Summary
Nous présentons une méthode pour quantifier la méthylation de l'ADN en fonction de la 5-méthylcytosine (5-mC) dot blot. Nous avons déterminé les niveaux de 5 mC pendant la dédifférenciation des chondrocytes. Cette technique simple pourrait être utilisée pour déterminer rapidement le phénotype des chondrocytes dans le traitement ACI.
Abstract
La dédifférenciation des chondrocytes hyalins dans les chondrocytes fibroblastiques accompagne souvent l'expansion monocouche de chondrocytes in vitro . Le niveau global de méthylation de l'ADN des chondrocytes est considéré comme un biomarqueur approprié pour la perte du phénotype des chondrocytes. Cependant, les résultats basés sur différentes méthodes expérimentales peuvent être incohérents. Par conséquent, il est important d'établir une méthode précise, simple et rapide pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN pendant la dédifférenciation des chondrocytes.
Les techniques actuelles d'analyse de la méthylation à l'échelle du génome reposent largement sur le séquençage génomique des bisulfites. En raison de la dégradation de l'ADN pendant la conversion du bisulfite, ces procédés nécessitent généralement un volume d'échantillon important. D'autres méthodes utilisées pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN comprennent la chromatographie liquide haute performance (HPLC). Cependant, la HPLC nécessite une digestion complète de l'ADN génomique. En outre, le coût prohibitif élevé de la HPLC dansLes instruments limitent l'application plus large de HPLC.
Dans cette étude, l'ADN génomique (ADNg) a été extrait de chondrocytes humains cultivés avec un nombre variable de passages. Le niveau de méthylation de l'ADNc a été détecté en utilisant un dosage de transfert de point spécifique à la méthylation. Dans cette approche dot blot, un mélange d'ADNg contenant l'ADN méthylé à détecter a été repéré directement sur une membrane N + en tant que point à l'intérieur d'un modèle de modèle circulaire préalablement étiré. Par rapport à d'autres approches d'imprégnation à base d'électrophorèse sur gel et d'autres procédures complexes de transfert, la méthode de transfert de points enregistre un temps important. En outre, les transferts de points peuvent détecter le niveau global de méthylation de l'ADN en utilisant un anticorps 5-mC disponible dans le commerce. Nous avons constaté que le niveau de méthylation de l'ADN différait entre les sous-cultures monocouches et pouvait donc jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des chondrocytes. Le point blot 5 mC est une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau général de méthylation de l'ADN pour évaluerPhénotype chondrocyte.
Introduction
L'implantation de chondrocytes autologue (ACI) est une procédure relativement nouvelle et à la fine pointe de la technique pour traiter les défauts du cartilage articulaire 1 , 2 . L'une des étapes cruciales de l'ACI est l'amplification des chondrocytes par culture monocouche in vitro . Pendant l'amplification, les chondrocytes hyalines perdent facilement leur phénotype et deviennent dédifférenciés, ce qui n'est pas souhaitable pour le traitement ACI 3 , 4 . Pour optimiser le résultat du traitement ACI, l'étendue de la dédifférenciation des chondrocytes devrait être déterminée avant la replantation. Il est impératif d'établir un moyen économique et rapide de déterminer le statut des chondrocytes. Récemment, l'association entre la méthylation de l'ADN et la dédifférenciation des chondrocytes a attiré beaucoup d'attention 4 , 5 , 6 . La méthylation de l'ADN est un processus par whDes groupes méthyle sont ajoutés à l'ADN, ce qui entraîne la conversion des résidus de cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC).
Pour élucider la biologie de la méthylation de l'ADN dans la dédifférenciation des chondrocytes, la première étape consiste à évaluer le niveau de méthylation de l'ADN des chondrocytes qui, jusqu'à présent, se sont révélés difficiles. Le séquençage génomique du bisulfite est la technique la plus utilisée pour analyser la méthylation de l'ADN 7 , 8 . Dans ce dosage, la conversion de bisulfite provoque une dégradation de l'ADN, et donc une quantité substantielle d'échantillon doit être fournie pour l'essai. En outre, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) a été utilisée pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN 9 , 10 . Cependant, l'analyse HPLC nécessite une digestion par l'ADN génomique. En outre, des instruments expérimentaux avancés et coûteux sont nécessaires. Par conséquent, en plus du coût élevé, ces procédures expérimentales sont des contre-inconvénientsUming. Les anticorps anti-5-mC sont maintenant disponibles dans le commerce, ce qui a créé la possibilité d'un transfert immunologique d'ADN génomique contenant 5 mC à partir de génomes complexes.
Dans ce rapport, nous avons extrait l'ADN génomique des chondrocytes cultivés dans une série de cultures monocouches. Nous avons utilisé un test de point blot pour évaluer le contenu de 5 mC dans les chondrocytes humains avec différents nombres de passages. Nous avons constaté que le contenu de 5 mC était augmenté dans les chondrocytes fortement dédifférenciés par rapport aux chondrocytes à dédifférenciation de bas grade. En outre, nous avons identifié une relation entre le statut de dédifférenciation et les niveaux de 5 mC. Enfin, nous avons signalé que les changements dans le contenu de 5 mC étaient associés au phénotype des chondrocytes. Par conséquent, l'essai de transfert de point de 5 mC est une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau de méthylation de l'ADN dans les chondrocytes.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique humaine de Shenzhen Second People's Hospital.
1. Collection tissulaire du cartilage articulaire humain et culture des chondrocytes
- Préparation des matériaux
- Préparez le milieu de Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine. Préparez 1 mg / mL de collagénase II, 0.25% de trypsine-EDTA, de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) et un filtre cellulaire (nylon de 40 μm).
- Collecte du tissu cartilagineux articulaire humain
- Isoler le cartilage articulaire des articulations du genou des patients donneurs après un traumatisme. Obtenir le consentement éclairé de tous les participants.
- Découper le cartilage en 1-2 mm 3 en utilisant un scalpel stérile et digérer les chondrocytes du cartilage haché avec 1 mg / mL de collagénase II dans le DMEM à 37 ° C pendant 12-16 h.
- Filtrer le celL suspension à travers un filtre cellulaire (40 μm) et laver deux fois avec du PBS.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre et une graine à une densité de 20 000 à 30 000 cellules / cm 2 dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine.
- Culture dans un incubateur à 37 ° C.
- Expansion de chondrocytes monocouche
- Récolte des cellules sous-confluentes en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA et re-plaque à une densité de 6 600 cellules / cm 2 . Changez le support deux fois par semaine.
- Chondrocytes culturels en monocouches pour un maximum de six passages et évaluation aux passages 1, 2, 3, 4 et 5.
2. Extraction d'ADN génomique (ADNc)
- Recueillir des cellules et resuspendre dans 500 μL de tampon de lyse (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / mL RNase A) pour 10 millions de cellules. Remettre en suspension les cellules par pipettage et inversion rapide, puis incuber pendant 1 h à 37 ° C.
- UNEDd proteinase K à une concentration de 160 μg / mL de lysat cellulaire et inverser vigoureusement le mélange. Incuber 6 h à 55 ° C.
- Ajouter un volume de Tris pH 7.9 phénol saturé: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1) à l'échantillon. Vortex ou secouer l'échantillon à la main soigneusement pendant environ 20 s.
- Centrifuger l'échantillon à température ambiante pendant 5 min à 13 000 × g. Retirer la phase aqueuse supérieure et transférer la couche dans un tube frais.
- Extraire avec un volume égal de chloroforme pour éliminer le phénol et transférer la phase aqueuse supérieure à un tube frais.
- Précipiter l'ADN en ajoutant 0,1 volume d'échantillon d'acétate de sodium 3 M à pH 8,0 et 2 volumes d'éthanol à 100%.
- Conserver le tube à -20 ° C pendant la nuit pour précipiter l'ADNc.
- Centrifuger l'échantillon à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 xg pour extraire l'ADNc.
- Laver l'échantillon trois fois avec de l'éthanol à 70% et centrifuger à 4 ° C pendant 2 min à 13 000 x g.
- Supprimer le surnageantT soigneusement et ensuite sécher à l'air. Remettre en suspension l'ADN dans 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.
3. Profilage en méthylation d'ADN
- Utilisez un kit de méthylation d'ADN pour effectuer la conversion de bisulfite en utilisant un total de 500 ng d'ADN génomique, selon le protocole du fabricant. Eluir dans 10 μl de tampon d'élution (50 ng / μL).
- Effectuer le profilage de méthylation d'ADN en utilisant un kit commercial selon le protocole du fabricant.
4. Analyse du point de transfert
- Denaturez l'ADN isolé (1 mg par échantillon) dans NaOH 0,1 M pendant 10 min à 95 ° C. Neutraliser l'ADN avec NH 4 OAc 1 M sur de la glace, puis diluer deux fois. Présenter 2 μl de l'ADN génomique dilué en série sur une membrane N + .
- Nettoyer la membrane à 80 ° C pendant 30 min.
- Bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques en trempant la membrane N + dans 5% de BSA dans TBS-T pendant 1 h. Utilisez une boîte de Petri de 10 cm comme réactionChambre à ion à température ambiante.
- Après avoir lavé 5 minutes trois fois dans TBST, incuber la membrane avec un anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine (5-mC) anti-5 (1: 1 000) dans du TBS-T à 4 ° C pendant une nuit.
- Laver la membrane pendant 5 min trois fois dans le TBS-T, puis incuber avec un anticorps secondaire, une immunoglobuline G (IgG) anti-souris mâchée conjuguée à HRP (1: 5000) dans du TBS-T pendant 1 h à température ambiante.
- Laver la membrane pendant 5 min trois fois dans TBS-T.
- Ajouter le substrat enzymatique à la membrane et incuber pendant 5 à 10 min. Visualisez le signal d'anticorps secondaire en utilisant un kit de chimioluminescence conformément aux instructions du fabricant.
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Representative Results
Les chondrocytes ont été cultivés dans une monocouche jusqu'au passage 6 (P6). Les chondrocytes ont montré des modifications phénotypiques progressives avec des passages successifs de la culture monocouche. La morphologie des chondrocytes P0 était ronde, alors que les cellules étaient fortement pincées et aplatis avec des passages successifs jusqu'à P6 ( figure 1 ). Ce changement de morphologie est typique du processus de dédifférenciation des chondrocytes. Pendant ce temps, les résultats de la carte de chaleur indiquaient que le niveau général de méthylation des sites CpG augmentait avec une sous-culture prolongée. L'analyse par point blot de 5 mC a en outre démontré que des niveaux de méthylation de CpG plus élevés accompagnaient la propagation des chondrocytes ( figure 2 ). Ces résultats ont suggéré une association entre les niveaux de méthylation généralement accrus et la dédifférenciation des chondrocytes.
Figure 2: dosage par point blanc 5-mC spécifique de l'ADNc des chondrocytes. L'ADN génomique a été isolé à partir de chondrocytes après un nombre variable de passages. Des niveaux élevés de 5-mC ont été observés progressivement. 200 ng, 100 ng, 50 ng et 25 ng de gDNA ont été chargés par point. ( A ) Image d'un point blot spécifique à 5 mC; ( B ) Analyse de l'intensité du point par ImageJ. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La dédifférenciation des chondrocytes in vitro compromet sérieusement le résultat de l'ACI dans le traitement de la réparation des défauts du cartilage 11 , 12 . Pour optimiser les résultats ACI, il est crucial d'éviter l'utilisation de chondrocytes dédifférenciés 13 . Des études ont suggéré que le niveau général de méthylation de l'ADN est associé à l'étendue de la dédifférenciation des chondrocytes 4 , 6 . Ainsi, il est impératif d'établir une méthode fiable et rapide pour détecter l'état général de la méthylation de l'ADN des chondrocytes avant son application clinique.
Pour détecter les niveaux généraux de méthylation de l'ADN dans les chondrocytes humains dédifférenciés, nous pourrions mesurer le niveau de 5 mC dans les chondrocytes passés en série. 5-mC est résistant à la désamination par le traitement au bisulfite. Cette propriété a été exploitée pour analyser les schémas de méthylation de cytosine d'ADN en utilisant tIl bisulfite l'approche séquentielle 14 . Le séquençage génomique du bisulfite et la digestion par restriction sensible à la méthylation ont été considérés comme des technologies standard de l'or pour la détection de la méthylation de l'ADN 15 , 16 . Ces approches peuvent identifier 5-mC avec une résolution de paire de base unique. Cependant, le principal inconvénient du séquençage des bisulfites est la dégradation de l'ADN pendant la conversion des bisulfites. Si cette approche était utilisée pour évaluer la dédifférenciation des chondrocytes, cela entraînerait un gaspillage des chondrocytes propagés pour l'ACI. La HPLC est une autre méthode pratique pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN, mais elle convient uniquement aux laboratoires équipés d'un équipement HPLC. Ainsi, le besoin de volumes d'échantillons plus importants ou d'équipements modernes rend ces approches peu pratiques pour les tests de routine du niveau 5-mC dans les laboratoires cliniques typiques.
La disponibilité commerciale d'anticorps de 5 mC offre la possibilité de détecterNiveaux généraux de méthylation de l'ADN en utilisant un test de transfert de points. Par rapport à d'autres techniques de transfert, le point blot 5-mC est une procédure plus facile, qui ne nécessite ni de grandes quantités d'ADNg ni d'électrophorèse. De plus, les instruments sont disponibles dans des laboratoires modérément équipés. Par conséquent, la méthode 5-mC dot blot devrait être applicable comme une approche alternative du dosage de la méthylation de l'ADN.
Dans ce rapport, nous avons identifié une association entre les niveaux supérieurs de 5 mC et la dédifférenciation des chondrocytes; Les niveaux de 5 mC ont augmenté avec l'augmentation du passage de la sous-culture. Nos résultats suggèrent que 5 mC pourrait être intimement impliqué dans la dédifférenciation causée par les conditions d'expansion des chondrocytes monocouches. Fait important, nous avons constaté que des niveaux supérieurs de 5 mC étaient associés à la perte du phénotype des chondrocytes, ce qui empêche une large application de l'ACI de réparer les défauts du cartilage. Par conséquent, les résultats de notre étude suggèrent que le transfert de points de 5 mC pourrait être un moyen fiable de mesurer l'étendue deLa dédifférenciation des chondrocytes, en particulier lorsqu'un nombre plus important d'échantillons et de plus petites quantités d'ADNg doivent être analysés.
Afin d'appliquer des méthodes de transfert de points à l'analyse de la méthylation de l'ADN, la question clé qui doit être considérée est la qualité de l'échantillon d'ADN. Par conséquent, l'étape critique dans la détection 5-mC via dot blot est l'étape d'extraction génomique de l'ADNc. Nous suggérons aux chercheurs d'utiliser un kit d'extraction de gDNA disponible dans le commerce pour maximiser la concentration et la pureté de l'ADNc. De plus, l'échantillon d'ADN doit être chargé sur une membrane en nylon. Une autre question importante est de s'assurer que l'échantillon d'ADN a été immobilisé et entièrement absorbé par la membrane de nylon.
La technique que nous décrivons ici nous donne l'occasion de réaliser des tests multiples au moindre coût. Un avantage supplémentaire de cette approche est la dépendance à l'égard d'équipements simples et abordables pour effectuer l'analyse et interpréter les résultats. En outre, il peut être utilisé pour comparer le parentDifférences dans les niveaux globaux de méthylation entre 2 échantillons ou plus. Cependant, ce dosage ne peut pas être utilisé pour une quantification précise des niveaux de méthylation de l'ADN ou pour déterminer l'état de méthylation de CpG d'une séquence d'ADN spécifique. En outre, cette méthode a une sensibilité limitée, car l'état de méthylation ne peut pas être détecté avec précision dans des échantillons d'ADNg inférieurs à 50 ng. Bien que cette méthode fournisse une analyse qualitative de la méthylation globale de l'ADN, elle pourrait donner lieu à des résultats faussement positifs si elle était incorrecte.
En résumé, le point blot de 5 mC est une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau général de méthylation de l'ADN pour évaluer le phénotype des chondrocytes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: Fondation des sciences naturelles de la Chine (n ° 81572198; n ° 81260161; n ° 81000460); Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, Chine (n ° 2015A030313772); Projet financé par la Fondation canadienne de la science postdoctorale (no 2013M530385); La Fondation de recherche médicale de la province de Guangdong, en Chine (no A2016314); Projets de science et de technologie de Shenzhen (n ° JCYJ20160301111338144; N ° JSGG20151030140325149; N ° JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; N ° JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
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