Summary
Efter fremstillingen af en 64 Cu-modificeret monoklonalt antistofbinding til en transgen murin T-cellereceptor, T-celler radiomærkes in vivo, analyseret for levedygtighed, funktionalitet, stabilitet mærkning og apoptose og adoptivt overført i mus med en luftvej forsinket hypersensitivitet reaktionen til ikke-invasiv billeddannelse ved positronemissionstomografi / computertomografi (PET / CT).
Abstract
Denne protokol illustrerer fremstillingen af 64 Cu og chelatoren konjugation / radiomærkning af et monoklonalt antistof (mAb) efterfulgt af murine lymfocyt cellekultur og 64 Cu-antistofreceptor målretning af cellerne. In vitro bedømmelsen af det radioaktive og ikke-invasiv in vivo celle tracking i en dyremodel af en luftvej forsinkede type hypersensitivitetsreaktion (DTHR) af PET / CT er beskrevet.
I detaljer er konjugeringen af et mAb med chelatoren 1,4,7,10tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre (DOTA) vist. Efter produktionen af radioaktivt 64 Cu, radiomærkning af DOTA-konjugeret mAb beskrevet. Næste, udvidelse af kyllingeovalbumin (Cova) -specifik CD4 + interferon (IFN) -γ-producerende T-hjælperceller (Cova-TH1) og efterfølgende radioaktiv mærkning af Cova-Th1-celler er afbildet. Forskellige in vitro-teknikker præsenteres for at evaluere efeffekt for af 64 Cu-radioaktiv mærkning på cellerne, såsom bestemmelse af cellelevedygtighed ved trypanblåt-udelukkelse, farvningen for apoptose med Annexin V til flowcytometri, og vurderingen af funktionaliteten af IFN-γ enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) . Endvidere er bestemmelsen af det radioaktive optagelse i cellerne og stabiliteten mærkning beskrevet i detaljer. Denne protokol beskriver yderligere, hvordan man udfører celle sporing undersøgelser i en dyremodel for en luftvej DTHR, og derfor er induktionen af Cova-induceret akut luftvej DHTR i BALB / c-mus inkluderet. Endelig er en robust PET / CT arbejdsgang, herunder erhvervelse billede, genopbygning, og analyse præsenteres.
64 Cu-antistofreceptor målretning fremgangsmåde med efterfølgende receptorinternalisering giver høj specificitet og stabilitet, reduceret cellulær toksicitet og lave udstrømningshastigheder sammenlignet med almindelige PET-sporstoffer til cellemærkning, fx 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazon) (64 Cu-PTSM). Endelig vores tilgang muliggør ikke-invasiv in vivo cellesporing af PET / CT med et optimalt signal-baggrund-forhold i 48 timer. Denne eksperimentelle fremgangsmåde kan overføres til forskellige dyremodeller og celletyper med membranbundne receptorer, som internaliseres.
Introduction
Non-invasiv celle tracking er et alsidigt værktøj til overvågning af cellefunktion, migration og homing in vivo. Nylige celle sporing undersøgelser har fokuseret på mesenchymal 1, 2 eller knogle-marv afledte stamceller 3 i forbindelse med regenerativ medicin, autologe perifere hvide blodlegemer i inflammation eller T-lymfocytter i adoptiv celleterapi mod cancer 3, 4. Belysning af de steder, hvor handling og de underliggende biologiske principper for cellebaserede behandlinger er af enorm betydning. CD8 + cytotoksiske T-lymfocytter, gensplejset kimære antigenreceptor (CAR) T-celler eller tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er) blev bredt betragtes som den gyldne standard. Imidlertid har tumorassocierede antigenspecifikke TH1-celler vist sig at være et effektivt alternativ behandlingsmulighed 4, </ sup> 5, 6, 7.
Som centrale aktører i inflammation, organspecifikke autoimmune sygdomme (fx rheumatoid arthritis eller bronkial astma), og celler af høj interesse i cancerimmunterapi, er det vigtigt at karakterisere de tidsmæssige fordeling og målsøgende mønstre af TH1-celler. Noninvasive in vivo-afbildning af PET præsenterer en kvantitativ, meget følsom metode 8 at undersøge celle migrationsmønstre, in vivo målsøgende, og stederne for T-celle handling og reaktioner under inflammation, allergier, infektioner eller tumorafstødningsantigen 9, 10, 11.
Klinisk 111In-oxin anvendes til leukocyt scintigrafi for diskrimination af inflammation og infektion 12, medens 2-deoxy-2- (18F) fluor-D-glucose (18 F-FDG) er almindeligt anvendt til celle sporing undersøgelser af PET 3, 13. En væsentlig ulempe ved denne PET-sporstof, er imidlertid den korte halveringstid af radionuklidet 18F på 109,7 minutter, og den lavt intracellulært stabilitet, som hindrer billeddannelse på senere tidspunkter efter adoptiv celleoverførsel. Ved længere tids in vivo celle sporing undersøgelser af PET, selv ustabil i cellerne, er 64 Cu-PTSM ofte anvendes til ikke-specifikt at mærke celler 14, 15 med minimerede skadelige virkninger på T-celle levedygtighed og funktion 16.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til yderligere at reducere ugunstige virkninger på cellelevedygtighed og funktion under anvendelse af en T-cellereceptor (TCR) -specifik radiomærket mAb. Første, produktionen af den radioaktive isotop 64 Cu, konjugeringen af mAb KJ1-26 med the chelator DOTA og den efterfølgende 64 Cu-radiomærkning er vist. I et andet trin, er isolering og ekspansion af Cova-TH1 celler af DO11.10 donormus og radiomærkningen med 64 Cu-loaded DOTA-konjugeret mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) beskrevet i detaljer. Vurderingen af uptake værdier og udstrømning af radioaktivitet med en dosiskalibrator og ved y-tælling henholdsvis samt evaluering af virkningerne af 64 Cu-radioaktiv mærkning på cellelevedygtighed ved trypanblåt-udelukkelse og funktionalitet med IFN-y ELISA præsenteres . Til ikke-invasiv in vivo celle sporing, er fremkaldelsen af en musemodel for Cova-induceret akut luftvej DTHR og billedoptagelse af PET / CT efter adoptiv celleoverførsel beskrevet.
Desuden kan denne mærkning fremgangsmåde overføres til forskellige sygdomsmodeller, murine T-celler med forskellige TCR'er eller generelle celler af interesse med membranbundne receptorer eller ekspression markers underliggende kontinuerlig membran shuttling 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sikkerhedsforanstaltninger: Ved håndtering radioaktivitet, opbevares 64 Cu bag 2-tommer-tykke bly mursten og bruge respektive afskærmning for alle skibe med aktivitet. Anvend passende redskaber til indirekte håndtere uskærmede kilder for at undgå direkte hånd kontakt og minimere eksponeringen for radioaktivt materiale. Brug altid strålingsdosimetri overvågning badges og personlige værnemidler og kontrollere sig selv og arbejdsområdet for forurening til straks at tage fat på det. Kassere potentielt kontaminerede personligt sikkerhedsudstyr forud for forlader det område, hvor der anvendes radioaktive stoffer. Lagre hele radioaktivt affald bag blyafskærmning indtil den radioaktive 64 Cu henfaldet (ca. 10 halveringstider = 127 timer), før passende bortskaffelse.
1. 64 Cu Production
BEMÆRK: radioisotop 64 Cu produceres via 64 Ni (p, n) 64 Cu kernereaktion anvendelse af en Pettløb cyklotron ifølge en modificeret protokol af McCarthy et al. 18.
- For 64 Cu produktion, bestråle 64 Ni, som elektropletteret på en platin / iridium plade (90/10), med 30 uA i 6 timer med en protonstråle på 12,4 MeV.
- Opvarme målet for platin / iridium til 100 ° C i en dedikeret polyetheretherketon (PEEK) kammer og inkuber i 2 ml koncentreret HCI i 20 minutter for at opløse 64 Cu / 64 Ni.
- Tilføje endnu 1 ml koncentreret HCI og inkuberes i 10 min.
- Fordampe HCI under anvendelse af en strøm af argon og afkøles kammeret til stuetemperatur.
- Skylle kammeret med 3 ml 4% 0,2 M HCI og 96% methanol (vol / vol) og overføre denne opløsning til en ionbyttersøjle, der var prækonditioneret med 4% 0,2 M HCI i methanol i mindst 15 min. Gennemløbet kan anvendes til at genanvende 64 Ni.
- Vask 64 Cu tilbageholdt i søjlen med 4% 0,2 M HCI in methanol.
- Eluer 64 Cu med 70% 1,3 M HCI / 30% isopropanol (v / v) i en samling hætteglas, inddampes opløsningen i en strøm af argon og lad hætteglasset afkøles til stuetemperatur.
- Opløs 64 Cu i 140-210 pi 0,1 M HCI.
2. Antistof Konjugation med DOTA og efterfølgende 64 Cu-radioaktiv mærkning
BEMÆRK: chelator DOTA vil blive knyttet til funktionelle aminogrupper i mAb med N-hydroxysuccinimid (NHS) -ester kemi og konjugatet efterfølgende vil blive radioaktivt mærket med 64 Cu 19.
- Indstille koncentrationen af KJ1-26-mAb til 8 mg / ml og diafiltrat 1 ml mAb opløsning mod 0,1 M Na2HPO 4 pH 7,5 behandlet med 1,2 g / l af en chelateringsionbytterharpiks anvendelse af en molekylvægtsafskæring ( MWCO 30 kDa) centrifugalfilterenhed. Anvendelse 3 efterfølgende vasketrin med 14 ml af bufferen. Efter den sidste vasketrinkoncentrere opløsningen igen til 1 ml. Kvantificere den antistofkoncentration ved OD280nm målinger.
- Forberede et DOTA-NHS opløsning i ultrarent eller PCR-grade vand ved en koncentration på 10 mg / ml umiddelbart før anvendelse. Lad hætteglasset justere til stuetemperatur, før åbningen for at undgå vandkondensation, og fjern DOTA-NHS ved anvendelse af en plast spatel. Tilføj 216 pi af denne DOTA-NHS opløsning til 8 mg af den diafiltrerede KJ1-26-mAb opløsning, blandes grundigt, og der inkuberes i 24 timer ved 4 ° C på en tromleblander.
- Diafiltrat DOTA-KJ1-26-mAb mod 0,25 M ammoniumacetat, pH 7,0, behandlet med 1,2 g / l af en chelateringsionbytterharpiks, under anvendelse af en molekylvægt (MWCO 30 kDa) centrifugalfilterenhed. Påfør 7 vasketrin. Koncentrer mAb til et endeligt volumen på 1 ml og igen måle proteinkoncentrationen ved OD280nm målinger.
- Før radiomærkning ombytte bufferen af DOTA-KJ1-26-mAb mod PBS via størrelse-exclusion under anvendelse gelfiltreringskolonner. Dette fjerner også potentielle lavmolekylære urenheder.
- Forbered 100 MBq 64 CuCl2-opløsning i 10 mM HCI og pH indstilles til 6-7 med 10x PBS. Tilsæt 200 ug af DOTA-KJ1-26-mAb. Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C.
- Til kvalitetskontrol, udføre tyndtlagskromatografi med 0,1 M natriumcitrat (pH 5) som den mobile fase og analysere ved autoradiografi. Mindst 90% af aktiviteten bør være bundet til antistoffet og således påvises ved start stedet. Ubundet aktivitet er chelateret af citrat-baserede mobile fase og striber til opløsningsmiddelfronten. Efter en reference, er anvendelsen af 64 CuCI2 tilrådes.
3. Kylling Ovalbumin-specifikke TH1 (Cova-TH1) Cell Isolering og Udvidelse
BEMÆRK: kultur af TH1 celler er beskrevet i henhold til tidligere offentliggjorte studier 16, 17.
- Isoler milt og extraperitoneal lymfeknuder (LN) fra DO11.10 mus.
- Sacrifice musen i henhold til føderale lovgivning. Desinficere dyret med 70% ethanol og fikser det med tape til fjernelse af milten og LN. Lav en median incision og adskille huden fra bughinden ved siden at trække den til hvert sted.
- Lokalisere det cervikale, aksiale, brachial og ingvinale LN. Fjerne dem med stump pincet og placere dem i 1% føtalt kalveserum (FCS) / PBS-buffer.
- Åbn bughinden og find milten. Adskil milten fra bugspytkirtlen og bindevæv og placere den i 1% FCS / PBS-buffer. For yderligere vejledning, se referencer 20,21.
- Hakkekød milt og LN gennem et 40 um filter i en 50 ml skruelåg rør under anvendelse af stemplet på en sprøjte. Filteret skylles med 10 ml 1% FCS / PBS-buffer.
- Centrifugere ved 400 xg i 5 minutter og fjern supernatanten. Subsequently, udføre lyse af erythrocytter ved tilsætning ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysisbuffer (1,5 ml pr donordyret) i 5 minutter ved stuetemperatur. Tilføje 8,5 ml 1% FCS / PBS-buffer (per donordyret).
- Centrifuger cellerne ved 400 xg i 5 minutter og fjern supernatanten. Vask cellerne i 10 ml 1% FCS / PBS-puffer, centrifugeres ved 400 xg i 5 minutter og fjern supernatanten.
- Til magnetisk celleseparation, resuspendere cellerne i 1% FCS / PBS-buffer, og tilføj CD4 + mikroperler. Se producentens anvisninger for buffervolumenet og mængden af CD4 + mikroperler at bruge.
- Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C. Tilsæt derefter 1% FCS / PBS-buffer op til 50 ml, centrifugere cellerne ved 400 xg i 5 minutter, og fjern supernatanten.
- Fortsæt med CD4 + T-celle isolation under anvendelse af kommercielle magnetisk separationskolonner og en respektiv magnet tribune ifølge fabrikantens protokol. Justere de eluerede CD4 + T-celler til en concentration af 10 6 celler / ml i Dulbeccos modificerede Eagles medium med 10% varmeinaktiveret FCS, 2,5% penicillin / streptomycin, 1% HEPES buffer, 1% MEM aminosyrer, 1% natriumpyruvat og 0,2% 2-mercaptoethanol og lagre dem ved 4 ° C.
- Indsamle kolonnen udladning i et 50 ml rør med skruelåg til fremstilling antigenpræsenterende celler (APC'er). Centrifugeres søjlen udladning ved 400 xg i 5 minutter og fjern supernatanten.
- Tilføje 10 pg / ml anti-CD4 (klon: GK1.5), 10 pg / ml anti-CD8 (klon: 5367,2) og 10 pg / ml muse-anti-rotte-mAb (MAR18.5) og 1,5 ml kaninkomplement. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C.
- Centrifuger cellerne ved 400 xg i 5 minutter, supernatanten fjernes, og der tilsættes 3 ml medium. Bestråle APC'erne på en γ-ray eller røntgenkilde med 30 Gy i alt. Bagefter justere APC'er til en koncentration på 5 x 10 6 celler / ml.
- Tilsæt 100 pi af CD4 + T-celler og 100 pi APC'er på en 96-brønd plate sammen med 10 ug / mL cOVA 323-339-peptid, 10 ug / ml anti-IL-4-mAb, 0,3 uM CPG1668-oligonukleotider og 5 U / ml IL-2.
- Tilføj 50 U / ml IL-2 hver anden dag. Efter 3 - 4 dage, overføre cellerne fra plader med 96 brønde til 24-brønds plader. Kombiner 3-5 brønde fra 96 brønde i en brønd på 24-brønds plade. Tilsæt 100 U / ml IL-2 indeholdende medium i et 1: 1 forhold.
- Efter yderligere 2-3 dage, overføre cellerne fra 48-brønds plade til 175 cm 2 celledyrkningskolber (1 x 48-brønds plade pr kolbe). Fyld med medium i en 1: 1-forhold. Tilføj 50 U / ml IL-2 hver anden dag.
- Splitte celler ifølge celletæthed og tilsættes 50 U / ml IL-2 hver anden dag. På denne måde kultur cellerne i yderligere 10 dage.
4. Cova-TH1 Cell Radioaktiv mærkning
BEMÆRK: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb vil blive anvendt til dyrkede Cova-TH1-celler for at muliggøre intracellulær radioaktiv mærkning.
- For Cova-TH1 cell radiomærkning, uafgjort 37 MBq den radiomærkede 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i en sprøjte uden dødvolumen anvendelse af en dosis kalibrator. Tilsæt 1 ml saltvand til at modtage en 37 MBq / ml opløsning.
- Suspender Cova-Th1-celler i medium ved 2 x 10 6 celler / ml og tilsæt 0,5 ml af cellesuspensionen til hver brønd i en 48-brønds plade.
- Tilsæt 20 pi af de friskfremstillede 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb opløsning til hver brønd i 48-brønds plade. Det endelige forhold for mærkning er 0,7 MBq per 10 6 celler i et volumen på 520 pi. Der inkuberes ved 37 ° C og 7,5% CO2 i 30 minutter.
- Efter inkubation omhyggeligt resuspendere cellerne i hver brønd og overføre cellesuspensionen fra 48-brønds plade i en 50 ml skruelåg rør. For at minimere celletab, skylles hver brønd med forvarmet medium.
- Centrifugeres Cova-TH1 cellesuspension ved 400 xg i 5 minutter, supernatanten, og cellerne resuspenderes i 10 ml forvarmet PBS. Fjern en aliquot af cellesuspensionen til celletælling. Gentag vasketrinet.
- Tæl levedygtige Cova-Th1-celler i en passende fortynding med trypanblå farvning.
- Juster cellekoncentrationen til 5 x 10 7 celler / ml til intraperitoneal (ip) injektion af 10 7-celler i 200 pi PBS.
- Gentage trin 4,3-4,5 at radiomærke Cova-TH1-celler med stigende mængder af aktivitet, fx 1,4 MBq eller 2,1 MBq per 10 6 celler.
- At radiomærke af cellerne med 1,4 MBq per 10 6 celler, bruger 40 pi af de 37 MBq / ml 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb opløsning og 60 pi til radiomærkning med 2,1 MBq per 10 6 celler. Udføre trinene 4,3-4,7 med 0,7 MBq, 1,4 MBq og 2,1 MBq 64 kobber og PTSM men øge den tid mærkning til 3 h for komparative undersøgelser 17.
- Fortsæt til trin 5 for at bestemme den optimale mængde aktivitet.
5. In vitro evaluering af virkningen af det radioaktive om Cova-Th1-celler
BEMÆRK: Karakteriseringen af påvirkninger af det radioaktive mærke på TH1 celler udføres via trypanblåt-udelukkelse assay for levedygtighed, IFN-y ELISA for funktionalitet vurdering og PE-Annexin V-farvning til induktion af apoptose 16, 17. Bestemmelse af intracellulære optagelse og udstrømningen af radioaktivitet er også beskrevet nedenfor. Som sammenligning kan 64 Cu-PTSM-mærket Cova-TH1-celler også anvendes.
- Effekt på levedygtighed ved trypanblå eksklusion
- At justere mindst 18 x 10 6 Cova-TH1 celler radioaktivt mærkede med 0,7 MBq / 10 6 celler, 1.4 MBq / 10 6 celler og 2,1 MBq / 10 6 celler henholdsvis til en koncentration på 2 x 10 6 celler / ml og udføre trin 5.1. 2-5.1.7 for hver aktivitet dosis. Brug ikke-radioactive KJ1-26-mAb mærket Cova-TH1-celler og umærkede Cova-TH1-celler som kontrollerne.
- Pipetter 1 ml af cellen opløsning i 9 brønde i en plade med 24 brønde.
- Samle indholdet af 3 brønde i 3 separate 15 ml skruelåg rør, 3 timer efter indledende radioaktiv mærkning.
- Skyl nu tomme brønde med forvarmet medium for at minimere celletab og tilføje mediet til de respektive 15 ml skruelåg rør fra trin 5.1.3.
- Centrifuger 15 ml rør ved 400 xg i 5 min og resuspender resulterende cellepellet i 1 ml forvarmet medium.
- Tæl både levedygtige og døde celler i trypanblåt særskilt for hver 15 ml rør og beregne procentdelen af levedygtige celler.
- Gentage trin 5.1.3-5.1.6 24 og 48 timer efter 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomærkning.
- Virkninger på funktionalitet bestemt ved IFN-y-ELISA
BEMÆRK: For at vurdere virkningen af den 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomærke på IFN-γ production som en markør for funktionalitet, udføre et IFN-γ ELISA fra en kommerciel leverandør og henviser til referere 17 for yderligere detaljer.- Dispergere 10 5 levedygtige celler i 100 pi medium på en 96-brønds plade, 3 timer efter 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomærkning af Cova-TH1-celler med 0,7 MBq, 1,4 MBq eller 2,1 MBq. Anvende ikke-mærkede, ikke-radioaktive KJ1-26-mAb-mærkede eller 64 Cu-PTSM-mærkede Cova-TH1-celler som kontrollerne.
- Stimulere IFN-γ-produktion i 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-TH1 celler i 100 pi medium med 10 ug / ml Cova peptid, 5 U / ml IL-2 og 5x10 5 APC'er i 100 pi medium i 24 timer ved 37 ° C og 7,5% CO2. Yderligere kontrol kan være de andre betingelser uden tilsætning af Cova peptidet.
- Analyser supernatanten ved ELISA i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Gentag trin 5.2.2. til 5.2.3. 24 og 48 timer efter proceduren mærkning.
- Induktion af apoptose bestemt ved PE-Annexin V-farvning til flowcytometri
BEMÆRK: For at vurdere apoptose induktion ved 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomærke, bruge et kommercielt tilgængeligt kit til flowcytometri og forberede celleprøver ifølge producentens instruktioner før farvning med Annexin V for phosphatidylserin redegørelse på cellemembranen .- På 3, 24 og 48 timer efter 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomærkning af Cova-Th1-celler, bejdse triplikater med mindst 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-TH1-celler med Annexin V kit i overensstemmelse med producentens anvisninger og analysere inden for den næste time. Anvende ikke-radioaktive KJ1-26-mAb-mærkede, 64 Cu-PTSM-mærkede og umærkede Cova-TH1-celler som kontroller. Der henvises til referere 17 for yderligere oplysninger.
- Optagelse og udstrømning
BEMÆRK: optagelse af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i cellerne måles i et dosiskalibrator og udstrømningen af radioaktivitet måles i en γ-optælling assay 0, 5, 24 og 48 timer efter radioaktiv mærkning.- Forberede ti γ-tælleglas hver til 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-TH1-celler, den respektive supernatant og vasketrinnet.
- Transfer 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærket Cova-Th1-celler i 1 ml medium i hver af de ti γ-tælleglas direkte efter radiomærkning. For hvert af tidspunkterne 5, 24 og 48 timer efter radiomærkning holde mindst 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-TH1-celler i medium på 24-brønds celledyrkningsplader i en inkubator ved 37 ° C og 7,5% CO2.
- Centrifuger γ-tælleglas ved 400 xg i 5 min og overføre supernatanten i ti nye γ-tælleglas.
- Vask cellerne en gang i 1 ml medium for at fjerne den ubundne fraktion af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb etd indsamle supernatanten i ti nye γ-tælleglas.
- Tilsæt 1 ml nyt medium til Cova-TH1-celler og bestemme den oprindelige optagelse værdi i en dosiskalibrator. Rørene kan også lagres i en inkubator ved 37 ° C og 7,5% CO2.
- Gentage trin 5.4.2 til 5.4.5 efter 5, 24 og 48 timer og måle alle rør i en γ-tæller ifølge fabrikantens protokol. At korrigere for radioaktivt henfald og for kvantitativ analyse anvendes en standard med en defineret dosis af radioaktivitet.
6. OVA-induceret akut Airway DTHR
BEMÆRK: migration dynamik og målsøgende mønstre af adoptivt overførte og radiomærket Cova-TH1 celler til stedet for inflammation vil blive visualiseret og kvantificeret i en dyremodel for Cova luftvejsreaktioner-DTHR 16, 17.
- Injicere 8 uger gamle BALB / c-mus ip med en blanding af 150 pi aluminum gel / 50 pi Cova-opløsning (10 ug i 50 pi PBS) til at immunisere musene.
- To uger efter immuniseringen, bedøver musene med 100 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin ved ip injektion. Placer de eksperimentelle mus på ryggen og langsomt pipetteres 100 pg Cova opløst i 50 pi PBS i næseborene af dyr. Dyrene vil inhalere opløsning dråbe for dråbe.
- Gentag efter 24 timer. For stærkere luftvejs DTHR induktioner, gentage igen efter 48 timer.
- At analysere den specifikke migration af de overførte Cova-TH1-celler, inducerer luftvejs-DTHR med kalkun-eller fasan-OVA som kontrol. Derfor Gentag trin 6.1-6.3 ved anvendelse af den respektive OVA-protein.
7. In vivo Imaging Brug af PET / CT
BEMÆRK: In vivo billeddannelse af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-TH1 celler i Cova-DTHR syge mus og kontroldyr fra samme kuld demonstrerer den specifikke målsøgning og migration dynamik Cova-TH1-celler. Derfor erhverve statiske PET scanninger og anatomisk CT scanner sekventielt 3, 24 og 48 timer efter adoptiv celleoverførsel.
- Direkte efter radioaktiv mærkning, justere de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-TH1-celler til 5 x 10 7 celler / ml for ip injektion af 10 7-celler i 200 pi.
- Anvendelse af en 1 ml sprøjte og en 30-gauge kanyle, tegne 200 pi af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærket Cova-TH1 cellesuspensionen og injicere cellerne ip i Cova-DTHR-syge dyr mellem 4 og 5. brystvorte. At bestemme den samlede injicerede mængde radioaktivitet, måle sprøjten i en dosiskalibrator før og efter injektion.
- Bedøver de mus, 10 minutter før den ønskede optagelse tid, med 1,5% isofluran i 100% oxygen (strømningshastighed: 0,7 l / min) i et temperaturkontrolleret anæstesi kassen.
- I mellemtiden, for at lette co-registreringaf PET- og CT-billeder under billedanalyse, fix glaskapillarer indeholdende 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb opløsning eller gratis 64 CuCl2 opløsning under musen seng.
- Derfor fremstille en opløsning af 0,37 MBq / ml og fyld glaskapillarer med et volumen på 10 pi med denne opløsning. Eftersom celleafledte radioaktivitet signaler er i sagens natur svage, ikke bruger store mængder af aktivitet for at sikre, at markørerne ikke forstyrrer celleafledte signaler i mus.
- Efter at have nået kirurgisk tolerance, som indikeret ved tab af pedalen tilbagetrækning refleks af bagbenet, overføre musen på et PET-og CT-kompatible lille dyr seng udstyret med en passende rørsystem for at opretholde anæstesi.
- Immobilisere musen på den lille dyr sengen ved hjælp af vatpinde og kirurgisk tape. Anvend øjensalve for at undgå udtørring af øjnene.
- Overfør musen sengen til PET-scanner, centrere synsfeltet med en focus på lungerne og erhverve en 20 min statisk PET-scanning med en energi vindue på 350-650 keV.
- Overfør musen sengen til CT-scanner. Via spejder opfattelse, centrere synsfeltet på lungerne. Erhverve en plan CT billedet via 360 projektioner under en 360 ° drejning i "trin og skyde" tilstand med en eksponeringstid på 350 ms og binning faktor 4.
8. Billedanalyse
- Rekonstruere PET dataliste-mode ved at anvende statistisk iterativ bestilt delmængde forventning maksimering (OSEM) 2D algoritme og CT-scanninger i et 3D-billede med en pixelstørrelse på 75 um.
- Til billedet co-registrering i et passende billedanalyse software (f.eks Inveon Research Arbejdsplads eller PMOD), bruge den automatiske co-registrering værktøj. Hvis dette mislykkes, bruge glaskapillarer under musen seng som vejledning til at co-registrere de rekonstruerede PET- og CT-billeder rumligt i den aksiale, koronale og sagittal visning.
- Ret de PET-billederfor radioaktivt henfald ved anvendelse af radioaktive henfald lov og den halve tid af radionuklidet 64 Cu på 12,7 timer. Til billedet normalisering, vælge et billede (A) som en reference og justere intensiteten af displayet billedet i det respektive billede analyse software.
- Ved hjælp af værdierne netop sat for henvisningen billedet (A), den injicerede aktivitet (A) og den injicerede aktivitet for de andre billeder (X), normalisere de andre billeder ved hjælp af følgende ligning: (injiceret aktivitet (X) / injiceret aktivitet ( A)) x intensitetsværdier (A).
- Tegn 3D mængder af interesse (VOI) på det normaliserede PET-signalet af de pulmonale og perithymic LN.
- Bestemmelse af procentdelen injiceret dosis pr cm3 (% ID / cm3) ved følgende ligning: (middel aktivitet i VOI / samlede aktivitet i mus) x 100. For yderligere retningslinjer for billedanalyse, se referencer 22, 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 opsummerer mærkning af Cova-TH1-celler med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb og det eksperimentelle design til in vitro og in vivo studier, der er omfattet i denne protokol.
Figur 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb Mærkning Proces & Experimental Design. (A) Skematisk gengivelse af radioaktiv mærkning celle med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb binder til Cova-TCR-receptorer på celleoverfladen af Th1-celler og internaliseres med receptoren inden 24 timer. Cova-TCR'er er re-udtrykte 24 timer efter radiomærkning. (B) CD4 + T-celler blev isoleret, ekspanderet og radioaktivt mærket med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in vitro. Optagelse og efflux værdier were bestemmes ved en dosiskalibrator og γ-tælling. Virkninger af det radioaktive antistof på cellelevedygtigheden blev vurderet med trypanblåt-farvning, på funktionalitet med IFN-y ELISA og på induktion af apoptose med Phycoerythrin (PE) -Annexin V farvning. (C) Cova-luftvej DHTR blev induceret i BALB / c-mus. 10 7 TH1 celle blev adoptivt overført til Cova-luftvejs DHTR-syge dyr direkte efter radiomærkning. PET / CT-billeder blev erhvervet 3, 24 og 48 timer efter adoptiv celleoverførsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den succesfulde intracellulære mærkning af TH1-celler med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb blev bekræftet ved immunhistokemi (figur 2A). 64 Cu-DOTA-KJ1-26 antistof (grøn) blev co-lokaliseret medCD3 på cellemembranen 3 timer efter radiomærkning medens signalet af mAb på cellemembranen var kun svag ved 24 timer (gul). Ved 48 timer efter radiomærkning blev 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR-komplekset internaliseres via endocytose med et stærkt signal i cytoplasmaet af Th1-celler. Den anvendte radioaktive dosis på 0,7 MBq reducerede levedygtigheden af TH1-celler med kun 8%, mens højere doser af 1,4 MBq og 2,1 MBq 64 kobber og DOTA-KJ1-26-mAb havde mere udtalte virkninger. Sammenlignet med radioaktiv mærkning med 64 Cu-PTSM blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant fordel ved 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (figur 2B). 64 Cu-antistof radiomærkede celler udviste lille tab i funktionalitet som vist ved IFN-γ-sekretion (figur 2C), reduceret udstrømning af radioaktivitet (figur 2D), og reduceret induktion af apoptose (fig 2E) sammenlignet med 64 Cu-PTSM-mærket TH1 celler.
Figur 2: In vitro Evaluering af radioaktivt TH1 Cell Mærkning med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. (A) Konfokal mikroskopi viser den intracellulære optagelse af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb'er (grøn) i Cova-TH1-celler (cellemembranen; rød) inden 24 timer efter indledende mærkning (Dette tal er modificeret fra henvisningen 17) . (B) Titrering af radioaktive mærkning doser på 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM afslørede en lige indflydelse på levedygtigheden som detekteret ved trypanblåt-udelukkelse 24 timer efter mærkning. Brugen af 0,7 MBq til cellemærkning inducerede de laveste værdiforringelse af levedygtigheden (middelværdi ± SD i procent;. Dette tal er blevet modificeret fra referencer 16, 17 (C) Titrering af radioaktiv mærkning doses af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM afslørede en stærkere forringelse af funktionaliteten efter 64 Cu-PTSM mærkning, som påvist ved IFN-y ELISA 24 timer efter mærkning. En stigende dosis på 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i cellemærkning havde ingen indflydelse på funktionaliteten (middelværdi ± SD i procent; statistikker: t-test; * p <0,05, ** p <0,01, ** * p <0,001; dette tal er blevet modificeret fra referencerne 16, 17). (D) efflux målinger af radioaktivt mærkede celler (γ-tælling) viste en højere stabilitet af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb mærkning sammenlignet med 64 Cu-PTSM 5 timer og 24 timer efter mærkning (middel ± SD i procent; statistikker : t-test; *** p <0,001; dette tal har været ændret siden 17). (E) Respektive flowcytometri (PE-Annexin V) diagrammer angiver en højere apoptosis induktion 24 timer efter 64 Cu-PTSM mærkning sammenlignet med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkning (Dette tal er modificeret fra henvisning 17). Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter adoptiv overførsel af 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-TH1 celler ind Cova-DTHR-syge dyr og ubehandlede kontroller, høj opløsning statisk PET og anatomiske CT-billeder blev erhvervet. Til billedanalyse blev billeder fusioneret i den koronale, aksiale og sagittalt billede ved hjælp af glaskapillarer indeholdende en lille mængde af 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (figur 3A). Vois blev trukket på de pulmonære og perithymic LN'er på henfaldsprodukterne-korrigerede og normaliseret PET billeder til beregning af procentdelen af injiceret dosis pr cm3(Figur 3B).
Figur 3: PET / CT-co-registrering og analyse. (A) PET- og CT-billeder blev co-registreret i billedanalyse-software. Hvis automatiseret registrering af softwaren mislykkedes, blev billederne fusioneret ved at overlejre PET og CT signaler af glaskapillarer (markers), fyldt med radioaktivitet og faste under dyret seng. (B) vois placeres på de korrigerede og normaliserede PET signalerne fra de perityhmic og pulmonale LN. Klik her for at se en større version af dette tal.
Cova-TH1 cellemigration blev sporet til det pulmonale og perithymic LN som Cova-præsentation steder i luftvejene DTHR. In vivo PET signaler deoppebæres fra 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-mærkede Cova-Th1-celler var betydeligt højere end signaler fra 64 Cu-PTSM-mærkede celler (figur 4A). Cova-TH1 celleoptagelse værdier i de pulmonære og perithymic LN blev signifikant forøget i DTHR-syge dyr sammenlignet med ubehandlede kontroldyr fra samme kuld (figur 4B).
Figur 4: Cova-TH1 Cell Tracking i Airway DTHR Model af in vivo PET / CT. (A) Respektive PET / CT billeder af adoptivt overført Cova-Th1-celler, der tidligere var mærket med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb eller 64 Cu-PTSM, i Cova-DTHR-sygdomsramte eller ubehandlede mus. De overførte Cova-TH1-celler homed til de pulmonale og perithymic LN. (B) Kvantitativ analyse af homing sites af Cova-TH1-celler viste sig en højere homing til betændte væv (gennemsnit ± SD, statistikker: t-test; * p <0,05, ** p <0,01). Mærkning med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb viste sig en højere følsomhed (forøget% ID / cm3) sammenlignet med 64 Cu-PTSM i de forskellige målsøgende sites (gennemsnit ± SD, statistik: t-test; # p <0,05, ## p <0,01, ### p <0,001). Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 16, 17. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol udgør en pålidelig og nem metode til stabilt radiomærke celler til in vivo sporing af PET. Anvendelse af denne fremgangsmåde, Cova-Th1-celler, isoleres og ekspanderes in vitro fra donormus, kunne være radioaktivt mærket med 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb og deres målsøgning blev sporet til de pulmonale og perithymic LN'er som lokaliteter af Cova præsentation i en Cova-induceret akut luftvej DTHR.
Modifikationen af mAb med chelateringsmidlet kræver hurtig og effektiv bearbejdning og anvendelse af ultra-rene opløsninger uden spor af aminer. Opløsningerne blev behandlet med en chelerende ionbytterharpiks for at sikre korrekt konjugation af DOTA-NHS-aktiv ester til amin rester af mAb. Chelatoren-konjugeret mAb som et intracellulært radiomærke har flere fordele i forhold til anvendelsen af ikke-specifikke mærkning celle midler. For det første mAb giver fremragende specificitet giver mulighed for målrettet mærkning af en defineret cellepopulation. den mAbselv er ikke cytotoksisk og har ingen skadelig virkning på levedygtighed eller funktionaliteten af cellerne. Dernæst blev udstrømningen af radioaktivitet fra cellerne signifikant reduceret forbedre signal-til-baggrund-forholdet af PET billeder 17, 24. Ved at vælge et mAb med en anden specificitet er denne fremgangsmåde let overføres til andre cellepopulationer af interesse såsom CD8 + TIL eller CD14 + monocytter. Desuden kan denne celle tilgang mærkning anvendes til celle sporing undersøgelser i forskellige dyremodeller af inflammatoriske humane sygdomme (fx rheumatoid arthritis og bronkial astma) eller dyremodeller for forskellige typer humane cancerceller. Denne fremgangsmåde mærkning er imidlertid begrænset til membranbundne receptorer eller opdelinger markører som mål eftersom mAb'er ikke passivt diffundere over cellemembranen. Aktiveringen-induceret internalisering af målet eller blot membran-shuttling fordelagtig. ENhøjaktivitets mellem mAb'et og målet kunne imidlertid også være tilstrækkeligt til in vivo afbildning, eventuelt med et reduceret signal til baggrund-forhold.
Valget af DOTA som en chelator for vores eksperimenter var baseret på tidlig arbejde ved hjælp af 64 Cu 25. Men i mellemtiden DOTA blev vist ikke være en optimal chelator for denne isotop, hvilket fører til temmelig høje aktivitet optagelse i leveren ved transchelatering til superoxiddismutase 26. Selvom brug det radiomærkede antistof til in vitro-mærkning af celler, der derefter adoptivt overførte bør nedsætte risikoen for 64 Cu frigivelse og transport til leveren, moderne chelatorer optimeret til 64 Cu, ligesom 1,4,7-triazacyclononan, 1-glutarsyre -4,7-eddikesyre (NODAGA) eller 1,4,7-triazacyclononan-trieddikesyre (NOTA), kan fortrinsvis anvendes med vores fremgangsmåde til yderligere at øge specificiteten af de opnåede data 27 64 Cu (fx N-chlorsuccinimid (NCS)) eller andre isotoper, såsom 89 Zr (f.eks desferrioxamin;. DFO).
Valget af 64 Cu som radioisotopen var baseret på det faktum, at in vivo-cellevandring og homing er en temmelig langsom proces i forhold til metaboliske ændringer sædvanligvis afbildet af PET. 64 Cu med en halveringstid på cirka 12,7 timer muliggør gentagen billeddannelse af cellemigration i løbet af 48 timer efter injektion. For 64 Cu produktion, er det vigtigt at anvende high-grade opløsninger uden spormetalioner at sikre renheden af 64 Cu. Desuden er renheden af 64 Cu er af stor betydning for radiomærkning af DOTA-mAb siden multivalent metalionurenheder kunne føre til en reduceret specifik aktivitet af 64 Cu opløsning til niveauer, der udelukker protein radiomærkning og følgelig billeddannelse. Selvom 64 Cu frembringer en significant procentdel af stærkt energiske, cytotoksiske Auger-elektroner når rådnende 28, en justeret dosis af radioisotopen tolereres godt af cellerne som repræsenteret ved minimale virkninger på levedygtighed og funktionalitet og lav apoptoseinduktion efter radioaktiv mærkning. Alligevel er det klart tilrådeligt i første omgang at titrere aktivitet dosis, der anvendes til radioaktiv mærkning til andre celletyper og justere radiomærkning protokol. Hurtig og nem in vitro evalueringsmetoder er blevet påvist i protokollen, herunder bestemmelse af levedygtighed ved trypanblåt-udelukkelse og farvning med PE-Annexin V til bestemmelse af de apoptotiske fraktioner af cellerne. Begge metoder er relativt billige og bruger let tilgængelige laboratorieudstyr. Kombinere PE-Annexin V-farvning med et farvestof for diskrimination af levende og døde celler, såsom 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ville give mulighed for bestemmelse af levedygtighed og apoptose i en eksperimentel stes. Som et alternativ til at vurdere levedygtigheden af mærkede T-celler, kan en 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT-) assay anvendes til at vurdere cellen metabolisk aktivitet. Evalueringen af optagelses- og efflux værdier med en dosiskalibrator og γ-tæller er mere avancerede, men stadig hurtigt og billigt at opnå, da næsten alle laboratorium arbejder med radioaktivitet har den respektive hardware på stedet. Gensekvensering eller mikrochip-baserede metoder ville give mere detaljerede data. Disse metoder er imidlertid ikke altid let tilgængelige, har brug for passende ekspertise og er oftest forbundet med højere omkostninger.
Selvom PET er ikke i stand til at nå frem til en cellulær beslutning ligesom mikroskopiske billeddannelsesteknikker 29, det giver fremragende følsomhed i picomolær området til påvisning af selv små antal celler inden dyr eller mennesker 8. Sammenlignet med andre ikke-invasive billedteknik såsom optical billeddannelse, PET kvantitativ, ikke begrænset i indtrængningsdybden og tilvejebringer billeder af høj kvalitet med tredimensionelle opløsninger. Kombinerer den høje følsomhed af PET med den anatomiske nøjagtighed CT muliggør høj præcision billeddannelse af cellemigrering. Desuden kan in vivo-data let valideres af flere ex vivo metoder, herunder γ-tælling for biodistribution analyse. Autoradiografi af frysesnit og efterfølgende histologisk farvning af kryosektioner kan overlejres at korrelere den autoradiografiske kortet aktivitet med immun celle infiltrater identificeret af hæmatoxylin og eosinfarvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant samt Natalie Altmeyer for støtte under eksperimenter og dataanalyse. Dette arbejde blev støttet af Werner Siemens-Fonden, DFG gennem SFB685 (projekt B6) og Fortune (2309-0-0).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | WKL | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 mL | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitroevaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30 G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µL | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
- Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
- Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
- Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
- Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
- Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
- Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
- Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
- Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
- Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
- Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
- Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
- Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
- Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
- McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
- Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
- Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
- Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
- Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
- Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
- Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).
