System til Effekt og cytotoksicitet Screening af inhibitorer Målretning Intracellulær<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Summary

Vi har udviklet en modulær højkapacitetsscreening system til at opdage hidtil ukendte forbindelser mod Mycobacterium tuberculosis, målretning intracellulære og i-bouillon voksende bakterier samt cytotoksicitet mod pattedyrværtscelle.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, det forårsagende middel af tuberkulose (TB), er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i hele verden. Medikamentfølsomme TB er en behandlelige sygdom, der kræver flere antibiotika i en periode på 6 måneder. Trods en behandlelige sygdom, blev TB dødelighed anslået til 1,5 millioner i 2015 ^en. I de seneste 10 år har der været stigende bekymring over forekomsten af resistente M. tuberculosis. Multiresistent tuberkulose (MDR-TB) er defineret som TB der er resistent overfor mindst Isoniazid (INH) og Rifampicin (RMP), og de fleste MDR-TB-stammer er også modstandsdygtige over for vælge second-line TB lægemidler, hvilket begrænser behandlingsmuligheder . Virkningerne af lægemiddelresistens skabe en større udfordring til behandling af patienter med samtidig infektion med humant immundefekt virus (HIV); 400.000 patienter på verdensplan døde af HIV-associeret tuberkulose i 2015 ^1. Skuffende, USA Food and Drug Administration har godkendt kun én ny TB lægemiddel mod MDR-TB, bedaquiline, i de seneste 40 år ^2. Fremskridt i at finde bedre og kortere TB terapier er et presserende behov for at være på forkant i kampen mod tuberkulose og multiresistent tuberkulose.

Traditionelt er TB lægemiddelscreeninger udført under in vitro vækstbetingelser i vækstmedium, hvorved forbindelser tilsættes til en voksende kultur og deres effektivitet til udryddelse mikroorganismerne bestemmes ved at tælle kolonidannende enheder (CFU) på fast medium. Da CFU tæller er arbejdskrævende, tidskrævende, og kostbar, har forskellige indirekte metoder blevet udviklet til at afhjælpe dette problem. Sådanne fremgangsmåder indbefatter Alamar Blue levedygtighedsassay ^3, bestemmelse af fluorescens ⁴ fra grønt fluorescerende protein (GFP) eller luminescens ⁵ fra luciferase-udtrykkende bakterier, og skønnet over den samlede adenosintriphosphat (ATP) ^{6, 7.}

Typisk TB er kendetegnet ved en M. tuberculosis-infektion i lungen, hvor bakterierne opholde sig og replikere inde i fagosomer af alveolære makrofager ^8. Den enkle i-bouillon fænotypisk skærm kan passe ekstracellulære patogener; men i historisk perspektiv, ramte forbindelser mod M. tuberculosis identificeret ved anvendelse af denne fremgangsmåde ofte undlader at leve op til forventningerne i nedstrøms valideringsrutiner infektionsmodeller. Vi foreslår, at TB medicin er bedst udføres i en intracellulær værtscelle infektion model. Ikke desto mindre er intracellulære modeller besidder mange teknologiske og biologiske barrierer for high-throughput screening (HTS) udvikling. En stor hindring er kompleksiteten af ​​infektionsprocessen, eksemplificeret ved talrige trin og den omfattende fjernelse af ekstracellulære bakterier ved i-mellem vask. En anden stor forhindring er den lange tid retingelserne, som vækst detektion, normalt ved CFU regner dyrkningsplader, er en proces der tager over 3 uger at gennemføre. En løsning til at erstatte CFU tællinger er blevet tilvejebragt ved automatiseret fluorescerende mikroskopi i kombination med fluorescerende bakterier. Men denne løsning kræver en indledende udstyr investering, der er uden for rækkevidde for mange forskningslaboratorier,. En enkel, billig, og sygdom-relevant HTS metode ville i høj grad øge lægemiddelopdagelsesprocessen.

I denne undersøgelse rapporterer vi en ny, modulært HTS-system, der har til formål at give en hurtig og yderst skalerbar, men økonomisk, assay egnet til bestemmelse af aktiviteten af forbindelser mod intracellulær M. tuberculosis. Dette system består af tre moduler: (i) intracellulære, (ii) cytotoksicitet, og (iii) i-bouillon assays. Det kombinerede endelige resultat giver en omfattende beskrivelse af de sammensatte egenskaber, med yderligere information med hensyn til den potentielle virkemåde. Denne screening system er blevet anvendt i flere projekter med forskellige forbindelsesbiblioteker, der er målrettet virkemåde, herunder analyse af lægemiddelsynergi ^9, stimulering af autophagy ^10, og inhiberingen af M. tuberculosis -secreted virulensfaktor (ikke offentliggjort). Forbindelser med ukendt virkningsmekanisme er også blevet undersøgt ^11. En modificeret version af denne metode blev også vedtaget af vores industrielle partner som den primære screeningsmetode til at identificere nye forbindelser mod intracellulær M. tuberculosis ^11.

Protocol

1. bakteriestamme og Vækst Medium Gøre albumin dextrose og salt stamopløsning (ADS) ved at opløse 25 g bovint serumalbumin, 10,0 g dextrose og 4,05 g natriumchlorid i 460 ml deioniseret vand. Filter-sterilisere ADS og opbevares ved 4 ° C. Gøre 7H9 bouillon ved tilsætning af 4,7 g af 7H9 pulver og 2 ml af glycerol til 900 ml renset vand. Autoklaver 7H9 bouillon ved 121 ° C i 10 min og lad den afkøle til stuetemperatur, før der fortsættes. Gøre 7H9ADST ved tilsætning af 100 ml ADS og 0,5 …

Representative Results

High-throughput intracellulær screening under anvendelse af M. tuberculosis, der udtrykker luciferasegenet Figur 2A og Tabel 1 indeholder de rå data indsamlet af luminometeret, udtrykt i relative luminescerende enheder (RLU), der viser virkningen af en stigende koncentration af TB lægemiddel rifampicin på M. tuberculosis inde THP-1-celler. Figur 2A er et sca…

Discussion

Målet med denne undersøgelse var at skabe en enkel og omkostningseffektiv HTS fremgangsmåde under anvendelse af en human intracellulær infektion model for M. tuberculosis. Tuberkulose er en human sygdom karakteriseret ved infektion af alveolære makrofager af M. tuberculosis. På grund af biosikkerhed spørgsmål, har forskning med biologiske modeller af både bakterien og værten cellerne blevet anvendt i fortiden. Det har imidlertid vist sig, at brugen af surrogat bakterier og ikke-menneskelige m…

Materials

RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717