Summary
本発明者らは、5-メチルシトシン（5-mC）ドットブロットに基づいてDNAメチル化を定量する方法を提示する。我々は、軟骨細胞脱分化の間の5-mCレベルを決定した。この単純な技術は、ACI治療における軟骨細胞の表現型を迅速に決定するために使用することができる。
Abstract
硝子軟骨細胞の繊維芽細胞様軟骨細胞への脱分化は、しばしばインビトロでの軟骨細胞の単層拡大を伴う。軟骨細胞の全体的なDNAメチル化レベルは、軟骨細胞表現型の喪失に適したバイオマーカーであると考えられている。しかしながら、異なる実験方法に基づく結果は矛盾することがある。したがって、軟骨細胞の脱分化の間の全体的なDNAメチル化レベルを定量化するための正確で単純で迅速な方法を確立することが重要である。
現在のゲノムワイドメチル化分析技術は、主にバイサルファイトゲノム配列決定に依存している。亜硫酸水素塩転換中のDNA分解のために、これらの方法は、典型的には、大きな試料量を必要とする。全体のDNAメチル化レベルを定量するために使用される他の方法には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれる。しかしながら、HPLCはゲノムDNAの完全消化を必要とする。さらに、HPLCのコストが非常に高くなります。HPLCの幅広い応用が制限されています。
この研究では、ゲノムDNA（gDNA）を、様々な継代数で培養したヒト軟骨細胞から抽出した。 gDNAメチル化レベルは、メチル化特異的ドットブロットアッセイを用いて検出した。このドットブロットアプローチでは、検出されるべきメチル化DNAを含むgDNA混合物を、先に描かれた円形鋳型パターン内のドットとしてN +膜上に直接スポットした。他のゲル電気泳動に基づくブロッティング法および他の複雑なブロッティング法と比較して、ドットブロット法はかなりの時間を節約する。加えて、ドットブロットは、市販の5-mC抗体を用いて全体のDNAメチル化レベルを検出することができる。本発明者らは、DNAメチル化レベルが単層継代培養の間で異なり、したがって軟骨細胞脱分化に重要な役割を果たすことができることを見出した。 5-mCドットブロットは、一般的なDNAメチル化レベルを検出して評価するための、信頼性の高い簡単で迅速な方法です軟骨細胞表現型。
Introduction
自己軟骨細胞移植（ACI）は、関節軟骨欠損を治療するための比較的新しい、最先端の方法である1,2 。 ACIの重要なステップの1つは、 インビトロでの単層培養による軟骨細胞の増幅である。増幅中、硝子軟骨細胞は容易にその表現型を失い、脱分化し、ACI処置3,4にとって望ましくない。 ACI治療の結果を最適化するために、軟骨細胞脱分化の程度は、再移植の前に決定されるべきである。軟骨細胞の状態を決定する経済的かつ迅速な方法を確立することが不可欠です。近年、DNAメチル化と軟骨細胞の脱分化との関連が注目されている4,5,6。 DNAメチル化は、whメチル基がDNAに付加され、シトシン残基が5-メチルシトシン（5-mC）に変換される。
軟骨細胞の脱分化におけるDNAメチル化の生物学を解明するために、第一段階は軟骨細胞のDNAメチル化レベルを評価することであり、これまで困難であった。バイサルファイトのゲノムシーケンシングは、DNAメチル化を解析するために最も広く使用されている手法です7,8 。このアッセイでは、重亜硫酸塩の変換はDNA分解を引き起こすため、アッセイのために相当量の試料を提供しなければならない。また、グローバルDNAメチル化レベル9,10を定量するために、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が使用されています。しかしながら、HPLC分析はゲノムDNA消化を必要とする。さらに、高度で高価な実験器具が必要である。したがって、高コストに加えて、これらの実験手順は、時間の短所uming。現在、抗5-mC抗体が市販されており、複合ゲノムからの5-mC含有ゲノムDNAの免疫ブロットの可能性が生じている。
この報告では、一連の単層培養で増殖した軟骨細胞からゲノムDNAを抽出した。本発明者らは、異なる数の継代を有するヒト軟骨細胞における5-mC含量を評価するために、ドットブロットアッセイを使用した。我々は、5-mC含量が、低分化脱分化を伴う軟骨細胞と比較して、高度に脱分化した軟骨細胞において増加することを見出した。さらに、脱分化状態と5-mCレベルとの間の関係を同定した。最後に、我々は、5-mC含量の変化が軟骨細胞の表現型と関連していることを報告した。したがって、5-mCドットブロットアッセイは、軟骨細胞におけるDNAメチル化レベルを検出するための信頼性が高く、簡単で迅速な方法である。
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Protocol
この研究は、深セン第二人民病院の人間倫理委員会によって承認された。
1.ヒト関節軟骨組織収集および軟骨細胞培養
- 材料の準備
- 10％ウシ胎仔血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地を調製する。 1mg / mLコラゲナーゼII、0.25％トリプシン-EDTA、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）および細胞ストレーナー（40μmナイロン）を調製する。
- ヒト関節軟骨組織収集
- 外傷後にドナー患者の膝関節から関節軟骨を隔離する。すべての参加者からインフォームドコンセントを得る。
- 滅菌メスを使用して軟骨を1〜2mm 3個に切って、37℃で12〜16時間DMEM中の1mg / mLコラゲナーゼIIを含む軟骨軟骨から軟骨細胞を消化する。
- 結果のセルをフィルタリングする細胞懸濁液（40μm）で懸濁し、PBSで2回洗浄する。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したDMEM中で、血球計算器および20,000〜30,000細胞/ cm 2の密度で細胞を計数する。
- インキュベーターで37℃で培養する。
- 単層軟骨細胞増殖
- 0.25％トリプシン-EDTAを用いてサブコンフルエントな細胞を採取し、6,600細胞/ cm 2の密度で再プレートする。 1週間に2回、培地を交換する。
- 単層の軟骨細胞を6継代まで培養し、継代1,2,3,4および5で評価する。
ゲノムDNA（gDNA）抽出
- 100万個の細胞あたり500μLの溶解バッファー（15mM Tris pH 8.0,10mM EDTA pH 8.0,0.5％SDS、200μg/ mL RNase A）で細胞を回収し、再懸濁する。ピペッティングと急速逆転により細胞を再懸濁し、37℃で1時間インキュベートする。
- AddプロテイナーゼKを160μg/ mLの細胞溶解液の濃度で添加し、混合物を激しく逆転させる。 55°Cで6時間インキュベートする。
- トリスpH 7.9飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）の1容量を試料に添加する。約20秒間手でボルテックスまたは振とうします。
- 試料を13,000×gで5分間室温で遠心分離する。上部の水相を除去し、層を新しいチューブに移す。
- 等量のクロロホルムで抽出してフェノールを除去し、上部の水相を新しいチューブに移す。
- 0.1Mサンプルの3M酢酸ナトリウムpH8.0および2倍量の100％エタノールを加えてDNAを沈殿させる。
- チューブを-20℃で一晩保存してgDNAを沈殿させます。
- サンプルを4℃で16,000 xgで10分間遠心分離してgDNAをペレットにします。
- サンプルを70％エタノールで3回洗浄し、4℃で2分間、13,000×gで遠心分離する。
- スーパーナタールを取り除く注意深く風乾してください。 DNAを10mMトリスpH8.0,0.1mM EDTAに再懸濁する。
DNAメチル化プロファイリング
- DNAメチル化キットを使用して、製造業者のプロトコールに従って、総500ngのゲノムDNAを使用して重亜硫酸塩変換反応を実施する。 10μLの溶出バッファー（50 ng /μL）で溶出する。
- 市販のキットを製造業者のプロトコールに従って用いてDNAメチル化プロファイリングを行う。
4.ドットブロット分析
- 単離されたDNA（サンプルあたり1 mg）を0.1 M NaOHで95℃で10分間変性させます。氷上で1 M NH 4 OAcでDNAを中和し、次に2倍に希釈する。連続希釈されたゲノムDNA2μLをN +膜にスポットする。
- 膜を80℃で30分間ブロッティングする。
- TBS-T中の5％BSAにN +膜を1時間浸漬することにより、非特異的な抗体結合部位をブロックする。反応として10cmのペトリ皿を使用するイオンチャンバー内に室温で置く。
- TBSTで5分間3回洗浄した後、膜をTBS-T中マウス抗5-メチルシトシン（5-mC）モノクローナル抗体（1：1,000）と4℃で一晩インキュベートする。
- 膜をTBS-Tで5分間3回洗浄し、次いでTBS-T中の二次抗体であるHRPコンジュゲートヒツジ抗マウス免疫グロブリン-G（IgG）（1：5,000）と共に室温で1時間インキュベートする。
- 膜をTBS-T中で5分間3回洗浄する。
- 酵素基質を膜に加え、5〜10分間インキュベートする。製造元の指示に従って、化学発光キットを使用して二次抗体シグナルを視覚化する。
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Representative Results
軟骨細胞は継代6まで単層培養した（P6）。軟骨細胞は、単層培養の連続継代で進行性の表現型の変化を示した。 P0軟骨細胞形態は丸いが、細胞はP6までの連続継代で高度に挟み込まれ、平滑化された（ 図1 ）。この形態変化は、軟骨細胞脱分化プロセスの典型である。一方、ヒートマップの結果は、継代培養の延長によりCpG部位の一般的なメチル化レベルが増加することを示した。 5-mCドットブロット分析は、より高いCpGメチル化レベルが軟骨細胞増殖に付随することをさらに実証した（ 図2 ）。これらの結果は、一般に増加したメチル化レベルと軟骨細胞脱分化との間の関連を示唆した。
図2：軟骨細胞のgDNAの5-mC特異的ドットブロットアッセイ。継代数を変化させた後、軟骨細胞からゲノムDNAを単離した。漸進的に上昇した5-mCレベルが観察された。 1ドット当たり200ng、100ng、50ngおよび25ngのgDNAをロードした。 （ A ）5-mC特異的ドットブロットの画像; （ B ）ImageJによるドット強度分析。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
インビトロでの軟骨細胞脱分化は、軟骨欠損修復の治療におけるACIの結果を著しく損なう11,12 。 ACI結果を最適化するためには、脱分化した軟骨細胞の使用を避けることが重要です13 。研究は、一般的なDNAメチル化レベルが軟骨細胞脱分化の程度に関連していることを示唆している4,6。したがって、臨床応用の前に軟骨細胞の一般的なDNAメチル化状態を検出するための信頼性の高い迅速な方法を確立することが不可欠である。
脱分化したヒト軟骨細胞における一般的なDNAメチル化レベルを検出するために、連続継代軟骨細胞における5-mCレベルを測定することができた。重亜硫酸塩処理により5mCは脱アミノ化に耐性があります。この性質を利用して、DNAシトシンメチル化パターンをt彼は重亜硫酸塩シーケンシングアプローチ14 。バイサルファイトゲノム配列決定およびメチル化感受性制限消化は、DNAメチル化の検出のための金標準技術とみなされている15,16 。これらのアプローチは、単一塩基対の分解能で5-mCを同定することができる。しかしながら、重亜硫酸塩の配列決定の最大の欠点は重亜硫酸塩変換中のDNA分解である。このアプローチが軟骨細胞の脱分化を評価するために使用された場合、ACIの増殖軟骨細胞を無駄にするであろう。 HPLCは、全体のDNAメチル化レベルを定量するための別の実用的な方法であるが、HPLC装置を備えた研究室にのみ適している。したがって、より大きなサンプル量または現代的な装置の必要性は、典型的な臨床検査室におけるルーチンの5mCレベルの試験では、これらのアプローチを非実用的にする。
5-mC抗体の商業的利用可能性は、ドットブロットアッセイを用いた一般的なDNAメチル化レベル。他のブロッティング技術と比較して、5-mCドットブロットは、大量のgDNAも電気泳動も必要としない、より簡単な手順である。さらに、これらの機器は、適度に装備された実験室で入手可能である。従って、5mCドットブロット法は、DNAメチル化アッセイの代替アプローチとして適用可能であるべきである。
この報告では、より高い5-mCレベルと軟骨細胞脱分化との間の関連を同定した。 5-mCレベルは、継代培養継代の増加と共に増加した。本発明者らの知見は、5-mCが単層軟骨細胞増殖条件によって引き起こされる脱分化に密接に関与している可能性があることを示唆している。重要なことに、軟骨欠損を修復するためのACIの広範な適用を妨げる、より高い5-mCレベルが軟骨細胞表現型の喪失に関連することを発見した。したがって、我々の研究結果は、5-mCドットブロッティングが、より多くのサンプルおよびより少量のgDNAが分析される場合には、特に軟骨細胞の脱分化を促進する。
DNAメチル化分析にドットブロット法を適用するためには、考慮すべき重要な問題はDNAサンプルの品質です。したがって、ドットブロットによる5-mC検出の重要なステップは、ゲノムgDNA抽出ステップです。我々は研究者がgDNAの濃度と純度を最大にするために市販のgDNA抽出キットを使用することを提案します。さらに、DNAサンプルはナイロン膜にロードする必要があります。別の重要な問題は、DNAサンプルが固定化され、ナイロン膜によって完全に吸収されていることを確認することです。
ここで説明する手法は、最も低いコストで複数のアッセイを実行する機会を与えます。このアプローチのさらなる利点は、アッセイを実施し結果を解釈するための簡単で手頃な装置への依存である。また、それは相対的な2つ以上のサンプル間の全体的なメチル化レベルの差異。しかしながら、このアッセイは、DNAメチル化レベルの正確な定量化または特定のDNA配列のCpGメチル化状態の決定に使用することはできない。さらに、この方法は、メチル化状態が50ng未満のgDNAサンプルでは正確に検出できないため、感度が制限されています。この方法は、全体のDNAメチル化の定性分析を提供するが、不適切に実施されると偽陽性の結果を生じさせる可能性がある。
要約すると、5-mCドットブロットは、軟骨細胞表現型を評価するための一般的なDNAメチル化レベルを検出する信頼性の高い、単純で迅速な方法である。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、以下のグラントによって支持された：中国の自然科学財団（No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460）;広東省自然科学財団、中国（No. 2015A030313772）;中国ポストドクター・サイエンス財団資金提供プロジェクト（No. 2013M530385）;中国広東省の医学研究財団（No. A2016314）;深セン科学技術プロジェクト（No.JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
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