Summary
وقد وضعت العديد من البروتوكولات ووصف لعزل أنواع مختلفة من خلايا القلب من القلب الفئران. هنا، يوصف بروتوكول الأمثل الذي يسمح لعزل عالية الجودة أنواع الخلايا القلب الرئيسية (الخلايا العضلية، الخلايا البطانية، والألياف الليفية) من إعداد واحد، والحد من التكاليف التجريبية.
Abstract
الفئران هو نموذج حيواني مهم المستخدمة في البحوث القلب والأوعية الدموية، وتستخدم خلايا القلب الفئران بشكل روتيني لتحليل المختبر من الآليات الجزيئية للتقدم أمراض القلب والأوعية الدموية مثل تضخم القلب والتليف وتصلب الشرايين. على الرغم من أن العديد من المحاولات مع نجاح متغير قد أحرزت لتطوير خطوط الخلايا خلد من نظام القلب والأوعية الدموية لفهم هذه الآليات الخلوية، والخلايا الأولية توفر أكثر طبيعية وقريبة من البيئة في الجسم الحي لمثل هذه الدراسات. لذلك، مختبرات مختلفة تعمل على نوع خلية معينة وضعت بروتوكولات لعزل أنواع فردية من خلايا القلب الفئران من الفائدة. ومع ذلك، هناك بروتوكول يسمح لعزل أكثر من نوع خلية واحدة، غير موجود. هنا يوصف بروتوكول الأمثل الذي يسمح لعزل عالية الجودة أنواع خلايا القلب الرئيسية (الخلايا العضلية، الخلايا البطانية، والألياف الليفية) من إعداد واحد وتمكن ثيr للاستخدام في التحليلات الخلوية. ويسمح ذلك بأكفأ استخدام للموارد المتاحة، مما قد يوفر الوقت ويقلل من تكاليف البحث.
Introduction
وقد استخدمت منذ فترة طويلة نماذج القوارض كأدوات لتوسيع فهمنا لعلم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية في الصحة والمرض. 1 على الرغم من أن هذه النماذج الحيوانية تسمح لنا لفهم الفيزيولوجيا المرضية للمرض على مستوى الجهاز وتحليل الدوائية والديناميكا الدوائية من مختلف العوامل الدوائية المستخدمة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية، وفهم الآليات الجزيئية للتطور أمراض القلب والأوعية الدموية ومساهمة معين نوع الخلية يتطلب استخدام في المختبر نماذج زراعة الخلايا. لهذا الغرض تم تطوير خطوط خلوية مختلفة من نظام القلب والأوعية الدموية؛ 2 ، 3 ومع ذلك، الخلايا الأولية المعزولة حديثا هي من الناحية الفسيولوجية والوظيفية أكثر ملاءمة للأنسجة الحية والكائنات الحية.
القلب هو جهاز تنوعا يحتوي على جميع أنواع رئيسية من خلايا القلب والأوعية الدموية قيستم، وقلب الفئران لا يزال نموذجا شائع الاستخدام لفهم علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية. خلال العقود القليلة الماضية، تم وصف طرق مختلفة لعزل أنواع الخلايا الفردية من أنسجة القلب. 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، ولكن هذه الأساليب تركز فقط على عزل نوع واحد من الخلايا المحددة مما أدى إلى فقدان أنواع أخرى من الخلايا التي لم تعد تستخدم للتحليل الخلوي. هنا، يتم وصف بروتوكول الأمثل التي تمكن العزلة في وقت واحد وعالية الجودة من أنواع الخلايا الرئيسية من أنسجة القلب، أي الخلايا العضلية، الخلايا البطانية، والألياف الليفية. كل هذه الأنواع من الخلايا يمكن استخدامها في الاجهزة التجريبية المختلفة 8 ، 9 ، 10 ولتحليل التفاعلات خلية الخلية من نفس الحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويتفق التحقيق مع دليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (منشور المعهد الوطني للصحة رقم 85-23 1985) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية في جامعة جيسن. تم استخدام الذكور البالغين من الفئران ويستار وزنها 200 - 250 غرام في هذه الدراسة.
1. الأوتوكلاف
- قبل يوم واحد على الأقل من الإجراء هو أن يتم تنفيذها، الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية، نصائح ماصة، وماصات باستور لاستخدامها في إجراء العزلة في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. إعداد وسائل الإعلام والحلول
ملاحظة: يمكن إعداد حلول من الخطوات 2،1-2،4 تصل إلى أسبوع قبل العزلة وتخزينها في 4 درجات مئوية، ولكن إعداد الحلول في الخطوات 2.5-2.8 في يوم العزلة. وترد في الجدول 1 وصفات كاملة من المخازن المؤقتة ووسائل الإعلام. دافئة جميع وسائل الإعلام والحلول إلى 37 درجة مئوية في أحمام الماء قبل البدء في إعداد.
- إعداد باول المتوسطة عن طريق إذابة المواد الكيميائية المدرجة في الجدول 1 في 4.5 لتر من H 2 O في درجة حرارة الغرفة (رت). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 2.0 N هيدروكسيد الصوديوم، وتقديم حجم إلى 5.0 L. العقيمة تصفية الحل، وتخزينه في 4 درجات مئوية.
- إعداد الكرياتين، L- كارنيتين، والتورين (كت) المتوسطة عن طريق إذابة M199 مسحوق المتوسطة في 4.5 لتر من H 2 O. إضافة هيبيس مسحوق وفقا للجدول إلى المتوسطة وتخلط لمدة 15 دقيقة. إضافة الكرياتين، الكارنيتين، التورين، و أرا-C وفقا للجدول 1 . تخلط جيدا، وضبط درجة الحموضة مع متر الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع 2.0 N هيدروكسيد الصوديوم، وجلب حجم إلى 5.0 L. فلتر العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد وسط زراعة الخلايا للألياف الليفية عن طريق إضافة 10٪ مصل العجل الجنين (فس) و 2٪ البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) إلى M199 المتوسطة. دمم مناسبة على قدم المساواة كما M199 ويمكن أيضا أن تستخدم لخلية الخلايا الليفية.
- إعداد MV2 زراعة الخلاياe المتوسطة للخلايا البطانية عن طريق إضافة جميع محتويات مزيج ملحق إلى وسط MV2 القاعدية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خذ قسامة 5 مل ودافئ إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إعداد البطانية عازلة عزل الخلايا عن طريق إذابة 0.05 غرام من ألبومين المصل البقري (بسا) في 50 مل من هانكس حل الملح المتوازن (هبس) وإضافة 0.5 مل من محلول إثيلينديامينتيتراسيتيك 200 ملي (إدتا) حل لذلك. تصفية معقمة هذا وتخزينه في 4 درجات مئوية.
- إعداد البطانة عازلة غسيل الخلايا عن طريق إضافة 0.1 مل من 200 ملي إلى 9.9 مل من برنامج تلفزيوني وتخزينه في 4 درجات مئوية.
- إعداد حل كولاجيناز عن طريق إذابة 27 ملغ من كولاجيناز في 5 مل من باول المتوسطة وإضافة 12.5 ميكرولتر من 100 ملي كاكل 2 حل لذلك. دافئ إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إعداد الإضافية كا 2+ حلول الترميم 1، 2، و 3 ل كارديوميوسيتس بإضافة 12.5 ميكرولتر، 25 ميكرولتر، و 120 ميكرولتر من 100 ملي كاكل 2 سولوتأيون إلى 6 مل، 6 مل، و 12 مل من باول المتوسطة، على التوالي.
- قبل معطف أطباق ثقافة الخلية ل كارديوميوسيتس قبل يوم واحد من العزلة عن طريق إضافة 1 مل من وسط الطلاء قبل تحتوي على لامينين لكل 35 ملم طبق ثقافة الخلية. احتضان لهم في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3. إعداد الخرز المغناطيسي
- وضع 0.5 مل من العازلة عزل الخلايا البطانية في أنبوب عينة 1.5 مل على الجليد.
- إضافة 5 ميكرولتر (2 × 10 6 ) من الماوس عموم مفتش الخرز المغناطيسي وتخلط جيدا.
- وضع أنبوب في رف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. سوف الخرز تلتزم جدار الأنبوب نحو المغناطيس. إزالة بعناية طاف مع ماصة 1 مل.
- كرر الغسيل مرتين أكثر وأخيرا إعادة تعليق الخرز في 50 ميكرولتر العازلة الخلايا البطانية العزلة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
4. إعداد لانجندورفف نظام نضح
- تنظيف رانه لانجندورفف النظام عن طريق نضح مع 2 لتر من الماء المقطر.
- تعميم 50 مل من باول المتوسطة من خلال النظام لمدة 5 دقائق وتجاهل المتوسطة.
- إضافة 80 مل الطازجة باول المتوسطة. يروي باستمرار مع "كربوجين" عن طريق فقاعات مع ماصة باستور الزجاج من اسطوانة الغاز. السماح إعادة تدوير المتوسطة من خلال النظام. النظام هو الآن على استعداد لإرواء القلب ( الشكل 1A ).
5. تشريح الجرذ
- وضع الفئران في مجفف 5 لتر تحت غطاء الدخان وإضافة 1.5 مل من 4-5٪ إيسوفلوران من خلال تنفيس الهواء، وإغلاق الغطاء.
ملاحظة: وضع الحيوان على لوحة مثقبة مرتفعة داخل المجففة لتجنب الاتصال المباشر من الحيوان مع إيسوفلوران السائل. - انتظر حتى يفقد الفئران رد فعل غطاء لها (عادة ~ 5 دقائق)، ثم تأخذ الفئران من المجفف. الموت ببطء الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
- قطع الجلد في البطن والعضلات الكامنة الأفقألي، إلى داخل، ال التعريف، خصر، الاستعمال، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، إزدوج، بسبب، حاد، سسيسورس. بعد ذلك، وقطع العضلات عموديا إلى عظمة الفئران وفتح الصدر. إزالة القلب جنبا إلى جنب مع الرئتين ووضع على الفور الأجهزة في الجليد الباردة 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم.
- إزالة الرئتين مع مساعدة من زوج من مقص وتجاهل لهم. تنظيف قلب أي النسيج الضام، وقطع الشريان الأورطي كاودالي في فرع الجذع العضدي الرأسي.
6. إرواء القلب والهضم مع كولاجيناز
- جبل القلب عبر الشريان الأورطي في نظام نضح لانجندورفف (القسم 4) باستخدام اثنين من أزواج من ملقط رقيقة، منحنية. من أجل ضمان بيرفوسد عضلة القلب في الوراء، وضع نهاية قنية من نظام نضح بين الفرع الأبهر الأول والصمام الأبهري. إصلاح الشريان الأورطي باستخدام المشبك التمساح.
- إصلاح القلب مع خياطة الجراحية، وإزالة المشبك التمساح ( الشكل 1B ).
- فتح صمام قنية للسماح المتوسطة نضح (35 مل) لتمرير من خلال القلب قطرة الحكمة (60 قطرات / دقيقة، 5 مل / دقيقة) لغسل أي الدم المتبقية. تجاهل أي تدفق من خلال في هذه المرحلة.
ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات الهواء في أي مرحلة من نضح لأن هذا سوف يؤدي إلى الهضم غير الكامل وفشل الإجراء العزلة الخلية. - وضع القلب معلقة في قمع جمع (غرفة القلب؛ الشكل 1B ) والبدء في مضخة تمعجية، والتي سيتم إعادة تدوير المتوسطة نضح من قمع جمع إلى الخزان ( الشكل 1A ).
- إضافة حل كولاجيناز (من الخطوة 2.8) إلى المتوسطة نضح. يروي القلب مع إعادة تدوير حل كولاجيناز لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة جدا لتحسين العائد الخلية. الوقت نضح يعتمد على نشاط كولاجيناز، والتي قد تختلف اعتمادا على الدفعة. اختبار 3-4 دفعات من كولاجيناز للعثور على واحد مع أوبتيالنشاط المال. ثم كميات كبيرة من الدفعة الأنسب مناسبة يمكن شراؤها التي تكفي لمدة سنة واحدة على الأقل للنتائج استنساخه. - في نهاية وقت الهضم، ووقف نضح، وإزالة القلب من نظام لانجندورفف باستخدام زوج من مقص، ووضعه في طبق بيتري الزجاج.
- قطع وتجاهل كل من الأذينين، وإزالة أي أنسجة دهنية بقايا. تقشر بعناية التامور مع مساعدة من اثنين من أزواج من ملقط لتجنب تلوث الخلايا الظهارية.
ملاحظة: التامور يمكن زيادة هضمها مع كولاجيناز للحصول على خلايا ظهارية القلب النقي إذا لزم الأمر. لم يتم إعطاء بروتوكول مفصل في هذه الدراسة لأن هذا هو خارج نطاق هذا البروتوكول. - قطع القلب أسفل وسط مع زوج من مقص ووضعه في المروحية الأنسجة. المفروم القلب 2-3 مرات وإعادة تعليق الأنسجة المفروم في 12 مل من العازلة الهضم من نضح لانجندورفف.
ملاحظة: لا تقطع hإيرت بشكل مفرط، وهذا سوف يؤدي إلى نسبة أعلى من كارديوميوسيتس ميت. - نقل الأنسجة المفروم إلى 15 مل من كولاجيناز التي تحتوي على تفكك المتوسطة والسماح لها هضم في حمام مائي لمدة 5-10 دقيقة مع خلط بين الحين والآخر عن طريق إعادة تعليق باستخدام ماصة بلاستيكية 5 مل المتاح.
- في نهاية فترة الهضم، وتصفية تعليق الخلية من خلال غربال 100 ميكرون. تجاهل الحطام الأنسجة والمواد غير مهضوم.
- في نهاية نضح لانجندورفف، مسح نظام نضح فورا مع الحد الأدنى من 1 لتر من الماء المقطر. إرضاء النظام عن طريق إعادة تدوير 100 مل من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم لمدة 30 دقيقة، وأخيرا مسح النظام مع 2-3 لتر من الماء المقطر. تجفيف النظام عن طريق تدفق الهواء وتغطي الافتتاح مع الفقرة الفيلم.
7. الجرذ خلايا القلب العزلة
- عزل وثقافة الخلايا العضلية
- أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 25 x ج لمدة 1 دقيقة (بدون برأكيس) لتكوير العضلية. قد يسمح أيضا كارديوميوسيتس لتسوية لمدة 10 دقيقة في رت دون الطرد المركزي.
- إزالة بعناية طاف تحتوي على الخلايا البطانية والألياف الليفية مع مساعدة من ماصة البلاستيك المتاح في أنبوب 50 مل جديد.
- ريسوسبيند بيليه كارديوميوسيت في كا 2 + 6 مل حل 1 (الخطوة 2.9). السماح 1 دقيقة للخلايا لضبط منخفض كا 2+ بيئة التركيز، وأجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى في 25 x ج لمدة 1 دقيقة (بدون فرامل).
- تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 6 مل كا 2 + الحل 2 (الخطوة 2.9). السماح للخلايا 1 دقيقة للتكيف مع تركيز وسيطة من الكالسيوم 2+ ، وأخيرا إضافة 12 مل من الكالسيوم 2 + الحل 3 (الخطوة 2.9) إلى الخلايا. مزيج مع مساعدة من ماصة بلاستيكية المتاح.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 25 x ج لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل طاف و ريسوسبيند الخلايا في 20 مل قبلووارمد كت المتوسطة. إضافة 1 مل من تعليق خلية إلى كل من 20 العقيمة 35 ملم طبق ثقافة الخلية قبل المغلفة مع لامينين (الخطوة 2.9) والسماح للخلايا لربط لمدة 2 ساعة في كو 2 خالية من حاضنة ثقافة الخلية.
ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون مثقف كارديوميوسيتس تحت بيئة كو 2 ؛ ومع ذلك، في هذه الحالة يجب استخدام وسائل الإعلام مع نظام العازلة بيكربونات. - بعد 2 ساعة، استبدل الوسط ب 2 مل من الوسط كت المشحونة لإزالة أي خلايا ميتة.
ملاحظة: الخلايا جاهزة لأي التجارب المخطط لها ويمكن استزراعها لمدة تصل إلى 3 أيام في حاضنة ثقافة الخلايا نموذجية (كو 2 مجانا) دون خسارة كبيرة من الخلايا الحية. وتظهر نموذجية صحية على شكل قضيب كارديوميوسيتس في الشكل 2A .
- عزل الخلايا البطانية والألياف الليفية
- الطرد المركزي طاف تحتوي على الخلايا البطانية والألياف الليفية (من الخطوة 7.1.2) في 250 x ج لمدة 10 دقيقة.
- تجاهل سوبرناتانت و ريسوسبيند بيليه الخلية في 1.5 مل من الخلايا البطانية عازلة العزلة في أنبوب عينة 2 مل.
- إضافة 3 ميكروغرام (1: 500) من الأجسام المضادة الماوس المضادة للفئران CD31 إلى تعليق الخلية واحتضان ذلك في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع نهاية إلى نهاية التناوب.
ملاحظة: ينصح المعايرة من الأجسام المضادة للتخفيف الأمثل. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة في 4 درجات مئوية كما في رت الاستيعاب السريع للجسم المضاد من الخلايا البطانية سوف يؤدي إلى انخفاض العائد. - إضافة أعدت سابقا (القسم 3) عموم المضادة للماوس مفتش الخرز إلى تعليق الخلية واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مع دوران نهاية إلى نهاية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن يكون الماوس المضادة للفئران CD31 الأجسام المضادة قبل تعلق على الخرز المغناطيسي ثم تضاف إلى تعليق الخلية. ومع ذلك، فإن هذا يزيد من وقت حضانة الخرز مع تعليق الخلية، ويمكن أن يؤدي إلى زيادة غير محددة ملزمة من الخلايا غير البطانية، وبالتالي ارتفاع التلوث من أنواع الخلايا الأخرى. - ار نهاية فترة حضانة الأجسام المضادة، ووضع أنبوب يحتوي على تعليق الخلية في رف المغناطيسي والسماح 2 دقيقة لتسوية الخرز المغناطيسي تعلق على الخلايا البطانية إلى جانب الأنبوب.
- إزالة بعناية بقية تعليق الخلية (التي تحتوي أساسا على الخلايا الليفية) باستخدام ماصة 1 مل وإضافته إلى 10 سم طبق ثقافة الخلية التي تحتوي على 10 مل من الخلايا الليفية خلية ثقافة المتوسطة (الخطوة 2.3). وضعه في حاضنة ثقافة الخلية نموذجية تحتوي على 5٪ كو 2 . يستمر الإجراء في الخطوة 7.3.
- إضافة 1 مل من غسل العازلة إلى أنبوب مع الخرز المغناطيسي التي تحتوي على الخلايا البطانية.
- كاب الأنبوب، وإزالته من الرف المغناطيسي، و ريسوسبيند بعناية الخرز عن طريق هز بلطف صعودا وهبوطا 4 - 5 مرات. وضع أنبوب مرة أخرى في الرف المغناطيسي، والسماح للخرز لتسوية على جدار الأنبوب لمدة 1 دقيقة، وإزالة بعناية العازلة غسل.
- كرر خطوات الغسيل 5-7 مرات للتخلص من أي تلوث نعلى الخلايا البطانية.
- ريسوسبيند الخلايا البطانية تعلق على الخرز في 1 مل من MV2 الخلايا البطانية المتوسطة زراعة الخلايا، إضافة إلى بئر واحدة من لوحة 12 جيدا، واحتضان في كو 2 حاضنة ثقافة الخلية.
- السماح للخلايا لربط بين عشية وضحاها وتغيير المتوسطة في اليوم التالي وبعد ذلك كل 2-3 أيام حتى تصبح الخلايا شبه متلاصقة (عادة 5 - 7 أيام).
ملاحظة: وتظهر نموذجية الخلايا غير البطانية غير متموجة بعد 3-4 أيام والخلايا البطانية متموجة بعد 7-10 أيام من العزلة في أرقام 3A و 3 B، على التوالي. ويمكن بعد ذلك تريبسينيزد الخلايا (القسم 7.4) ومصنفة في T25 قارورة ثقافة الخلية.
- غسل وثقافة الخلايا الليفية (تابع من الخطوة 7.2.6)
- بعد 1 ساعة من الحضانة، نضح المتوسطة وغسل الخلايا الليفية تعلق على طبق ثقافة الخلية عن طريق إضافة حجم مناسب من برنامج تلفزيوني قبل تحسنت. نضح برنامج تلفزيوني وتكرار قتيب 2-3 مرات وأخيرا إضافة ما قبل تحسنت الخلايا الليفية الطازجة خلية ثقافة المتوسطة.
- غسل الخلايا المرفقة مرة أخرى في اليوم التالي مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت (كما هو الحال في الخطوة السابقة) وإضافة المتوسطة الطازجة تحسنت قبل. تغيير المتوسطة بعد كل 2-3 أيام. ويرد النمط الظاهري نموذجية من الخلايا الليفية في يوم 2 من العزلة في الشكل 4A .
ملاحظة: الخلايا الليفية تصبح شبه متلاحمة عادة في غضون 5-7 أيام، وبعد ذلك على استعداد ليكون التربسينيزد (القسم 7.4) وتستخدم للتجارب المخطط لها. مع هذا الإجراء، ونحن عادة الحصول على 95-99٪ الخلايا الليفية نقية. ويرد النمط الظاهري نموذجية من الخلايا الليفية في يوم 7 من العزلة في الشكل 4B .
- تريبسينيزاتيون من الخلايا البطانية والألياف الليفية
- نضح المتوسطة من طبق ثقافة الخلية وإضافة ما يكفي من تحسنت قبل برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا.
- نضح بس وإضافة ما يكفي من التربسين-إدتا الحل (0.05٪ و 0.02٪ على التوالي) لتغطية الخلايا ومكان فيه 37 درجة مئوية حاضنة لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند الخلايا عن طريق بيبتينغ الخلايا صعودا وهبوطا مع مساعدة من ماصة 1 مل والتوقف عن عمل التربسين عن طريق إضافة 10٪ فس.
- بيليه تعليق الخلية بواسطة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في رت.
- ريسوسبيند الخلايا في حجم مناسب من ما قبل تحسنت وسط ثقافة الخلية.
8. الخلايا البطانية توصيف
ملاحظة: يتم تحديد نقاء الخلايا البطانية بواسطة امتصاص ديل- أس-لدل والمناعية من عامل فون ويلبراند (فوف). وتصور الخلايا التي كتبها مضان أو متحد البؤر المجهري ( أرقام 3C-3E ).
- امتصاص ديل- أس-لدل من الخلايا البطانية
- تريبسينيز الخلايا البطانية (الخطوة 7.4) والثقافة لهم بين عشية وضحاها على كوفرسليبس الزجاج في لوحة 12 جيدا (حوالي 10 × 10 4 خلايا / سم 2 ).
- نضح المتوسطة وشطف الخلايا مع 1 مل من قبل ثالمسلحة هبس.
- نضح هبس وإضافة 1 مل مستنبت الخلايا البطانية المتوسطة تحتوي على 10 ميكروغرام / مل ديل- أس-لدل وترك الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- نضح المتوسطة وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت ثلاث مرات وإصلاحها مع 1 مل من بارافورمالدهيد 4٪ (بفا، الذائبة في برنامج تلفزيوني). احتضان لهم بفا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: بفا هو تآكل. دائما استخدام قفازات مقاومة للحامض أثناء التعامل مع حل بفا. - نضح بفا، وشطف الخلايا على ساترة في لوحة 12 جيدا مع 1 مل برنامج تلفزيوني ثلاث مرات واحتضان لهم مع حل تلطيخ النووي تو-برو (10 ميكرومتر) لمدة 1 ساعة في رت.
ملاحظة: إذا كان المرشح المناسب متاح للمجهر، 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي؛ 1 ميكروغرام / مل) ويمكن أيضا أن تستخدم. في هذه الحالة يجب تقليل الوقت الحضانة إلى 10 دقيقة. - شطف الخلايا على ساترة في 12 لوحة جيدا مع برنامج تلفزيوني 1 مل، نضح في برنامج تلفزيوني، وكرر الخطوة ثلاث مرات.
- خذ جالزائد من 12 لوحة جيدا وجبل على شريحة زجاجية مع قطرة من وسط تصاعد. الخلايا جاهزة لتكون تصور تحت المجهر الفلورسنت / متحد البؤر. استخدام فلتر الإثارة من 530-560 نانومتر ل ديل- أس-لدل، 640 نانومتر ل تو-برو، و 340-380 نانومتر ل دابي.
- فون ويلبراند (فوف) تلطيخ
- ثقافة الخلايا البطانية كما هو موضح في الخطوة 8.1.1.
- نضح المتوسطة وشطف الخلايا مع 1 مل من هبس قبل تحسنت. بعد ذلك، إصلاح مع بفا 4٪ كما هو موضح في الخطوة 8.1.4.
- نضح بفا، وشطف الخلايا على ساترة في لوحة 12 جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مرتين، و بيرمابيليز الخلايا مع 1 مل من 0.1٪ تريتون X-100 (في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة في رت.
- نضح حل بيرمابيليزينغ واحتضان الخلايا مع حل عرقلة (5٪ بسا / 5٪ فس في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة.
- احتضان الخلايا مع الأرنب المضادة للفوف الأجسام المضادة (1: 100) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في غرفة ترطيب. إضافة ساترة واحدة دون ثه الأجسام المضادة الأولية كسيطرة سلبية.
- شطف الخلايا على ساترة في 12 لوحة جيدا مع 1 مل برنامج تلفزيوني ثلاث مرات واحتضان الخلايا مع حمار المضادة للأرنب اليكسا فلور-488 الأجسام المضادة (1: 500) وحل تلطيخ النووي تو-برو (10 ميكرومتر) لمدة 1 ساعة في رت.
- شطف الخلايا على ساترة في لوحة 12 جيدا مع 1 مل بس، نضح في برنامج تلفزيوني، وكرر الخطوة ثلاث مرات.
- اتخاذ ساترة من لوحة 12 جيدا وجبله على شريحة زجاجية مع قطرة من وسط تصاعد. الخلايا جاهزة لتكون تصور تحت المجهر الفلورسنت / متحد البؤر. استخدام فلتر الإثارة من 490 نانومتر ل فوف و 640 نانومتر لتلوين النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يؤدي إجراء العزلة إلى العائد من 70 - 80٪ قابلة للحياة، على شكل قضيب، كارديوميوسيتس المخططة ( أرقام 2A و 2 C ) التي يمكن استخدامها للتجارب المخطط لها. في كارديوميوسيتس مختبرنا تستخدم بشكل روتيني لتحليل كا 2 + الإشارات. الشكل 5A يظهر الكالسيوم داخل الخلايا [كا 2 + ] ط التذبذبات ردا على نقص التروية / ضخه في خلايا عضلية محملة فورا-آم (5 ميكرومتر). ويبين الشكل 5B التغيرات في [كا 2 + ] ط في الخلايا البطانية والخلايا الليفية بعد إضافة أتب (100 ميكرومتر). تم تحليل التغيرات في [كا 2 + ] ط في أنواع مختلفة من خلايا القلب كما هو موضح سابقا. 6 ، 11 ، 12
ري 1 "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
الشكل 1: تعديل لانجندورفف نظام نضح. ( A ) كامل نظام نضح لانجندورفف تستخدم لعزل خلايا القلب ( B ) عرض موسع من القلب معلقة في "غرفة القلب" تستخدم أيضا لجمع العازلة نضح لإعادة تدوير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: كارديوميوسيتس الجرذ الكبار. ( A ) نموذجية على شكل قضيب، كارديوميوسيتس صحية 2 ساعة بعد الطلاء في أطباق ثقافة الخلايا المغلفة لامينين ( B ) مثال نموذجي من سوء الإعداد بسبب عدم اكتمال هضم الأنسجة. 2 ساعة بعد الطلاء في لامينين المغلفة أطباق ثقافة الخلية، موست من الخلايا هيبيركونتراكتيد وننظر مستدير، وهناك عدد قليل من كارديوميوسيتس على شكل قضيب. شريط مقياس = 10 ميكرون ( C ) ميكروغراف متحد البؤر من كارديوميوسيت واحدة ملطخة لتصور أكتين كما هو موضح سابقا. 13 شريط مقياس = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الجرذ خلايا بطانة القلب. ( A ) المرحلة النقيض ميكروغراف من غير متموجة الخلايا أحادية الطبقة البطانية 3 أيام بعد العزلة. البقع الداكنة هي الخرز المغناطيسي التي لا تزال تعلق على الخلايا البطانية الأم. شريط مقياس = 10 ميكرون ( B ) مرحلة ميكروغراف النقيض من طبقة مونولاير الخلايا البطانية متموجة 7 أيام بعد العزلة ( C) إمونوستينينغ من الخلايا البطانية تظهر ديل- أس-لدل امتصاص (الأحمر) وتلطيخ النووية (الأزرق) ( D ) المناعية من الخلايا البطانية تظهر تلطيخ من فوف (الأحمر) وتلطيخ النووية (الأزرق) ( E ) الخلايا المحتضنة فقط مع الأجسام المضادة الثانوية وصمة عار النووية (الأزرق) (مقياس شريط = 50 ميكرون) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الفئران الليفية القلبي. ( A ) نموذجي المغزل على شكل الخلايا الليفية القلب في اليوم الثاني من العزلة. ( B ) متموجة، الخلايا الليفية نقية بعد 7 أيام من الثقافة. ( C ) مثال نموذجي لإعداد ضعيف ملوثة بالخلايا الظهارية. الخلايا المشار إليها بواسطة رؤوس السهام هي الخلايا الظهارية القلبية . شريط مقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التغيرات في [كا 2 + ] ط في خلايا القلب. ( A ) اقتفاء أثر ممثل للتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا [كا 2 + ] ط يقاس بنسبة فورا-2 في العضلية الفئران الفئران المعرضة لنقص التروية الكيميائية (نا سيانات، 2 ملم) تليها ضخه ( ب ) اقتفاء أثر ممثل للتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا [كا 2 + ] أنا تقاس بنسبة فورا-2 في الخلايا البطانية القلب الفئران والألياف الليفية، تعامل مع أتب (100 ميكرومتر) كما هو مبين. > الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، يتم وصف بروتوكول استنساخ لعزل وثقافة ميوسيتس القلب، الخلايا البطانية، والألياف الليفية. يصف هذا البروتوكول العزلة في وقت واحد وعالية الجودة من أنواع الخلايا الرئيسية من الأنسجة القلبية، أي خلايا عضلية، الخلايا البطانية، والخلايا الليفية في مقابل نوع خلية واحدة فقط. وهناك خطوة حاسمة في إجراء العزل هو الهضم السليم للنسيج القلب. إذا كان الهضم غير مكتمل، قد لا يزال الحصول على عدد كبير من ميوسيتس ولكن نوعية جودتها سيئة جدا، وهي في الغالب هيبيركونتراكتيد وجولة ( الشكل 2B ) وليس لها قيمة في التجارب. وعلاوة على ذلك، سيتم تخفيض العائد من الخلايا البطانية والألياف الليفية. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق التحكم في وقت الهضم. قبل إزالة القلب من نظام نضح، ليونة من القلب يمكن التحقق مع مساعدة من ملقط وأطراف الأصابع. إذا كان النسيج لا يزال غير ملحوظ sأوفت، قد بيرفوسد القلب لمدة إضافية 5-10 دقيقة. الخطوة الحرجة الثانية في العزلة كارديوميوسيت صحية هي استعادة تدريجية من كا 2 + في مخازن العزل. سوف استعادة سريعة من تركيزات عالية من كا 2 + في وسائل الإعلام يؤدي إلى كارديوميوسيتس مدورة. نوعية المياه المستخدمة لإعداد المخازن المؤقتة هو عامل مهم آخر يؤثر على نوعية العضلية. لذلك، يوصى باستخدام المياه ذات النوعية الجيدة.
نقاء الخلايا البطانية تعتمد اعتمادا كبيرا على خطوات الغسيل. يجب أن يكون إدتا موجودة في العازلة الغسيل لمنع ملزمة غير محددة من الخلايا غير البطانية إلى الخرز المغناطيسي. وجود خلايا الدم في تعليق الخلية سوف يقلل كثيرا من العائد من الخلايا البطانية. وبالتالي، والغسل السليم للقلب أمر بالغ الأهمية بعد تصاعد القلب في نظام نضح وقبل إضافة كولاجيناز. مكونات الدم المتبقية سوف يقلل أيضا رانه نشاط كولاجيناز وبالتالي تعيق هضم القلب.
التلوث الأكثر شيوعا في الخلايا الخلايا الليفية هو ظهور المستعمرات الأقمار الصناعية من الخلايا الظهارية ( الشكل 4C ). هذا التلوث يمكن تجنبها من خلال خطوتين زراعة الخلايا الليفية. في الخطوة الأولى، يتم تقليل تركيز فس في الخلية ثقافة الخلايا الليفية إلى 5٪ ويسمح تعليق الخلية على الانضمام إلى طبق ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة في الحاضنة. الخلايا الظهارية تلتزم بسرعة ولكن يتم زيادة الخلايا الليفية وقت التصاق الخلية في وجود تركيز منخفض من المصل. بعد 30 دقيقة من الحضانة، تتم إزالة تعليق الخلية التي تحتوي على الخلايا الليفية غير ملتصقة بعناية إلى طبق ثقافة الخلية الجديدة. وبهذه الطريقة يمكن تخفيض العائد من الخلايا الليفية ولكن نقاءها تتعزز بشكل كبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين ليس لديهم ما يعلن.
Acknowledgments
الدعم الفني من L. رينالدي، S. شافير، D. ريتز، H. توماس و A. ويبر هو مع الامتنان بشكر. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور إ. مارتينسون على قراءته المكثفة للطباعة والتحرير اللغوي للمخطوطة. وأيد الدراسة من قبل جامعة جيسن أنسكوبسفينانزيرونغ منحة ل M. أسلم و D. غوندوز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
