Summary
쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.
Abstract
쥐는 심장 혈관 연구에 사용되는 중요한 동물 모델이며, 랫트 심장 세포는 심근 비대, 섬유증 및 죽상 동맥 경화증과 같은 심혈관 질환 진행의 분자 메커니즘에 대한 생체 외 분석을 위해 일상적으로 사용됩니다. 이러한 세포 메커니즘을 이해하기 위해 심혈관 시스템에서 불후의 세포주를 개발하기 위해 다양한 성공을 거둔 여러 시도가 있었지만, 일차 세포는 이러한 연구를 위해보다 자연스럽고 가까운 생체 내 환경을 제공합니다. 따라서 특정 세포 유형에 종사하는 여러 실험실에서는 관심있는 쥐 심장 세포의 개별 유형을 분리하는 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 하나 이상의 셀 유형을 격리 할 수있는 프로토콜이 없습니다. 여기에는 하나의 준비에서 고품질의 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial 세포 및 fibroblasts)의 격리를 허용하고 최적화 된 프로토콜을 설명합니다세포 분석에 사용. 이를 통해 사용 가능한 리소스를 가장 효율적으로 사용할 수 있으므로 시간을 절약하고 연구 비용을 줄일 수 있습니다.
Introduction
설치류 모델은 오랫동안 건강과 질병에서 심혈 관계 생리학에 대한 우리의 이해를 넓히는 도구로 사용되어 왔습니다. 1 이 동물 모델은 기관 수준에서 질병의 병리 생리학을 이해하고 심혈관 질환 치료에 사용되는 다양한 약리학 적 약물의 약물 동력학 및 약력학을 분석하고 심혈관 질환 발병의 분자 메커니즘 및 특정 세포 유형은 시험 관내 세포 배양 모델의 사용을 필요로한다. 이 목적을 위해 심혈관 시스템으로부터의 상이한 불멸화 된 세포주가 개발되었다. 2 , 3 그러나 새로 분리 된 1 차 세포는 생리 학적으로 기능적으로 살아있는 조직과 유기체와 관련이 있습니다.
심장은 심장 혈관의 모든 주요 유형의 세포를 포함하는 다용도 장기입니다.ystem, 쥐 심장은 여전히 심혈관 생리학의 이해를 위해 일반적으로 사용되는 모델입니다. 지난 수십 년 동안 심장 조직으로부터 개별 세포 유형을 분리하기위한 여러 가지 방법이 설명되었습니다. 4 , 5 , 6 , 7 그러나 이러한 방법은 특정 세포 유형의 분리에만 초점을 맞추어 더 이상 세포 유형을 잃어 버려 세포 분석에 더 이상 사용할 수 없습니다. 여기에는 심장 조직, 즉 심근 세포, 내피 세포 및 섬유 아세포의 주요 세포 유형을 동시에 고품질로 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이러한 모든 세포 유형은 다른 실험 설정 8 , 9 , 10 및 동일한 동물의 세포 - 세포 상호 작용 분석에 사용할 수 있습니다.
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Protocol
이 조사는 미 국립 보건원 (NIH Publication No. 85-23 1985)에 의해 출판 된 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서에 따르며 Giessen 대학 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 200-250 g의 성인 남성 Wistar 쥐를 사용 하였다.
1. 고압 증기 멸균
- 절차가 수행되기 적어도 하루 전에 121 ° C에서 30 분 동안 격리 절차에 사용되는 모든 수술 도구, 피펫 팁 및 파스퇴르 피펫을 고압 멸균하십시오.
2. 미디어 및 솔루션 준비
참고 : 2.1-2.4 단계의 솔루션은 격리 전 1 주일까지 준비하고 4 ℃에서 보관할 수 있지만 격리 당일 2.5-2.8 단계에서 솔루션을 준비하십시오. 완충액과 배지의 완전한 조리법은 표 1 에 나와 있다. 37 ℃로 모든 매체와 용액을 따뜻하게준비를 시작하기 전에 물 목욕.
- 실온 (RT)에서 4.5 L의 H2O에 표 1 에 열거 된 화학 물질을 용해시켜 파웰 (Powell) 배지를 준비한다. 2.0 N NaOH로 pH를 7.4로 조정하고, 5.0 L로 부피를 가져온다. 용액을 멸균하고 4 ℃에서 보관한다.
- 크레아틴, L- 카르니틴 및 타우린 (CCT) 배지를 4.5L의 H2O에 용해시켜 M199 분말 배지를 준비한다. 표에 따라 HEPES 분말을 배지에 넣고 15 분간 혼합한다. 표 1 에 따라 크레아틴, 카르니틴, 타우린 및 Ara-C를 첨가하십시오. 잘 섞고 pH 미터로 pH를 2.0 N NaOH로 7.4로 조절하고 5.0 L로 부피를 가져라. 무균 필터와 4 ℃에서 보관한다.
- 중간 M199에 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS)과 2 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)을 추가하여 섬유 아 세포에 대한 세포 배양 매체를 준비합니다. DMEM은 M199와 마찬가지로 적합하며 섬유 아세포 세포 배양에도 사용할 수 있습니다.
- MV2 세포 배양 준비e 배지를 제조사의 지시에 따라 기저부 MV2 배지에 첨가하여 내피 세포를 배양한다. 5 ML 나누어 지는를 가지고 물을 욕조에 37 ° C로 따뜻하게.
- 행크 균형 소금 용액 (HBSS) 50 ML에 소 혈청 알부민 (BSA) 0.05g을 용해시키고 200mM ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA) 솔루션 0.5 ML을 추가하여 내피 세포 격리 버퍼를 준비합니다. 이것을 무균 여과하고 4 ° C에 보관하십시오.
- PBS 9.9 mL에 200 MM 0.1 ML을 추가하여 내피 세포 세척 버퍼를 준비하고 4 ° C에 보관하십시오.
- 파월 배지 5 mL에 콜라게나 제 27 mg을 녹이고 100 mM CaCl 2 용액 12.5 μL를 가하여 콜라게나 제 용액을 조제한다. 수조에서 37 ° C로 따뜻하게하십시오.
- 100 mM CaCl 2 solut의 12.5 μL, 25 μL 및 120 μL를 추가하여 cardiomyocytes에 대한 증분 칼슘 2 + 복원 솔루션 1, 2, 3을 준비이온을 각각 6 mL, 6 mL 및 12 mL의 Powell 배지에 넣었다.
- 각 35mm 세포 배양 접시에 laminin을 포함하는 사전 코팅 매체 1 ML을 추가하여 격리하기 하루 전에 cardiomyocytes에 대한 세포 배양 접시를 미리 코트. 37 ° C 밤새 세포 배양 보육에서 그들을 품어.
3. 자성 비드의 제조
- 얼음 1.5 ML 샘플 튜브에 내피 세포 격리 버퍼 0.5 ML을 놓습니다.
- 냄비 마우스 마그네틱 비즈 5 μL (2 X 10 6 )을 추가하고 잘 섞는다.
- 튜브를 자성 선반에 1 분 동안 넣으십시오. 비드는 자석쪽으로 튜브 벽에 달라 붙을 것입니다. 조심스럽게 1 ML 피펫으로 뜨는을 제거합니다.
- 두 번 더 세탁을 반복하고 마지막으로 50 μL 내피 세포 격리 버퍼의 구슬을 다시 일시 중지하고 4 ° C까지 보관하십시오.
4. Langendorff 관류 시스템의 준비
- 청소2L의 증류수로 관류하여 Langendorff 시스템에 주입 하였다.
- 5 분 동안 시스템을 통해 Powell 배지 50 mL를 순환시키고 배지를 버린다.
- 신선한 파웰 매체 80 ML을 추가합니다. 가스 실린더에서 유리 파스퇴르 피펫으로 버블 링하여 "카보 겐"으로 계속해서 환기시킵니다. 매체가 시스템을 통해 재순환되도록하십시오. 시스템은 이제 심장을 관류 할 준비가되었습니다 ( 그림 1A ).
5. 쥐의 해부
- 쥐를 흄 후드 아래의 5 L 데시 케이 터에 놓고 에어 벤트를 통해 4-5 % 이소 플루 란 1.5 mL를 넣고 뚜껑을 닫으십시오.
참고 : 액체 isoflurane과 동물의 직접적인 접촉을 피하기 위해 데시 케이 터 내부에있는 높은 천공 된 판에 동물을 올려 놓으십시오. - 쥐가 뚜껑 반사 (일반적으로 ~ 5 분)를 잃을 때까지 기다린 다음 쥐를 데시 케이 터에서 꺼내십시오. 자궁 경관 탈구로 쥐를 안락사.
- 복부 피부와 밑에있는 근육을 잘라내십시오.한 쌍의 날카로운 가위를 사용하여 가운데 아군. 그 후, 근육을 쥐의 흉골에 수직으로 절단하고 흉부를 엽니 다. 폐와 함께 심장을 제거하고 즉시 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl 용액에 장기를 놓습니다.
- 가위로 폐를 제거하고 폐기하십시오. 어떤 결합 조직의 심장을 깨끗하게하고, 대동맥 트렁크의 가지에서 대동맥을 자릅니다.
6. 콜라게나 제로 심장 충혈과 소화
- 두 쌍의 얇은 곡선 포셉을 사용하여 Langendorff 관류 시스템 (섹션 4)에서 대동맥을 통해 심장 을 장착하십시오. 심근이 역행 방식으로 관류되도록하기 위해 첫 번째 대동맥 분지와 대동맥 판막 사이에 관류 시스템의 캐 뉼러 끝 부분을 놓습니다. 악어 클램프를 사용하여 대동맥을 고정하십시오.
- 외과 용 봉합사로 심장을 고정시키고 악어 클램프 ( 그림 1B )를 제거합니다.
- 관류의 밸브를 열어 관류 매체 (35 ML)는 심장 드롭 (60 방울 / 분, 5 ML / 분)을 통해 어떤 잔여 혈액을 씻어 통과하도록 허용합니다. 이 단계에서 유출 물을 버립니다.
참고 : 이것은 관류의 불완전한 소화 및 세포 분리 과정의 실패를 초래할 수 있으므로 관류의 어느 단계에서든 공기 방울의 형성을 피하십시오. - 교수형 심장을 수집 깔때기 (심장 챔버, 그림 1B )에 놓고 연동 펌프를 시작하면 관류 매체가 수집 깔대기에서 저장소로 재순환됩니다 ( 그림 1A ).
- 관류 매체에 콜라게나 제 용액 (2.8 단계에서)을 추가합니다. 30 분 동안 콜라게나 제 용액을 재순환시켜 심장을 관류하십시오.
참고 :이 단계는 셀 생산량 최적화에 매우 중요합니다. 관류 시간은 콜라게나 제의 활성에 따라 다르며, 이는 배치에 따라 다를 수 있습니다. Collagenase 3-4 batch를 시험하여 opti말 행동; 재현성있는 결과를 위해서는 최소 1 년 동안 충분한 양의 최적의 배치를 대량 구매할 수 있습니다. - 소화 시간의 끝에서, 재관류를 중지하고 가위를 사용하여 Langendorff 시스템에서 심장을 제거하고 유리 페트리 접시에 놓으십시오.
- 두 개의 심방을 잘라 버리고 남은 지방 조직을 제거하십시오. 조심스럽게 두 쌍의 포셉의 도움으로 상피 세포의 오염을 피하기 위해 심낭을 떼어냅니다.
참고 : 필요하다면 심낭은 콜라게나 제로 더 소화되어 순수한 심장 상피 세포를 얻을 수 있습니다. 상세한 프로토콜은 본 연구의 범위를 벗어나기 때문에 본 연구에서는 제시하지 않았다. - 가위로 심장을 잘라내어 조직 절단기에 넣으십시오. 심장을 2-3 번 말려서 Langendorff 재관류에서 소화 완충액 12 mL에 다진 조직을 다시 부순다.
참고 : h를 자르지 마십시오.과도하게, 이는 죽은 심근 세포의 비율이 더 높아짐에 따라 과도하게 심하게됩니다. - 5 ML 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 다시 서스펜션에 의해 가끔 혼합과 5-10 분 동안 수욕에서 콜라게나 제 함유 해리 매체의 15 ML로 다진 조직을 전송하고 보자.
- 소화 기간이 끝나면 100 μm의 체에 세포 현탁액을 걸러냅니다. 조직 파편 및 소화되지 않은 물질은 폐기하십시오.
- Langendorff 재관류가 끝나면 최소 1 L의 증류수로 즉시 관류 시스템을 세척하십시오. 30 분 동안 0.1 N NaOH 100 ML을 재순환하여 시스템을 충만하고 마지막으로 증류수 2 ~ 3 L로 시스템을 플러시. 공기를 흘려 시스템을 건조시키고 패 필름으로 개구부를 덮으십시오.
7. 랫 심장 세포 분리
- 심근 세포의 분리 및 배양
- 1 분 25 xg에서 세포 현탁액을 원심 분리기없이 (br없이akes)를 사용하여 심근 세포를 펠렛 화했습니다. 심근 세포는 원심 분리없이 실온에서 10 분 동안 정치되도록 허용 될 수 있습니다.
- 조심스럽게 새로운 50 ML 튜브에 일회용 플라스틱 피펫의 도움으로 내피 세포와 섬유 아 세포를 포함하는 뜨는을 제거합니다.
- 칼슘 2 + 6 ML 솔루션 1 (단계 2.9)에서 cardiomyocyte의 펠렛을 Resuspend. 세포가 낮은 칼슘 2 농도 환경에 적응하고, (브레이크없이) 1 분 25 XG에서 세포 현탁액을 다시 원심 분리기에 1 분 허용하십시오.
- 뜨는을 버리고 6 ML 칼슘 2 + 솔루션 2 (단계 2.9)에서 세포 펠렛을 resuspend. 세포가 1 분 Ca 2 + 의 중간 농도에 적응하고, 마지막으로 세포에 칼슘 2 + 솔루션 3 (단계 2.9) 12 ML을 추가 할 수 있습니다. 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 혼합하십시오.
- 1 분 25 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 뜨는 부분을 버리고 20 ML 사전에 세포를 resuspend온난화 된 CCT 배지. laminin (단계 2.9)로 미리 코팅 된 20 멸균 35mm 세포 배양 접시 각각에 세포 현탁액 1 ML을 추가하고 세포가 이산화탄소없는 세포 배양기 배양기에서 2 시간 동안 부착되도록합니다.
참고 : cardiomyocytes도 이산화탄소 환경에서 배양 할 수 있습니다; 그러나이 경우 중탄산 완충 시스템이있는 매체를 사용해야합니다. - 2 시간 후 배양액을 새로운 2 mL의 CCT 배지로 교체하여 죽은 세포를 제거합니다.
참고 : 세포는 계획된 실험을 할 준비가되어 있으며 살아있는 세포를 크게 손실시키지 않으면 서 전형적인 세포 배양기 (CO 2가 없는)에서 최대 3 일 동안 배양 할 수 있습니다. 전형적인 건강한 막대 모양의 cardiomyocytes은 그림 2A 에 표시됩니다.
- 내피 세포 및 섬유 아세포의 분리
- 내피 세포와 섬유 아세포 (단계 7.1.2에서)를 포함하는 상등액을 250 xg에서 10 분간 원심 분리한다.
- 수퍼맨을 버리십시오.2 mL의 시료 튜브에 1.5 mL의 내피 세포 분리 완충액에 세포 펠렛을 재현 탁한다.
- 세포 현탁액에 마우스 anti-rat CD31 항체 3 μg (1 : 500)을 넣고 4 ℃에서 배양합니다. 30 분 동안 end-to-end 회전을합니다.
참고 : 최적의 희석을위한 항체의 적정이 권고됩니다. 이 단계는 RT에서와 같이 4 ° C에서 수행되어야하며, 내피 세포에 의한 항체의 신속한 내재화는 낮은 수율을 초래할 것이다. - 이전에 준비한 (섹션 3) 냄비 안티 마우스 IgG 비즈를 세포 현탁액에 첨가하고 4에서 20 분 동안 품을 때 종단 간 회전.
참고 : 또는 마우스 항 쥐 CD31 항체를 자기 구슬에 미리 부착 한 다음 세포 현탁액에 첨가 할 수 있습니다. 그러나, 이것은 세포 현탁액과 구슬의 부화 시간을 증가시키고 비 - 내피 세포의 비특이적 결합을 증가시킬 수 있으며, 따라서 다른 세포 유형의 오염을 증가시킬 수있다. - 에이항체 잠복 시간의 끝, 자기 랙에 세포 현탁액을 포함하는 튜브를 배치하고 튜브의 측면에 내피 세포에 연결된 자기 구슬을 해결 2 분 수 있습니다.
- 조심스럽게 1 ML 피펫을 사용하여 세포 현탁액 (주로 fibroblasts 포함)의 나머지 부분을 제거하고 섬유 아세포 세포 배양 매체 (단계 2.3) 10 ML을 포함하는 10cm 세포 배양 접시에 추가합니다. 5 % CO 2를 함유 한 전형적인 세포 배양 배양기에 넣으십시오. 절차는 7.3 단계에서 계속됩니다.
- 내피 세포가 들어있는 자기 구슬과 튜브에 세척 버퍼 1 ML을 추가합니다.
- 뚜껑을 덮고 자성 선반에서 꺼내어 조심스럽게 4-5 번 위아래로 흔들어서 구슬을 다시 부풀립니다. 튜브를 다시 자기 랙에 넣고 비드가 튜브 벽에 1 분 동안 정착되도록하고 조심스럽게 세척 완충제를 제거합니다.
- 오염을 제거하려면 5 ~ 7 번 세척 단계를 반복하십시오. n내피 세포.
- MV2 내피 세포 배양 매체 1 ML에 구슬에 첨부 된 내피 세포를 Resuspend, 12 잘 접시의 단일 우물에 추가하고 이산화탄소 세포 배양 보육에서 알을 품다.
- 세포가 밤새 붙어서 세포가 반 합류 (보통 5 ~ 7 일) 될 때까지 다음날 다음 2-3 일마다 매체를 교체하십시오.
참고 : 3-4 일 후 전형적인 비 융합 내피 세포 및 7-10 일 후 격리 된 융합 내피 세포를 각각도 3A 및 3B 에 나타내었다. 그런 다음 세포를 트립신 처리 (7.4 절)하고 T25 세포 배양 플라스크에 파종 할 수 있습니다.
- 섬유 아세포의 세척 및 배양 (단계 7.2.6에서 계속)
- 부화 1 시간 후, 매체를 대기음 및 예선 PBS의 적절한 볼륨을 추가하여 세포 배양 접시에 연결된 섬유 아 세포를 씻으십시오. PBS를 흡인하고 반복하십시오2 ~ 3 회 가하고 마지막으로 예열 된 신선한 섬유 아세포 세포 배양 배지를 첨가하십시오.
- 미리 데워진 PBS (이전 단계에서와 같이)와 첨부 된 세포를 다음날 다시 씻고 사전 예열 새로운 매체를 추가합니다. 2-3 일마다 매질을 교체하십시오. 단리 2 일째의 섬유 아세포의 전형적인 표현형을 도 4A 에 나타내었다.
참고 : 섬유 아 세포는 일반적으로 5-7 일 이내에 semi-confluent가되어 trypsinize (7.4 절) 할 준비가되고 계획된 실험에 사용됩니다. 이 과정을 통해 우리는 보통 95-99 %의 순수한 섬유 아세포를 얻습니다. 분리 7 일째의 섬유 아세포의 전형적인 표현형을 도 4B 에 나타내었다.
- 내피 세포 및 섬유 아세포의 트립신 화
- 세포 배양 접시에서 배지를 대기음하고 세포를 덮기에 충분한 예열 PBS를 추가합니다.
- PBS를 대기음에 넣고 충분한 트립신 -EDTA 용액 (각각 0.05 % 및 0.02 %)을 첨가하여 세포를 덮고 th5 분 37 ° C 배양기.
- 1 ML 피펫의 도움으로 세포를 위아래로 pipetting하여 10 % FCS를 추가하여 트립신 행동을 중지하여 세포를 Resuspend.
- RT에서 10 분 동안 250 xg에서 원심 분리하여 세포 현탁액을 펠렛.
- 미리 데워진 세포 배양 배지의 적절한 부피에 세포를 Resuspend.
8. 내피 세포의 특성
참고 : 내피 세포의 순도는 Dil-Ac-LDL 섭취와 폰 빌레 브란트 인자 (vWF)의 면역 염색에 의해 결정됩니다. 세포는 형광 또는 공 촛점 현미경으로 시각화됩니다 ( 그림 3C-3E ).
- 내피 세포에 의한 Dil-Ac-LDL 섭취
- 내피 세포 (7.4 단계)를 Trypsinize하고 12 - 웰 플레이트 (약 10 X 10 4 셀 / cm 2 )에서 유리 coverslips에 하룻밤 그들을 그들을 문화.
- 배지를 대기음과 사전 1 ML로 세포를 씻어무장 한 HBSS.
- HBSS를 대기음 10 μg / ML 딜 -Ac-LDL을 포함하는 1 ML 내피 세포 배양 매체를 추가하고 4 시간 동안 37 ° C 배양기에서 세포를 둡니다.
- 매체를 대기음하고 사전 예열 PBS 3 회와 세포를 씻어서 4 % paraformaldehyde (PFA, PBS에 용해) 1 ML로 그들을 수정. 37 ° C에서 20 분 동안 PFA와 함께 품어 낸다.
참고 : PFA는 부식성이 있습니다. PFA 용액을 취급하는 동안 항상 내산성 장갑을 사용하십시오. - PFA를 대기음, 1 ML PBS 세 번과 12 잘 접시에 coverslip에 세포를 씻고 RT에서 1 시간 동안 핵 얼룩 솔루션 토 - 프로 (10 μM)와 그들을 품어.
참고 : 적절한 필터를 현미경에 사용할 수있는 경우 4 ', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌 (DAPI; 1 μg / mL)을 사용할 수도 있습니다. 이 경우 배양 시간은 10 분으로 줄여야합니다. - 1 ML PBS와 12 잘 접시에 coverslip에 세포를 씻어, PBS를 대기음, 그리고 세 번 단계를 반복하십시오.
- C 가져 가라.12 - 웰 플레이트에서 overslip하고 장착 매체 한 방울과 유리 슬라이드에 탑재. 세포는 형광 / 공 촛점 현미경으로 시각화 할 준비가되었습니다. Dil-Ac-LDL에는 530-560 nm, TO-PRO에는 640 nm, DAPI에는 340-380 nm의 여기 필터를 사용하십시오.
- 폰 빌레 브란트 (vWF) 염색
- 단계 8.1.1에서 설명한대로 내피 세포를 문화.
- 배지를 대기음으로 미리 데워진 HBSS 1 mL로 세포를 헹구십시오. 그 후에 단계 8.1.4에서 설명한대로 4 % PFA로 고정하십시오.
- PFA를 대기음, PBS의 1 ML와 12 잘 접시에 coverslip에 세포를 씻어서 RT에서 20 분 0.1 % 트리톤 X - 100 (PBS에) 1 ML로 permeabilize.
- permeabilizing 솔루션을 대기하고 차단 솔루션 (PBS에 5 % BSA / 5 % FCS)와 세포를 품어.
- humidified 챔버에서 밤새 4 ° C에서 토끼 항 -vWF 항체 (1 : 100)로 세포를 품어. th없이 하나의 coverslip 추가e 1 차 항체를 음성 대조군으로 사용 하였다.
- 1 ML PBS 3 번와 12 잘 접시에 coverslip에 세포를 씻어 내고 당나귀 안티 - 토끼 알렉사 플 루어 488 항체 (1 : 500)와 핵 염색 솔루션 투 - 프로 (10 μm의) 1 시간 동안 세포를 품어 RT에서.
- 1 ML PBS와 12 잘 접시에 coverslip에 세포를 씻어, PBS를 대기음, 그리고 단계를 세 번 반복합니다.
- 12 - 웰 플레이트에서 coverslip을 가지고 마운트 매체 한 방울과 유리 슬라이드에 탑재하십시오. 세포는 형광 / 공 촛점 현미경으로 시각화 할 준비가되었습니다. vWF에는 490 nm, 핵 염색에는 640 nm의 여기 필터를 사용하십시오.
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Representative Results
분리 절차는 계획된 실험에 사용될 수있는 70-80 % 생존 가능하고 막대 모양의 줄무늬 심근 세포 ( 그림 2A 및 2C )의 수율을 초래합니다. 우리의 실험실에서 cardiomyocytes는 일상적으로 칼슘 2 + 신호 분석에 사용됩니다. 그림 5A 는 Fura - AM (5 μm의)와로드 된 cardiomyocytes의 허혈 / reperfusion에 대한 응답으로 세포 내 칼슘 [칼슘 2 + ] 진동을 보여줍니다. 그림 5B 는 ATP (100 μm의)의 추가 후 내피 세포와 섬유 아 세포의 [칼슘 2 + ] i의 변화를 보여줍니다. 다른 심장 세포 유형에서 [Ca 2+ ] i 의 변화를 이전에 설명한대로 분석했습니다. 6 , 11 , 12
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그림 1 : 수정 된 Langendorff 관류 시스템. ( A ) 심장 세포의 격리에 사용 된 전체 Langendorff 관류 시스템 ( B ) 재관류를위한 관류 완충액의 수집에 사용되는 "심장 챔버"에 매달려있는 심장의 확대보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 성인 쥐의 심근 세포. ( A ) laminin 코팅 세포 배양 접시에 도금 2 시간 후 전형적인 막대 모양의 건강한 cardiomyocytes ( B ) 불완전한 조직 소화로 인한 가난한 준비의 전형적인 예. laminin 코팅 세포 배양 접시에 도금 후 2 시간, MO세포의 st는 hypercontracted하고 둥근 모양, 그리고 막대 모양의 cardiomyocytes가 없습니다. 눈금 막대 = 10 μm ( C ) 이전에 설명한대로 액틴 시각화에 대한 얼룩 단일 cardiomyocyte의 공 촛점 현미경. 13 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 쥐 심장 내피 세포. ( A ) 격리 후 3 일 동안 비 융합 내피 세포 단일 층의 위상 - 대조 현미경 사진. 다크 스팟은 여전히 부모 내피 세포에 부착 된 자기 비드입니다. 스케일 바 = 10 μm ( B ) 격리 후 7 일째의 합류 내피 세포 단층의 위상차 현미경 사진 ( C) Dil-Ac-LDL 섭취 (적색) 및 핵 염색 (파란색)을 나타내는 내피 세포의 면역 염색 ( D ) vWF (적색) 및 핵 염색 (청색)의 염색을 보여주는 내피 세포의 면역 염색 ( E ) 2 차 항체 및 핵 염색 (파란색) (스케일 막대 = 50 μm) 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 쥐 심장 섬유 아 세포. ( A ) 격리 2 일째에 전형적인 스핀들 모양의 심장 섬유 아세포. ( B ) 문화의 7 일 후 합류, 순수 섬유 아 세포. ( C ) 상피 세포로 오염 된 불량 제제의 전형적인 예. 화살촉으로 표시된 세포는 심장 상피 세포 . 눈금 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 심장 세포에서 [Ca 2+ ] i의 변화. ( A ) 화학 허혈에 노출 된 쥐의 심근 세포 (Na-cyanate; 2 mM)에서 Fura-2 비율로 측정 한 세포 내 칼슘 [Ca 2+ ] i의 대표적인 추적 결과 재관류 ( B ) 세포 내 칼슘의 변화에 대한 대표적인 추적 지시 된대로 ATP (100 μM)로 처리 한 쥐 심장 내피 세포 및 섬유 아세포에서 Fura-2 비율로 측정 한 [Ca 2+ ] i . >이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기사에서는 심장 근세포, 내피 세포 및 섬유 아세포의 분리 및 배양에 대한 재현 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 단지 하나의 세포 유형에 반대 cardiomyocytes, 내피 세포, 그리고 섬유 아 세포와 같은 심장 조직의 주요 세포 유형의 동시 고품질 분리를 설명합니다. 격리 절차의 중요한 단계는 심장 조직의 적절한 소화입니다. 소화가 불완전하다면 많은 양의 근육 세포가 여전히 얻어 질 수 있지만 품질은 매우 좋지 않으며 대다수는과 농축되어 둥글며 ( 그림 2B ) 실험에서는 아무런 가치가 없습니다. 또한, 내피 세포 및 섬유 아세포의 수율 또한 감소 될 것이다. 이 문제는 소화 시간을 조절하여 해결할 수 있습니다. 관류 시스템에서 심장을 제거하기 전에, 포셉과 손가락의 도움으로 심장의 부드러움을 확인할 수 있습니다. 조직이 아직 눈에 띄지 않으면심장은 추가 5-10 분 동안 관류 될 수 있습니다. 건강한 cardiomyocyte 격리의 두 번째 중요한 단계는 격리 버퍼에서 칼슘 2 + 의 증분 복원입니다. 배지에서 고농도의 Ca 2+ 를 신속하게 복원하면 심장 모양 세포가 둥글게됩니다. 완충액 준비에 사용되는 물의 품질은 심근 세포의 품질에 영향을 미치는 또 다른 중요한 요소입니다. 따라서 양질의 물을 사용하는 것이 좋습니다.
내피 세포의 순도는 세척 단계에 따라 크게 좌우됩니다. EDTA는 비 - 내피 세포가 비드에 비특이적으로 결합하는 것을 막기 위해 세척 완충액에 존재해야한다. 세포 현탁액에 혈구가 존재하면 내피 세포의 수율이 크게 감소합니다. 따라서 심장을 관류 시스템에 장착하고 콜라게나 제를 첨가하기 전에 심장을 적절히 세척하는 것이 매우 중요합니다. 잔여 혈액 성분은 또한 t그는 콜라게나 제 (collagenase)의 활성 때문에 심장의 소화를 방해한다.
섬유 아세포 세포 배양에서 가장 흔한 오염은 상피 세포의 위성 콜로니의 출현이다 ( 그림 4C ). 이 오염은 섬유 아세포의 2 단계 배양으로 피할 수 있습니다. 첫 번째 단계에서 섬유 아세포 세포 배양 배지의 FCS 농도를 5 %로 낮추고 세포 현탁액을 배양기에서 30 분 동안 세포 배양 접시에 부착시킵니다. 상피 세포는 급속히 접착하지만 혈청 농도가 낮은 환경에서는 섬유 아세포 세포 부착 시간이 길어집니다. 배양 30 분 후, 비 - 부착 성 섬유 아 세포를 함유하는 세포 현탁액을 신 세포 배양 접시로 조심스럽게 제거 하였다. 이런 식으로 섬유 아세포의 수율은 감소하지만 순도는 크게 향상됩니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas 및 A. Weber의 기술 지원은 감사하게 생각합니다. 저자는 광범위한 증거 교정과 원고의 언어 편집을 위해 Dr. E. Martinson에게 감사드립니다. 이 연구는 Giessen Anschubsfinanzierung 대학의 M. Aslam과 D. Gündüz 연구원의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
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