Summary
Se presenta un método para cuantificar la metilación del ADN basado en la 5-mctilcitosina (5-mC) dot blot. Se determinaron los niveles de 5-mC durante la desdiferenciación de condrocitos. Esta técnica simple podría utilizarse para determinar rápidamente el fenotipo de condrocito en el tratamiento de ACI.
Abstract
La desdiferenciación de condrocitos hialinos en condrocitos fibroblásticos acompaña a menudo la expansión monocapa de condrocitos in vitro . El nivel global de metilación del ADN de los condrocitos se considera un biomarcador adecuado para la pérdida del fenotipo de los condrocitos. Sin embargo, los resultados basados en diferentes métodos experimentales pueden ser inconsistentes. Por lo tanto, es importante establecer un método preciso, simple y rápido para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN durante la desdiferenciación de los condrocitos.
Las técnicas actuales de análisis de metilación en todo el genoma se basan en gran medida en la secuenciación genómica del bisulfito. Debido a la degradación del ADN durante la conversión de bisulfito, estos métodos requieren típicamente un gran volumen de muestra. Otros métodos utilizados para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Sin embargo, la HPLC requiere digestión completa del ADN genómico. Además, el costo prohibitivo de la HPLC enLimita la aplicación más amplia de HPLC.
En este estudio, el ADN genómico (gDNA) se extrajo de condrocitos humanos cultivados con un número variable de pasajes. El nivel de metilación de gDNA se detectó usando un ensayo dot blot de metilación específica. En este enfoque dot blot, una mezcla de gDNA que contenía el ADN metilado a detectar se colocó directamente sobre una membrana N + como un punto dentro de un patrón de plantilla circular previamente dibujado. Comparado con otros enfoques basados en electroforesis en gel y otros procedimientos de transferencia de material complejos, el método dot blot ahorra tiempo significativo. Además, las manchas de puntos pueden detectar el nivel de metilación del ADN global usando un anticuerpo de 5 mC comercialmente disponible. Encontramos que el nivel de metilación del ADN difería entre los subcultivos monocapa, y por lo tanto podría desempeñar un papel clave en la desdiferenciación condrocitos. El punto blot de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel general de metilación del ADN a evaluarE fenotipo de condrocito.
Introduction
El implante autólogo de los condrocitos (IAC) es un procedimiento relativamente nuevo y de última generación para tratar los defectos del cartílago articular 1 , 2 . Uno de los pasos cruciales en ACI es la amplificación de condrocitos a través de cultivo monocapa in vitro . Durante la amplificación, los condrocitos hialinos pierden fácilmente su fenotipo y se desdiferencian, lo cual es indeseable para el tratamiento con ACI 3 , 4 . Para optimizar el resultado del tratamiento con ACI, se debe determinar la extensión de la desdiferenciación de los condrocitos antes de la replantación. Es imperativo establecer una manera económica y rápida de determinar el estatus de los condrocitos. Recientemente, la asociación entre la metilación del ADN y la desdiferenciación de los condrocitos ha atraído mucha atención 4 , 5 , 6 . La metilación del ADN es un proceso porLos grupos metilo se añaden al ADN, dando como resultado la conversión de residuos de citosina en 5-metilcitosina (5-mC).
Para dilucidar la biología de la metilación del ADN en la desdiferenciación de los condrocitos, el primer paso es evaluar el nivel de metilación del ADN de los condrocitos, que hasta ahora ha resultado difícil. La secuenciación genómica del bisulfito es la técnica más utilizada para analizar la metilación del ADN 7 , 8 . En este ensayo, la conversión de bisulfito causa la degradación del ADN, y por lo tanto se debe proporcionar una cantidad sustancial de muestra para el ensayo. Además, se ha utilizado la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN 9 , 10 . Sin embargo, el análisis de HPLC requiere la digestión del ADN genómico. Además, se requieren instrumentos experimentales avanzados y costosos. Por lo tanto, además del alto costo, estos procedimientos experimentales son contra del tiempoUming Los anticuerpos anti-5-mC se han vuelto comercialmente disponibles, lo que ha creado la posibilidad de inmunotransferencia de ADN genómico que contiene 5 mC de genomas complejos.
En este informe, hemos extraído ADN genómico de los condrocitos cultivados en una serie de monocapas culturas. Se utilizó un ensayo dot blot para evaluar el contenido de 5 mC en los condrocitos humanos con diferentes números de pasajes. Se encontró que el contenido de 5-mC se incrementó en condrocitos altamente desdiferenciados en comparación con los condrocitos con desdiferenciación de bajo grado. Además, se identificó una relación entre el estado de desdiferenciación y los niveles de 5-mC. Finalmente, se informó de que los cambios en el contenido de 5-mC se asociaron con el fenotipo condrocito. Por lo tanto, el ensayo de transferencia de puntos de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel de metilación del ADN en los condrocitos.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen.
1. Colección de Tejido Articular Humano y Cultura de Condrocitos
- Preparación de materiales
- Preparar el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar 1 mg / ml de colagenasa II, 0,25% de tripsina-EDTA, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y un colador celular (40 μm de nylon).
- Colección de tejido del cartílago articular humano
- Aislar el cartílago articular de las articulaciones de la rodilla de los pacientes donantes después del trauma. Obtenga el consentimiento informado de todos los participantes.
- Dice el cartílago en 1-2 mm 3 piezas utilizando un escalpelo estéril y digerir los condrocitos del cartílago picados con 1 mg / ml de colagenasa II en DMEM a 37 ° C durante 12-16 h.
- Filtrar la cel resultanteL de suspensión a través de un filtro de células (40 μm) y lavar dos veces con PBS.
- Contar células con un hemocitómetro y semilla a una densidad de 20.000-30.000 células / cm2 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
- Cultivo en una incubadora a 37 ° C.
- Expansión de condrocitos monocapa
- Cosecha de células subconfluentes usando tripsina-EDTA al 0,25% y re-plancha a una densidad de 6,600 células / cm2. Cambiar el medio dos veces por semana.
- Condrocitos de la cultura en monocapas para hasta seis pasajes y evaluar en los pasos 1, 2, 3, 4 y 5.
2. Extracción de ADN genómico (gDNA)
- Recoger las células y resuspender en 500 μ l de buffer de lisis (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μ g / mL RNasa A) por 10 millones de células. Resuspender las células pipeteando y la inversión rápida, y luego incubar durante 1 h a 37 ° C.
- UNDd proteinasa K a una concentración de 160 μg / ml de lisado celular e invertir la mezcla vigorosamente. Incubar 6 h a 55 ° C.
- Añadir un volumen de Tris pH 7,9 saturado fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) a la muestra. Vortex o agitar la muestra a mano a fondo durante aproximadamente 20 s.
- Centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min a 13.000 x g. Retirar la fase acuosa superior y transferir la capa a un tubo nuevo.
- Extraer con un volumen igual de cloroformo para eliminar fenol y transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
- Precipitar el ADN añadiendo 0,1 volumen de muestra de acetato de sodio 3 M pH 8,0 y 2 volúmenes de etanol al 100%.
- Guarde el tubo a -20 ° C durante la noche para precipitar el gDNA.
- Centrifugar la muestra a 4 ° C durante 10 min a 16.000 xg para sedimentar gDNA.
- Lavar la muestra tres veces con etanol al 70% y centrifugar a 4 ° C durante 2 min a 13.000 x g.
- Quitar el supernatanT cuidadosamente y luego seque al aire. Resuspender el ADN en Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM.
3. Perfiles de metilación de ADN
- Utilizar un kit de metilación de ADN para realizar la reacción de conversión de bisulfito utilizando un total de 500 ng del ADN genómico, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluir en 10 μl de tampón de elución (50 ng / μl).
- Realice el perfilado de metilación del ADN utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Análisis de transferencia de puntos
- Desnaturalizar el ADN aislado (1 mg por muestra) en NaOH 0,1 M durante 10 min a 95 ° C. Neutralizar el ADN con 1 M NH 4 OAc en hielo, y luego diluir dos veces. Poner 2 μL del ADN genómico diluido en serie en una membrana N + .
- Secar la membrana a 80 ° C durante 30 min.
- Bloquear sitios de unión a anticuerpos no específicos sumergiendo la membrana N + en BSA al 5% en TBS-T durante 1 h. Utilice una placa de Petri de 10 cm como reactivoIon a temperatura ambiente.
- Después de lavar 5 minutos tres veces en TBST, incubar la membrana con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-5-metilcitosina (1: 1.000) en TBS-T a 4ºC durante la noche.
- Lavar la membrana durante 5 min tres veces en TBS-T, e incubar después con un anticuerpo secundario, inmunoglobulina-G (IgG) de ratón oveja conjugada con HRP (1: 5.000) en TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar la membrana durante 5 min tres veces en TBS-T.
- Añadir el substrato enzimático a la membrana e incubar durante 5-10 min. Visualizar la señal del anticuerpo secundario utilizando un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Los condrocitos se cultivaron en una monocapa hasta el paso 6 (P6). Los condrocitos mostraron cambios fenotípicos progresivos con pases sucesivos del cultivo monocapa. La morfología de los condrocitos P0 era ronda, mientras que las células se convirtió muy pellizcado y aplanado con pases sucesivos hasta P6 ( Figura 1 ]. Este cambio de morfología es típico del proceso de desdiferenciación de condrocitos. Mientras tanto, los resultados del mapa de calor indicaron que el nivel general de metilación de los sitios CpG aumentó con la subcultura prolongada. El 5-mC punto blot análisis demostrado más alto que los niveles de metilación CpG acompañado de la propagación de condrocitos ( Figura 2 ]. Estos resultados sugirieron una asociación entre el aumento general de los niveles de metilación y la desdiferenciación de los condrocitos.
Figura 2: Ensayo de transferencia de punto específico de 5-mC de gDNA de condrocitos. ADN genómico fue aislado de los condrocitos después de un número variable de pasajes. Se observaron niveles progresivamente elevados de 5-mC. 200 ng, 100 ng, 50 ng y 25 ng de gDNA se cargaron por punto. ( A ) Imagen de mancha puntual de 5 mC; ( B ) Análisis de intensidad de puntos por la ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Desdiferenciación de condrocitos in vitro compromete gravemente el resultado de la ACI en el tratamiento de la reparación de defectos del cartílago [ 11 , 12] . Para optimizar el resultado ACI, es crucial evitar el uso de condrocitos desdiferenciados [ 13] . Los estudios han sugerido que el nivel general de metilación del ADN está asociado con la extensión de la desdiferenciación de los condrocitos 4 , 6 . Por lo tanto, es imperativo establecer un método fiable y rápido para detectar el estado general de metilación del ADN de los condrocitos antes de su aplicación clínica.
Para detectar los niveles generales de metilación del ADN en los condrocitos humanos desdiferenciados, podríamos medir el nivel de 5 mC en los condrocitos en serie pasados. 5-mC es resistente a la desaminación por tratamiento con bisulfito. Esta propiedad fue explotada para analizar ADN citosina metilación patrones utilizando tEl enfoque de secuenciación de bisulfito 14 . Bisulfite genómica de secuenciación y metilación sensibles a la digestión de restricción se han considerado como estándar de oro para la detección de ADN metilación [ 15 , 16] . Estos enfoques pueden identificar 5-mC con una sola resolución de pares de bases. Sin embargo, el mayor inconveniente de la secuenciación de bisulfito es la degradación del ADN durante la conversión de bisulfito. Si este enfoque se usó para evaluar la desdiferenciación de los condrocitos, resultaría en el desperdicio de los condrocitos propagados para la ACI. La HPLC es otro método práctico para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN, pero sólo es adecuado para laboratorios con equipos de HPLC. Por lo tanto, la necesidad de volúmenes de muestra mayores o equipos modernos hace que estos enfoques sean poco prácticos para las pruebas de rutina de 5 mC en laboratorios clínicos típicos.
La disponibilidad comercial de anticuerpos 5-mC proporciona la posibilidad de detectarNiveles generales de metilación del ADN utilizando un ensayo dot blot. En comparación con otras técnicas de transferencia, la transferencia de punto 5-mC es un procedimiento más fácil, que no requiere grandes cantidades de gDNA ni electroforesis. Además, los instrumentos están disponibles en laboratorios moderadamente equipados. Por lo tanto, el método de transferencia de puntos de 5 mC debe ser aplicable como un enfoque alternativo del ensayo de metilación del ADN.
En este informe, se identificó una asociación entre los niveles más altos de 5-mC y la desdiferenciación de condrocitos; Los niveles de 5-mC aumentaron al aumentar el paso de la subcultura. Nuestros hallazgos sugieren que el 5-mC podría estar íntimamente involucrado en la desdiferenciación causada por las condiciones de expansión monocapa condrocito. Es importante destacar que encontramos mayores niveles de 5-mC se asociaron con la pérdida del fenotipo condrocito, lo que impide la amplia aplicación de ACI para reparar los defectos del cartílago. Por lo tanto, los resultados de nuestro estudio sugieren que la transferencia de puntos de 5 mC podría ser una forma confiable para medir el grado deDesdiferenciación de condrocitos, en particular cuando se va a analizar un número mayor de muestras y cantidades menores de ADNg.
Con el fin de aplicar los métodos de transferencia de puntos al análisis de metilación del ADN, la cuestión clave que debe tenerse en cuenta es la calidad de la muestra de ADN. Por lo tanto, el paso crítico en la detección de 5 mC mediante transferencia de puntos es el paso de extracción genómica de gDNA. Sugerimos que los investigadores utilicen un kit de extracción de gDNA comercialmente disponible para maximizar la concentración y pureza de gDNA. Además, la muestra de ADN se debe cargar en una membrana de nylon. Otra cuestión importante es asegurar que la muestra de ADN ha sido inmovilizada y completamente absorbida por la membrana de nylon.
La técnica que describimos aquí nos da la oportunidad de llevar a cabo ensayos múltiples al menor costo. Una ventaja adicional de este enfoque es su dependencia de equipo simple y asequible para realizar el ensayo e interpretar los resultados. Además, puede utilizarse para compararDiferencias en los niveles de metilación global entre 2 o más muestras. Sin embargo, este ensayo no puede utilizarse para la cuantificación precisa de los niveles de metilación del ADN ni para determinar el estado de metilación de CpG de una secuencia de ADN específica. Además, este método tiene una sensibilidad limitada, ya que el estado de metilación no se puede detectar con exactitud en muestras de ADN glicoso por debajo de 50 ng. Aunque este método proporciona un análisis cualitativo de la metilación global del ADN, podría dar lugar a resultados falsos positivos si se realiza indebidamente.
En resumen, la transferencia de puntos de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel general de metilación del ADN para evaluar el fenotipo de los condrocitos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones siguientes: Fundación de Ciencias Naturales de China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Proyecto financiado por la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (No. 2013M530385); La Fundación de Investigación Médica de la provincia de Guangdong, China (No. A2016314); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
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