Summary
Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.
Abstract
De rat is een belangrijk diermodel dat wordt gebruikt bij cardiovasculair onderzoek, en rattencardiale cellen worden routinematig gebruikt voor in vitro analyse van de moleculaire mechanismen van hart- en vaatziektenprogressie, zoals cardiale hypertrofie, fibrose en atherosclerose. Hoewel verschillende pogingen met variabel succes zijn gemaakt om onsterfelijke cellijnen uit het cardiovasculaire systeem te ontwikkelen om deze cellulaire mechanismen te begrijpen, bieden primaire cellen een meer natuurlijke en dicht bij in-vivo omgeving voor dergelijke studies. Daarom hebben verschillende laboratoria die werken op een bepaald celtype protocollen ontwikkeld om afzonderlijke typen rattencellencellen van belang te isoleren. Een protocol dat de isolatie van meer dan één celtype mogelijk maakt, ontbreekt echter. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoogwaardige belangrijke cardiale celcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt en deR gebruiken voor cellulaire analyses. Dit maakt het meest efficiënt gebruik van beschikbare middelen mogelijk, wat tijd kan besparen en de onderzoekskosten verminderen.
Introduction
Knaagdierenmodellen zijn al lang gebruikt als gereedschap om ons begrip van cardiovasculaire fysiologie in gezondheid en ziekte te vergroten. 1 Hoewel deze diermodellen ons toelaten om de pathofysiologie van een ziekte op het orgaanniveau te begrijpen en de farmacokinetiek en farmacodynamica van verschillende farmacologische middelen die gebruikt worden om hart- en vaatziekten te behandelen, te analyseren, te begrijpen hoe de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van hart- en vaatziekten en de bijdrage van een bepaalde Celtype vereist het gebruik van in vitro celkweekmodellen. Daartoe zijn verschillende onsterfelijke cellijnen uit het cardiovasculaire systeem ontwikkeld; 2 , 3 echter zijn fris geïsoleerde primaire cellen fysiologisch en functioneel meer relevant voor levende weefsels en organismen.
Het hart is een veelzijdig orgaan dat alle belangrijke typen cellen van de hart- en vaatziekten bevatYstem, en het rat hart is nog steeds een veelgebruikte model voor het begrijpen van cardiovasculaire fysiologie. Gedurende de laatste decennia zijn verschillende methoden voor de isolatie van individuele celsoorten van hartweefsel beschreven; 4 , 5 , 6 , 7, maar deze methoden richten zich uitsluitend op de isolatie van één specifiek celtype, wat resulteert in het verlies van andere typen cellen die niet langer gebruikt kunnen worden voor cellulaire analyse. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de gelijktijdige en hoge kwaliteit isolatie van de belangrijkste celsoorten van hartweefsel, dwz cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten mogelijk maakt. Al deze celtypes kunnen gebruikt worden in verschillende experimentele opstellingen 8 , 9 , 10 en voor de analyse van cel-cel interacties van hetzelfde dier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoek is in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren, gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23 1985) en is goedgekeurd door de lokale ethische commissie van de Universiteit van Giessen. Volwassen mannelijke Wistar ratten van 200 tot 250 g werden in deze studie gebruikt.
1. Autoclaving
- Autoclaaf minstens een dag voordat de procedure moet worden uitgevoerd, alle chirurgische instrumenten, pipettips en Pasteurpipetten die gedurende 30 minuten bij de isolatieprocedure bij 121 ° C moeten worden gebruikt.
2. Voorbereiding van media en oplossingen
OPMERKING: Oplossingen van stappen 2.1-2.4 kunnen tot een week voor de isolatie worden opgesteld en opgeslagen bij 4 ° C, maar bereiden de oplossingen in stap 2.5-2.8 op de dag van isolatie. De volledige recepten van de buffers en media zijn in tabel 1 gegeven . Warm alle media en oplossingen op 37 ° C in eenWaterbad voordat u de voorbereiding begint.
- Bereid Powell medium door de in tabel 1 vermelde chemicaliën op te lossen in 4,5 liter H20 bij kamertemperatuur (RT). Pas de pH op op 7,4 met 2,0 N NaOH, en breng het volume naar 5,0 L. Steril filter de oplossing en berg deze bij 4 ° C.
- Bereid creatine, L-carnitine en taurine (CCT) medium door M199 poeder medium op te lossen in 4,5 L H20. Voeg HEPES poeder toe volgens tabel aan het medium en meng gedurende 15 minuten. Voeg creatine, carnitine, taurine en Ara-C toe volgens tabel 1 . Meng goed, stel de pH met pH meter op tot 7.4 met 2,0 N NaOH, en breng het volume naar 5,0 L. Steriele filter en sla bij 4 ° C op.
- Bereid celcultuurmedium voor fibroblasten door 10% foetaal kalfserum (FCS) en 2% penicilline / streptomycine (Pen / Strep) aan medium M199 toe te voegen. DMEM is even geschikt als M199 en kan ook gebruikt worden voor fibroblastcelcultuur.
- Bereid MV2 celcultuur voorE medium voor endotheelcellen door alle inhoud van de supplementmengsel toe te voegen aan het basale MV2-medium volgens de instructies van de fabrikant. Neem een 5 ml aliquot en verwarm het tot 37 ° C in een waterbad.
- Bereid de endotheliale celisolatiebuffer op door 0,05 g boviene serumalbumine (BSA) in 50 ml Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) op te lossen en 0,5 ml 200 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing daaraan toe te voegen. Steril filter dit en berg deze bij 4 ° C.
- Bereid endotheliale celwasbuffer door 0,1 ml van 200 mM aan 9,9 ml PBS toe te voegen en op te slaan bij 4 ° C.
- Bereid collagenaseoplossing door 27 mg collagenase in 5 ml Powell-medium op te lossen en 12,5 μl 100 mM CaCl2-oplossing daaraan toe te voegen. Verwarm het tot 37 ° C in een waterbad.
- Bereid incrementele Ca 2+ restauratieoplossingen 1, 2 en 3 voor cardiomyocyten door 12,5 μl, 25 μl en 120 μl 100 mM CaCl 2- oplosmiddel toe te voegenIon tot respectievelijk 6 ml, 6 ml en 12 ml Powell-medium.
- Pre-coat de celkweekschotels voor cardiomyocyten op een dag voor de isolatie door 1 ml pre-coating medium dat laminine bevat aan elke 35 mm celcultuurschotel toe te voegen. Incubeer ze in de celcultuur incubator bij 37 ° C overnacht.
3. Bereiding van magnetische kralen
- Plaats 0,5 ml van de endotheliale celisolatiebuffer in een 1,5 ml monsterbuis op ijs.
- Voeg 5 μL (2 x 10 6 ) van de IgG magnetische kralen van de pan-muis toe en meng goed.
- Plaats de buis in het magnetische rek voor 1 minuut. De kralen houden zich aan de wand van de buis vast aan de magneet. Haal de supernatant voorzichtig uit met een pipet van 1 ml.
- Herhaal de was nog twee keer en schakel de kralen eindelijk opnieuw in 50 μL endotheliale celisolatiebuffer en berg deze bij 4 ° C tot gebruik.
4. Bereiding van Langendorff Perfusion System
- Reinig tHij Langendorff systeem door perfusie met 2 liter gedestilleerd water.
- Circuleer 50 ml Powell medium door het systeem gedurende 5 minuten en wrijf het medium af.
- Voeg 80 ml fris Powell medium toe. Vervolg het voortdurend met "carbogen" door te bellen met een glazen Pasteur pipette uit de gascilinder. Laat het medium door het systeem recirculeren. Het systeem is nu klaar om het hart te perfectioneren ( Figuur 1A ).
5. Dissectie van de Rat
- Plaats de rat in een 5 liter droogmiddel onder een afzuigkap en voeg 1,5 ml 4-5% isofluraan door de luchtventilatie en sluit het deksel.
OPMERKING: Plaats het dier op een verhoogde geperforeerde plaat in de desiccator om direct contact met het dier te voorkomen met het vloeibare isofluraan. - Wacht tot de rat zijn dekselreflex (meestal ~ 5 min) verloor, en neem de rat uit de uitdrogingseenheid. Euthanize de rat door cervicale dislocatie.
- Snij de buikhuid en de onderliggende spieren horizontBondgenoot in het midden met een paar scherpe scharen. Daarna snij de spier verticaal naar de baarmoeder van de rat en open de thorax. Verwijder het hart samen met de longen en plaats de organen onmiddellijk in ijskoude 0,9% NaCl oplossing.
- Verwijder de longen met behulp van een schaar en verwijder ze. Maak het hart van elk bindweefsel schoon en snijd de aorta caudaal aan de tak van de brachiocefalische romp.
6. Perfusie van het Hart en Spijsvertering Met Collagenase
- Monteer het hart via de aorta in het Langendorff perfusiesysteem (sectie 4) met twee paar dunne, gebogen tang. Om ervoor te zorgen dat het myocard op een retrograde wijze wordt geperfumeerd, plaats het uiteinde van de canule van het perfusiesysteem tussen de eerste aorta tak en de aorta klep. Fixeer de aorta met behulp van een krokodilklem.
- Bevestig het hart met een chirurgische hechting en verwijder de krokodilklamp ( Figuur 1B ).
- Open de klep van de canule om het perfusiemedium (35 ml) door het hart te laten druppelen (60 druppels / min, 5 ml / min) om het resterende bloed uit te spoelen. Wegblazen elke doorstroming in dit stadium.
OPMERKING: Vermijd de vorming van luchtbellen in elk stadium van de perfusie, aangezien dit onvolledige spijsvertering en falen van de celisolatieprocedure tot gevolg zal hebben. - Plaats het hangende hart in de verzameltrechter (hartkamer, figuur 1B ) en start de peristaltische pomp, die het perfusiemedium van de trechter naar het reservoir zal recirculeren ( Figuur 1A ).
- Voeg de collagenase oplossing (van stap 2.8) toe aan het perfusiemedium. Perfuseer het hart met recirculerende collageenoplossing gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Deze stap is zeer kritisch voor het optimaliseren van de celopbrengst. De perfusietijd hangt af van de activiteit van collagenase, die afhankelijk kan zijn van de partij. Test 3-4 batches collagenase om de een met opti te vindenMal activiteit; Dan kunnen grote hoeveelheden van de meest geschikte partij gekocht worden die voor ten minste een jaar voldoende zijn voor reproduceerbare resultaten. - Na afloop van de spijsverteringstijd stop de perfusie, verwijder het hart van het Langendorff-systeem met een schaar en plaats het in een glas Petri-schotel.
- Knip af en verwijder beide atria, en verwijder eventuele resterende vetweefsels. Schud het pericardium met behulp van twee paar tangjes zorgvuldig om de besmetting van de epitheelcellen te vermijden.
OPMERKING: Het pericardium kan verder worden verteerd met collagenase om zuivere cardiale epitheelcellen te verkrijgen indien nodig. Een gedetailleerd protocol wordt niet gegeven in de huidige studie, omdat dit buiten het toepassingsgebied van dit protocol valt. - Knip het hart in het midden met een schaar en leg het in de weefselhacker. Knip het hart 2-3 keer en zet het gehaktweefsel weer in 12 ml van de spijsverteringbuffer uit de Langendorff perfusie.
OPMERKING: Haal de h niet aanOord overdreven, omdat dit resulteert in een hoger aantal dode cardiomyocyten. - Breng het gehaktweefsel over in 15 ml collagenase-bevattende dissociatiemedium en laat het gedurende 5-10 minuten in een waterbad verteren, met af en toe mengen door opnieuw suspensie met een 5 ml wegwerp plastic pipet.
- Aan het eind van de spijsvertering filter de cel suspensie door een 100 μm zeef. Gooi het weefselafval en onverdesteld materiaal weg.
- Na afloop van de Langendorff perfusie spoel het perfusiesysteem onmiddellijk met minimaal 1 liter gedistilleerd water. Perfuseer het systeem door 100 ml 0,1 N NaOH gedurende 30 minuten te recirculeren, en laat het systeem uiteindelijk met 2-3 liter gedestilleerd water spoelen. Droog het systeem door lucht te spoelen en de opening te bedekken met para-film.
7. Rat hartcellenisolatie
- Isolatie en cultuur van cardiomyocyten
- Centrifugeer de cel suspensie bij 25 xg gedurende 1 minuut (zonder brAkes) om de cardiomyocyten te pelletiseren. Kardiomyocyten mogen ook gedurende 10 minuten bij RT zonder centrifugeren worden opgelost.
- Verwijder het supernatant met endotheelcellen en fibroblasten zorgvuldig met behulp van een plastic plastic pipet in een nieuwe 50 ml buis.
- Resuspendeer de cardiomyocytpellet in Ca2 + 6 ml oplossing 1 (Stap 2.9). Laat 1 minuut toe dat de cellen zich aanpassen aan de lage Ca 2+ concentratie omgeving en centrifugeer de cel suspensie opnieuw gedurende 25 minuten bij 25 xg (zonder remmen).
- Gooi de supernatant weg en verwijder de celpellet in 6 ml Ca 2+ oplossing 2 (stap 2.9). Laat de cellen 1 min. Aanpas bij de intermediaire concentratie Ca 2+ , en voeg uiteindelijk 12 ml Ca 2+ oplossing 3 (Stap 2.9) toe aan de cellen. Meng met behulp van een plastic plastic pipet.
- Centrifugeer de cel suspensie bij 25 xg gedurende 1 min.
- Gooi de supernatant weg en verwijder de cellen in 20 ml voor-warmed CCT medium. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan elk van 20 steriele 35 mm celcultuurschotel, vooraf bedekt met laminine (stap 2.9) en laat de cellen gedurende 2 uur in een CO 2 -vrije celcultuur-incubator hangen.
OPMERKING: De cardiomyocyten kunnen ook gekweekt worden onder CO 2 -omgeving; In dit geval moet media met bicarbonaatbuffersysteem worden gebruikt. - Na 2 uur vervang het medium met een nieuw 2 ml CCT medium om eventuele dode cellen te verwijderen.
OPMERKING: De cellen zijn klaar voor eventuele geplande experimenten en kunnen gedurende maximaal 3 dagen worden gekweekt in een typische celcultuur-incubator (CO 2 vrij) zonder significant verlies van levende cellen. Typische gezonde staafvormige cardiomyocyten worden getoond in Figuur 2A .
- Isolatie van endotheelcellen en fibroblasten
- Centrifugeer het supernatant dat endotheelcellen en fibroblasten bevat (van stap 7.1.2) bij 250 xg gedurende 10 minuten.
- Gooi de supe wegRnatant en resuspendeer de celpellet in 1,5 ml endotheliale cel isolatie buffer in een 2 ml monster buis.
- Voeg 3 μg (1: 500) muis anti-rat CD31 antilichaam toe aan de cel suspensie en incubeer het gedurende 30 minuten bij 4 ° C met end-to-end rotatie.
OPMERKING: Een titratie van het antilichaam voor optimale verdunning wordt geadviseerd. Deze stap moet uitgevoerd worden bij 4 ° C bij RT. Een snelle internalisatie van antilichaam door endotheelcellen resulteert in een lage opbrengst. - Voeg de eerder voorbereide (sectie 3) pan anti-muis IgG kralen toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C met end-to-end rotatie.
OPMERKING: Alternatief kan het anti-ratten CD31-antistof van de muis vooraf worden gehecht aan de magnetische kralen en vervolgens aan de celsuspensie toegevoegd worden. Dit zal echter de tijd van incubatie van de kralen met de celsuspensie verhogen en kan leiden tot verhoogde niet-specifieke binding van niet-endotheelcellen en derhalve hogere verontreiniging van andere celtypes. - EENT het einde van de incubatietijd van het antilichaam, plaats de buis die de celsuspensie bevat in een magnetisch rek en laat 2 minuten de magnetische kralen die aan de kant van de buis bevestigd zijn, regelen.
- Verwijder de rest van de celsuspensie (bevat hoofdzakelijk de fibroblasten) voorzichtig met een pipet van 1 ml en voeg deze toe aan een 10 cm celcultuurschotel die 10 ml fibroblastcelkweekmedium bevat (stap 2.3). Plaats het in een typische celkweek incubator die 5% CO2 bevat. De procedure gaat verder in stap 7.3.
- Voeg 1 ml wasbuffer aan de buis toe met magnetische kralen die de endotheelcellen bevinden.
- Pak de buis vast, verwijder het uit het magnetische rek en zorg ervoor dat u de kralen zorgvuldig resuspen door 4 tot 5 keer zachtjes omhoog en omlaag te schudden. Plaats de buis weer in het magnetische rek, laat de kralen gedurende 1 minuut op de wand van de buis zakken en verwijder de wasbuffer voorzichtig.
- Herhaal de wasstapjes 5-7 keer om te ontdoen van vervuilende nEndotheliale cellen.
- Resuspendeer de endotheelcellen die aan de kralen zijn gehecht in 1 ml MV2 endotheliale celcultuurmedium, voeg toe aan een enkele put van een 12-putjesplaat en incubeer in een CO 2 -celkweek incubator.
- Laat de cellen overnacht hechten en verander het medium de volgende dag en vervolgens elke 2-3 dagen tot de cellen semi-confluent worden (meestal 5 - 7 dagen).
OPMERKING: Typische niet-confluente endothelcellen na 3 - 4 dagen en confluente endotheelcellen na 7-10 dagen isolatie worden getoond in respectievelijk figuren 3A en 3B . De cellen kunnen dan geprobepsineerd worden (sectie 7.4) en worden geperst in een T25 celkweek fles.
- Was en cultuur van fibroblasten (vervolg van stap 7.2.6)
- Na 1 uur incubatie, aspireer het medium en was de fibroblasten vastgemaakt aan celcultuurschotel door een geschikt volume van vooraf verwarmde PBS toe te voegen. Aspireer de PBS en herhaal de sVoeg 2-3 keer aan en voeg het voorverwarmde verse fibroblastcelcultuurmedium toe.
- Was de bijgevoegde cellen de volgende dag opnieuw met voorverwarmde PBS (zoals in de vorige stap) en voeg het voorverwarmde verse medium toe. Verander het medium na elke 2-3 dagen. Een typisch fenotype van fibroblasten op dag 2 van isolatie is getoond in figuur 4A .
OPMERKING: De fibroblasten worden meestal half confluent, meestal binnen 5-7 dagen en zijn dan klaar om te worden geprobeerd (sectie 7.4) en gebruikt voor geplande experimenten. Met deze procedure krijgen we gewoonlijk 95-99% pure fibroblasten. Een typisch fenotype van fibroblasten op dag 7 van isolatie is getoond in figuur 4B .
- Trypsinisatie van endotheelcellen en fibroblasten
- Aspireer het medium uit de celkweekschotel en voeg voldoende voorverwarmde PBS toe om de cellen te bedekken.
- Aspireren PBS en voeg nog voldoende trypsine-EDTA oplossing (0,05% en 0,02% respectievelijk) om de cellen te bedekken en plaats inE 37 ° C incubator gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cellen door de cellen op en neer te pipetteren met behulp van een 1 ml pipet en stop de trypsine werking door 10% FCS toe te voegen.
- Pell de cel suspensie door centrifugeren bij 250 x g gedurende 10 min bij RT.
- Resuspendeer de cellen in een geschikt volume van voorverwarmd celkweekmedium.
8. Endotheelcellen Karakterisering
OPMERKING: De zuiverheid van endotheelcellen wordt bepaald door Dil-Ac-LDL opname en immunostaining van von Willebrand factor (vWF). Cellen worden gevisualiseerd door fluorescentie of confocale microscopie ( figuren 3C-3E ).
- Dil-Ac-LDL opname door endotheelcellen
- Trypsineer de endotheelcellen (stap 7.4) en kweek ze 's nachts op glazen deklagen in een 12-putjesplaat (ongeveer 10 x 10 4 cellen / cm 2 ).
- Aspireren het medium en spoel de cellen met 1 ml pre-wGewapende HBSS.
- Aspirateer de HBSS en voeg 1 ml endotheliale celcultuurmedium toe dat 10 μg / ml Dil-Ac-LDL bevat en laat de cellen in de 37 ° C incubator gedurende 4 uur.
- Aspireer het medium en spoel de cellen driemaal met voorverwarmen PBS en maak ze met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA, opgelost in PBS). Incubeer hen met PFA bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
OPMERKING: PFA is bijtend; Gebruik altijd zuurbestendige handschoenen tijdens het hanteren van PFA-oplossing. - Aspiratie van de PFA, spoel de cellen op de deklaag in de 12-putjesplaat met 1 ml PBS-driemaal en incubeer ze gedurende 1 uur bij RT met nucleaire kleuroplossing TO-PRO (10 μM).
OPMERKING: Als het juiste filter beschikbaar is voor de microscoop, kan ook 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; 1 μg / ml) worden gebruikt. In dit geval moet de incubatietijd tot 10 minuten worden gereduceerd. - Spoel cellen op de deklaag in de 12-putjesplaat met 1 ml PBS, aspireer de PBS en herhaal de stap drie keer.
- Neem de cOverschuif uit een 12-putje plaat en plaats deze op een glazen glijbaan met een druppel montagemedium. De cellen zijn klaar om onder een fluorescerende / confocale microscoop te visualiseren. Gebruik een excitatiefilter van 530-560 nm voor Dil-Ac-LDL, 640 nm voor TO-PRO en 340-380 nm voor DAPI.
- Von Willebrand (vWF) kleuring
- Cultuur de endotheelcellen zoals beschreven in stap 8.1.1.
- Aspireren het medium en spoel de cellen met 1 ml voorverwarmde HBSS; Daarna repareren met 4% PFA zoals beschreven in stap 8.1.4.
- Aspiratie van de PFA, spoel de cellen op de deklaag in de 12-putjesplaat met 1 ml PBS tweemaal en laat de cellen gedurende 20 min bij RT met 1 ml 0,1% Triton X-100 (in PBS) doordrenken.
- Aspireer de permeabiliserende oplossing en incubeer de cellen met blokkerende oplossing (5% BSA / 5% FCS in PBS) gedurende 1 uur.
- Incubeer de cellen met konijn anti-vWF antilichaam (1: 100) bij 4 ° C overnacht in een bevochtigde kamer. Voeg een deksel toe zonder thE primair antilichaam als negatieve controle.
- Spoel de cellen op de deklaag in de 12-putjesplaat met 1 ml PBS drie keer en incubeer de cellen met Alexa-488-antilichaam (1: 500) en nucleaire kleuroplossing TO-PRO (10 μM) gedurende 1 uur Bij RT.
- Spoel de cellen op de deklaag in de 12-putjesplaat met 1 ml PBS, aspireer de PBS en herhaal de stap drie keer.
- Breng de deklaag uit de 12-putjesplaat en zet deze op een glazen glijbaan met een druppel montagemedium. De cellen zijn klaar om onder een fluorescerende / confocale microscoop te visualiseren. Gebruik een excitatiefilter van 490 nm voor vWF en 640 nm voor nucleaire kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De isolatieprocedure resulteert in een opbrengst van 70-80% levensvatbare, staafvormige, gestreepte cardiomyocyten ( figuren 2A en 2C ) die kunnen worden gebruikt voor geplande experimenten. In ons laboratorium worden cardiomyocyten routinematig gebruikt voor de analyse van Ca 2+ -signalering. Figuur 5A toont intracellulaire calcium [Ca2 + ] i- oscillaties in reactie op ischemie / reperfusie in cardiomyocyten geladen met Fura-AM (5 μM). Figuur 5B toont veranderingen in [Ca2 + ] i in endotheliale cellen en fibroblasten na toevoeging van ATP (100 μM). De veranderingen in [Ca 2+ ] i in verschillende hartcel typen werden geanalyseerd zoals eerder beschreven. 6 , 11 , 12
Re 1 "src =" / files / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
Figuur 1: Modified Langendorff Perfusion System. ( A ) Het volledige Langendorff perfusiesysteem dat wordt gebruikt voor het isoleren van hartcellen ( B ) Vergrote weergave van het hangende hart in de "hartkamer", die ook gebruikt wordt voor het verzamelen van perfusiebuffer voor recirculatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Volwassen Rat Cardiomyocyten. ( A ) Typische staafvormige, gezonde cardiomyocyten 2 uur na plating in laminine-beklede celkweekschotels ( B ) Een typisch voorbeeld van een slechte bereiding door onvolledige weefselvertering. 2 uur na plating in gelamineerde celcultuurschotels, moSt van de cellen zijn hypercontracted en kijken afgerond, en er zijn weinig rod-vormige cardiomyocyten. Schaalbalk = 10 μm ( C ) Confocal micrograaf van enkele cardiomyocyt die is gekleurd voor actine visualisatie zoals eerder beschreven. 13 Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Rat-cardiale endotheelcellen. ( A ) Fase-contrast micrograaf van niet-confluente endotheliale cel monolaag 3 dagen na isolatie. Donkere vlekken zijn de magnetische kralen die nog steeds aan de ouderendotheelcellen zijn bevestigd. Schaalbalk = 10 μm ( B ) Fase-contrast micrograaf van confluente endotheliale cel monolaag 7 dagen na isolatie ( C) Immunostaining van endotheliale cellen die Dil-Ac-LDL opname tonen (rood) en nucleaire kleuring (Blue) ( D ) Immunostaining van endotheliale cellen die kleuring van vWF (Red) en nucleaire kleuring (Blue) tonen. ( E ) Cellen die alleen met secundair antilichaam worden geïncubeerd En kernvlek (Blauw) (Schaalbalk = 50 μm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 4: Rat hartfibroblasten. ( A ) Typische spindelvormige hartfibroblasten op de tweede dag van isolatie. ( B ) Confluente, pure fibroblasten na 7 dagen cultuur. ( C ) Een typisch voorbeeld van een slecht preparaat verontreinigd met epitheliale cellen. Cellen die door pijlpunten worden aangeduid, zijn de hartseepitheelcellen . Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Wijzigingen in [Ca 2+ ] i in hartcellen. ( A ) Representatieve tracings van veranderingen in intracellulaire calcium [Ca 2+ ] i gemeten door Fura-2 ratio in rat cardiomyocyten blootgesteld aan chemische ischemie (Na-cyanaat; 2 mM) gevolgd door reperfusie ( B ) Representatieve tracings van veranderingen in intracellulaire calcium [Ca 2+ ] i gemeten door Fura-2 ratio in rat-hart endotheliale cellen en fibroblasten, behandeld met ATP (100 μM) zoals aangegeven. > Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel wordt een reproduceerbaar protocol voor de isolatie en de kweek van hartmyocyten, endotheelcellen en fibroblasten beschreven. Dit protocol beschrijft de gelijktijdige en hoge kwaliteit isolatie van de belangrijkste celtypes van hartweefsel, dwz cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten, in tegenstelling tot slechts één celtype. Een kritische stap in de isolatieprocedure is de juiste vertering van het hartweefsel. Als de spijsvertering onvolledig is, kan er nog steeds een groot aantal myocyten worden verkregen, maar hun kwaliteit is zeer arm en ze zijn meestal hypercontracted and round ( Figuur 2B ) en van geen waarde in experimenten. Bovendien zal de opbrengst van endotheelcellen en fibroblast ook worden verminderd. Dit probleem kan worden opgelost door de verteringstijd te regelen. Voordat u het hart van het perfusiesysteem verwijdert, kan de zachtheid van het hart worden gecontroleerd met behulp van tang en vingertoppen. Als het weefsel nog steeds niet merkbaar isVaak kan het hart gedurende nog eens 5-10 minuten geperfereerd worden. Een tweede kritische stap in gezonde cardiomyocytisolatie is de incrementele restauratie van Ca2 + in de isolatiebuffers. Een snelle herstel van hoge concentraties Ca 2+ in de media zal resulteren in afgeronde cardiomyocyten. De kwaliteit van het water dat wordt gebruikt voor de bereiding van buffers is een andere belangrijke factor die de kwaliteit van cardiomyocyten beïnvloedt. Daarom wordt gebruik gemaakt van goede kwaliteit water.
De zuiverheid van endotheelcellen is sterk afhankelijk van de wasstapjes. EDTA moet aanwezig zijn in de wasbuffer ter voorkoming van niet-specifieke binding van niet-endotheelcellen aan de magnetische kralen. De aanwezigheid van bloedcellen in de celsuspensie zal de opbrengst van endotheelcellen sterk verminderen; Daarom is de juiste wassing van het hart zeer kritisch na het bevestigen van het hart in het perfusiesysteem en voor het toevoegen van collagenase. Resterende bloedcomponenten zullen ook t verminderenHij activiteit van collagenase en daarmee belemmering van het hart.
De meest voorkomende verontreiniging in de fibroblastcelcultuur is het verschijnen van satellietkolonies van epitheelcellen ( Figuur 4C ). Deze verontreiniging kan worden vermeden door twee stappen cultuur van fibroblasten. In de eerste stap wordt de concentratie van FCS in het fibroblastcelcultuurmedium tot 5% gereduceerd en wordt de celsuspensie gedurende 30 minuten in de incubator aan de celkweekschotel gehecht. Epitheliale cellen hechten zich snel aan, maar de adhesie van fibroblastcel wordt verhoogd in aanwezigheid van een lage concentratie serum. Na 30 minuten incubatie wordt de cellesuspensie die niet-aanhechtende fibroblasten bevat, zorgvuldig verwijderd naar een nieuwe celcultuurschotel. Op deze manier kan de opbrengst van fibroblasten worden verminderd, maar hun zuiverheid wordt sterk verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
De technische ondersteuning van L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas en A. Weber wordt met dank erkend. De auteurs willen ook dr. E. Martinson bedanken voor uitgebreide bewijslezing en taalbewerking van het manuscript. De studie werd ondersteund door de universiteit van Giessen Anschubsfinanzierung subsidie aan M. Aslam en D. Gündüz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
