Summary
Presentiamo un metodo per quantificare la metilazione del DNA in base alla macchia dot-5-metilcitosina (5-mc). Abbiamo determinato i livelli di 5 mC durante la dedifferentiation dei condrociti. Questa semplice tecnica potrebbe essere utilizzata per determinare rapidamente il fenotipo condrocitico nel trattamento ACI.
Abstract
La dedifferentiation dei condrociti ialine nei condrociti fibroblastici spesso accompagna l'espansione monoselocca dei condrociti in vitro . Il livello globale di metilazione del DNA dei condrociti è considerato un biomarker adatto per la perdita del fenotipo condrocitico. Tuttavia, i risultati basati su metodi sperimentali diversi possono essere incoerenti. Pertanto, è importante stabilire un metodo preciso, semplice e rapido per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA durante la dedifferentiation della condrociti.
Le tecniche di analisi di metilazione a livello genomico in gran parte dipendono dal sequenziamento genomico di bisolfito. A causa del degrado del DNA durante la conversione di bisolfito, questi metodi richiedono tipicamente un grande volume di campione. Altri metodi utilizzati per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA includono la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Tuttavia, la HPLC richiede una completa digestione del DNA genomico. Inoltre, il costo proibitativamente elevato di HPLC inGli strumenti limitano l'applicazione più ampia di HPLC.
In questo studio, il DNA genomico (gDNA) è stato estratto da condrociti umani coltivati con un numero variabile di passaggi. Il livello di metilazione del gDNA è stato rilevato utilizzando un test di macchia puntale specifico per la metilazione. In questo approccio dot blot, una miscela di gDNA contenente il DNA metilato da rilevare è stata individuata direttamente su una membrana N + come punto all'interno di un modello di schema circolare precedentemente disegnato. Rispetto ad altri approcci di blotting a base di elettroforesi a base di gel e ad altre procedure di blotting complesse, il metodo dot blot consente di risparmiare tempo significativo. Inoltre, le macchie a punti possono rilevare il livello generale di metilazione del DNA utilizzando un anticorpo a 5 mc commercialmente disponibile. Abbiamo scoperto che il livello di metilazione del DNA differiva tra le sottoculture monolayer e quindi potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nella dedifferentiation condrocitica. La macchia a punti da 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello generale di metilazione del DNA da valutareE fenotipo condrocitico.
Introduction
L'impianto di condrociti autologo (ACI) è una procedura relativamente nuova e all'avanguardia per curare i difetti della cartilagine articolare 1 , 2 . Uno dei punti cruciali in ACI è l'amplificazione dei condrociti attraverso la coltura monolayer in vitro . Durante l'amplificazione, i condrociti ialini facilmente perdono il loro fenotipo e diventano dedifferenziati, che è indesiderabile per il trattamento ACI 3 , 4 . Per ottimizzare l'esito del trattamento ACI, la dimensione della dedifferentiation dei condrociti dovrebbe essere determinata prima della reimpianto. È indispensabile stabilire un modo economico e rapido per determinare lo status di condrociti. Recentemente, l'associazione tra la metilazione del DNA e la dedifferentiation dei condrociti ha attirato molta attenzione 4 , 5 , 6 . La metilazione del DNA è un processo di whI gruppi metilici vengono aggiunti al DNA, con conseguente conversione di residui di citosina a 5-metilcitosina (5-mC).
Per chiarire la biologia della metilazione del DNA nella dedifferentiation condrocitica, il primo passo è valutare il livello di metilazione del DNA dei condrociti, che finora si è dimostrato difficile. La sequenza genomica bisulfite è la tecnica più utilizzata per analizzare la metilazione del DNA 7 , 8 . In questo saggio, la conversione di bisolfito provoca il degrado del DNA e quindi una quantità sostanziale di campione deve essere fornita per il dosaggio. Inoltre, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è stata utilizzata per quantificare i livelli di metilazione del DNA a livello mondiale 9 , 10 . Tuttavia, l'analisi HPLC richiede la digestione genomica del DNA. Inoltre, sono necessari strumenti sperimentali avanzati e costosi. Pertanto, oltre al costo elevato, queste procedure sperimentali sono tempi di devastazioneUming. Gli anticorpi anti-5-mC sono ormai diventati commercialmente disponibili, il che ha creato la possibilità di bloccaggio immunitario di DNA genomico contenente 5 mC da genomi complessi.
In questo rapporto, abbiamo estratto il DNA genomico dai condrociti coltivati in una serie di colture monolayer. Abbiamo utilizzato un punteggio di punteggio per valutare il contenuto di 5 mc nei condrociti umani con diversi numeri di passaggi. Abbiamo riscontrato che il contenuto di 5 mC è aumentato in condrociti altamente dedifferenziati rispetto ai condrociti con dedifferentiation a basso grado. Inoltre, abbiamo identificato una relazione tra lo stato di dedifferentiation ei livelli di 5-mc. Infine, abbiamo riportato che le variazioni nel contenuto di 5 mc erano associate al fenotipo condrocitico. Pertanto, il test a blot di punti a 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello di metilazione del DNA nei condrociti.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Umano di Shenzhen Second People's Hospital.
1. Raccolta dei tessuti di cartilagine articolare umana e cultura condrocitica
- Preparazione dei materiali
- Preparare il mezzo modificato Dulbecco's medium di aquila (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale e 1% di penicillina-streptomicina. Preparare 1 mg / mL collagenasi II, 0,25% trypsin-EDTA, salina fosfata-bufferata (PBS) e un filtro cellulare (40 μm nylon).
- Raccolta di tessuti articolari di cartilagine umana
- Isolare la cartilagine articolare dalle articolazioni del ginocchio dei pazienti donatori dopo il trauma. Ottenere un consenso informato da tutti i partecipanti.
- Tagliare la cartilagine in 1-2 mm 3 pezzi utilizzando un bisturi sterile e digerire condrociti dalla cartilagine macinata con 1 mg / mL collagenasi II in DMEM a 37 ° C per 12-16 h.
- Filtra il risultato ottenutoL sospensione attraverso un filtro cellulare (40 μm) e lavare due volte con PBS.
- Contare le cellule con un emocitometro e un seme ad una densità di 20.000-30.000 cellule / cm 2 in DMEM completato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina.
- Coltura in un incubatore a 37 ° C.
- Espansione monocolore condrocita
- Seppellire le cellule sub-confluenti utilizzando 0.25% di trypsin-EDTA e ricaricare a una densità di 6.600 cellule / cm 2 . Cambiare il mezzo due volte alla settimana.
- Condurre i condrociti in monostrati per un massimo di sei passaggi e valutare ai passi 1, 2, 3, 4 e 5.
2. Estrazione del DNA genomico (gDNA)
- Raccogliere le cellule e risospendere in 500 μl di tampone di lisi (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / mL RNasi A) per 10 milioni di cellule. Riposizionare le cellule pipettando e rapida inversione, quindi incubare per 1 h a 37 ° C.
- UNDd proteinasi K ad una concentrazione di 160 μg / mL di lisato cellulare e invertire la miscela vigorosamente. Incubare 6 h a 55 ° C.
- Aggiungere un volume di Tris pH 7,9 fenolo saturo: cloroformio: isoamilico alcol (25: 24: 1) al campione. Vortice o scuotete il campione manualmente per circa 20 s.
- Centrifugare il campione a temperatura ambiente per 5 min a 13.000 × g. Rimuovere la fase acquosa superiore e trasferire lo strato su un tubo fresco.
- Estrarre con un uguale volume di cloroformio per rimuovere fenolo e trasferire la fase acquosa superiore in un tubo fresco.
- Precipitare il DNA con l'aggiunta di 0,1 campioni di 3 M di acetato di sodio pH 8,0 e 2 volumi di etanolo al 100%.
- Conservare il tubo a -20 ° C per la notte per precipitare il gDNA.
- Centrifugare il campione a 4 ° C per 10 min a 16.000 xg per gDNA di pellet.
- Lavare il campione tre volte con il 70% di etanolo e centrifugare a 4 ° C per 2 minuti a 13.000 x g.
- Rimuovere il soprannatanoT con attenzione e poi asciugata all'aria. Resuspendere il DNA in 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.
3. Profilo di metilazione del DNA
- Utilizzare un kit di metilazione del DNA per eseguire la reazione di conversione bisolfita usando un totale di 500 ng del DNA genomico, secondo il protocollo del produttore. Eluire in 10 μl di tampone di eluizione (50 ng / μL).
- Eseguire la profilazione della metilazione del DNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
4. Dot Blot Analysis
- Denatura il DNA isolato (1 mg per campione) in 0,1 M NaOH per 10 minuti a 95 ° C. Neutralizzare il DNA con 1 M NH 4 OAc su ghiaccio e quindi diluire due volte. Spot 2 μL del DNA genomico diluito seriale su una membrana N + .
- Blot la membrana a 80 ° C per 30 min.
- Bloccare i siti di legame non specifico dell'anticorpo imbevando la membrana N + nel 5% di BSA in TBS-T per 1 h. Utilizzare un piatto di Petri da 10 cm come reagireIon a temperatura ambiente.
- Dopo aver lavato 5 minuti tre volte in TBST, incubare la membrana con un anticorpo monoclonale anti-5-metilcitosina (5-mC) del mouse (1: 1,000) in TBS-T a 4 ° C per una notte.
- Lavare la membrana per 5 minuti tre volte in TBS-T e poi incubare con un anticorpo secondario, immunoglobulina IgG (Ig: 1: 5,000) anti-mouse pecore coniugato con HRP in TBS-T per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare la membrana per 5 minuti tre volte in TBS-T.
- Aggiungere il substrato enzimatico alla membrana e incubare per 5-10 min. Visualizzare il segnale secondario anticorpale usando un kit di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore.
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Representative Results
I condrociti sono stati coltivati in un monostrato fino al passaggio 6 (P6). I condrociti hanno mostrato progressi fenotipici con passaggi successivi della coltura monolayer. La morfologia dei condrociti P0 era rotonda, mentre le cellule sono diventate altamente schiacciate e appiattite con passaggi successivi fino a P6 ( Figura 1 ). Questo cambiamento morfologico è tipico del processo di dedifferentiation condrocitico. Nel frattempo, i risultati della mappa termica hanno indicato che il livello generale di metilazione dei siti CpG aumenta con una subcoltura prolungata. L'analisi della macchia a punti da 5 mc ha inoltre dimostrato che i livelli di metilazione superiori a CpG hanno accompagnato la propagazione dei condrociti ( Figura 2 ). Questi risultati suggerivano un'associazione tra livelli di metilazione generalmente aumentati e dedifferentiation condrocitico.
Figura 2: Esame blot di punti a 5 mC di gDNA di condrociti. Il DNA genomico è stato isolato dai condrociti dopo un numero variabile di passaggi. Sono stati osservati livelli progressivamente elevati di 5 mC. 200 ng, 100 ng, 50 ng e 25 ng di gDNA sono stati caricati per punto. ( A ) Immagine di blot di punti specifico a 5 mC; ( B ) Analisi dell'intensità dei punti da parte di ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La dedifferentiation condrocitica in vitro compromette gravemente l'esito dell'ACI nel trattamento della riparazione di difetti della cartilagine 11 , 12 . Per ottimizzare l'esito ACI, è fondamentale evitare l'uso di condrociti dedifferenziati 13 . Gli studi hanno suggerito che il livello generale di metilazione del DNA è associato all'estensione della dedifferentiation condroscica 4 , 6 . Quindi è indispensabile stabilire un metodo affidabile e rapido per rilevare lo stato di metilazione del DNA dei condrociti prima della sua applicazione clinica.
Per individuare i livelli generali di metilazione del DNA nei condrociti umani dedifferenziati, potremmo misurare il livello di 5 mC in condrociti passati in serie. 5-MC è resistente alla deaminazione mediante trattamento di bisolfito. Questa proprietà è stata sfruttata per analizzare i modelli di metilazione della citosina DNA usando tL'approccio di sequenziamento bisolfito 14 . La sequenza genomica bisulfite e la digestione di restrizione sensibile alla metilazione sono state considerate come tecnologie standard oro per la rilevazione della metilazione del DNA 15 , 16 . Questi approcci possono identificare la risoluzione di 5 mC con una singola base-pair. Tuttavia, il più grande inconveniente del sequenziamento di bisolfito è il degrado del DNA durante la conversione di bisolfito. Se questo approccio fosse utilizzato per valutare la dedifferentiation condrocitica, ciò comporterebbe uno spreco dei condrociti propagati per ACI. HPLC è un altro metodo praticabile per quantificare i livelli di metilazione del DNA globale, ma è adatto solo a laboratori con apparecchiature HPLC. Pertanto, la necessità di grandi volumi di campioni o di apparecchiature moderne rende questi approcci impraticabili per i test di routine di livello a 5 mC in laboratori clinici tipici.
La disponibilità commerciale di anticorpi da 5 mc offre la possibilità di rilevareI livelli generali di metilazione del DNA usando un test di blot dot. Rispetto ad altre tecniche di blotting, la macchia a punti da 5 mc è una procedura più facile, che non richiede grandi quantità di gDNA né elettroforesi. Inoltre, gli strumenti sono disponibili in laboratori moderatamente attrezzati. Pertanto, il metodo a blot di 5 mc dovrebbe essere applicabile come un approccio alternativo del test di metilazione del DNA.
In questa relazione abbiamo individuato un'associazione tra i livelli superiori a 5 mc e la dedifferentiation dei condrociti; I livelli di 5-mc aumentano con l'incremento del passaggio di subculture. I nostri risultati suggeriscono che 5-MC potrebbe essere intimamente coinvolto nella dedifferentiation causata da condizioni di espansione monocolorale di condrociti. Importante, abbiamo riscontrato livelli superiori a 5 mC associati alla perdita del fenotipo condrocitico, che impedisce un'ampia applicazione dell'ACI per la riparazione dei difetti della cartilagine. Pertanto, i nostri risultati di studio suggeriscono che 5 mc dot blotting potrebbe essere un modo affidabile per misurare la portataDedifferentiation di condrociti, in particolare quando si devono analizzare più grandi quantità di campioni e piccole quantità di gDNA.
Al fine di applicare metodi di macchia dot-bling all'analisi della metilazione del DNA, la questione fondamentale da considerare è la qualità del campione di DNA. Pertanto, il passaggio critico in rilevazione a 5 mC tramite punto blot è la fase di estrazione genomica di gDNA. Suggeriamo che i ricercatori utilizzino un kit di estrazione gDNA disponibile in commercio per massimizzare la concentrazione e la purezza di gDNA. Inoltre, il campione del DNA dovrebbe essere caricato su una membrana in nylon. Un'altra importante questione è assicurare che il campione di DNA sia stato immobilizzato e completamente assorbito dalla membrana in nylon.
La tecnica che descriviamo qui ci offre l'opportunità di eseguire test multipli al minor costo. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è la sua dipendenza da apparecchiature semplici e convenienti per eseguire il test e interpretare i risultati. Inoltre, può essere utilizzato per confrontare i relativiDifferenze nei livelli di metilazione globale tra 2 o più campioni. Tuttavia, questo dosaggio non può essere utilizzato per una quantificazione precisa dei livelli di metilazione del DNA o per determinare lo stato di metilazione di CpG di una sequenza specifica del DNA. Inoltre, questo metodo ha una sensibilità limitata, in quanto lo stato di metilazione non può essere rilevato con precisione nei campioni di gDNA inferiori a 50 ng. Anche se questo metodo fornisce un'analisi qualitativa della metilazione del DNA globale, potrebbe dare luogo a risultati falsi positivi se eseguiti in modo improprio.
In sintesi, la macchia a punti da 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello generale di metilazione del DNA per valutare il fenotipo della condrociti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: Science Foundation of China (No. 81572198, No. 81260161, No. 81000460); Fondazione della Scienza Naturale della provincia di Guangdong, Cina (No. 2015A030313772); Progetto finanziato dalla Fondazione della scienza postduttorica cinese (n. 2013M530385); La Fondazione di ricerca medica della provincia di Guangdong, Cina (n. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
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