Summary
Plusieurs protocoles ont été développés et décrits pour l'isolement de différents types de cellules cardiaques d'un cœur de rat. Ici, un protocole optimisé est décrit qui permet d'isoler des types de cellules cardiaques majeurs de haute qualité (cardiomyocytes, cellules endothéliales et fibroblastes) à partir d'une seule préparation, réduisant ainsi les coûts expérimentaux.
Abstract
Le rat est un modèle animal important utilisé dans la recherche cardiovasculaire, et les cellules cardiaques de rat sont utilisées habituellement pour une analyse in vitro des mécanismes moléculaires de la progression de la maladie cardiovasculaire telles que l'hypertrophie cardiaque, la fibrose et l'athérosclérose. Bien que plusieurs tentatives de succès variable aient été faites pour développer des lignées cellulaires immortalisées du système cardiovasculaire pour comprendre ces mécanismes cellulaires, les cellules primaires offrent un environnement plus naturel et plus proche de l'in vivo pour de telles études. Par conséquent, différents laboratoires travaillant sur un type de cellule particulier ont développé des protocoles pour isoler les types individuels de cellules cardiaques de rat d'intérêt. Cependant, il manque un protocole qui permet l'isolement de plus d'un type de cellule. On décrit ici un protocole optimisé qui permet l'isolement de types de cellules cardiaques majeurs de haute qualité (cardiomyocytes, cellules endothéliales et fibroblastes) à partir d'une seule préparation et permet d'isolerR pour les analyses cellulaires. Cela permet l'utilisation la plus efficace des ressources disponibles, ce qui peut gagner du temps et réduire les coûts de recherche.
Introduction
Les modèles de rongeurs ont longtemps été utilisés comme outils pour élargir notre compréhension de la physiologie cardiovasculaire dans la santé et la maladie. 1 Bien que ces modèles animaux nous permettent de comprendre la pathophysiologie d'une maladie au niveau des organes et d'analyser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de divers agents pharmacologiques utilisés pour traiter les maladies cardiovasculaires, la compréhension des mécanismes moléculaires du développement de la maladie cardiovasculaire et la contribution d'un particulier Type de cellule nécessite l' utilisation de modèles de culture cellulaire in vitro . A cet effet, différentes lignées cellulaires immortalisées du système cardiovasculaire ont été développées; 2 , 3 cependant, les cellules primaires fraîchement isolées sont physiologiquement et fonctionnellement plus pertinentes pour les tissus et organismes vivants.
Le cœur est un organe polyvalent contenant tous les principaux types de cellules cardiovasculairesYstem, et le cœur du rat est encore un modèle couramment utilisé pour la compréhension de la physiologie cardiovasculaire. Au cours des dernières décennies, différentes méthodes d'isolement des types de cellules individuelles à partir du tissu cardiaque ont été décrites; 4 , 5 , 6 , 7 cependant, ces méthodes se concentrent uniquement sur l'isolement d'un type de cellule spécifique, ce qui entraîne la perte d'autres types de cellules qui ne peuvent plus être utilisées pour l'analyse cellulaire. Ici, un protocole optimisé est décrit qui permet l'isolation simultanée et de haute qualité des principaux types cellulaires de tissu cardiaque, c'est-à-dire les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Tous ces types de cellules peuvent être utilisés dans différentes configurations expérimentales 8 , 9 , 10 et pour l'analyse des interactions cellule-cellule du même animal.
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Protocol
L'enquête est conforme au Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health des États-Unis (Publication NIH n ° 85-23 1985) et a été approuvé par le comité local d'éthique de l'Université de Giessen. Des rats Wistar mâles adultes pesant 200 à 250 g ont été utilisés dans cette étude.
1. Autoclavage
- Au moins un jour avant le début de la procédure, autoclavez tous les instruments chirurgicaux, pipettes et pipettes Pasteur à utiliser dans la procédure d'isolement à 121 ° C pendant 30 minutes.
2. Préparation des médias et des solutions
REMARQUE: les solutions des étapes 2.1-2.4 peuvent être préparées jusqu'à une semaine avant l'isolement et stockées à 4 ° C, mais préparez les solutions aux étapes 2.5-2.8 le jour de l'isolement. Les recettes complètes des tampons et des médias sont données dans le tableau 1 . Réchauffez tous les médias et solutions à 37 ° C dans unBain d'eau avant de commencer la préparation.
- Préparer le milieu Powell en dissolvant les produits chimiques énumérés dans le tableau 1 dans 4,5 L d'H 2 O à température ambiante (RT). Ajustez le pH à 7,4 avec NaOH 2,0 N et amenez le volume à 5,0 L. Filsez la solution en stérile et rangez-la à 4 ° C.
- Préparer le milieu de la créatine, de la L-carnitine et de la taurine (CCT) en dissolvant le milieu en poudre M199 dans 4,5 L de H 2 O. Ajouter la poudre HEPES selon la Table au milieu et mélanger pendant 15 min. Ajouter la créatine, la carnitine, la taurine et Ara-C selon le tableau 1 . Mélangez bien, ajustez le pH avec un pH-mètre à 7,4 avec NaOH 2,0 N et amenez le volume à 5,0 L. Filtre stérile et rangez-le à 4 ° C.
- Préparer le milieu de culture cellulaire pour les fibroblastes en ajoutant 10% de sérum de veau fœtal (FCS) et 2% de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) à M199 moyen. Le DMEM convient également comme M199 et peut également être utilisé pour la culture de cellules de fibroblastes.
- Préparer la culture de cellules MV2E moyen pour les cellules endothéliales en ajoutant tous les contenus du mélange de supplément au milieu MV2 basal selon les instructions du fabricant. Prenez une partie aliquote de 5 ml et réchauffez-la à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Préparer un tampon d'isolement des cellules endothéliales en dissolvant 0,05 g d'albumine de sérum bovin (BSA) dans 50 ml de solution de sel équilibré Hanks (HBSS) et ajouter 0,5 ml d'une solution d'éthylène diaminetétracétique (EDTA) à 200 mM. Filtrer stériles et le ranger à 4 ° C.
- Préparer un tampon de lavage des cellules endothéliales en ajoutant 0,1 ml de 200 mM à 9,9 ml de PBS et le stocker à 4 ° C.
- Préparer une solution de collagénase en dissolvant 27 mg de collagénase dans 5 ml de milieu Powell et en ajoutant 12,5 μL de solution 100 mM de CaCl 2 . Réchauffez-le à 37 ° C dans un bain-marie.
- Préparer les solutions incrémentales de restauration de Ca 2+ 1, 2 et 3 pour les cardiomyocytes en ajoutant 12,5 μL, 25 μL et 120 μL de soluté CaCl 2 100 mMÀ 6 mL, 6 mL et 12 mL de milieu Powell, respectivement.
- Préchauffer les plaques de culture cellulaire pour les cardiomyocytes un jour avant l'isolement en ajoutant 1 mL de milieu de pré-revêtement contenant de la laminine à chaque plat de culture cellulaire de 35 mm. Incuber les dans l'incubateur de culture cellulaire à 37 ° C pendant une nuit.
3. Préparation des perles magnétiques
- Placez 0,5 ml du tampon d'isolement des cellules endothéliales dans un tube à échantillon de 1,5 ml sur de la glace.
- Ajouter 5 μL (2 x 10 6 ) de perles magnétiques IgG de souris et mélanger bien.
- Placez le tube dans le support magnétique pendant 1 min. Les perles adhéreront à la paroi du tube vers l'aimant. Retirez soigneusement le surnageant avec une pipette de 1 mL.
- Répéter le lavage deux fois plus et enfin remettre en suspension les perles dans 50 μL de tampon d'isolement des cellules endothéliales et stocker à 4 ° C jusqu'à l'utilisation.
4. Préparation du système de perfusion de Langendorff
- Clean tLe système de Langendorff par perfusion avec 2 L d'eau distillée.
- Circuler 50 ml de milieu Powell dans le système pendant 5 min et jeter le milieu.
- Ajouter 80 ml de milieu Powell frais. Perfusion continue avec du "carbogène" en bouillonnant avec une pipette Pasteur en verre de la bouteille de gaz. Laisser la recirculation moyenne à travers le système. Le système est maintenant prêt à perfuser le cœur ( Figure 1A ).
5. Dissection du rat
- Placez le rat dans un dessiccateur de 5 L sous une hotte et ajoutez 1,5 ml d'isoflurane à 4-5% dans l'évent et fermez le couvercle.
REMARQUE: Placez l'animal sur une plaque perforée élevée à l'intérieur du dessiccateur pour éviter le contact direct de l'animal avec l'isoflurane liquide. - Attendez que le rat perd son réflexe de couvercle (généralement ~ 5 min), puis retirez le rat du dessicateur. Éuthaniser le rat par dislocation cervicale.
- Couper la peau abdominale et le muscle musculaire sous-jacentAlly au milieu en utilisant une paire de ciseaux pointus. Ensuite, coupez le muscle verticalement au sternum du rat et ouvrez le thorax. Retirez le cœur avec les poumons et placez immédiatement les organes dans une solution glacée de NaCl à 0,9%.
- Retirer les poumons à l'aide d'une paire de ciseaux et les jeter. Nettoyez le cœur de tout tissu conjonctif et coupez l'aorte caudalement à la branche du tronc brachio-céphalique.
6. Perfusion du coeur et de la digestion avec la collagénase
- Montez le coeur via l'aorte dans le système de perfusion Langendorff (Section 4) en utilisant deux paires de pince fine et courbée. Afin de s'assurer que le myocarde soit perfusé de façon rétrograde, placer la fin de la canule du système de perfusion entre la première branche aortique et la valve aortique. Fixez l'aorte à l'aide d'une pince à crocodile.
- Fixez le coeur avec une suture chirurgicale et retirez la pince de crocodile ( Figure 1B ).
- Ouvrez la soupape de la canule pour permettre au milieu de perfusion (35 mL) de traverser le gouttes cardiaques (60 gouttes / min, 5 mL / min) pour éliminer tout sang résiduel. Jeter tout écoulement à ce stade.
REMARQUE: Évitez la formation de bulles d'air à n'importe quel stade de la perfusion car cela entraînera une digestion incomplète et une panne de la procédure d'isolement cellulaire. - Placez le coeur suspendu dans l'entonnoir collecteur (chambre du coeur, Figure 1B ) et démarrez la pompe péristaltique, qui recyclera le milieu de perfusion de l'entonnoir collecteur vers le réservoir ( Figure 1A ).
- Ajouter la solution de collagénase (de l'étape 2.8) au milieu de perfusion. Perfuser le cœur avec une solution de collagénase recyclable pendant 30 min.
REMARQUE: cette étape est très critique pour l'optimisation du rendement cellulaire. Le temps de perfusion dépend de l'activité de la collagénase, qui peut varier en fonction du lot. Testez 3-4 lots de collagénase pour trouver celui avec optiMauvaise activité; Ensuite, on peut acheter de grandes quantités du lot le mieux adapté, qui sont suffisantes pendant au moins un an pour des résultats reproductibles. - À la fin du temps de digestion, arrête la perfusion, enlève le cœur du système Langendorff à l'aide d'une paire de ciseaux et place-le dans une boîte en Pétri en verre.
- Couper et jeter les deux oreillettes et retirer les tissus gras restants. Éloignez soigneusement le péricarde à l'aide de deux paires de pince pour éviter la contamination des cellules épithéliales.
NOTE: Le péricarde peut être encore digéré avec de la collagénase pour obtenir des cellules épithéliales cardiaques pures si nécessaire. Un protocole détaillé n'est pas donné dans la présente étude, car cela dépasse la portée du présent protocole. - Couper le cœur au milieu avec une paire de ciseaux et le mettre dans l'hachoir de tissus. Piquez le cœur 2-3 fois et ré-suspendez le tissu émincé dans 12 ml du tampon de digestion de la perfusion de Langendorff.
REMARQUE: ne pas hacher le hEart excessivement, car cela entraînera une proportion plus élevée de cardiomyocytes morts. - Transférer le tissu émincé dans 15 mL de milieu de dissociation contenant de la collagénase et laisser digérer dans un bain d'eau pendant 5 à 10 minutes avec un mélange occasionel par ré-suspension en utilisant une pipette en plastique jetable de 5 ml.
- À la fin de la période de digestion, filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de 100 μm. Jeter les débris tissulaires et le matériau non digéré.
- À la fin de la perfusion de Langendorff, rincer immédiatement le système de perfusion avec un minimum de 1 L d'eau distillée. Perfuser le système en recyclant 100 ml de NaOH 0,1 N pendant 30 min, et finalement rincer le système avec 2-3 L d'eau distillée. Séchez le système en rinçant l'air et recouvrez l'ouverture avec du para-film.
7. Isolation cellulaire cardiaque de rat
- Isolation et culture des cardiomyocytes
- Centrifuger la suspension cellulaire à 25 xg pendant 1 min (sans brAkes) pour granuler les cardiomyocytes. Les cardiomyocytes peuvent également être déposés pendant 10 min à la RT sans centrifugation.
- Retirez soigneusement le surnageant contenant des cellules endothéliales et des fibroblastes à l'aide d'une pipette en plastique jetable dans un nouveau tube de 50 ml.
- Remettre en suspension la pastille de cardiomyocytes dans la solution 1 de Ca 2+ 6 mL (étape 2.9). Prévoyez 1 min pour que les cellules s'adaptent à l'environnement de concentration faible de Ca 2+ et centrifuger à nouveau la suspension cellulaire à 25 xg pendant 1 min (sans freins).
- Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot cellulaire dans 6 ml de solution de Ca 2+ 2 (étape 2.9). Laisser les cellules 1 min pour s'adapter à la concentration intermédiaire de Ca 2+ et enfin ajouter 12 ml de solution de Ca 2+ 3 (étape 2.9) aux cellules. Mélanger à l'aide d'une pipette en plastique jetable.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 25 xg pendant 1 min.
- Jeter le surnageant et ré-endiguer les cellules dans 20 mL pré-Warmed CCT medium. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans chacun des 20 boîtes de culture de cellules stériles de 35 mm pré-revêtues de laminine (étape 2.9) et permettre aux cellules de se fixer pendant 2 h dans un incubateur de culture cellulaire libre de CO 2 .
NOTE: Les cardiomyocytes peuvent également être cultivés dans un environnement de CO 2 ; Cependant, dans ce cas, les médias avec le système tampon de bicarbonate devraient être utilisés. - Après 2 h, remplacez le milieu par de nouveaux 2 mL de milieu CCT pour éliminer les cellules mortes.
REMARQUE: Les cellules sont prêtes pour toute expérience planifiée et peuvent être cultivées pendant 3 jours maximum dans un incubateur typique de culture cellulaire (sans CO 2 ) sans perte importante de cellules vivantes. Les cardiomyocytes typiques en forme de tige sont présentés à la figure 2A .
- Isolation des cellules endothéliales et des fibroblastes
- Centrifuger le surnageant contenant des cellules endothéliales et des fibroblastes (de la étape 7.1.2) à 250 xg pendant 10 min.
- Jeter le supeRenouvelez et resuspendez le culot cellulaire dans 1,5 ml de tampon d'isolement des cellules endothéliales dans un tube d'échantillon de 2 ml.
- Ajouter 3 μg (1: 500) d'anticorps anti-rat CD31 de souris à la suspension cellulaire et l'incuber à 4 ° C pendant 30 minutes avec une rotation de bout en bout.
REMARQUE: Un dosage de l'anticorps pour une dilution optimale est conseillé. Cette étape devrait être effectuée à 4 ° C car, à la RT, une internalisation rapide des anticorps par les cellules endothéliales entraînerait un faible rendement. - Ajouter les perles IgG anti-souris antiparasitaires précédemment préparées (Section 3) à la suspension cellulaire et incuber pendant 20 min à 4 ° C avec une rotation de bout en bout.
NOTE: En variante, l'anticorps anti-rat CD31 de souris peut être pré-attaché aux perles magnétiques, puis ajouté à la suspension cellulaire. Cependant, cela augmentera le temps d'incubation des perles avec la suspension cellulaire et peut entraîner une augmentation de la liaison non spécifique des cellules non endothéliales et donc une contamination plus élevée d'autres types de cellules. - UNET la fin du temps d'incubation des anticorps, placez le tube contenant la suspension cellulaire dans une crémaillère magnétique et laissez 2 min pour déposer les billes magnétiques attachées aux cellules endothéliales sur le côté du tube.
- Retirez soigneusement le reste de la suspension cellulaire (contenant principalement les fibroblastes) en utilisant une pipette de 1 mL et ajoutez-la dans un plat de culture cellulaire de 10 cm contenant 10 ml de milieu de culture cellulaire de fibroblastes (étape 2.3). Placez-le dans un incubateur typique de culture cellulaire contenant 5% de CO 2 . La procédure se poursuit à l'étape 7.3.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage au tube avec des billes magnétiques contenant les cellules endothéliales.
- Enlevez le tube, retirez-le de la grille magnétique et remettez soigneusement en suspension les bourrelets en agitant doucement vers le haut et vers le bas 4 à 5 fois. Placez le tube à nouveau dans la grille magnétique, laissez les billes se déposer sur la paroi du tube pendant 1 min, et retirez soigneusement le tampon de lavage.
- Répétez les étapes de lavage 5 à 7 fois pour éliminer toute contaminationCellules endothéliales.
- Remettre en suspension les cellules endothéliales attachées aux perles dans 1 mL de milieu de culture de cellules endothéliales MV2, ajouter à un puits unique d'une plaque à 12 puits et incuber dans un incubateur de culture de CO 2 .
- Permettre aux cellules de se fixer pendant la nuit et changer le milieu le lendemain, puis tous les 2-3 jours jusqu'à ce que les cellules deviennent semi-confluentes (habituellement 5 à 7 jours).
NOTE: Les cellules endothéliales non confluentes typiques après 3 à 4 jours et les cellules endothéliales confluentes après 7 à 10 jours d'isolement sont présentées respectivement sur les figures 3A et 3B . Les cellules peuvent ensuite être trypsinisées (section 7.4) et ensemencées dans un flacon de culture cellulaire T25.
- Lavage et culture des fibroblastes (continuer à partir de l'étape 7.2.6)
- Après 1 heure d'incubation, aspirer le milieu et laver les fibroblastes attachés au plat de culture cellulaire en ajoutant un volume approprié de PBS préchauffé. Aspirer le PBS et répéter le s2-3 fois et finalement ajouter un milieu de culture cellulaire de fibroblastes frais préchauffé.
- Laver les cellules attachées à nouveau le lendemain avec du PBS préchauffé (comme à l'étape précédente) et ajouter du milieu frais préchauffé. Changer le milieu après chaque 2-3 jours. Un phénotype typique des fibroblastes au jour 2 de l'isolement est montré à la figure 4A .
NOTE: Les fibroblastes deviennent semi-confluents habituellement dans les 5-7 jours et sont ensuite prêts à être trypsinisés (section 7.4) et utilisés pour des expériences planifiées. Avec cette procédure, nous obtenons généralement des fibroblastes purs de 95 à 99%. Un phénotype typique des fibroblastes au jour 7 de l'isolement est montré à la figure 4B .
- Trypsinization of endothelial cells and fibroblasts
- Aspirer le milieu du plat de culture cellulaire et ajouter suffisamment de PBS préchauffé pour recouvrir les cellules.
- Aspirez le PBS et ajoutez suffisamment de solution de trypsine-EDTA (0,05% et 0,02%, respectivement) pour couvrir les cellules et placer dansE 37 ° C incubateur pendant 5 min.
- Ressusciter les cellules en pipetant les cellules vers le haut et vers le bas à l'aide d'une pipette de 1 mL et arrêter l'action de la trypsine en ajoutant 10% de FCS.
- Pelleter la suspension cellulaire par centrifugation à 250 xg pendant 10 min à la température ambiante.
- Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de milieu de culture cellulaire préchauffé.
8. Caractérisation des cellules endothéliales
NOTE: La pureté des cellules endothéliales est déterminée par l'absorption de Dil-Ac-LDL et l'immunocoloration du facteur von Willebrand (vWF). Les cellules sont visualisées par fluorescence ou microscopie confocale ( figures 3C-3E ).
- L'absorption de Dil-Ac-LDL par les cellules endotheliales
- Trypsiniser les cellules endothéliales (étape 7.4) et les cultiver pendant la nuit sur des lamelles de verre dans une plaque de 12 puits (environ 10 x 10 4 cellules / cm 2 ).
- Aspirer le milieu et rincer les cellules avec 1 ml de pré-wHBSS armé.
- Aspirer le HBSS et ajouter 1 mL de milieu de culture de cellules endothéliales contenant 10 μg / mL de Dil-Ac-LDL et laisser les cellules dans l'incubateur à 37 ° C pendant 4 h.
- Aspirer le milieu et rincer les cellules avec du PBS préchauffé trois fois et les réparer avec 1 ml de paraformaldéhyde à 4% (PFA, dissous dans PBS). Incuber les PFA à 37 ° C pendant 20 min.
REMARQUE: le PFA est corrosif; Utilisez toujours des gants résistant aux acides pendant la manipulation de la solution PFA. - Aspirer le PFA, rincer les cellules sur lamelle dans une assiette à 12 puits avec 1 mL de PBS trois fois et les incuber avec une solution de coloration nucléaire TO-PRO (10 uM) pendant 1 h à la température ambiante.
REMARQUE: si le filtre approprié est disponible pour le microscope, on peut également utiliser 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1 μg / mL). Dans ce cas, le temps d'incubation devrait être réduit à 10 min. - Rincer les cellules sur lamelle dans une plaque de 12 puits avec 1 ml de PBS, aspirer le PBS et répéter l'étape trois fois.
- Prenez le cDépasser la plaque à 12 puits et la monter sur une glissière en verre avec une goutte de support. Les cellules sont prêtes à être visualisées sous un microscope fluorescent / confocal. Utilisez un filtre d'excitation de 530-560 nm pour Dil-Ac-LDL, 640 nm pour TO-PRO et 340-380 nm pour DAPI.
- Von Willebrand (vWF) colorant
- Culturez les cellules endothéliales comme décrit à l'étape 8.1.1.
- Aspirer le milieu et rincer les cellules avec 1 mL de HBSS préchauffé; Par la suite, réparer avec 4% de PFA comme décrit à l'étape 8.1.4.
- Aspirer le PFA, rincer les cellules sur lamelle dans une assiette à 12 puits avec 1 ml de PBS deux fois et perméabiliser les cellules avec 1 ml de Triton X-100 à 0,1% (en PBS) pendant 20 minutes à la température ambiante.
- Aspirer la solution de perméabilisation et incuber les cellules avec une solution de blocage (5% de BSA / 5% de FCS dans PBS) pendant 1 h.
- Incuber les cellules avec un anticorps anti-vWF de lapin (1: 100) à 4 ° C pendant une nuit dans une chambre humidifiée. Ajoutez un couvre-lit sansE anticorps primaire comme témoin négatif.
- Rincer les cellules sur le lamelleau dans une plaque à 12 puits avec 1 mL de PBS trois fois et incuber les cellules avec l'anticorps anti-lapin Alexa Fluor-488 anti-lapin (1: 500) et la solution de coloration nucléaire TO-PRO (10 μM) pendant 1 h À la RT.
- Rincer les cellules sur la lamelle dans une plaque de 12 puits avec 1 ml de PBS, aspirer le PBS et répéter l'étape trois fois.
- Retirez le couvercle de la plaque à 12 puits et montez-le sur une glissière en verre avec une goutte de support. Les cellules sont prêtes à être visualisées sous un microscope fluorescent / confocal. Utilisez un filtre d'excitation de 490 nm pour vWF et 640 nm pour la coloration nucléaire.
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Representative Results
La procédure d'isolement aboutit à un rendement de 70 à 80% de cardiomyocytes striés en forme de tige ( Figures 2A et 2C ) qui peuvent être utilisés pour des expériences planifiées. Dans notre laboratoire, les cardiomyocytes sont habituellement utilisés pour l'analyse de la signalisation Ca 2+ . La figure 5A montre les oscillations intracellulaires du calcium [Ca 2+ ] i en réponse à l'ischémie / reperfusion dans les cardiomyocytes chargés avec Fura-AM (5 μM). La figure 5B montre les changements dans [Ca 2+ ] i dans les cellules endothéliales et les fibroblastes après addition d'ATP (100 μM). Les changements dans [Ca 2+ ] i dans différents types de cellules cardiaques ont été analysés comme décrit précédemment. 6 , 11 , 12
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Figure 1: Système de perfusion Langendorff modifié. ( A ) L'ensemble du système de perfusion de Langendorff utilisé pour l'isolement des cellules cardiaques ( B ) Vue agrandie du coeur suspendu dans la "chambre du coeur" également utilisée pour la collecte du tampon de perfusion pour la recirculation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Cardiomyocytes à rat adulte. ( A ) Cardiomyocytes typiques en forme de tige et en forme de 2 h après le placage dans des plats de culture cellulaire revêtus de laminine ( B ) Un exemple typique d'une mauvaise préparation due à une digestion incomplète des tissus. 2 h après le placage dans des plaques de culture cellulaire revêtues de laminine, moLes cellules sont hypercontruites et semblent arrondies, et il existe peu de cardiomyocytes en forme de tige. Barre d'échelle = 10 μm ( C ) Micrographie confocale de cardiomyocytes uniques colorés pour la visualisation d'actine comme décrit précédemment. 13 Barre d'échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Cellules endothéliales cardiaques de rat. ( A ) Micrographie à contraste de phase de la monocouche de cellules endothéliales non confluentes 3 jours après l'isolement. Les taches sombres sont les perles magnétiques qui sont encore attachées aux cellules endothéliales parentales. Barre d'échelle = 10 μm ( B ) Micrographie à contraste de phase de la monocouche de cellules endothéliales confluentes 7 jours après l'isolement ( C) L'immunocoloration des cellules endothéliales montrant l'absorption de Dil-Ac-LDL (Rouge) et la coloration nucléaire (Bleu) ( D ) L'immunocoloration des cellules endothéliales montrant une coloration de la coloration vWF (Rouge) et nucléaire (Bleu) ( E ) Les cellules incubées uniquement avec un anticorps secondaire Et la tache nucléaire (Bleu) (Barre d'échelle = 50 μm) Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Fibroblastes cardiaques à base de rat. ( A ) Fibroblastes cardiaques typiques en forme de fuseau au deuxième jour d'isolement. ( B ) Fibroblastes Confluents, purs après 7 jours de culture. ( C ) Un exemple typique d'une mauvaise préparation contaminée par des cellules épithéliales. Les cellules indiquées par les pointes de flèches sont les cellules épithéliales cardiaques . Barre d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Changements dans [Ca 2+ ] i dans les cellules cardiaques. ( A ) Des tracés représentatifs des changements dans le calcium intracellulaire [Ca 2+ ] i mesurés par le rapport Fura-2 dans les cardiomyocytes de rat exposés à une ischémie chimique (Na-cyanate, 2 mM) suivie d'une reperfusion ( B ) Des tracés représentatifs des changements dans le calcium intracellulaire [Ca 2+ ] mesuré par le rapport de Fura-2 dans les cellules endothéliales cardiaques de rat et les fibroblastes, traités avec de l'ATP (100 uM) comme indiqué. > Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans cet article, un protocole reproductible pour l'isolement et la culture des myocytes cardiaques, des cellules endothéliales et des fibroblastes est décrit. Ce protocole décrit l'isolation simultanée et de haute qualité des principaux types cellulaires de tissu cardiaque, c'est-à-dire les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes par opposition à un seul type de cellule. Une étape critique dans la procédure d'isolement est la bonne digestion du tissu cardiaque. Si la digestion est incomplète, un grand nombre de myocytes peuvent encore être obtenus, mais leur qualité est très médiocre et ils sont principalement hypercontruits et ronds ( figure 2B ) et sans valeur expérimentale. En outre, le rendement des cellules endothéliales et des fibroblastes sera également réduit. Ce problème peut être résolu en contrôlant le temps de digestion. Avant de retirer le cœur du système de perfusion, la douceur du cœur peut être vérifiée avec l'aide de la pince et des doigts. Si le tissu n'est toujours pas visibleOft, le coeur peut être perfusé pendant 5 à 10 minutes supplémentaires. Une deuxième étape critique dans l'isolement sain de cardiomyocytes est la restauration incrémentale de Ca 2+ dans les tampons d'isolement. Une restauration rapide de concentrations élevées de Ca 2+ dans les milieux entraînera des cardiomyocytes arrondis. La qualité de l'eau utilisée pour la préparation des tampons est un autre facteur important qui affecte la qualité des cardiomyocytes. Par conséquent, l'utilisation d'eau de bonne qualité est recommandée.
La pureté des cellules endothéliales dépend fortement des étapes de lavage. L'EDTA doit être présent dans le tampon de lavage pour empêcher la liaison non spécifique de cellules non endothéliales aux perles magnétiques. La présence de cellules sanguines dans la suspension cellulaire réduira considérablement le rendement des cellules endotheliales; Par conséquent, le lavage correct du cœur est très critique après le montage du coeur dans le système de perfusion et avant l'ajout de collagénase. Les composants sanguins résiduels réduiront également tL'activité de la collagénase et donc entraver la digestion du cœur.
La contamination la plus fréquente dans la culture de fibroblastes est l'apparition de colonies satellites de cellules épithéliales ( figure 4C ). Cette contamination peut être évitée par la culture en deux étapes des fibroblastes. Dans la première étape, la concentration de FCS dans le milieu de culture cellulaire de fibroblastes est réduite à 5% et la suspension cellulaire est autorisée à adhérer au plat de culture cellulaire pendant 30 minutes dans l'incubateur. Les cellules épithéliales adhèrent rapidement, mais le temps d'adhésion des cellules de fibroblastes augmente en présence d'une faible concentration de sérum. Après 30 minutes d'incubation, la suspension cellulaire contenant des fibroblastes non adhérents est soigneusement enlevée dans un nouveau plat de culture cellulaire. De cette façon, le rendement des fibroblastes peut être réduit, mais leur pureté est considérablement améliorée.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Le soutien technique de L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas et A. Weber est reconnaissant. Les auteurs souhaitent également remercier le Dr E. Martinson pour la lecture approfondie et l'édition de la langue du manuscrit. L'étude a été soutenue par la subvention de l'Université de Giessen Anschubsfinanzierung à M. Aslam et D. Gündüz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
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- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
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- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
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- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
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