Summary
Bir fare kalpten farklı kardiyak hücre tiplerinin izolasyonu için çeşitli protokoller geliştirilmiş ve açıklanmıştır. Burada, yüksek kaliteli ana kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan deneysel maliyetleri düşüren optimize edilmiş bir protokol tarif edilmiştir.
Abstract
Sıçan, kardiyovasküler araştırmalarda kullanılan önemli bir hayvan modelidir ve fare kalp hücreleri, kalp hipertrofisi, fibroz ve ateroskleroz gibi kardiyovasküler hastalık ilerlemesinin moleküler mekanizmalarının in vitro analizi için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu hücresel mekanizmaları anlamak için kardiyovasküler sistemden ölümsüzleştirilmiş hücre hatları geliştirmek için değişken başarı ile çeşitli girişimler yapılmış olsa da, primer hücreler bu çalışmalar için daha doğal ve canlı ortamda çevreye yakınlık sağlar. Bu nedenle, belirli bir hücre tipinde çalışan farklı laboratuvarlar, ilgili fare kalp hücrelerinin bireysel tiplerini izole etmek için protokoller geliştirmiştir. Bununla birlikte, birden fazla hücre türünün izolasyonunu sağlayan bir protokol eksiktir. Burada, yüksek kalitede büyük kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan ve bir preparasyondanH hücresel analizler için kullanın. Bu, kullanılabilir kaynaklardan en verimli şekilde yararlanılmasına izin verir; bu da zaman kazandırabilir ve araştırma maliyetlerini düşürebilir.
Introduction
Kemirgen modelleri, sağlık ve hastalıkta kardiyovasküler fizyoloji konusundaki anlayışımızı genişletmek için uzun zamandır araç olarak kullanılmıştır. 1 Bu hayvan modelleri, bir hastalığın organ seviyesinde patofizyolojisini anlamamıza ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılan çeşitli farmakolojik ajanların farmakokinetik ve farmakodinamiklerini analiz etmemize, kardiyovasküler hastalık gelişiminin moleküler mekanizmalarının anlaşılmasına ve belirli bir hastalığa katkıda bulunmamıza izin vermesine rağmen Hücre tipi, in vitro hücre kültürü modellerinin kullanılmasını gerektirir. Bu amaçla kardiyovasküler sistemden farklı ölümsüzleştirilmiş hücre hatları geliştirilmiştir; Bununla birlikte, yeni izole edilen primer hücreler, canlı dokular ve organizmalar için fizyolojik ve fonksiyonel açıdan daha alakalıdır.
Kalp, kardiyovasküler sistemin tüm önemli hücrelerini içeren çok yönlü bir organtır.Ystem ve sıçan kalbi halen kardiyovasküler fizyolojinin anlaşılması için yaygın olarak kullanılan bir model. Son birkaç on yıl boyunca, tek tek hücre tiplerinin kalp dokusunda izole edilmesi için farklı yöntemler tanımlanmıştır; Bununla birlikte, bu yöntemler yalnızca belirli bir hücre türünün izolasyonuna odaklanır, bu nedenle artık hücresel analiz için kullanılmayan diğer hücrelerin kaybına neden olur. Burada, kardiyak doku, yani kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve fibroblastların majör hücre tiplerinin eşzamanlı ve yüksek kalitede izolasyonunu sağlayan optimize edilmiş bir protokol anlatılmıştır. Bu hücre tiplerinin hepsi farklı deneysel kurulumlarda 8 , 9 , 10 ve aynı hayvantan hücre-hücre etkileşimlerinin analizi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırma, ABD Ulusal Sağlık Enstitülerince yayınlanan Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (NIH Yayın No. 85-23 1985) uygundur ve Giessen Üniversitesi yerel etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 200-250 g ağırlığındaki yetişkin erkek Wistar sıçanları kullanıldı.
1. Otoklavlama
- İşlem yapılmadan en az bir gün önce, bütün cerrahi aletleri, pipet uçlarını ve Pasteur pipetleri izolasyon işleminde 121 ° C'de 30 dakika süreyle otoklavda bekletin.
2. Medyanın Hazırlanması ve Çözümler
NOT: Adımlar 2.1-2.4'teki çözeltiler, izolasyondan bir hafta öncesine kadar hazırlanabilir ve 4 ° C'de saklanabilir, ancak izolasyonun yapıldığı günlerde 2.5-2.8 arasındaki adımlarla çözümleri hazırlayabilir. Tamponların ve ortamların eksiksiz tarifleri Tablo 1'de verilmektedir . Tüm ortamları ve çözeltileri 37 ° C'yeHazırlanmaya başlamadan önce su banyosu hazırlayın.
- Powell ortamını, Tablo l' de listelenen kimyasalları, oda sıcaklığında (RT) 4.5 L H20 içerisinde eriterek hazırlayın. 2.0 N NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın ve hacmi 5.0 L'ye getirin. Çözelti steril filtre edin ve 4 ° C'de saklayın.
- M199 toz ortamı 4.5 L H20 ile eriterek kreatin, L-karnitin ve taurin (CCT) ortamı hazırlayın. Tablete göre HEPES tozu medyaya ekleyin ve 15 dakika karıştırın. Tablo 1'e göre kreatin, karnitin, taurin ve Ara-C'yi ekleyin. İyi karıştırın, pH metre ile pH'ı 2,0 N NaOH ile 7,4'e ayarlayın ve hacmi 5,0 L'ye getirin. Steril filtre ve 4 ° C'de saklayın.
- Orta M199'a% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 2 penisilin / streptomisin (Pen / Strep) ekleyerek fibroblastlar için hücre kültürü ortamı hazırlayın. DMEM, M199 olarak eşit derecede uygundur ve fibroblast hücre kültürü için de kullanılabilir.
- MV2 hücre kültürünü hazırlayınE ortamı için üreticinin talimatlarına göre ek karışımın tüm içeriğini bazal MV2 ortamına ekleyerek endotel hücreleri için hazırlanmıştır. 5 mL alikot alın ve bir su banyosu içinde 37 ° C'ye ısıtın.
- 0.05 g sığır serumu albümini (BSA) 50 mL Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde çözerek ve buna 0.5 mL 200 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ilave ederek endotel hücre izolasyon tamponunu hazırlayın. Steril filtreyi kullanın ve 4 ° C'de saklayın.
- 9.9 mL PBS'ye 200 mM'den 0.1 mL ilave ederek endotel hücre yıkama tamponunu hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
- 27 mg kollajenazın 5 mL Powell ortamında çözündürülmesi ve buna 12.5 uL 100 mM CaCl2 solüsyonu ilave edilerek kollajenaz çözeltisi hazırlayın. Su banyosunda 37 ° C'ye ısıtın.
- 12.5 μL, 25 μL ve 100 mM CaCl 2 çözeltisinin 120 μL'sini ekleyerek kardiyomiyositler için artımlı Ca 2+ restorasyon çözümleri 1, 2 ve 3'ü hazırlayınIyonu sırasıyla 6 mL, 6 mL ve 12 mL Powell ortamı içerebilir.
- Her 35-mm hücre kültürü çanak laminin içeren ön kaplama orta 1 ml ekleyerek izolasyon bir gün önce kardiyomiyosit için hücre kültürü yemekleri ön ceket. Onları gece boyunca 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
3. Manyetik Boncukların Hazırlanması
- Buz üzerinde 1.5 mL numune tüpüne 0.5 mL endotel hücre izolasyon tamponu yerleştirin.
- 5 μL (2 x 10 6 ) pan fare IgG manyetik boncuk ekleyin ve iyice karıştırın.
- Tüp manyetik rafa 1 dakika yerleştirilir. Boncuk tüpün duvarına mıknatısa doğru yapışır. Yüzen maddeyi 1 mL pipetle dikkatlice çıkarın.
- Yıkamayı iki kez tekrarlayın ve son olarak, 50 μL endotel hücresi izolasyon tamponundaki boncukları tekrar askıya alın ve kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
4. Langendorff Perfüzyon Sisteminin Hazırlanması
- TemizleLangendorff sistemini 2 L damıtılmış su ile perfüzyonla yıkayın.
- Sistem boyunca 50 mL Powell ortamını 5 dakika boyunca dolaştırın ve ortamı atın.
- 80 mL taze Powell orta maddesi ilave edin. Gaz silindirinden bir cam Pasteur pipetiyle kabarcıklanarak "karbogen" ile devamlı bir şekilde perfüze edin. Ortamın sistem üzerinden devri daim yaptırmasına izin verin. Sistem şimdi kalbi perfüze etmeye hazırdır ( Şekil 1A ).
5. Sıçanın Diseksiyonu
- Sıçanı, 5 litrelik bir desikatörde bir davlumbazın altına yerleştirin ve havalandırma deliğinden 1.5 mL% 4-5 izofluran ekleyin ve kapağı kapatın.
NOT: Hayvanı sıvı izofluran ile doğrudan temastan kaçınmak için, hayvanı desikatöre yükseltilmiş delikli plakanın üzerine koyun. - Sıçan kapak refleksini kaybedene kadar bekleyin (genellikle ~ 5 dak) ve sonra sıçanı desikatöre götürün. Sıçanı servikal çıkıkla euthanize edin.
- Karın derisini ve yatan kas horizasını kesin.Ortada bir çift keskin makas kullanarak müttefik. Bundan sonra kasları dikey olarak sıçanın göğüs kafesine kadar kesin ve toraks açın. Kalbi ciğerler ile birlikte çıkarın ve hemen orjinalleri buz soğukluğunda% 0.9 NaCl solüsyonuna yerleştirin.
- Akciğerleri bir çift makas yardımıyla çıkarın ve atın. Herhangi bir bağ dokusunun kalbini temizleyin ve brakiocefalik gövdenin dala kaudal olarak aort kesmek.
6. Kalbin Perfüzyonu ve Kollajenazla Sindirim
- İki çift ince, kıvrımlı forseps kullanarak kalbi Langendorff perfüzyon sistemindeki aort yoluyla bağlayın (Bölüm 4). Miyokardın geriye doğru şekilde perfüze olmasını sağlamak için perfüzyon sisteminin kanülünün ucunu ilk aort dalı ile aort kapağı arasına yerleştirin. Bir timsah kelepçe kullanarak aortu düzeltin.
- Kalbi bir ameliyat dikişiyle düzeltin ve timsah kelepçesini çıkarın ( Şekil 1B ).
- Herhangi bir kalıntı kanı temizlemek için perfüzyon maddesinin (35 mL) kalpten damla damla geçişine (60 damla / dak; 5 mL / dakika) izin vermek için kanül valfini açın. Bu aşamadaki akışları atın.
NOT: Perfüzyonun herhangi bir evresinde hava kabarcığı oluşumundan kaçının; bu, eksik hücre sızıntısına ve hücre izolasyon prosedürünün başarısız olmasına neden olur. - Sarkan kalbi toplama hunisine (kalp odası: Şekil 1B ) yerleştirin ve perfüzyon ortamını toplama hunisinden rezervuara ( Şekil 1A ) sirküle edecek olan peristaltik pompayı çalıştırın.
- Kollajenaz çözeltisini (2.8. Adımdan) perfüzyon ortamına ekleyin. Kolajenaz çözeltisinin tekrar dolaştırılması ile kalbi 30 dakika süreyle çalıştırın.
NOT: Hücrenin verimini optimize etmek için bu adım çok önemlidir. Perfüzyon süresi, partiye bağlı olarak değişebilen kollajenazın aktivitesine bağlıdır. Opti olanı bulmak için kollajenazın 3-4 partisini test edinMal aktivitesi; Tekrarlanabilir sonuçlar için en az bir yıl için yeterli olan en uygun partinin büyük miktarı satın alınabilir. - Sindirim süresinin sonunda, perfüzyonu durdurun, kalp Langendorff sisteminden bir çift makas kullanarak çıkarın ve bir cam Petri kabına koyun.
- Kesip atriyum atın ve artık yağ dokularını çıkarın. Epitelyal hücrelerin kirlenmesini önlemek için dikkatle iki çift forseps yardımı ile perikard soyun.
NOT: Gerekirse saf kalp epitel hücreleri elde etmek için perikard kollajenaz ile daha da sindirilebilir. Bu çalışmada ayrıntılı protokol verilmemiştir, çünkü bu, mevcut protokolün kapsamı dışındadır. - Kalbi bir çift makasla ortadan kesin ve doku kıyıcıya koyun. Kalbe 2-3 kez küçültün ve kıyılmış dokuyu 12 mL'lik sindirim tamponunda Langendorff perfüzyonundan tekrar askıya alın.
NOT: h parçasını kesmeÖlü kardiyomiyositlerin daha yüksek bir oranına neden olacağı için aşırı derecede yedirin. - Kıyılmış dokuyu 15 mL kollajenaz içeren disosiyasyon ortamına aktarın ve 5 mL tek kullanımlık bir plastik pipet kullanarak tekrar süspansiyon ile arada sırada karıştırarak 5-10 dakika boyunca bir su banyosunda sindirin.
- Sindirim periyodunun sonunda, hücre süspansiyonunu 100 um elekten geçirin. Doku parçalarını ve sindirilmemiş malzemeyi atın.
- Langendorff perfüzyonunun sonunda, perfüzyon sistemini derhal en az 1 L damıtılmış su ile yıkayın. Sistemi, 100 mL 0.1 N NaOH'yi 30 dakika boyunca tekrar sirküle ederek boşaltın ve sistemi 2-3 L damıtılmış suyla yıkayın. Sistemi havayı yıkayarak kurutun ve açıklığı para filmle örtün.
7. Sıçan Kardiyak Hücre İzolasyonu
- Kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü
- Hücre süspansiyonunu 1 dakika 25 x g'de santrifüjleyin (br olmadan)Akes) kardiyomiyositlerin pelet haline getirilmesi. Kardiyomiyositlerin oda sıcaklığında santrifüj uygulanmadan 10 dakika dinlendirilmesine izin verilebilir.
- Dikkatle, yeni bir 50 mL tüp içinde bir atılabilir plastik pipet yardımı ile endotel hücreleri ve fibroblast içeren süpernatantı çıkarın.
- Ca 2+ 6 mL solüsyon 1 (Adım 2.9) kardiyomiyosit peletini süspansiyon haline getirin. Hücrelerin düşük Ca2 + konsantrasyon ortamına ayarlaması için 1 dakika bekleyin ve hücre süspansiyonunu 1 dakika boyunca (frensiz) 25 xg'de tekrar santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve hücre pelletini 6 mL Ca 2+ solüsyon 2 (Adım 2.9) içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Hücrelerin 1 dakika boyunca Ca 2+ ara konsantrasyonuna ayarlanmasına ve son olarak hücrelere 12 mL Ca 2+ solüsyon 3'ün (Adım 2.9) ilave edilmesine izin verin. Tek kullanımlık bir plastik pipet yardımı ile karıştırın.
- 1 dakika 25 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve hücreleri 20 mL pre-Çarp CCT orta. Laminin (Adım 2.9) ile önceden kaplanmış 20 steril 35 mm hücre kültürü çanağının her birine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücrelerin CO 2 içermeyen hücre kültürü inkübatöründe 2 saat süreyle bağlanmasına izin verin.
NOT: Kardiyomiyositleri ayrıca CO 2 ortamında kültürlenebilir; Ancak, bu durumda bikarbonat tamponlu ortamlar kullanılmalıdır. - 2 saat sonra, ölü hücreleri yok etmek için ortamı yeni 2 mL CCT ortamı ile değiştirin.
NOT: Hücreler planlanan herhangi bir deney için hazırdır ve canlı hücrelerin önemli bir kaybı olmaksızın tipik bir hücre kültürü inkübatöründe (CO 2 içermeyen) 3 gün boyunca kültürlenebilir. Tipik sağlıklı çubuk şeklindeki kardiyomiyositleri Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- Endotel hücreleri ve fibroblastların izolasyonu
- Endotel hücreleri ve fibroblast içeren süpernatantı (basamak 7.1.2'den itibaren), 250 xg'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Supe'yi yok etRnatant ve hücre pelletini, 2 mL numune tüpünde 1.5 mL endotel hücresi izolasyon tamponuna tekrar süspanse edin.
- Hücre süspansiyonuna 3 μg (1: 500) fare anti-sıçan CD31 antikoru ekleyin ve uç uca rotasyon ile 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: En iyi seyreltme için antikor titrasyonu önerilir. Bu adım, RT'de olduğu gibi 4 ° C'de gerçekleştirilmelidir; endotel hücreleri tarafından antikorun hızlı içselleştirilmesi düşük verime neden olacaktır. - Önceden hazırlanmış (Bölüm 3) pan anti-fare IgG boncukları hücre süspansiyonuna ilave edin ve uçtan uca rotasyon ile 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
NOT: Alternatif olarak fare anti-sıçan CD31 antikoru, manyetik boncuklara önceden bağlanabilir ve daha sonra hücre süspansiyonuna eklenebilir. Bununla birlikte, bu, boncukların hücre süspansiyonu ile inkübasyon süresini artıracak ve endotel dışı hücrelerin spesifik olmayan bağlanmasına ve dolayısıyla diğer hücre türlerinin daha yüksek bulaşmasına neden olabilir. - birAntikor inkübasyon süresinin sonuna kadar, hücre süspansiyonunu içeren bir tüpü bir manyetik rafta yerleştirin ve tüpün kenarına endotel hücrelere bağlı manyetik boncukların yerleşmesi için 2 dakika bekleyin.
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde hücre süspansiyonunun geri kalanını (esasen fibroblastlar içeren) çıkarın ve 10 mL'lik fibroblast hücre kültürü ortamı (Adım 2.3) içeren 10 cm'lik hücre kültürü çanağına ekleyin. % 5 CO 2 içeren tipik bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İşlem, Adım 7.3'te devam eder.
- Endotel hücreleri içeren manyetik boncuklar ile tüp 1 mL yıkama tamponu ekleyin.
- Tübü kapatın, manyetik raftan çıkarın ve boncukları 4-5 kez hafifçe yukarı aşağı sallayarak dikkatle tekrar süspanse edin. Tüpü manyetik rafa tekrar yerleştirin, boncukların borunun duvarına 1 dakika kadar yerleşmesini sağlayın ve yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın.
- Kirleten n'lerden kurtulmak için yıkama adımlarını 5-7 kez tekrarlayın.Endotel hücreleri.
- MV2 endotel hücresi kültür ortamı 1 ml boncuklar bağlı endotel hücreleri Tekrar, bir 12 well plaka tek bir kuyu eklemek ve CO 2 hücre kültürü kuluçka inkübe edin.
- Hücrelerin gecede bağlanmasına izin verin ve ertesi gün ortamı değiştirin ve sonra her 2-3 günde bir hücreleri yarı konfluent olana kadar (genellikle 5-7 gün) değiştirin.
NOT: 3-4 gün sonra tipik konfluent olmayan endotel hücreleri ve 7-10 gün izolasyondan sonra konfluent endotel hücreleri sırasıyla Şekil 3A ve 3B'de gösterilmektedir. Hücreler daha sonra tripsinize edilebilir (bölüm 7.4) ve bir T25 hücre kültürü şişesine ekilir.
- Fibroblastların yıkanması ve kültürü (basamak 7.2.6'ya devam edin)
- 1 saat inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve önceden ısıtılmış PBS'nin uygun bir hacmini ekleyerek hücre kültürü çanağına bağlanan fibroblastları yıkayın. PBS'yi aspire edin ve2-3 kez tepkimeye sokun ve son olarak önceden ısıtılmış taze fibroblast hücre kültürü ortamı ekleyin.
- Eklenen hücreleri bir sonraki gün tekrar önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın (önceki aşamada olduğu gibi) ve önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin. Ortamı her 2-3 günden sonra değiştirin. İzolasyonun 2. gününde fibroblastların tipik bir fenotipi Şekil 4A'da gösterilmiştir.
NOT: Fibroblastlar genelde 5-7 gün içinde yarı konfluent olurlar ve daha sonra trippine edilmeye hazır olurlar (bölüm 7.4) ve planlı deneyler için kullanılırlar. Bu prosedürle, genellikle% 95-99 saf fibroblast elde ediyoruz. İzolasyonun 7. gününde fibroblastların tipik bir fenotipi Şekil 4B'de gösterilmektedir.
- Endotel hücreleri ve fibroblastların tripsinasyon
- Ortamı hücre kültürü çanak aspire ve hücreleri kapsayacak kadar önceden ısıtılmış PBS ekleyin.
- PBS'yi aspire edin ve hücreleri örtmek için yeterli tripsin-EDTA solüsyonu (sırasıyla% 0.05 ve% 0.02) ilave edin.37 ° C inkübatör 5 dakika boyunca.
- 1 mL'lik bir pipet yardımı ile hücreleri yukarıya ve aşağıya pipetleyerek hücreleri tekrar süspanse edin ve% 10 FCS ekleyerek tripsin eylemini durdurun.
- Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle 250 xg'de santrifüje tabi tutarak hücre süspansiyonunu peletleyin.
- Hücreleri önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı uygun bir hacminde tekrar süspanse edin.
8. Endotel Hücre Karakterizasyonu
NOT: Endotel hücrelerinin saflığı Dil-Ac-LDL alımı ve von Willebrand faktörünün (vWF) immün boyaması ile belirlenir. Hücreler, flüoresan veya konfokal mikroskopi ( Şekil 3C-3E ) ile görselleştirilir.
- Endotel hücreleri tarafından Dil-Ac-LDL alımı
- Endotel hücreleri (adım 7.4) Trypsinize ve 12 kapaklı plaka (yaklaşık 10 x 10 4 hücre / cm 2 ) cam lamelleri gece boyunca onları kültür.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL pre-w ile yıkayınSilahlı HBSS.
- HBSS'yi aspire edin ve 10 μg / mL Dil-Ac-LDL içeren 1 mL endotel hücre kültürü ortamı ilave edin ve 4 saat boyunca 37 ° C inkübatöre hücreleri bırakın.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile üç kez yıkayın ve 1 mL% 4 paraformaldehitle (PFA, PBS içinde çözülmüş olarak) sabitleyin. Onları PFA ile 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
NOT: PFA aşındırıcıdır; PFA çözeltisini kullanırken daima asite dayanıklı eldiven kullanın. - PFA aspire, 1 ml PBS ile 12 yuvalı plakada lamel hücreleri yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca nükleer boyama çözümü TO-PRO (10 μM) ile inkübe edin.
NOT: Mikroskop için uygun filtre varsa, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 ug / mL) de kullanılabilir. Bu durumda inkübasyon süresi 10 dakikaya indirilmelidir. - 1 ml'lik PBS ile 12 oyuklu plakada lamel hücreleri durulayın, PBS aspirat ve adım üç kez tekrarlayın.
- C alın12 kuyucuklu plakayı çıkarın ve bir damla montaj ortamı ile cam bir slayda monte edin. Hücreler bir floresan / konfokal mikroskop altında görselleştirmeye hazır. Dil-Ac-LDL için 530-560 nm, TO-PRO için 640 nm ve DAPI için 340-380 nm'lik bir uyarım filtresi kullanın.
- Von Willebrand (vWF) boyama
- Adım 8.1.1'de açıklandığı gibi endotel hücrelerini kültürleyin.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış HBSS ile durulayın; Bundan sonra, adım 8.1.4'te tarif edildiği gibi% 4 PFA ile sabitleyin.
- PFA'yı aspire edin, iki kere 1 mL'lik PBS ile 12 oyuklu plakada lamellerin üzerindeki hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 mL% 0.1 Triton X-100 (PBS içinde) ile hücreleri permeabilize edin.
- Geçirgen hale getirme çözeltisini aspire edin ve hücreleri bloke edici çözelti (PBS içerisinde% 5 BSA /% 5 FCS) ile 1 saat boyunca inkübe edin.
- 4 gece nemlendirilmiş bir odada gece boyunca tavşan anti-vWF antikor (1: 100) ile hücreleri inkübe edin. Bu olmadan bir lamel ekleyinBirincil antikor negatif kontrol olarak.
- 1 mL PBS ile üç kez 12 kaplı plakada lamelleri yıkayın ve 1 saat boyunca eşek anti-tavşan Alexa Fluor-488 antikor (1: 500) ve nükleer boyama çözümü TO-PRO ile hücreleri kuluçkaya yatırın RT'de.
- 1 mL PBS ile 12-iyi plakada lamel hücreleri durulayın, PBS aspirat ve adım üç kez tekrarlayın.
- 12 yuvalı plakadan lamelleri alın ve bir damla montaj ortamı ile cam slayt üzerine monte edin. Hücreler bir floresan / konfokal mikroskop altında görselleştirmeye hazır. VWF için 490 nm ve nükleer boyama için 640 nm'lik bir uyarılma filtresi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İzolasyon prosedürü, planlanan deneyler için kullanılabilir% 70 - 80 canlı, çubuk şeklinde, çizgili kardiyomiyositlerin ( Şekil 2A ve 2C ) bir verimiyle sonuçlanır. Laboratuarımızda kardiyomiyositler Ca 2+ sinyalizasyonunun analizi için rutin olarak kullanılırlar. Şekil 5A , Fura-AM (5 uM) yüklü kardiyomiyositlerde iskemi / reperfüzyona yanıt olarak hücre içi kalsiyum [Ca 2+ ] i salınımlarını göstermektedir. Şekil 5B , ATP'nin (100 uM) eklenmesinden sonra endotel hücrelerinde ve fibroblastlarda [Ca2 + ] i'deki değişiklikleri göstermektedir. Farklı kardiyak hücre tiplerinde [Ca 2+ ] i'deki değişiklikler daha önce tarif edildiği gibi analiz edildi. 6 , 11 , 12
Re 1 "src =" / dosyalar / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
Şekil 1: Modifiye Langendorf Perfüzyon Sistemi. ( A ) Kalp hücrelerinin izolasyonu için kullanılan tüm Langendorff perfüzyon sistemi ( B ) "kalp bölmesindeki" asılı kalp görüntüsü, devridaim için perfüzyon tamponunun toplanması için de kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Erişkin Sıçan Kardiyomiyositleri. ( A ) Laminin kaplı hücre kültürü kaplarında kaplamadan 2 saat sonra tipik çubuk şekilli, sağlıklı kardiyomiyosit ( B ) Tamamlanmamış doku sindirimine bağlı olarak zayıf bir preparatın tipik bir örneği. Laminin kaplı hücre kültürü kaplarında kaplandıktan 2 saat sonra, moHücrelerin steri köprü daralıyor ve yuvarlak görünüyor; çubuk şeklindeki birkaç kardiyomiyosit var. Ölçek çubuğu = 10 μm ( C ) Tek kardiyomiyositin konfokal mikrografı daha önce tarif edildiği gibi aktin görselleştirilmesi için boyandı. 13 Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Sıçan Kardiyak Endotel Hücreleri. ( A ) İzolasyondan 3 gün sonra konfluent olmayan endotel hücre monolayerının faz kontrastlı mikrografı. Koyu lekeler, ana endotel hücrelerine hala bağlı manyetik boncuklardır. Ölçek çubuğu = 10 μm ( B ) İzolasyondan 7 gün sonra konfluent endotel hücresi tek katmanının faz kontrast mikrografı ( C) Endotel hücrelerinin immüno-boyanması, Dil-Ac-LDL alımını (Kırmızı) ve nükleer boyayı ( M ) gösteren ( D ) vWF (Kırmızı) ve boyanmayı gösteren endotel hücrelerinin immün boyaması (Mavi) ( E ) Sekonder antikorla inkübe edilen hücreler Ve nükleer leke (Mavi) (Scale bar = 50 μm) Bu şekli daha geniş bir sürümünü görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Sıçan Kardiyak Fibroblastları. ( A ) İzolasyonun ikinci gününde tipik iğ şekilli kardiyak fibroblastlar. ( B ) 7 günlük kültürden sonra konfluent, saf fibroblastlar. ( C ) Epitel hücrelerle kontamine olmuş zayıf bir preparatın tipik bir örneği. Ok uçları ile gösterilen hücreler, kalp epitel hücreleri . Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Kardiyak Hücrelerdeki [Ca 2+ ] i'deki değişiklikler. ( A ) Kemik iskemisine (Na-siyanat; 2 mM) maruz kalan sıçan kardiyomiyositlerinde Fura-2 oranı ile ölçülen hücre içi kalsiyum [Ca 2+ ] i değişiminin temsili izlemesi, ardından reperfüzyon ( B ) İntraselüler kalsiyum değişikliklerinin temsili izleri [Ca 2+ ] i , belirtilen şekilde ATP (100 uM) ile muamele edilmiş sıçan kalp endotel hücreleri ve fibroblastlarında Fura-2 oranı ile ölçülmüştür. > Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, kardiyak miyositlerin, endotel hücrelerinin ve fibroblastların izolasyonu ve kültürü için tekrarlanabilir bir protokol anlatılmıştır. Bu protokol, sadece bir hücre türünün aksine, kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi kardiyak doku majör hücre tiplerinin eşzamanlı ve yüksek kalitede izolasyonunu tanımlar. İzolasyon prosedüründe kritik bir adım, kalp dokusunun doğru sindirilmesidir. Sindirim tamamlanmazsa, çok sayıda miyosit elde edilebilir ancak kalitesi çok zayıftır ve çoğunlukla hiperkontrakt ve yuvarlaktır ( Şekil 2B ) ve deneylerde değeri yoktur. Üstelik, endotel hücreleri ve fibroblastın verimi de azalacaktır. Bu problem sindirim süresini kontrol ederek çözülebilir. Kalbi perfüzyon sisteminden çıkarmadan önce kalbin yumuşaklığı forseps ve parmak ucu yardımıyla kontrol edilebilir. Doku hala belirgin değilseOft, kalp 5-10 dakika daha perfüze edilebilir. Sağlıklı kardiyomiyosit izolasyonunda ikinci bir kritik adım, izolasyon tamponlarında Ca 2+ 'nin artan restorasyonudur. Medyada yüksek Ca2 + konsantrasyonlarının hızlı şekilde restorasyonu yuvarlak kardiyomiyositlere neden olacaktır. Tamponların hazırlanması için kullanılan suyun kalitesi kardiyomiyositlerin kalitesini etkileyen önemli bir faktördür. Bu nedenle, kaliteli su kullanılması önerilir.
Endotel hücrelerinin saflığı yıkama adımlarına oldukça bağlıdır. Endotel hücrelerinin non-spesifik olarak manyetik boncuklara bağlanmasını önlemek için yıkama tamponunda EDTA bulunması gerekir. Hücre süspansiyonunda kan hücrelerinin varlığı, endotel hücrelerinin verimini büyük ölçüde düşürecektir; Dolayısıyla, kalbi perfüzyon sistemine monte ettikten ve kollajenaz ilavesinden önce kalbe uygun şekilde yıkamak çok önemlidir. Artık kan bileşenleri ayrıca tO kollajenaz faaliyeti ve dolayısıyla kalbin sindirimini engellemektedir.
Fibroblast hücre kültüründe en yaygın bulaşma, epitel hücrelerinin uydu kolonilerinin ortaya çıkmasıdır ( Şekil 4C ). Bu kirlenme, fibroblastların iki aşamalı kültürlenmesi ile önlenebilir. İlk aşamada, fibroblast hücre kültürü ortamındaki FCS konsantrasyonu% 5'e düşürülür ve hücre süspansiyonu inkübatöre 30 dakika boyunca hücre kültürü çanağına yapışmaya bırakılır. Epitelyal hücreler hızla yapışır, ancak fibroblast hücre yapışma zamanı düşük bir serum konsantrasyonunun varlığında arttırılır. 30 dakika inkübasyondan sonra, yapışkan olmayan fibroblastları ihtiva eden hücre süspansiyonu yeni bir hücre kültürü çanağına dikkatlice çıkarılır. Bu şekilde fibroblastların verimi azaltılabilir, ancak saflıkları büyük ölçüde arttırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar beyanda bulunacak bir şeyleri yok.
Acknowledgments
L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas ve A. Weber'in teknik desteği minnettarlıkla kabul edilmektedir. Yazarlar, el yazmalarının derin kanıtı okuma ve dil düzenlemesi için Dr. E. Martinson'a teşekkür etmek istiyorlar. Çalışma, M. Aslam ve D. Gündüz'e verilen Giessen Anschubsfinanzierung Üniversitesi tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
