Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.
Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.
Mycobacterium tuberculosis, Tüberküloz (TB) neden olan madde, dünyada morbidite ve mortalitenin başlıca nedenidir. İlaç duyarlı TBC 6 aylık bir süre için birden fazla antibiyotik gerektiren tedavi edilebilir bir hastalıktır. Tedavi edilebilen bir hastalık olmasına rağmen, TBC ölüm 2015 1 1.5 milyon olarak tahmin edilmiştir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, ilaca dirençli M. tuberculosis yaygınlığı kaygıları var artmaktadır. Ilaca dirençli TB (MDR-TB), en azından isoniazid (INH) ve Rifampisin (RMP), ve en çok MDR-TB kökler böylece tedavi seçenekleri sınırlayıcı ikinci satırı TBC ilaçların seçilmesi de dirençlidir dirençli TB olarak tanımlanmaktadır . ilaç direnci etkilerini İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV) ile ko-enfekte hastaların tedavisi için daha büyük bir sorun oluşturabilir; 400.000 kadar hasta 2015 1 'de HIV ile ilişkili TB öldü. Hayal kırıklığıyla, ABD Gıda ve İlaç Dairesi'ninrasyon Son 40 yılda 2, MDR-TB, Bedaquiline karşı tek yeni TB ilacı onayladı. Daha iyi ve daha kısa TB terapileri bulmakta gelişmeler acilen TB ve MDR-TB ile mücadelede önde kalabilmek için ihtiyaç vardır.
Geleneksel olarak, TB ilaç ekranlar bileşiklerin artan bir kültüre ilave edilmiştir ve mikroorganizmalar yok etmek etkinlikleri katı ortam üzerinde koloni oluşturan birim (CFU) sayımı ile tespit edilir ve böylece büyüme ortamında in vitro büyüme koşulları altında gerçekleştirilir. CFU sayımları emek yoğun, zaman tüketen ve masraflı olduğu için, çeşitli dolaylı yöntemler bu sorunu hafifletmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemler, Alamar Mavisi canlılığı deneyi 3, yeşil floresan protein (GFP) veya lusiferaz sentezleyen bakterilerden lüminesans 5'ten floresan 4 belirlenmesini ve toplam adenozin trifosfat tahmin (A içerirTP) 6, 7.
Tipik TB bakterileri bulunan ve alveoler makrofajlar 8 fagozomların içinde replike akciğer, bir M. tuberculosis enfeksiyonuna ile karakterize edilir. basit-et suyu fenotipik ekran hücre dışı patojenlerin uygun olabilir; Ancak tarihsel perspektifte, bu yöntem kullanılarak tespit M. tuberculosis bileşikler genellikle enfeksiyon modellerinde mansap doğrulama adımları sırasında beklentileri yaşamak için başarısız çarptı. Biz TB ilaç iyi bir intraselüler konakçı hücresi enfeksiyon modelinde yapılır öneriyoruz. Bununla birlikte, hücre içi modeller yüksek verimli tarama (HTS) gelişimine birçok teknolojik ve biyolojik engelleri sahiptirler. Büyük bir engel sayıda adımları ve yıkama-arasında hücre dışı bakteri ayrıntılı çıkarılması ile örneklenen, enfeksiyon süreci karmaşıklığıdır. İkinci büyük engel uzun zaman yeniden olduğunugerekliliklerine göre çıkarılabilirdir normal CFU kültür levhaları üzerinde sayılarak yapılır büyüme tespiti olarak tamamlamak için üzerinde 3 hafta süren bir işlemdir. CFU sayımları yerine bir çözüm floresan bakteri ile birlikte otomatik floresan mikroskobu tarafından sağlanmıştır. Ancak bu çözüm birçok araştırma laboratuvarları için ulaşamayacağı bir başlangıç ekipman yatırım gerektirir. Basit, düşük maliyetli ve hastalığa ilgili HTS yöntemi büyük ölçüde ilaç keşif sürecini artıracak.
Bu çalışmada, hücre içi M. tuberculosis bileşiklerin aktivitesini belirlemek için uygun bir hızlı ve yüksek ölçekli, ancak ekonomik, tahlil sağlamayı hedefleyen yeni modüler HTS sistemi bildirmektedir. (I), hücre içi, (ii) sitotoksisite, ve (iii) 'de-et suyu çorbası deneyleri: Bu sistem üç modülden oluşmaktadır. Birleştirilen Nihai sonuç işlevinin potansiyel modu için ek bilgi ile, bileşik özelliklerinin geniş kapsamlı bir açıklama sağlar. Bu scsistem reening ilaç sinerji 9 analizi de dahil olmak üzere etki modu hedef çeşitli bileşik kütüphaneleri, çeşitli projelerde kullanılmıştır, otofajinin 10 stimülasyonu ve M. tuberculosis inhibisyonu, hastalık oluşturma faktörü (yayınlanmamış) tarafından salgılanan. Eylem bilinmeyen modu bileşikleri ayrıca 11 incelenmiştir. Bu yöntemin bir tadil edilmiş bir versiyonu da, hücre içi, M. tuberculosis 11 karşı yeni bileşiklerin belirlenmesi için birinci tarama yöntemi olarak endüstriyel ortak tarafından kabul edilmiştir.
Bu çalışmanın amacı, M. tuberculosis için bir insan hücre içi enfeksiyon modeli kullanılarak basit ve düşük maliyetli HTS yöntemini yaratmaktı. Tüberküloz, M. tuberculosis ile alveoler makrofajların enfeksiyonu ile karakterize edilen bir insan hastalıktır. Nedeniyle bio, bakteri ve konak hücrelerin hem biyolojik modellerini kapsayan araştırma, geçmişte kullanılmıştır. Ancak, vekil bakteri ve insan olmayan modellerin kullanımı ilaç tarama iyi M. tuberculosis <sup …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
1M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
M. tuberculosis H37Rv | |||
96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |