Vi har udviklet en modulær højkapacitetsscreening system til at opdage hidtil ukendte forbindelser mod Mycobacterium tuberculosis, målretning intracellulære og i-bouillon voksende bakterier samt cytotoksicitet mod pattedyrværtscelle.
Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.
Mycobacterium tuberculosis, det forårsagende middel af tuberkulose (TB), er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i hele verden. Medikamentfølsomme TB er en behandlelige sygdom, der kræver flere antibiotika i en periode på 6 måneder. Trods en behandlelige sygdom, blev TB dødelighed anslået til 1,5 millioner i 2015 en. I de seneste 10 år har der været stigende bekymring over forekomsten af resistente M. tuberculosis. Multiresistent tuberkulose (MDR-TB) er defineret som TB der er resistent overfor mindst Isoniazid (INH) og Rifampicin (RMP), og de fleste MDR-TB-stammer er også modstandsdygtige over for vælge second-line TB lægemidler, hvilket begrænser behandlingsmuligheder . Virkningerne af lægemiddelresistens skabe en større udfordring til behandling af patienter med samtidig infektion med humant immundefekt virus (HIV); 400.000 patienter på verdensplan døde af HIV-associeret tuberkulose i 2015 1. Skuffende, USA Food and Drug Administration har godkendt kun én ny TB lægemiddel mod MDR-TB, bedaquiline, i de seneste 40 år 2. Fremskridt i at finde bedre og kortere TB terapier er et presserende behov for at være på forkant i kampen mod tuberkulose og multiresistent tuberkulose.
Traditionelt er TB lægemiddelscreeninger udført under in vitro vækstbetingelser i vækstmedium, hvorved forbindelser tilsættes til en voksende kultur og deres effektivitet til udryddelse mikroorganismerne bestemmes ved at tælle kolonidannende enheder (CFU) på fast medium. Da CFU tæller er arbejdskrævende, tidskrævende, og kostbar, har forskellige indirekte metoder blevet udviklet til at afhjælpe dette problem. Sådanne fremgangsmåder indbefatter Alamar Blue levedygtighedsassay 3, bestemmelse af fluorescens 4 fra grønt fluorescerende protein (GFP) eller luminescens 5 fra luciferase-udtrykkende bakterier, og skønnet over den samlede adenosintriphosphat (ATP) 6, 7.
Typisk TB er kendetegnet ved en M. tuberculosis-infektion i lungen, hvor bakterierne opholde sig og replikere inde i fagosomer af alveolære makrofager 8. Den enkle i-bouillon fænotypisk skærm kan passe ekstracellulære patogener; men i historisk perspektiv, ramte forbindelser mod M. tuberculosis identificeret ved anvendelse af denne fremgangsmåde ofte undlader at leve op til forventningerne i nedstrøms valideringsrutiner infektionsmodeller. Vi foreslår, at TB medicin er bedst udføres i en intracellulær værtscelle infektion model. Ikke desto mindre er intracellulære modeller besidder mange teknologiske og biologiske barrierer for high-throughput screening (HTS) udvikling. En stor hindring er kompleksiteten af infektionsprocessen, eksemplificeret ved talrige trin og den omfattende fjernelse af ekstracellulære bakterier ved i-mellem vask. En anden stor forhindring er den lange tid retingelserne, som vækst detektion, normalt ved CFU regner dyrkningsplader, er en proces der tager over 3 uger at gennemføre. En løsning til at erstatte CFU tællinger er blevet tilvejebragt ved automatiseret fluorescerende mikroskopi i kombination med fluorescerende bakterier. Men denne løsning kræver en indledende udstyr investering, der er uden for rækkevidde for mange forskningslaboratorier,. En enkel, billig, og sygdom-relevant HTS metode ville i høj grad øge lægemiddelopdagelsesprocessen.
I denne undersøgelse rapporterer vi en ny, modulært HTS-system, der har til formål at give en hurtig og yderst skalerbar, men økonomisk, assay egnet til bestemmelse af aktiviteten af forbindelser mod intracellulær M. tuberculosis. Dette system består af tre moduler: (i) intracellulære, (ii) cytotoksicitet, og (iii) i-bouillon assays. Det kombinerede endelige resultat giver en omfattende beskrivelse af de sammensatte egenskaber, med yderligere information med hensyn til den potentielle virkemåde. Denne screening system er blevet anvendt i flere projekter med forskellige forbindelsesbiblioteker, der er målrettet virkemåde, herunder analyse af lægemiddelsynergi 9, stimulering af autophagy 10, og inhiberingen af M. tuberculosis -secreted virulensfaktor (ikke offentliggjort). Forbindelser med ukendt virkningsmekanisme er også blevet undersøgt 11. En modificeret version af denne metode blev også vedtaget af vores industrielle partner som den primære screeningsmetode til at identificere nye forbindelser mod intracellulær M. tuberculosis 11.
Målet med denne undersøgelse var at skabe en enkel og omkostningseffektiv HTS fremgangsmåde under anvendelse af en human intracellulær infektion model for M. tuberculosis. Tuberkulose er en human sygdom karakteriseret ved infektion af alveolære makrofager af M. tuberculosis. På grund af biosikkerhed spørgsmål, har forskning med biologiske modeller af både bakterien og værten cellerne blevet anvendt i fortiden. Det har imidlertid vist sig, at brugen af surrogat bakterier og ikke-menneskelige m…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
1M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
M. tuberculosis H37Rv | |||
96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |