móvil a base de citrato y rayas para el frente del disolvente. Para una referencia, se aconseja el uso de CuCl 64 2.

3. pollo ovoalbúmina-específico TH1 (cova-TH1) aislamiento de células y de expansión

NOTA: El cultivo de células TH1 se describe de acuerdo con los estudios publicados previamente 16, 17.

  1. Aislar los bazos y los ganglios linfáticos extraperitoneal (LNS) de ratones DO11.10.
    1. Sacrificar el ratón de acuerdo a las regulaciones federales. Desinfectar el animal con 70% de etanol y fijar con cinta adhesiva para la eliminación del bazo y LN. Hacer una incisión media y separar la piel del peritoneo por lateralmente tirando de él a cada sitio.
    2. Localizar la cervical, axial, braquial y los LN inguinales. Retire ellos con unas pinzas romas y colocarlos en 1% de suero de ternera fetal (FCS) / tampón PBS.
    3. Abrir el peritoneo y localizar el bazo. Separar el bazo del páncreas y tejido conectivo y colocarlo en tampón FCS / PBS 1%. Para mayor orientación, véase las referencias 20,21.
  2. Pique bazo y LN a través de un filtro de 40 micras en una de 50 ml de tornillo tubo con tapón utilizando el émbolo de una jeringa. Enjuague el filtro con 10 ml de 1% de FCS / PBS-buffer.
  3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. SubsequenTLY, lleve a cabo la lisis de eritrocitos mediante la adición de amonio-cloruro-potasio (ACK) de tampón de lisis (1,5 ml por animal donante) durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 8,5 ml de 1% de FCS / PBS-tampón (por animal donante).
  4. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Se lavan las células en 10 ml de FCS al 1% / PBS-tampón, centrifugar a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante.
  5. Para la separación celular magnética, resuspender las células en 1% de FCS / PBS-tampón y añadir CD4 + microperlas. Consulte las instrucciones del fabricante para el volumen de compensación y la cantidad de células CD4 + microperlas de usar.
  6. Incubar durante 20 min a 4 ° C. A continuación, añadir 1% de FCS / PBS-tampón hasta 50 ml, centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, y eliminar el sobrenadante.
  7. Continuar con el aislamiento de células T CD4 + utilizando columnas de separación magnética comerciales y un soporte magnético correspondiente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Ajustar las células T CD4 + eluidas a un concentration de 10 6 células / ml en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 1% de ácidos 10% de FCS, inactivado por calor 2,5% de penicilina / estreptomicina, tampón HEPES 1%, MEM aminoácidos, piruvato de sodio 1%, y 0,2% de 2-mercaptoetanol y tienda ellos a 4 ° C.
  8. Recoger la descarga de columna en un tubo de 50 ml tapón de rosca para preparar células presentadoras de antígeno (APCs). Centrifugar la descarga de la columna a 400 xg durante 5 min y separar el sobrenadante.
  9. Añadir 10 g / ml anti-CD4 (clon: GK1.5), 10 g / ml anti-CD8 (clon: 5367,2) y 10 g de ratón / ml anti-rata-mAb (MAR18.5) y 1,5 ml de complemento de conejo. Incubar durante 45 min a 37 ° C.
  10. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y añadir 3 ml de medio. Irradiar las APC en una fuente de rayos γ o rayos x con 30 Gy en total. Después, ajustar las APC a una concentración de 5 x 10 6 células / ml.
  11. Añadir 100 células l de T CD4 + y 100 l de APCs en un pla de 96 pocilloste junto con 10 g / mL cOVA 323-339-péptido, 10 g / ml anti-IL-4-mAb, 0,3 mu M CPG1668-oligonucleótidos y 5 U / ml de IL-2.
  12. Añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día. Después de 3 - 4 días, la transferencia de las células de las placas de 96 pocillos a placas de 24 pocillos. Combinar 3-5 pozos de la placa de 96 pocillos en un pocillo en la placa de 24 pocillos. Añadir 100 U / ml de IL-2 que contenía medio en una proporción de 1: 1.
  13. Después de otros 23 días, la transferencia de las células de la placa de 48 pocillos a 175 cm 2 frascos de cultivo de células (placa 1 x 48 pocillos por matraz). Rellenar con en un 1 medio: 1. Añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día.
  14. Dividir las células de acuerdo con la densidad celular y añadir 50 U / ml de IL-2 cada segundo día. De esta manera, cultivar las células durante otros 10 días.

El radiomarcaje de la célula 4. cova-TH1

NOTA: El 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb se aplicará a las células cova-TH1 cultivadas para permitir el etiquetado radiactivo intracelular.

  1. Para cova-TH1 ceradiomarcaje ll, dibujar 37 MBq de la radiomarcado 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb en una jeringa sin volumen muerto usando un calibrador de dosis. Añadir 1 ml de solución salina para recibir una solución al 37 MBq / ml.
  2. Suspender las células cova-Th1 en medio a 2 x 10 6 células / ml y añadir 0,5 ml de la suspensión celular a cada pocillo en una placa de 48 pocillos.
  3. Añadir 20 l de la recién preparadas 37 MBq / ml 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a cada pocillo de la placa de 48 pocillos. La relación final para el etiquetado es de 0,7 MBq por 10 6 células en un volumen de 520! L. Incubar a 37 ° C y 7,5% de CO2 durante 30 min.
  4. Después de la incubación, resuspender cuidadosamente las células en cada pocillo y transferir la suspensión de células de la placa de 48 pocillos en un 50 ml de tornillo tubo con tapón. Para minimizar la pérdida de células, enjuague cada pocillo con medio precalentado.
  5. Centrifugar la suspensión celular cova-TH1 a 400 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante, y resuspender las células en 10 ml de PBS precalentado. Eliminar una unaliquot de la suspensión celular para el recuento celular. Repetir el paso de lavado.
  6. Recuento de células cova-TH1 viables en una dilución apropiada con tinción con azul de tripano.
  7. Ajustar la concentración de células a 5 x 10 7 células / ml para la inyección intraperitoneal (ip) de 10 7 células en 200 l de PBS.
  8. Repetir los pasos 4.3 a 4.5 para radiomarcar las células cova-TH1 con cantidades crecientes de la actividad, por ejemplo, 1,4 MBq o 2.1 MBq por 10 6 células.
    1. Para radiomarcar las células con 1,4 MBq por 10 6 células, usar 40! L de los 37 MBq / ml 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y 60 l para radiomarcar con 2,1 MBq por 10 6 células. Realice los pasos 4.3 a 4.7 con 0,7 MBq, 1,4 MBq y 2,1 MBq 64 Cu-PTSM pero aumentar el tiempo de etiquetado a 3 h para investigaciones comparativas 17.
    2. Continúe en el paso 5 para determinar la cantidad óptima de actividad.

5. Evaluación in vitro del efecto del radiomarcador en células cova-TH1

NOTA: La caracterización de las influencias del radiomarcador en las células TH1 se realiza mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano para determinar la viabilidad, IFN-gamma ELISA para la evaluación de la funcionalidad y V tinción PE-Anexina para la inducción de la apoptosis 16, 17. Determinación de la absorción intracelular y el flujo de salida de radioactividad también se describe a continuación. Como comparación, las células marcado con Cu-PTSM 64 cova-TH1 también se pueden utilizar.

  1. Efecto sobre la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano
    1. Ajustar por lo menos 18 x 10 6 células cova-TH1 radiomarcados con 0,7 MBq / 10 6 células, 1,4 MBq / 10 6 células y 2,1 MBq / 10 6 células, respectivamente, a una concentración de 2 x 10 6 células / ml y realizar los pasos 5.1. 2-5.1.7 para cada dosis actividad. El uso no radiactivamenteve KJ1-26-mAb marcado células cova-TH1 y células cova-TH1 no marcados como los controles.
    2. Pipetear 1 ml de la solución de células en 9 pocillos de una placa de 24 pocillos.
    3. Recoger el contenido de 3 pocillos en 3 separadas 15 ml de tornillo tubos con tapa, 3 h después de radiomarcaje inicial.
    4. Lavar los pocillos ahora vacías con medio de pre-calentado para reducir al mínimo la pérdida de células y añadir el medio a los respectivos 15 ml tornillo tubos con tapón de la etapa 5.1.3.
    5. Centrifugar los tubos de 15 ml a 400 xg durante 5 min y resuspender el sedimento celular resultante en 1 ml de medio de pre-calentado.
    6. Recuento de células viables y muertas en azul de tripano por separado para cada tubo de 15 ml y calcular el porcentaje de células viables.
    7. Repetir los pasos 5.1.3-5.1.6 24 y 48 h post 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcaje.
  2. Efectos sobre la funcionalidad determinaron por ELISA IFN-gamma
    NOTA: Para evaluar el efecto de la 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomarcador en productio IFN-γn como un marcador de la funcionalidad, lleve a cabo un ELISA de IFN-γ de un proveedor comercial y se refieren a la referencia 17 para más detalles.
    1. Dispersar 10 5 células viables en 100 l de medio en una placa de 96 pocillos, 3 h después de 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomarcaje de las células cova-TH1 con 0,7 MBq, 1,4 MBq o 2,1 MBq. Utilice no radiactivos o 64 células no marcadas, etiquetadas-KJ1-26-mAb-etiquetados-PTSM Cu cova-TH1 como los controles.
    2. Estimular la producción de IFN-γ en 10 5 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 células cova-Th1 en 100 l de medio con 10 g / ml de péptido COVA, 5 U / ml de IL-2 y 5x10 5 APCs en 100 l de medio durante 24 h a 37 ° C y 7,5% de CO2. Otros controles pueden ser las otras condiciones sin la adición del péptido COVA.
    3. Analizar el sobrenadante por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Repita el paso 5.2.2. a 5.2.3. a las 24 y 48 h después del procedimiento de etiquetado.
  3. La inducción de la apoptosis determinada por V tinción PE-Anexina para citometría de flujo
    NOTA: Para evaluar la inducción de apoptosis por el radiomarcador 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utilizar un kit comercialmente disponible para citometría de flujo y se preparan muestras de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de la tinción con anexina V para fosfatidil serina exposición en la membrana celular .
    1. A las 3, 24 y 48 h post 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcado de las células cova-TH1, triplicados mancha con al menos 10 6 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 células cova-TH1 con el kit de Anexina V de acuerdo con las instrucciones del fabricante y analizar dentro de la hora siguiente. Usa, 64 células cova-TH1 no radiactivos marcados con KJ1-26-mAb-PTSM marcadas con Cu y no marcados como controles. Por favor refiérase a la referencia 17 para más detalles.
  4. Captación y el flujo de salida
    NOTA: La absorción de la 64 Cu-DOTAKJ1-26-mAb en las células se mide en un calibrador de dosis y el flujo de salida de la radiactividad se mide en un ensayo de γ-conteo de 0, 5, 24, y 48 h después de radiomarcaje.
    1. Preparar diez tubos γ-contando cada durante 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb-, el sobrenadante respectivo y el paso de lavado.
    2. Transferencia 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcado con células cova-TH1 en 1 ml de medio en cada uno de los diez tubos γ-conteo directamente después de marcar radiactivamente. Para cada uno de los puntos 5, 24 y 48 h después de radiomarcaje de tiempo, mantener al menos 10 etiquetados-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 7 64 células cova-Th1 en medio en placas de cultivo celular de 24 pocillos en un incubador a 37 ° C y 7,5% de CO2.
    3. Centrifugar los tubos de γ-conteo a 400 xg durante 5 min y transferir el sobrenadante a diez nuevos tubos de γ-recuento.
    4. Lavar las células una vez en 1 ml de medio para eliminar la fracción no unida de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb unad recoger el sobrenadante en diez nuevos tubos γ-recuento.
    5. Añadir 1 ml nuevo medio a las células cova-TH1 y determinar el valor de captación inicial en un calibrador de dosis. Los tubos también se pueden almacenar en una incubadora a 37 ° C y 7,5% de CO2.
    6. Repetir los pasos 5.4.2 a 5.4.5 después de 5, 24 y 48 h y medir todos los tubos en un γ-contador según el protocolo del fabricante. Para corregir por la desintegración radiactiva y para el análisis cuantitativo, utilizar un estándar con una dosis definida de la radiactividad.

Inducida por OVA 6. aguda de las vías respiratorias DTHR

NOTA: La dinámica de migración y patrones de homing de células radiomarcado cova-TH1 adoptivamente transferidas y en el sitio de la inflamación se visualizó y se cuantificó en un modelo animal para inducida por COVA vía aérea-DTHR 16, 17.

  1. Inyectar ratones de 8 semanas de edad BALB / c ip con una mezcla de 150 l aluminum gel / 50 l cova-solución (10 g en 50 l de PBS) para inmunizar los ratones.
  2. Dos semanas después de la inmunización, anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por inyección ip. Coloque los ratones experimentales sobre sus espaldas y lentamente pipetear 100 g COVA disuelto en 50 l de PBS en las fosas nasales de los animales. Los animales serán inhalar la solución gota a gota.
  3. Repita después de 24 h. Para las inducciones DTHR de las vías respiratorias más fuertes, repetir de nuevo después de 48 h.
  4. Para analizar la migración específica de las células cova-TH1 transferidos, inducir la vía aérea-DTHR con el pavo-o faisán-OVA como control. Por lo tanto, repita los pasos 6.1 a 6.3 mediante el uso de la respectiva OVA-proteína.

7. El uso de imágenes in vivo de PET / CT

NOTA: En imágenes in vivo de 64-etiquetados Cu DOTA KJ1-26-mAb-células cova-Th1 en cova-DTHR ratones enfermos y compañeros de camada de control demuestra la homing específico y el midinámica gración de las células cova-TH1. Por lo tanto, adquirir exploraciones PET estáticas y anatómica CT escanea secuencialmente 3, 24 y 48 h de la transferencia celular adoptiva poste.

  1. Directamente después de radiomarcaje, ajustar las 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb a 5 x 10 7 células / ml para inyección ip de 10 7 células en 200 l.
  2. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 30, dibujar 200 l de la suspensión celular cova-TH1 marcado con Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 64 y se inyectan las células IP en los animales cova-DTHR-enfermas entre el 4 y 5 de pezón. Para determinar la cantidad total inyectada de la radiactividad, medir la jeringa en un calibrador de dosis antes y después de la inyección.
  3. Anestesiar los ratones, 10 min antes del tiempo de absorción se desea, con 1,5% de isoflurano en oxígeno al 100% (velocidad de flujo: 0,7 L / min) en una caja de la anestesia con temperatura controlada.
  4. Mientras tanto, para facilitar la co-registrode imágenes PET y CT durante el análisis de imágenes, fijar los capilares de vidrio que contenían 64 solución de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o solución libre 64 CuCl 2 debajo de la cama del ratón.
    1. Por lo tanto, preparar una solución de 0,37 MBq / ml y llenar capilares de vidrio con un volumen de 10 l con esta solución. Dado que las señales de radiactividad derivados de células son inherentemente débil, no utilice altas cantidades de actividad para asegurarse de que los marcadores no están interfiriendo con las señales derivadas de las células en ratones.
  5. Después de alcanzar la tolerancia quirúrgica, como se indica por la pérdida del reflejo de retirada pedal de la extremidad posterior, transferir el ratón para un pequeño animal cama compatible-CT PET-y equipado con un sistema de tubos adecuado para mantener la anestesia.
  6. Inmovilizar el ratón en la pequeña cama animal usando hisopos de algodón y cinta quirúrgica. Aplicar ungüento para los ojos para evitar la desecación de los ojos.
  7. La transferencia de la cama de ratón para el escáner PET, centrar el campo de visión con una focus en los pulmones y adquirir una exploración PET estática 20 minutos con una ventana de energía de 350-650 keV.
  8. La transferencia de la cama de ratón para el escáner CT. A través del explorador de vista, centrar el campo de visión de los pulmones. Adquirir una imagen planar CT a través de 360 ​​proyecciones durante una rotación de 360 ​​° en el modo de "paso y disparar" con un tiempo de exposición de 350 ms y binning factor de 4.

Análisis 8. Imagen

  1. Reconstruir PET de datos en modo de lista mediante la aplicación iterativa algoritmo estadístico ordenado a la maximización de la expectativa subconjunto (OSEM) 2D y tomografías computarizadas en una imagen 3D con un tamaño de píxel de 75 micras.
  2. Para la imagen co-registro en un software de análisis de imágenes apropiado (por ejemplo Inveon Investigación lugar de trabajo o Pmod), utilice la herramienta automática co-registro. Si esto no funciona, utilice los capilares de vidrio debajo de la cama ratón como guía para co-registrar las imágenes PET y CT reconstruidas espacialmente en la dirección axial, coronal y sagital.
  3. Corregir las imágenes PETpara la desintegración radiactiva usando la ley de la desintegración radiactiva y el tiempo medio del radionúclido 64 Cu a 12,7 h. Para la imagen de normalización, elegir una imagen (A) como una referencia y ajustar la intensidad de la visualización de imágenes en el software de análisis de imagen correspondiente.
    1. Utilizando los valores acaba de establecer la imagen de referencia (A) para, la actividad inyectada (A) y la actividad inyectada para las otras imágenes (X), normalizar las otras imágenes utilizando la siguiente ecuación: (actividad inyectada (X) / actividad inyectada ( A)) Los valores de x de intensidad (A).
  4. Dibujar volúmenes 3D de interés (VOI) en la señal de PET normalizada de la LNS pulmonares y peritímica.
  5. Determinar la dosis inyectada porcentaje por cm 3 (% ID / cm 3) usando la siguiente ecuación: (media de la actividad de la actividad VOI / total en el ratón) x 100. Para mayor orientación relativa a análisis de imágenes, ver referencias 22, 23.

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Representative Results

La Figura 1 resume el etiquetado de las células cova-TH1 con el 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y el diseño experimental para la in vitro y en estudios in vivo cubiertos en este protocolo.

Figura 1
Figura 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb proceso de etiquetado y Diseño Experimental. (A) Representación esquemática de etiquetado celular radiactiva con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. El 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb se une a receptores cova-TCR en la superficie celular de las células TH1 y es internalizado con el receptor dentro de 24 h. cova-TCR se re-expresa 24 h después de radiomarcaje. Se aislaron (B) las células T CD4 +, se expandieron y radiomarcados con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in vitro. valores de captación y flujo de salida de were determinada por un calibrador de dosis y γ-conteo. Efectos del anticuerpo radiactivo en la viabilidad celular se evaluaron con tinción con azul de tripano, en la funcionalidad con IFN-gamma ELISA, y en la inducción de la apoptosis con ficoeritrina (PE) -Annexin V tinción. (C) cova-vías respiratorias DHTR se indujo en ratones hembra BALB / c. 10 7 células TH1 se transfirieron de manera adoptiva en animales cova-vías respiratorias DHTR-enferma directamente después de marcar radiactivamente. PET / CT imágenes fueron adquiridas 3, la transferencia adoptiva de células 24 y 48 h post. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El etiquetado intracelular con éxito de las células TH1 con el 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb fue confirmada por inmunohistoquímica (Figura 2A). El 64 anticuerpo Cu-DOTA-KJ1-26 (verde) fue co-localizada conCD3 en la celda de membrana 3 h después de radiomarcaje, mientras que la señal del mAb en la membrana celular fue sólo débil a las 24 h (amarillo). A las 48 h después de radiomarcaje, el complejo 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR se internaliza mediante endocitosis con una señal fuerte en el citoplasma de las células TH1. La dosis radiactiva aplicada de 0,7 MBq viabilidad de las células TH1 reducidos por sólo el 8%, mientras que dosis más altas de 1,4 MBq y 2,1 MBq 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb tuvieron efectos más pronunciados. En comparación con el radiomarcaje con 64 Cu-PTSM, sin embargo, no se observó ninguna ventaja significativa de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (Figura 2B). 64 células radiomarcados Cu-anticuerpos mostraron poca pérdida de funcionalidad como se muestra por la secreción de IFN-γ (Figura 2C), flujo de salida de la radiactividad (Figura 2D) reducida, y la reducción de la inducción de la apoptosis (Figura 2E) en comparación con 64 TH1 marcado con Cu-PTSM Células.


Figura 2: Evaluación in vitro de Radioactive TH1 marcado de células con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. (A) La microscopía confocal demuestra la captación intracelular de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAbs (verde) en células cova-TH1 (membrana celular; rojo) dentro de 24 h después del marcaje inicial (Esta figura se ha modificado de la referencia 17) . (B) La titulación de dosis de etiquetado radiactivos de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o 64 Cu-PTSM reveló una influencia igual sobre la viabilidad como se detecta por exclusión con azul de 24 h post etiquetado de tripano. El uso de 0,7 MBq para el etiquetado celular inducida los deterioros más bajos de la viabilidad (media ± SD en porcentaje;. Esta figura se ha modificado a partir de las referencias 16, 17 (C) La titulación de marcaje radiactivo hacerses de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o 64 Cu-PTSM reveló un deterioro más fuerte de la funcionalidad después de 64 etiquetado Cu-PTSM, como se detecta por IFN-gamma ELISA 24 h después de etiquetado. Un aumento de la dosis de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb para el etiquetado de células no tenía influencias sobre la funcionalidad (media ± SD en porcentaje; estadísticas: la prueba t de Student; * p <0,05, ** p <0,01, ** * p <0,001; esta figura se ha modificado a partir de las referencias 16, 17). Mediciones (D) flujo de salida de células radiomarcados (γ-conteo) mostraron una mayor estabilidad etiquetado de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb en comparación con 64 Cu-PTSM 5 h y 24 h de etiquetado post (media ± SD en porcentaje; estadísticas : la prueba t de Student; *** p <0,001; esta figura se ha modificado a partir de 17). (E) respectivo citometría de flujo (PE-Anexina V) diagramas indican un ap mayorinducción optosis 24 h después de 64 etiquetado Cu-PTSM en comparación con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etiquetado (Esta figura se ha modificado de la referencia 17). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de la transferencia adoptiva de 10 7 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb-en animales cova-DTHR-enfermas y los controles no tratados, PET estática alta resolución e imágenes CT anatómicas fueron adquiridos. Para el análisis de imagen, las imágenes se fusionaron en la vista coronal, axial y sagital con la ayuda de capilares de vidrio que contienen una pequeña cantidad de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (Figura 3A). VOI se dibuja en la LNS pulmonares y peritímica en las imágenes de desintegración corregida y PET normalizado para calcular el porcentaje de dosis inyectada por cm 3(Figura 3B).

figura 3
Figura 3: PET / CT-co-registro y análisis. (A) PET y CT imágenes fueron co-registrados en el software de análisis de imágenes. Si el registro automatizado por el software no, las imágenes se fusionaron mediante la superposición de las señales de PET y CT de capilares de vidrio (marcadores), llenos de radiactividad y fijas debajo de la cama animal. (B) VOI se colocan en las señales de PET corregidas y normalizadas de la LNS perityhmic y pulmonares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

migración celular cova-TH1 fue rastreado a la LN pulmonar y peritímica como sitios cova-presentación en DTHR vías respiratorias. In vivo señales de PET deRived de 64 células cova-TH1-etiquetados Cu DOTA KJ1-26 mAb-eran considerablemente más altos que las señales de 64 células marcadas-Cu-PTSM (figura 4A). valores de captación celular cova-Th1 en la LNS pulmonares y peritímica se incrementaron significativamente en DTHR-enfermas animales en comparación con los compañeros de camada de control no tratados (Figura 4B).

Figura 4
Figura 4: Seguimiento de la célula cova-TH1 en el DTHR Modelo Airway por In Vivo PET / CT. (A) respectivas imágenes PET / CT de manera adoptiva transfirieron células cova-TH1, que anteriormente se marcaron con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o 64 Cu-PTSM, en ratones cova-DTHR-enfermas o no tratados. Las células cova-TH1 transferidos alojan a la LNS pulmonares y peritímica. (B) El análisis cuantitativo de los sitios de homing de las células cova-TH1 demostró un alto homing a tejidos inflamados (media ± SD; estadísticas: la prueba t de Student; * p <0,05, ** p <0,01). El etiquetado con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb demostró una sensibilidad más alta (aumento de% ID / cm 3) en comparación con 64 Cu-PTSM en los diferentes sitios de homing (media ± SD, estadísticas: Student de t-test; # p <0,05, ## p <0,01, ### p <0,001). Esta figura se ha modificado de la referencia 16, 17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo presenta un método fiable y fácil de marcar radiactivamente de forma estable células para el seguimiento in vivo mediante PET. Utilizando este método, las células cova-TH1, aislado y ampliado in vitro de ratones donantes, podría ser radiomarcados con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y su homing fue rastreado a la LNS pulmonares y peritímica como lugares de presentación COVA en una COVA inducida DTHR vías respiratorias aguda.

La modificación del mAb con el quelante requiere un trabajo rápido y eficiente y el uso de soluciones de ultra-pura, sin trazas de aminas. Las soluciones se trataron con una resina de intercambio de iones quelante para asegurar la conjugación adecuada del éster activo DOTA-NHS a amina residuos del mAb. El mAb conjugado con quelador como un radiomarcador intracelular tiene varias ventajas sobre el uso de agentes de marcaje de células no específicas. En primer lugar, el mAb proporciona una excelente especificidad permitiendo el etiquetado selectivo de una población de células definida. el mAbsí no es citotóxica y no tiene efecto perjudicial sobre la viabilidad o la funcionalidad de las células. A continuación, el flujo de salida de la radiactividad de las células se redujo de manera significativa la mejora de la relación señal a fondo de las imágenes PET 17, 24. Al elegir un mAb con una especificidad diferente, este método es fácilmente transferible a otras poblaciones de células de interés, tales como CD8 + TIL o monocitos CD14 +. Además, este enfoque de etiquetado de células puede ser utilizado para estudios de seguimiento celular en diversos modelos animales de enfermedades inflamatorias humanas (por ejemplo, la artritis reumatoide y el asma bronquial) o modelos de animales para los diferentes tipos de cáncer humano. Este método de etiquetado, sin embargo, se limita a receptores unidos a membrana o marcadores diferenciaciones como objetivos desde mAbs no se difunden pasivamente a través de la membrana celular. La internalización inducida por activación de la diana o, simplemente, la membrana-shuttling es ventajosa. UNalta avidez entre el mAb y el objetivo, sin embargo, también podría ser suficiente para formación de imágenes in vivo, posiblemente con una señal reducida a la proporción de fondo.

La elección de DOTA como quelante para nuestros experimentos se basó en el trabajo temprano usando 64 Cu 25. Sin embargo, en el ínterin DOTA se demostró que no sea un agente quelante del óptimo para este isótopo, que conduce a la absorción en lugar de alta actividad en el hígado por la transquelación de superóxido dismutasa 26. Aunque utilizando el anticuerpo radiomarcado para el etiquetado in vitro de células que luego son transferidas de manera adoptiva debería reducir el riesgo de 64 liberación de Cu y el transporte al hígado, los quelantes modernos optimizados para 64 Cu, como 1,4,7-triazaciclononano, ácido 1-glutárico -4,7-ácido acético (NODAGA) o el ácido 1,4,7-triazaciclononano-triacético (NOTA), puede ser utilizado preferiblemente con nuestro método para mejorar aún más la especificidad de los datos obtenidos 27 64 Cu (por ejemplo, N-clorosuccinimida (NCS)) u otros isótopos, tales como 89 Zr (por ejemplo, la deferoxamina;. DFO).

La elección de 64 Cu como el radioisótopo se basó en el hecho de que en la migración celular in vivo y homing es un proceso más lento en comparación con los cambios metabólicos generalmente imaginada por PET. 64 Cu con un tiempo de vida media de 12,7 h permite la formación de imágenes repetidas de la migración celular durante 48 h después de la inyección. Por 64 la producción de Cu, es importante utilizar soluciones de alto grado sin iones metálicos traza para asegurar la pureza de 64 Cu. Además, la pureza de 64 Cu es de gran importancia para el radiomarcado de la DOTA-mAb ya que las impurezas de iones de metal multivalente podría conducir a una actividad específica reducida de la solución 64 Cu a niveles que impidan el radiomarcado de proteínas y la formación de imágenes en consecuencia. Aunque 64 Cu produce a siporcentaje gnificant de, electrones Auger citotóxicos altamente energéticas al decaer 28, una dosis ajustada de la radioisótopo es bien tolerado por las células como se representa por efectos mínimos sobre la viabilidad y funcionalidad y bajo la inducción de apoptosis después de radiomarcaje. Sin embargo, es claramente conveniente para valorar inicialmente la dosis la actividad utilizados para radiomarcación para otros tipos de células y ajustar el protocolo de radiomarcaje. Rápida y fácil en los métodos de evaluación in vitro se ha demostrado en el protocolo, incluyendo la determinación de la viabilidad por exclusión de azul de tripano y tinción con PE-Anexina V para la determinación de las fracciones apoptóticas de las células. Ambos métodos son relativamente baratos y el uso de equipos de laboratorio de fácil acceso. La combinación de PE-Anexina V tinción con un colorante para la discriminación de las células muertas, tales como 7-aminoactinomicina D (7-AAD) de estar y permitiría la determinación de la viabilidad y la apoptosis en una ste experimentalpag. Como una alternativa para evaluar la viabilidad de las células T marcadas, a (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo de 3- se pueden utilizar para evaluar la actividad metabólica celular. La evaluación de los valores de captación y de flujo de salida con un calibrador de dosis y γ-counter están más avanzados, pero sigue siendo rápido y barato de conseguir ya que casi todos los laboratorios que trabajan con radiactividad tiene el hardware correspondiente en el sitio. La secuenciación de genes o los métodos basados ​​en microchip rendirían datos más detallados. Estos métodos, sin embargo, no siempre son de fácil acceso, necesitan conocimientos técnicos apropiados y más a menudo están vinculados a mayores costos.

Aunque PET no es capaz de alcanzar una resolución celular como técnicas de imágenes microscópicas 29, proporciona una excelente sensibilidad en el rango picomolar para la detección de incluso un pequeño número de células dentro de animales o seres humanos 8. En comparación con otras técnicas de imagen no invasivas tales como optical de formación de imágenes, PET es cuantitativo, no se limita en profundidad de penetración y proporciona imágenes de alta calidad con tres resoluciones dimensionales. La combinación de la alta sensibilidad de la PET con la precisión anatómica de la TC permite la obtención de imágenes de alta precisión de la migración celular. Además, los datos in vivo pueden ser fácilmente validados por varios métodos ex vivo incluyendo γ-cuenta para el análisis de biodistribución. La autorradiografía de secciones criogénicas y posterior tinción histológica de las secciones criogénicas puede ser superpuesta a correlacionar el mapa actividad autorradiográfica con los infiltrados de células inmunes identificadas por tinción de hematoxilina y eosina.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a la doctora Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, así como Natalie Altmeyer por el apoyo durante los experimentos y análisis de datos. Este trabajo fue apoyado por el Werner Siemens-Fundación, la DFG a través de la SFB685 (B6 proyecto) y la fortuna (2309-0-0).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber WKL Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 mL Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitroevaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30 G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µL VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

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References

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Inmunología No. 122 de formación de imágenes de animales Pequeño marcaje celular no invasiva el PET / CT las células T TH1 reacción de hipersensibilidad de las vías respiratorias de tipo retardado
Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT
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Hoffmann, S. H. L., Maurer, A.,… More

Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

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