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Immunology and Infection

Murino Linfócitos Rotulagem por Published: April 29, 2017 doi: 10.3791/55270
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

Summary

Seguindo a preparação de um anticorpo monoclonal 64 Cu-modificados se ligar a um receptor de células T de murino transgico, as células T são radiomarcados in vivo, analisadas para a viabilidade, funcionalidade, estabilidade rotulagem e apoptose, e transferidas adoptivamente para ratinhos com uma via aérea hipersensibilidade de tipo retardado reacção para imagem não invasivo por tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT).

Abstract

Este protocolo ilustra a produção de 64 Cu e o quelante de conjugao / radiomarcação de um anticorpo monoclonal (mAb), seguido por cultura de células de linfócitos de murídeo e o receptor 64 de Cu-anticorpo segmentação das células. Avaliação in vitro do marcador radioactivo e não-invasivo de rastreamento de células in vivo num modelo animal de uma via respiratória de tipo retardado de reacção de hipersensibilidade (DTHR) por PET / CT são descritos.

Em detalhe, a conjugação de um mAb com o quelante de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) é mostrado. Após a produção de 64 Cu radioactivos, marcação radioactiva do mAb DOTA-conjugado é descrito. Em seguida, a expansão de ovalbumina de galinha (Cova) CD4 + espec�ico interferão (IFN) -γ produtoras de células T auxiliares (Cova-TH1) e a radiomarcação subsequente das células Cova-TH1 estão representados. Várias técnicas in vitro são apresentados para avaliar a effects de 64 Cu-radiomarcao sobre as células, tais como a determinação da viabilidade das células por exclusão do azul de tripano, a coloração para a apoptose com anexina V por citometria de fluxo, e a avaliação da funcionalidade por ensaio imunossorvente ligado a enzima de IFN-γ (ELISA) . Além disso, a determinação da incorporação radioactiva nas células e a estabilidade de marcação são descritos em detalhe. Este protocolo descreve ainda como realizar os estudos de seguimento de células em um modelo animal para uma DTHR das vias respiratórias e, por conseguinte, a indução de-induzida das vias respiratórias Cova DHTR aguda em ratinhos BALB / c está incluído. Finalmente, um fluxo de trabalho / CT robusta PET incluindo aquisição de imagem, reconstrução e análise é apresentada.

A abordagem de direccionamento do receptor 64 de Cu-anticorpo com a internalização do receptor subsequente proporciona uma elevada especificidade e estabilidade, reduzida toxicidade celular, e as taxas de efluxo baixos em comparação com PET-traçadores comuns para marcação celular, por exemplo, 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-metiltio-semicarbazona) (64 Cu-PTSM). Finalmente, a nossa abordagem permite não invasiva no rastreamento de células in vivo por PET / CT com uma óptima relação sinal-para-fundo durante 48 h. Esta abordagem experimental pode ser transferido para modelos animais e tipos de células diferentes com receptores ligados a membranas que são internalizados.

Introduction

Rastreamento de células não-invasiva é um instrumento versátil para monitorizar a função celular, migração e homing in vivo. Estudos recentes de rastreamento de células têm-se centrado no mesenquimais 1, 2 ou da medula óssea derivadas de células estaminais 3 no contexto da medicina regenerativa, as células brancas do sangue perifico autogos em inflamação ou linfócitos T em terapias de células adoptivas contra cancro de 3, 4. A elucidação dos locais de acção e os princípios subjacentes biológicos de terapias à base de células é de grande importância. Linfócitos T citotóxicos CD8 +, por engenharia genética do receptor de antigénio quimérico (CAR) células T ou linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) foram amplamente considerada como o padrão de ouro. No entanto, as células TH1 específicas para o antigénio associado a tumores provaram ser uma alternativa eficaz opção de tratamento 4, </ sup> 5, 6, 7.

Como actores-chave na inflamação, as doenças auto-imunes específicas de órgãos (por exemplo, artrite reumatóide ou asma brônquica), e células de elevado interesse em imunoterapia do cancro, é importante caracterizar a distribuição e homing padrões temporais de células TH1. Não invasiva in vivo de imagiologia por PET apresenta, um método altamente sensível quantitativa 8 para analisar os padrões de migração celular, no retorno in vivo, e os sítios de acção de células T e respostas durante a inflamao, alergias, infecções ou de rejeição de tumor 9, 10, 11.

Clinicamente, 111In-oxina é usado para cintigrafia de leucócitos para a discriminação de inflamação e infecção de 12, enquanto que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucose (18F-FDG) é comumente utilizada para estudos de rastreio celular por PET 3, 13. Uma grande desvantagem deste marcador de PET, no entanto, é a meia-vida curta do radionuclídeo 18 M em 109,7 min e a baixa estabilidade intracelular que impede a imagiologia em pontos de tempo mais tardios após a transferência adoptiva de células. Para longo prazo, os estudos in vivo de rastreio celular por PET, embora instável nas células, 64 Cu-PTSM é frequentemente usado para marcar as células não especificamente 14, 15, com efeitos prejudiciais minimizadas sobre a viabilidade das células T e a função de 16.

Este protocolo descreve um método para reduzir ainda mais os efeitos desvantajosos sobre a viabilidade e função das células utilizando um receptor de células T (TCR) de mAb marcado radioactivamente espec�ico. Em primeiro lugar, a produção do radioisótopo 64 Cu, a conjugação do mAb KJ1-26 com the quelante DOTA, e o subsequente 64 de Cu-radiomarcação são mostrados. Num segundo passo, o isolamento e a expansão de células TH1 Cova-de ratinhos dadores DO11.10 e a radiomarcação com 64Cu-carregado DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) são descritos em detalhe. A avaliação dos valores de absorção e de efluxo de radioactividade com um calibrador de doses e pela y-contagem, respectivamente, bem como a avaliação dos efeitos de 64 Cu-radiomarcao sobre a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano e funcionalidade com ELISA y IFN-são apresentados . Para não invasiva no rastreamento de células in vivo, o desencadeamento de um modelo de ratinho de-induzida aguda das vias aéreas Cova DTHR e aquisição de imagem por PET / CT após transferência adoptiva de células encontram-se descritos.

Além disso, esta abordagem de marcao podem ser transferidos para diferentes modelos de doença, as células T de murídeo com diferentes TCRs ou células gerais de interesse com receptores ligados a membranas ou mar expressãokers subjacente membrana contínua de vaivém 17.

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Protocol

Medidas de Segurança: Ao manusear radioactividade, armazenar 64 Cu atrás tijolos de chumbo 2 polegadas de espessura e utilizar respectivo blindagem para todos os vasos que transportam actividade. Use ferramentas apropriadas para tratar indiretamente fontes não blindados para evitar contato manual direto e minimizar a exposição a material radioativo. Sempre use radiação emblemas monitoramento dosimetria e equipamentos de proteção individual e verificar-se ea área de trabalho para a contaminação de enfrentá-lo imediatamente. Descartar equipamento de protecção individual potencialmente contaminado antes de deixar a área onde o material radioativo é usado. Armazenar toda a resíduos radioactivos atrás protecção de chumbo até que a radioactivos 64 Cu é deteriorado (aproximadamente 10 meias-vidas = 127 h) antes do descarte adequado.

1. 64 Cu Produção

NOTA: O radioisótopo 64 Cu é produzido através da 64 Ni (p, n) 64 reacção nuclear Cu utilizando um Pettciclotrão corrida de acordo com um protocolo modificado de McCarthy et al. 18.

  1. Para a produção de 64 Cu, Ni irradiar 64, que é galvanizado em um prato de platina / irídio (90/10), com 30 mA, durante 6 h com um feixe de protões de 12,4 MeV.
  2. Aqueça o alvo de platina / irídio a 100 ° C numa câmara de polieteretercetona dedicado (PEEK) e incubar em 2 mL de HCl concentrado durante 20 min para dissolver 64 Cu / Ni 64.
  3. Adicione outro 1 mL de HCl concentrado e incubar durante 10 min.
  4. Evapora-se HCI utilizando uma corrente de árgon e arrefece-se a câmara até à temperatura ambiente.
  5. Lavar a câmara com 3 mL de 4 M de HCl 0,2% e 96% de metanol (v / v) e transferir esta solução a uma coluna de permuta iónica que foi pré-condicionada com 4% de HCl 0,2 M em metanol durante pelo menos 15 min. O efluente pode ser usado para reciclar 64 Ni.
  6. Lava-se a 64 Cu retida na coluna com 4% de HCl 0,2 M in metanol.
  7. Eluir 64 Cu com 70% de HCl 1,3 M / 30% de isopropanol (v / v) para um frasco de recolha, evapora-se a solução numa corrente de árgon e deixar o frasco arrefecer para a temperatura ambiente.
  8. Dissolve-se 64 Cu em 140-210 mL de HCl 0,1 M.

2. Anticorpo Conjugação com DOTA e posterior 64 de Cu-radiomarcao

NOTA: O quelante DOTA vai ser ligada a grupos amino funcionais do mAb por N-hidroxissuccinimida (NHS) de éster química e o conjugado será subsequentemente marcado radioactivamente com 64 Cu 19.

  1. Ajustar a concentração do KJ1-26-mAb a 8 mg / ml e diafiltrado 1 mL de solução de mAb contra 0,1 M de Na 2 HPO 4, pH 7,5 tratados com 1,2 g / L de uma resina de permuta iónica quelante usando um peso molecular de corte ( MWCO 30 kDa) unidade do filtro centrífugo. Aplicar 3 passos de lavagem subsequentes com 14 ml do tampão. Após o passo de lavagem final,concentra-se a solução novamente para 1 mL. Quantificar a concentração de anticorpo por medições 280nm.
  2. Prepara-se uma solução de DOTA-NHS em ultrapura ou água-PCR grau a uma concentração de 10 mg / ml imediatamente antes da utilização. Deixe o frasco atingir a temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação de água, e cuidadosamente remover DOTA-NHS utilizando uma espátula de plástico. Adicionar 216 ul desta solução DOTA-NHS a 8 mg da solução KJ1-26-mAb diafiltrada, homogeneiza-se, e incuba-se durante 24 h a 4 ° C num misturador de tambor.
  3. Diafiltrado o DOTA-KJ1-26-mAb contra acetato de amónio 0,25 M, pH 7,0, tratados com 1,2 g / L de uma resina de permuta iónica quelante, usando um peso molecular de corte (MWCO 30 kDa) unidade do filtro centrífugo. Aplicar 7 etapas de lavagem. Concentra-se o mAb a um volume final de 1 ml e novamente medir a concentração de proteína por meio de medições 280nm.
  4. Antes de radiomarcao, trocar o tampão da DOTA-KJ1-26-mAb para o PBS através de tamanho-exccromatografia Lusion usando colunas de filtração de gel. Isto também remove impurezas potenciais de pequenas moléculas.
  5. Preparar 100 MBq 64 CuCl 2 em solução de HCl a 10 mM e ajustar o pH para 6-7 com 10x de PBS. Adicionar 200 mg de DOTA-KJ1-26-mAb. Incubar durante 60 minutos a 37 ° C.
  6. Para o controlo de qualidade, realizar uma cromatografia de camada fina com citrato de sódio 0,1 M (pH 5) como fase móvel e analisar-se por autorradiografia. Pelo menos 90% da actividade deve ser ligada ao anticorpo e, portanto, ser detectado no ponto de partida. actividade não ligada é quelado pela fase e estrias móvel à base de citrato para a frente do solvente. Para obter uma referência, o uso de 64 CuCl 2 é aconselhada.

TH1 específico para ovalbumina de galinha 3. (Cova-TH1) o isolamento de células e de expansão

NOTA: A cultura de células TH1 é descrito de acordo com os estudos anteriormente publicados 16, 17.

  1. Isolar os baços e os nódulos linfáticos extraperitoneal (LNs) de ratinhos DO11.10.
    1. Sacrificar o mouse de acordo com os regulamentos federais. Desinfectar o animal com 70% de etanol e fixar-o com fita adesiva para a remoção do baço e LN. Faça uma incisão mediana e separar a pele do peritônio, puxando-o lateralmente para cada site.
    2. Localizar o colo do útero, axial, braquial e LNs inguinais. Removê-los com uma pinça sem corte e colocá-los em 1% de soro fetal de vitelo (FCS) / tampão PBS.
    3. Abrir o peritoneu e localizar o baço. Separa-se o baço do pâncreas e do tecido conjuntivo e colocá-lo em 1% de tampão de FCS / PBS. Para mais orientações, ver referências 20,21.
  2. Tritura baço e LNs através de um filtro de 40 um em 50 ml de parafuso tubo de tampa utilizando o êmbolo de uma seringa. Lavar o filtro com 10 mL de 1% de FCS / PBS-tampão.
  3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Subsequently, realizar a lise dos eritrócitos adicionando-amónio cloreto e potássio (ACK) de tampão de lise (1,5 mL por animal dador) durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 8,5 mL de 1% de FCS / PBS-tampão (por animal dador).
  4. Centrifugar as células a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Lavam-se as células em 10 mL de 1% de FCS / PBS-tamp, centrifugar a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante.
  5. Para a separação de células magnético, ressuspender as células em 1% de FCS / PBS-tampão e adicionar CD4 + microesferas. Referem-se as instruções do fabricante para o volume de tampão e a quantidade de células T CD4 + microesferas de usar.
  6. Incubar durante 20 min a 4 ° C. Em seguida, adicionar 1% de FCS / PBS-tampão até 50 mL, centrifugar as células a 400 xg durante 5 min, e remover o sobrenadante.
  7. Continuar com o isolamento de células T CD4 + utilizando colunas de separação magnética comerciais e um respectivo suporte de íman de acordo com o protocolo do fabricante. Ajustar as células T CD4 + a um co eluídosncentration de 10 6 culas / mL em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco com 2,5% de penicilina / estreptomicina, 1% de tampão HEPES, ácidos FCS a 10%, inactivado pelo calor 1% MEM aminoácidos, 1% de piruvato de sódio, e 0,2% de 2-mercaptoetanol e loja -los a 4 ° C.
  8. Recolha a descarga da coluna em um tubo de 50 mL com tampa de rosca para preparar células apresentadoras de antígenos (APCs). Centrifugar a descarga da coluna a 400 xg durante 5 min e remover o sobrenadante.
  9. Adiciona-se 10 ug / ml de anti-CD4 (clone: ​​GK1.5), 10 ug / mL de anti-CD8 (clone: ​​5367,2) e 10 ug de rato / ml de anti-rato-mAb (MAR18.5) e 1,5 mL de complemento de coelho. Incubar durante 45 min a 37 ° C.
  10. Centrifugar as células a 400 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante e adicionar 3 mL de meio. Irradiar o APC em uma fonte de raios γ ou raios-x com 30 Gy no total. Em seguida, as APCs ajustar a uma concentração de 5 x 10 6 culas / mL.
  11. Adicionar 100 uL de células T CD4 + e 100 mL de APCs numa pla de 96 cavidadeste em conjunto com 10 ug / mL cOVA 323-339-peptídeo, 10 ug / ml de anti-IL-4, mAc de 0,3 uM CPG1668-oligonucleótidos e 5 U / ml de IL-2.
  12. Adicionar 50 U / mL de IL-2 a cada segundo dia. Depois de 3 - 4 dias, a transferência das células de placas de 96 pos para placas de 24 poços. Combinar 3-5 poços da placa de 96 poços em um poço na placa de 24 poços. Adicionam-se 100 U / ml de IL-2 que contém meio em uma proporção de 1: 1.
  13. Após mais 2-3 dias, transferir as células a partir da placa de 48 poços a 175 cm 2 frascos de cultura de células (1 x 48 poços de placas por frasco). Encha com o meio em uma proporção de 1: 1. Adicionar 50 U / mL de IL-2 a cada segundo dia.
  14. Dividir as células de acordo com a densidade celular e adicionar 50 U / mL de IL-2 a cada segundo dia. Desta forma, a cultura das células para mais 10 dias.

4. Cova-TH1 radiomarcação celular

NOTA: O 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb vai ser aplicada às células TH1 Cova-cultivadas para permitir a marcação radioactiva intracelular.

  1. Para Cova-TH1 cell radiomarcao, desenhar 37 MBq da radiomarcado 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb numa seringa sem volume morto usando um calibrador de doses. Adicionar 1 ml de solução salina para receber uma solução de 37 MBq / ml.
  2. Suspender as células Cova-TH1 em meio a 2 X 10 6 células / ml e adiciona-se 0,5 mL da suspensão celular a cada poço numa placa de 48 poços.
  3. Adiciona-se 20 uL dos preparados de fresco de 37 MBq / mL de 64 solução de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb para cada uma das cavidades da placa de 48 poços. A razão final para a rotulagem é 0,7 MBq por 10 6 culas, num volume de 520 uL. Incubar a 37 ° C e 7,5% de CO 2 durante 30 min.
  4. Após a incubação, ressuspender cuidadosamente as células em cada poço e transferir a suspensão de células a partir da placa de 48 poços em 50 mL de um parafuso tubo de tampa. Para minimizar a perda de células, lave cada po com meio de pré-aquecido.
  5. Centrifugar a suspensão de células Cova-TH1 a 400 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS pré-aquecido. Remover um umliquot da suspensão de células para contagem das células. Repetir o passo de lavagem.
  6. Contagem de células viáveis ​​Cova-TH1 em uma diluição apropriada com coloração com azul de tripano.
  7. Ajustar a concentração de células a 5 x 10 7 células / ml para injecção intraperitoneal (ip) de 10 7 culas em 200 de PBS.
  8. Repita os passos de 4,3-4,5 para marcar radioactivamente as culas Cova-TH1 com quantidades crescentes de actividade, por exemplo, 1,4 ou 2,1 MBq MBq por 10 6 culas.
    1. Para marcar radioactivamente as culas com 1,4 MBq por 10 6 culas, usar 40 ul dos 37 MBq / mL de 64 solução de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e 60 uL para radiomarcao com 2,1 MBq por 10 6 culas. Executar os passos 4,3-4,7 com 0,7 MBq, 1,4 MBq e 2,1 MBq 64 Cu-PTSM mas aumentar o tempo de etiquetagem até 3 h para estudos comparativos 17.
    2. Avance para o passo 5 para determinar a quantidade óptima de actividade.

5. Avaliação in vitro do efeito do marcador radioactivo em Células Cova-TH1

NOTA: A caracterização das influências do marcador radioactivo nas células TH1 é realizada por meio de ensaio de exclusão de azul de tripano para a viabilidade, o IFN-y de ELISA para a avaliação da funcionalidade e V coloração PE-Anexina para a indução de apoptose 16, 17. Determinação da absorção intracelular e o efluxo de radioactividade é também descrita abaixo. Como comparação, as células 64 de Cu-PTSM marcado Cova-TH1 também pode ser usado.

  1. Efeito na viabilidade por exclusão de azul tripano
    1. Ajustar, pelo menos, 18 x 10 6 culas Cova-TH1 radiomarcados com 0,7 MBq / 10 6 culas, 1,4 MBq / 10 6 culas e 2,1 MBq / 10 6 culas, respectivamente, a uma concentração de 2 x 10 6 culas / mL e executar passos 5.1. 2-5.1.7 para cada dose de actividade. Use non-radioactive KJ1-26-mAb marcado células Cova-TH1 e células Cova-TH1 n marcados como os controlos.
    2. Pipete 1 mL de solução de células em 9 pos de uma placa de 24 poços.
    3. Recolhe-se o conteúdo de 3 poços em 3 15 ml separados parafuso tubos de tampão, 3 h após a radiomarcação inicial.
    4. Lavar os poços agora vazios com meio pré-aquecido para minimizar a perda de células e adicionar o meio com os respectivos 15 mL parafuso tubos tampão a partir do passo 5.1.3.
    5. Centrifugar os tubos de 15 ml a 400 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento de células resultante em 1 mL de meio de pré-aquecido.
    6. Contagem de células viáveis ​​e mortas, tanto em azul de tripano separadamente para cada tubo de 15 ml e calcular a percentagem de células viáveis.
    7. Repita os passos 5.1.3-5.1.6 24 e 48 h após a 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcao.
  2. Efeitos sobre a funcionalidade determinada através de ELISA de IFN-y
    NOTA: Para avaliar o efeito do 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radioactivo em productio IFN-γn como um marcador de funcionalidade, realizar um ELISA de IFN-γ a partir de um fornecedor comercial e referem-se a referência 17 para mais detalhes.
    1. Dispersa-se 10 5 culas vieis em 100 uL de meio sobre uma placa de 96 poços, 3 h após 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomarcação das células Cova-TH1 com 0,7 MBq, 1,4 MBq ou 2,1 MBq. Use ou 64 células não marcadas, não radioactivos KJ1-26-mAb marcados com Cu-PTSM marcados Cova-TH1 como os controlos.
    2. Estimular a produção de IFN-γ em 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com células Cova-TH1 em 100 uL de meio com 10 ug / mL de péptido Cova, 5 U / mL de IL-2 e 5x10 5 APCs em 100 ? L de meio durante 24 h a 37 ° C e 7,5% de CO 2. Outros controlos podem ser as outras condições, sem a adição do péptido Cova.
    3. Analisar o sobrenadante por ELISA de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Repita o passo 5.2.2. a 5.2.3. às 24 e 48 h após o procedimento de marcação.
  3. A indução de apoptose determinada por PE-anexina V coloração por citometria de fluxo
    NOTA: Para avaliar a indução de apoptose pelo marcador radioactivo 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utilizar um kit disponível comercialmente para citometria de fluxo e preparar amostras de células de acordo com as instruções do fabricante antes de coloração com anexina V para a fosfatidil-serina exposição sobre a membrana celular .
    1. Às 3, 24 e 48 h após a 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcação das células Cova-TH1, triplicados mancha com pelo menos 10 6 culas TH1 Cova-64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com o kit de anexina V de acordo com as instruções do fabricante e analisar na próxima hora. Use, 64 células não-radioactivos KJ1-26-mAb marcados com Cu-PTSM-marcados e não marcados Cova-TH1 como controlos. Consulte a Referência 17 para mais detalhes.
  4. Captação e de efluxo
    NOTA: A captação do 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb para dentro das células é medida num calibrador de doses e o efluxo de radioactividade é medida num ensaio de γ de contagem de 0, 5, 24, e 48 h após marcação radioactiva.
    1. Prepare dez tubos γ de contagem de cada para 64 células TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados, o respectivo sobrenadante e o passo de lavagem.
    2. Transferir 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcado com células Cova-TH1 em 1 mL de meio em cada um dos dez tubos γ de contagem directamente após marcação radioactiva. Para cada um dos pontos de 5, 24 e 48 h após a radiomarcação de tempo, manter pelo menos 10 7, 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com células Cova-TH1 em meio em placas de 24 cavidades de cultura de culas numa incubadora a 37 ° C e 7,5% de CO 2.
    3. Centrifugar os tubos γ de contagem a 400 xg durante 5 min, e transferir o sobrenadante para novos tubos de dez γ-contagem.
    4. Lavar as células uma vez em 1 ml de meio para remover a fracção não ligada de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb umd recolher o sobrenadante em dez novos tubos γ-contagem.
    5. Adicionar 1 mL de meio novo para as células Cova-TH1 e determinar o valor de absorção inicial de um calibrador de doses. Os tubos também pode ser armazenado numa incubadora a 37 ° C e 7,5% de CO 2.
    6. Repita os passos 5.4.2 a 5.4.5 após 5, 24 e 48 h e medir todos os tubos em um γ-contador de acordo com o protocolo do fabricante. Para corrigir quanto ao decaimento radioactivo e para a análise quantitativa, usar um padrão com uma dose definida de radioactividade.

6. OVA-induzida aguda das vias aéreas DTHR

NOTA: A dinâmica de migração e padrões homing de células radiomarcado Cova-TH1 transferidos adoptivamente e para o local da inflamação serão visualizados e quantificados em um modelo animal para-induzida das vias respiratórias Cova-DTHR 16, 17.

  1. Injectar 8 semanas de idade, ratinhos BALB / c IP com uma mistura de 150 mL aluminum gel / 50 uL Cova-solução (10 ug em 50 uL de PBS) para imunizar os ratinhos.
  2. Duas semanas após a imunização, anestesiar os ratos com 100 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por injecção ip. Colocar os ratinhos experimentais sobre as suas costas e lentamente pipetar 100 ug Cova dissolvido em 50 uL de PBS nas narinas dos animais. Os animais vai inalar a gota solução a gota.
  3. Repetir após 24 h. Para induções DTHR vias aéreas mais fortes, repita novamente após 48 h.
  4. Para analisar a migração específica das células TH1 Cova-transferidos, induzir a via aérea-DTHR com peru-ou faisão-OVA como controlo. Portanto, repita os passos de 6,1-6,3 usando o respectivo OVA-proteína.

7. Na In Vivo usando PET / CT

NOTA: Imagiologia in vivo de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com células Cova-TH1 em Cova-DTHR ratinhos doentes e animais da mesma ninhada de controlo demonstra o homing específica e a midinâmica gração das células Cova-Th1. Por isso, adquirir exames PET estáticos e anatómica tomografias sequencialmente transferência adoptiva de células pós 3, 24 e 48 h.

  1. Directamente após marcação radioactiva, ajustar as 64 células TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados com 5 x 10 7 células / ml para injecção ip de 10 7 culas em 200? L.
  2. Usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de calibre 30, desenhar 200 uL da suspensão de células TH1 Cova-64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcado e injectar as células ip nos animais Cova-DTHR-doentes entre a quatro e 5 de mamilo. Para determinar a quantidade total de radioactividade injectada, medir a seringa num calibrador de doses antes e depois da injecção.
  3. Anestesiar os ratos, 10 min antes do tempo de absorção desejado, com 1,5% de isoflurano em 100% de oxigénio (taxa de fluxo: 0,7 L / min) numa caixa de anestesia com temperatura controlada.
  4. Entretanto, para facilitar a co-registrationde imagens PET e CT durante a análise de imagem, corrigir capilares de vidro contendo 64 solução de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou solução livre 64 CuCl 2 sob a cama de rato.
    1. Por conseguinte, preparar uma solução de 0,37 MBq / ml e preencher capilares de vidro com um volume de 10 ul com esta solução. Uma vez que os sinais de radioactividade derivada de células são inerentemente fraco, não usar quantidades elevadas de actividade para certificar-se de que os marcadores não interferem com sinais derivados de células em ratinhos.
  5. Depois de se atingir a tolerância cirúrgica, como indicado pela perda do reflexo de retirada do pedal do membro posterior, transferir o rato para uma cama de animais de pequeno porte e PET-CT-compatível equipado com um sistema de tubagem adequada para manter a anestesia.
  6. Imobilizar o mouse em cima da cama de pequenos animais usando cotonetes e fita cirúrgica. Aplicar pomada para evitar o ressecamento dos olhos.
  7. Transferir a cama do rato para o aparelho de PET, o centro do campo de visão com um focus nos pulmões e adquirir um 20 min PET scan estático com uma janela de energia de 350-650 KeV.
  8. Transfira a cama do mouse para o scanner CT. Via olheiro vista, centro do campo de visão sobre os pulmões. Adquirir uma imagem plana CT através de projecções 360, durante uma rotação de 360 ​​° no modo "passo e disparar" com um tempo de exposição de 350 ms e binning factor de quatro.

Análise 8. Imagem

  1. Reconstruir os dados de modo de lista de PET através da aplicação de algoritmo iterativo 2D estatística ordenada maximização subconjunto expectativa (OSEM) e tomografia computadorizada em uma imagem 3D com um tamanho de pixel de 75? M.
  2. Para uma imagem co-registo em um software de análise de imagem apropriado (por exemplo Inveon Research Workplace ou Pmod), use a ferramenta de co-registo automático. Se isto falhar, usar os capilares de vidro sob a cama de rato como orientação para co-registar as imagens de PET e CT reconstruídos espacialmente na axial, coronal e sagital.
  3. Corrigir as imagens de PETpara o decaimento radioactivo usando a lei de decaimento radioactivo e a meia-altura do radionuclídeo 64 Cu a 12,7 h. Para normalização imagem, escolher uma imagem (A) como uma referência e ajustar a intensidade da imagem de exibição no respectivo software de análise de imagem.
    1. Utilizando os valores assim definidas para a imagem de referência (A), a actividade injectada (A) e a actividade injectada para as outras imagens (X), normalizar as outras imagens usando a seguinte equação: (actividade injectada (X) / actividade injectada ( A)) Os valores x intensidade (A).
  4. Desenhar volumes 3D de interesse (ISV) do sinal de PET normalizado dos linfonodos pulmonares e perithymic.
  5. Determinar a dose injectada percentagem por cm 3 (% ID / cm3), usando a seguinte equação: (média de actividade da actividade ISV / global no murganho) x 100. Para orientação adicional relativa à análise de imagem, ver referências 22, 23.

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Representative Results

A Figura 1 resume a marcação das células Cova-TH1 com o 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e a concepção experimental para o in vitro e em estudos in vivo abrangidos neste protocolo.

figura 1
Figura 1: 64 de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb processo de etiquetagem & Desenho Experimental. (A) Representação esquemática da etiquetagem radioactiva de células com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. O 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb se liga a receptores Cova-TCR na superfície celular das células TH1 e é internalizado com o receptor dentro de 24 h. Cova-TCRs são re-expressos 24 h após a marcação radioactiva. (B) As células T CD4 + foram isolados, expandidos e radiomarcadas com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in vitro. valores de absorção e de efluxo were determinado por um calibrador de doses e γ-contagem. Efeitos do anticorpo radioactivo sobre a viabilidade celular foi avaliada com colorao com azul de tripano, em funcionalidade com IFN-y de ELISA, e na indução de apoptose com Ficoeritrina (PE) -Annexin V coloração. (C) Cova-DHTR vias respiratórias foi induzida em ratinhos BALB / c fêmeas. 10 7 células TH1 foram transferidas adoptivamente para animais Cova-vias aéreas DHTR-doente directamente após marcação radioactiva. imagens PET / CT foram adquiridas 3, 24 e 48 h após a transferência celular adoptiva. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A rotulagem intracelular bem sucedida das células TH1 com o 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb foi confirmada por imuno-histoquímica (Figura 2A). O Cu-DOTA-KJ1-26 anticorpo 64 (verde) foi co-localizada comCD3 na célula com membrana 3 h após marcação radioactiva, enquanto que o sinal do mAb na membrana celular foi apenas fraca às 24 h (amarelo). Às 48 horas após a marcação radioactiva, o complexo Cu-64 DOTA-KJ1-26-TCR foi internalizado por endocitose com um sinal forte no citoplasma das células TH1. A dose radioactiva aplicada de 0,7 MBq de viabilidade das células TH1 reduzidos em apenas 8%, enquanto que doses mais elevadas de 1,4 MBq e 2,1 MBq 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb teve efeitos mais pronunciados. Em comparação com radiomarcação com 64Cu-PTSM, no entanto, não se observou qualquer vantagem significativa de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (Figura 2B). 64 células radiomarcadas Cu-anticorpo mostrou pouca perda em termos de funcionalidade, como mostrado pela secreção de IFN-γ (Figura 2C), o efluxo de radioactividade (Figura 2D) reduzida, e reduzido de indução de apoptose (Figura 2E) em comparação com 64 TH1 Cu-PTSM-marcado células.


Figura 2: Avaliação in vitro da radioativo TH1 celular A marcação com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. (A) A microscopia confocal demonstra a captação intracelular de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (verde) em células Cova-TH1 (membrana celular; vermelho) dentro de 24 h após a marcação inicial (Esta figura foi modificado a partir de referência 17) . (B) A titulação de doses marcação radioactiva de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou 64 Cu-PTSM revelou uma influência igual sobre a viabilidade como detectado por exclusão de azul de 24 h após a rotulagem de tripano. O uso de 0,7 MBq de marcação celular induzida as tarifas mais deficiências da viabilidade (média ± DP, em percentagem;. Nesta figura foi modificado a partir de referências 16, 17 (C) Titulação de marcação radioactiva fazerses de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou 64 Cu-PTSM revelou uma deficiência mais forte da funcionalidade após 64 Cu-PTSM rotulagem, tal como detectado por ELISA de IFN-y 24 horas após etiquetagem. Um aumento da dose de 64 de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb para marcação celular teve nenhuma influência sobre a funcionalidade (média ± DP, em percentagem; estatísticas: teste t de Student, * p <0,05, ** p <0,01, ** * p <0,001; esta figura foi modificado a partir de referências 16, 17). Medições (D) efluxo de células radiomarcadas (γ de contagem) mostrou uma maior estabilidade rotulagem de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb em comparação com 64 de Cu-PTSM 5 h e 24 h após a rotulagem (média ± DP, em percentagem; estatísticas : teste t de Student; *** p <0,001; esta figura foi modificado a partir de 17). (E) a citometria de fluxo respectiva (PE-anexina V) diagramas indicam uma maior apindução optosis 24 h após a 64 Cu-PTSM rotulagem em comparação com 64 de Cu-DOTA-KJ1-26-Acm-rotulagem (Esta figura foi modificado a partir de 17 de referência). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a transferência adoptiva de 10 7 64 células TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-Acm-rotulados em animais Cova-DTHR-doentes e controlos não tratados, PET estática de alta resolução e imagens anatómicas CT foram adquiridos. Para a análise de imagem, as imagens foram fundidos no plano coronal, sagital e axial com a ajuda de capilares de vidro contendo uma pequena quantidade de Cu-64 DOTA-KJ1-26-mAb (Figura 3A). VOIs foram desenhados nas LNs pulmonares e perithymic sobre as imagens corrigidas-decaimento e PET normalizado para calcular a percentagem de dose injectada por cm3(Figura 3B).

Figura 3
Figura 3: PET / CT-co-registo e análise. Imagens (A) de PET e CT foram co-registradas no software de análise de imagem. Se o registo automatizado pelo software falhou, as imagens foram fundidos por sobreposição dos sinais de PET e CT de capilares de vidro (marcadores), encheram-se com a radioactividade e fixos debaixo da cama dos animais. (B) VOIs são colocados sobre os sinais corrigidos de PET e normalizados dos LN perityhmic e pulmonares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

migração celular Cova-TH1 foi monitorado ao LN pulmonar e perithymic como locais de Cova-apresentação em DTHR vias aéreas. In vivo sinais de PETrived de 64 células TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcados foram consideravelmente mais elevados do que os sinais de 64 células de Cu-PTSM-marcados (Figura 4A). valores de absorção de células TH1 em Cova-LNS pulmonares e perithymic foram significativamente aumentados em DTHR-doentes animais em comparação com animais da mesma ninhada de controlo não tratadas (Figura 4B).

Figura 4
Figura 4: Acompanhamento celular Cova-TH1 no DTHR modelo das vias aéreas por In Vivo PET / CT. (A) As respectivas imagens de PET / CT de células transferidas adoptivamente Cova-TH1, que foram previamente marcados com 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ou 64 Cu-PTSM, em ratinhos Cova-DTHR-doentes ou não tratados. As células TH1 Cova-hospedada transferidos para o LNS pulmonares e perithymic. (B) A análise quantitativa dos locais homing das células TH1 Cova-provou um superiores homing para tecidos inflamados (média ± SD; estatísticas: teste t de Student, * p <0,05, ** p <0,01). A marcação com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb mostrou uma sensibilidade maior (aumento da% ID / cm 3) em comparação com 64 de Cu-PTSM nos diferentes locais homing (média ± SD, estatísticas: Student t-teste; # p <0,05, ## P <0,01, ### p <0,001). Esta figura foi modificado a partir de referência 16, 17. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo apresenta um método de confiança e fácil de radiomarcar estavelmente células para o rastreamento in vivo por PET. Utilizando este método, as células Cova-TH1, isoladas e expandidas in vitro a partir de ratinhos dadores, poderia ser marcado radioactivamente com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e sua homing foi rastreado para o LNS pulmonares e perithymic como locais de apresentação em um Cova Cova-induzida DTHR aguda das vias aéreas.

A modificação do mAb com o quelante requer trabalho rápido e eficiente e a utilização de soluções de ultra-pura, sem vestígios de aminas. As soluções foram tratadas com uma resina de permuta iónica quelante para assegurar a conjugao apropriada do éster activo DOTA-NHS para amina resíduos do mAb. O mAb quelante-conjugado como um marcador radioactivo intracelular tem várias vantagens sobre o uso de agentes de marcação de células não-específicos. Em primeiro lugar, o mAb fornece excelente especificidade que permite a marcação alvo de uma população de células definida. o mAbem si não é citotóxico e não tem efeito prejudicial sobre a viabilidade ou a funcionalidade das células. Em seguida, o efluxo de radioactividade das células foi significativamente reduzida melhorando a razão sinal-para-fundo das imagens de PET 17, 24. Ao escolher um mAb com uma especificidade diferente, este método é facilmente transferível para outras populações de células de interesse, tais como CD8 + TIL ou CD14 + monócitos. Além disso, esta abordagem de marcao celular pode ser utilizada para estudos de acompanhamento de células em vários modelos animais de doenças inflamatórias em seres humanos (por exemplo, artrite reumatóide e asma brônquica) ou modelos animais para diferentes tipos de cancro humano. Este método de marcação, no entanto, limita-se a receptores ligados a membranas ou subdivisões marcadores como alvos uma vez que os mAb não difundir passivamente através da membrana celular. A internalização induzida por activação do alvo ou, simplesmente, membrana de vaivém é vantajosa. UMAelevada avidez entre o mAb e o alvo, no entanto, também pode ser suficiente para a imagiologia in vivo, possivelmente com uma redução do sinal de relação de fundo.

A escolha do conjugado da DOTA como um quelante para as nossas experiências foi baseada em trabalho inicial usando 64 Cu 25. No entanto, nesse meio tempo DOTA foi mostrado para não ser um quelante óptima para este isótopo, levando a absorção bastante elevada actividade no fígado por transchelation para superóxido dismutase 26. Embora usando o anticorpo marcado radioactivamente para marcação in vitro de células que são depois transferidas adoptivamente deve diminuir o risco de 64 Cu libertação e transporte para o fígado, quelantes modernos optimizado para 64 Cu, como 1,4,7-triazaciclononano, ácido 1-glutárico -4,7-acético (NODAGA) ou ido 1,4,7-triazaciclononano-triacético (NOTA), pode ser de preferência usado com o nosso método para aumentar ainda mais a especificidade dos dados obtidos 27 64 Cu (por exemplo, N-clorosuccinimida (NCS)) ou outros isopos, tais como Zr 89 (por exemplo, desferrioxamina;. DFO).

A escolha de 64 Cu como o radioisótopo foi baseado no facto de que na migração de células in vivo e homing é um processo bastante lento em comparação com alterações metabólicas geralmente fotografada por PET. 64 Cu com um tempo de meia-vida de 12,7 h permite a imagiologia repetida de migração de células durante 48 h pós-injecção. Para a produção de 64 Cu, é importante o uso de soluções de alta qualidade, sem traços de iões metálicos para assegurar a pureza de 64 Cu. Além disso, a pureza de 64 Cu é de grande importância para a radiomarcação do DOTA-mAb desde impurezas iões de metal multivalente pode levar a uma actividade específica reduzida da solução 64 Cu para níveis que impedem radiomarcação de proteína e, consequentemente, imagiologia. Embora 64 Cu produz um sipercentagem de gnificant altamente energéticos, electrões Auger citotóxicas quando a decomposição 28, uma dose ajustada do radioisótopo é bem tolerado pelas células, tal como representado por efeitos mínimos sobre a viabilidade e a funcionalidade e de indução de baixa apoptose após marcação radioactiva. No entanto, é claramente aconselhável titular a dose inicialmente actividade usado para a radiomarcação para outros tipos de células e ajustar o protocolo de radiomarcao. Rápido e fácil, em métodos de avaliação in vitro tem sido demonstrada no protocolo, incluindo a determinação de viabilidade por exclusão com azul de tripano e colorao com PE-anexina V para a determinação das fracções apoptóticas das células. Ambos os métodos são relativamente baratos e usar equipamentos de laboratório facilmente acessível. Combinando PE-anexina V a coloração com um corante para a discriminação de células mortas, tais como 7-aminoactinomycin D (7-AAD) de estar e permitiria a determinação da viabilidade e a apoptose em um ste experimentalp. Como uma alternativa para avaliar a viabilidade de células T marcados, um (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-ensaio 3- (MTT-) pode ser usado para avaliar a actividade metabólica da célula. A avaliação dos valores de absorção e de efluxo com um calibrador de dose e γ-counter são mais avançados, mas ainda rápido e barato para conseguir uma vez que quase todos os laboratórios trabalhando com radioatividade tem o respectivo hardware no local. Gene sequenciação ou métodos baseados em microchip renderia dados mais detalhados. Estes métodos, no entanto, nem sempre são facilmente acessíveis, precisa conhecimentos adequados e são mais frequentemente associados a custos mais elevados.

Embora o PET não é capaz de atingir uma resolução celular como técnicas microscópicas de imagem 29, que proporciona uma excelente sensibilidade na gama picomolar para a detecção de mesmo pequenas quantidades de células dentro de animais ou seres humanos 8. Em comparação com outras técnicas de imagem não-invasivos tais como a óptical imagiologia, o PET é quantitativa, não se limitando a profundidade de penetração e fornece imagens de alta qualidade com três resoluções dimensionais. Combinando a alta sensibilidade do PET com a precisão anatômica do CT permite imagens de alta precisão da migração celular. Além disso, dados in vivo pode ser facilmente validada por vários métodos ex vivo incluindo γ de contagem para análise de biodistribuição. A autorradiografia de criocortes e subsequente coloração histológica dos criocortes podem ser sobrepostos para correlacionar a actividade de auto-radiografia mapa com os infiltrados de células imunológicas identificados por hematoxilina e eosina.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, bem como Natalie Altmeyer pelo apoio durante a análise experiências e dados. Este trabalho foi apoiado pela Werner Siemens-Foundation, o DFG através do SFB685 (B6 projeto) e Fortune (2309-0-0).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber WKL Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 mL Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitroevaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30 G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µL VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

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References

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Immunology edição 122 imagiologia de pequenos animais marcação celular não-invasiva PET / CT células T Th1 reacção de hipersensibilidade das vias respiratórias do tipo retardada
Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT
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Hoffmann, S. H. L., Maurer, A.,… More

Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

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