Summary
Было разработано и описано несколько протоколов для изоляции различных типов сердечных клеток от сердца крысы. Здесь описан оптимизированный протокол, который позволяет изолировать высококачественные основные типы сердечных клеток (кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты) от одного препарата, что снижает затраты на эксперименты.
Abstract
Крыса является важной моделью животного, используемой в исследованиях сердечно-сосудистой системы, и клетки сердца крыс используются для анализа in vitro молекулярных механизмов прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний, таких как сердечная гипертрофия, фиброз и атеросклероз. Хотя было предпринято несколько попыток с переменным успехом для разработки иммортализованных клеточных линий из сердечно-сосудистой системы, чтобы понять эти клеточные механизмы, первичные клетки предлагают более естественную и близкую к in vivo среду для таких исследований. Поэтому различные лаборатории, работающие на определенном типе клеток, разработали протоколы для изоляции отдельных типов клеток сердечной мышцы крысы, представляющих интерес. Однако протокол, который позволяет изолировать более одного типа ячеек, отсутствует. Здесь описан оптимизированный протокол, который позволяет изолировать высококачественные основные типы сердечных клеток (кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты) от одного препарата и дает возможностьR для клеточного анализа. Это позволяет наиболее эффективно использовать имеющиеся ресурсы, что может сэкономить время и снизить затраты на исследования.
Introduction
Модели грызунов давно используются в качестве инструментов для расширения нашего понимания сердечно-сосудистой физиологии в области здравоохранения и болезней. 1 Хотя эти модели на животных позволяют нам понять патофизиологию заболевания на уровне органа и проанализировать фармакокинетику и фармакодинамику различных фармакологических средств, используемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, понять молекулярные механизмы развития сердечно-сосудистых заболеваний и вклад конкретного Клеточного типа требует использования in vitro моделей клеточных культур. С этой целью были разработаны различные иммортализованные клеточные линии от сердечно-сосудистой системы; 2 , 3, однако, свежевыделенные первичные клетки физиологически и функционально более релевантны живым тканям и организмам.
Сердце - это универсальный орган, содержащий все основные типы клеток сердечно-сосудистой системыИ сердце крысы по-прежнему является широко используемой моделью для понимания сердечно-сосудистой физиологии. В течение последних нескольких десятилетий были описаны различные способы выделения отдельных типов клеток из сердечной ткани; 4 , 5 , 6 , 7, однако эти методы фокусируются только на выделении одного конкретного типа клеток, что приводит к потере других типов клеток, которые больше не могут использоваться для клеточного анализа. Здесь описывается оптимизированный протокол, который позволяет одновременно и качественно изолировать основные типы клеток сердечной ткани, то есть кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. Все эти типы клеток могут быть использованы в различных экспериментальных установках 8 , 9 , 10 и для анализа взаимодействия между клетками одного и того же животного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование соответствует Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH № 85-23 1985) и была одобрена местным комитетом по этике Университета Гиссена. В этом исследовании использовали взрослых самцов крыс Wistar массой 200 - 250 г.
1. Автоклавирование
- По меньшей мере за один день до процедуры необходимо автоклавировать все хирургические инструменты, наконечники пипеток и пипетки Пастера для использования в процедуре изоляции при 121 ° C в течение 30 минут.
2. Подготовка носителей и решений
ПРИМЕЧАНИЕ. Решения, полученные на этапах 2.1-2.4, могут быть подготовлены за неделю до изоляции и сохранены при температуре 4 ° C, но готовят растворы на этапах 2.5-2.8 в день изоляции. Полные рецепты буферов и носителей приведены в таблице 1 . Нагрейте все среды и растворы до 37 ° C вВодяной бане перед началом приготовления.
- Подготовьте среду Пауэлла, растворяя химикаты, перечисленные в таблице 1, в 4,5 л H 2 O при комнатной температуре (RT). Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью 2,0 N NaOH и доведите объем до 5,0 л. Стерильный фильтр отфильтруйте и сохраните при 4 ° С.
- Приготовить среду для креатина, L-карнитина и таурина (CCT) путем растворения порошкообразной среды M199 в 4,5 л H 2 O. Добавить порошок HEPES в соответствии с таблицей в среду и перемешивать в течение 15 мин. Добавьте креатин, карнитин, таурин и Ara-C согласно таблице 1 . Хорошо перемешайте, доведите pH с помощью pH-метра до 7,4 с помощью 2,0 N NaOH и доведите объем до 5,0 л. Стерильный фильтр и храните при 4 ° С.
- Подготовьте клеточную культуральную среду для фибробластов, добавив 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 2% пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep) в среду M199. DMEM в равной степени подходит как M199 и может также использоваться для культивирования клеток фибробластов.
- Подготовить культуру клеток MV2Е среду для эндотелиальных клеток путем добавления всего содержимого добавки в основную среду MV2 в соответствии с инструкциями производителя. Возьмите аликвоту по 5 мл и согреть ее до 37 ° С на водяной бане.
- Готовят буфер для выделения эндотелиальных клеток путем растворения 0,05 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 50 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и добавления к нему 0,5 мл 200 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Стерильный фильтр это и хранить его при температуре 4 ° C.
- Подготовьте буфер для промывания эндотелиальных клеток, добавив 0,1 мл 200 мМ к 9,9 мл PBS и сохраните его при 4 ° С.
- Готовят раствор коллагеназы, растворяя 27 мг коллагеназы в 5 мл среды Пауэлла и добавляя к ней 12,5 мкл раствора 100 мМ CaCl 2 . Нагревают до 37 ° С на водяной бане.
- Подготовьте инкрементные растворы для восстановления Ca 2+ 1, 2 и 3 для кардиомиоцитов, добавив 12,5 мкл, 25 мкл и 120 мкл 100 мМ раствора CaCl 2Иона до 6 мл, 6 мл и 12 мл среды Пауэлла соответственно.
- Предварительно покрыть чашки для культивирования клеток для кардиомиоцитов за день до выделения, добавив 1 мл среды для предварительного покрытия, содержащей ламинин, в каждую чашку для культивирования клеток 35 мм. Инкубируйте их в инкубаторе с клеточной культурой при 37 ° С в течение ночи.
3. Подготовка магнитных шариков
- Поместите 0,5 мл буфера для выделения эндотелиальных клеток в пробирку для образца 1,5 мл на льду.
- Добавить 5 мкл (2 × 10 6 ) магнитных шариков мыши IgG для сковороды и хорошо перемешать.
- Поместите трубку в магнитную стойку на 1 мин. Бусины прилипают к стенке трубки к магниту. Тщательно удалите супернатант с 1 мл пипетки.
- Повторите промывку еще дважды и, наконец, повторно суспендируйте шарики в 50 мкл буфера для выделения эндотелиальных клеток и сохраняйте при 4 ° C до использования.
4. Подготовка системы перфузии Лангендорфа
- Чистый тСистеме Лангендорфа путем перфузии с 2 л дистиллированной воды.
- Проведите 50 мл среды Пауэлла через систему в течение 5 мин и выбросьте среду.
- Добавить 80 мл свежей среды Пауэлла. Непрерывно перфузируйте его «карбогеном», пузыря с помощью стеклянной пипетки Пастера из газового баллона. Позвольте среде рециркулировать через систему. Теперь система готова перфузировать сердце ( рис. 1А ).
5. Вскрытие крысы
- Поместите крысу в эксикатор емкостью 5 л под вытяжной колпак и добавьте 1,5 мл 4-5% изофлурана через вентиляционное отверстие и закройте крышку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите животное на повышенную перфорированную пластину внутри эксикатора, чтобы избежать непосредственного контакта животного с жидким изофлураном. - Подождите, пока крыса не потеряет свой рефлекс на крышку (обычно ~ 5 мин), а затем выведите крысу из эксикатора. Усыпите крысу шейным вывихом.
- Сократите брюшную кожу и нижний горизонтальный мускулВ середине с помощью пары острых ножниц. После этого разрежьте мышцу вертикально на грудную клетку крысы и откройте грудную клетку. Удалите сердце вместе с легкими и немедленно поместите органы в охлажденный льдом 0.9% раствор NaCl.
- Удалите легкие с помощью ножниц и выбросьте их. Очистите сердце любой соединительной ткани и разрежьте аорту каудально на ветви брахиоцефального ствола.
6. Перфузия сердца и пищеварение с помощью коллагеназы
- Смонтируйте сердце через аорту в перфузионной системе Лангендорфа (раздел 4), используя две пары тонких изогнутых щипцов. Чтобы обеспечить перфузию миокарда ретроградным способом, поместите конец канюли перфузионной системы между первой ветвью аорты и аортальным клапаном. Закрепите аорту с помощью зажима крокодила.
- Закрепите сердце хирургическим швом и снимите зажим крокодила ( Рисунок 1B ).
- Откройте клапан канюли, чтобы позволить перфузионной среде (35 мл) пройти через сердце по капле (60 капель / мин, 5 мл / мин), чтобы вымыть остаточную кровь. Отмените любые проходы на данном этапе.
ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте образования пузырьков воздуха на любой стадии перфузии, так как это приведет к неполному перевариванию и отказу процедуры выделения клеток. - Поместите висячее сердце в собирательную воронку (камера сердца, рис. 1В ) и запустите перистальтический насос, который будет рециркулировать перфузионную среду из воронки-коллектора в резервуар ( рис. 1А ).
- Добавить раствор коллагеназы (с этапа 2.8) в перфузионную среду. Perfuse сердца с рециркуляции коллагеназы решение в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг очень важен для оптимизации выхода клеток. Время перфузии зависит от активности коллагеназы, которая может варьироваться в зависимости от партии. Испытайте 3-4 партии коллагеназы, чтобы найти ту, у которой optiМалая активность; То могут быть приобретены большие партии наилучшей подходящей партии, достаточные по меньшей мере для одного года для воспроизводимых результатов. - В конце периода пищеварения прекратите перфузию, удалите сердце из системы Лангендорфа, используя ножницы, и поместите его в стеклянную чашку Петри.
- Отрежьте и выбросьте оба предсердия, и удалите все оставшиеся жировые ткани. Тщательно слезьте перикард с помощью двух пар щипцов, чтобы избежать загрязнения эпителиальных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Перикард может быть дополнительно обработан коллагеназой для получения чистых кардиальных эпителиальных клеток, если это необходимо. Подробный протокол не приводится в настоящем исследовании, поскольку это выходит за рамки настоящего протокола. - Сократите сердце вниз серединой с ножницами и поместите это в измельчитель ткани. Минс сердце 2-3 раза и повторно приостановить рубленого ткани в 12 мл буфера для пищеварения от перфузии Langendorff.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не обрезайте hEart чрезмерно, поскольку это приведет к увеличению доли мертвых кардиомиоцитов. - Перенесите измельченную ткань в 15 мл среды, содержащей коллагеназу, и дайте ей перевариваться на водяной бане в течение 5-10 минут с периодическим перемешиванием путем повторной суспензии, используя 5 мл одноразовой пластиковой пипетки.
- В конце периода пищеварения отфильтруйте суспензию клеток через сито 100 мкм. Удалите остатки тканей и непереваренный материал.
- В конце перфузии Лангендорфа немедленно промойте систему перфузии минимальным количеством 1 л дистиллированной воды. Перфуза системы путем рециркуляции 100 мл 0,1 N NaOH в течение 30 мин и, наконец, промыть систему 2-3 л дистиллированной воды. Высушите систему продувкой воздуха и закройте отверстие пара-пленкой.
7. Крысиная изоляция сердечной клетки
- Выделение и культивирование кардиомиоцитов
- Центрифугация клеточной суспензии при 25 xg в течение 1 мин (без BrAkes) для осаждения кардиомиоцитов. Кардиомиоциты можно также разрешить оседать в течение 10 мин при RT без центрифугирования.
- Тщательно удалите супернатант, содержащий эндотелиальные клетки и фибробласты, с помощью одноразовой пластиковой пипетки в новой 50 мл пробирке.
- Ресуспендируют гранулу кардиомиоцитов в растворе Ca 2+ 6 мл 1 (стадия 2.9). Разрешить 1 мин для клеток, чтобы приспособиться к низкой концентрации Ca 2+ окружающей среды, и центрифугировать суспензию клеток снова при 25 xg в течение 1 минуты (без тормозов).
- Отбрасывают супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 6 мл раствора Ca 2+ 2 (стадия 2.9). Дайте клеткам 1 мин довести до промежуточной концентрации Ca 2+ и, наконец, добавьте 12 мл раствора Ca 2+ 3 (стадия 2.9) в клетки. Смешать с помощью одноразовой пластиковой пипетки.
- Центрифуга клеточной суспензии при 25 мкг в течение 1 мин.
- Отбросьте супернатант и ресуспендируйте клетки в 20 мл предварительноНагретая среда ЧМТ. Добавьте 1 мл клеточной суспензии к каждой из 20 стерильных 35-миллиметровых чашек для культивирования клеток, предварительно покрытых ламинином (стадия 2.9), и дайте клеткам прикрепиться в течение 2 ч в инкубаторе без CO 2 для культивирования клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Кардиомиоциты можно также культивировать в среде CO 2 ; Однако в этом случае следует использовать среды с бикарбонатной буферной системой. - Через 2 часа замените среду новыми 2 мл среды ССТ для удаления мертвых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки готовы для любых запланированных экспериментов и могут культивироваться в течение 3 дней в типичном инкубаторе для клеточной культуры (без CO 2 ) без значительной потери живых клеток. Типичные здоровые стержневидные кардиомиоциты показаны на рисунке 2А .
- Выделение эндотелиальных клеток и фибробластов
- Центрифуга супернатант, содержащий эндотелиальных клеток и фибробластов (из шага 7.1.2) при 250 xg в течение 10 мин.
- ОтменитьRnatant и ресуспендируют клеточный осадок в 1,5 мл буфера для выделения эндотелиальных клеток в пробирке для образцов объемом 2 мл.
- Добавить 3 мкг (1: 500) мышиного анти-крысиного CD31-антитела к клеточной суспензии и инкубировать его при 4 ° С в течение 30 мин с вращением от конца до конца.
ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется титрование антитела для оптимального разбавления. Эта стадия должна быть проведена при 4 ° C, так как при RT быстрое усвоение антител эндотелиальными клетками приведет к низкому урожаю. - Добавьте заранее приготовленные (раздел 3) пан-антимышиные IgG-шарики к суспензии клеток и инкубируйте в течение 20 мин при 4 ° С с вращением от конца до конца.
ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы мышиное антитело против CD31 мыши может быть предварительно прикреплено к магнитным гранулам и затем добавлено в клеточную суспензию. Однако это увеличит время инкубации шариков с клеточной суспензией и может привести к увеличению неспецифического связывания неэндотелиальных клеток и, следовательно, к более высокому загрязнению других типов клеток. - В конце времени инкубации антитела помещают пробирку, содержащую суспензию клеток, в магнитную стойку и дают 2 мин для осаждения магнитных шариков, прикрепленных к эндотелиальным клеткам, на сторону трубки.
- Осторожно удалите остальную суспензию клеток (содержащую в основном фибробласты), используя 1 мл пипетку и добавьте ее в 10-см клеточную культуральную чашку, содержащую 10 мл среды для культивирования клеток фибробластов (шаг 2.3). Поместите его в типичный инкубатор культуры клеток, содержащий 5% CO 2 . Процедура продолжается на шаге 7.3.
- Добавить 1 мл промывочного буфера в пробирку с магнитными шариками, содержащими эндотелиальные клетки.
- Закройте пробирку, снимите ее с магнитной стойки и осторожно перемасштабируйте бисер, слегка встряхивая вверх и вниз 4 - 5 раз. Поместите трубку снова в магнитную стойку, дайте бусинам оседать на стенке трубки в течение 1 минуты и осторожно снимите промывочный буфер.
- Повторите шаги промывки 5 - 7 раз, чтобы избавиться от загрязнений nНа-эндотелиальных клетках.
- Ресуспендируют эндотелиальные клетки, прикрепленные к шарикам, в 1 мл культуральной среды эндотелиальных клеток MV2, добавляют в одну лунку 12-луночного планшета и инкубируют в культуральном инкубаторе с CO 2 .
- Разрешить клетки для прикрепления на ночь и изменить среду на следующий день, а затем каждые 2-3 дня, пока клетки становятся полуконфлюэнтными (как правило, 5-7 дней).
ПРИМЕЧАНИЕ. Типичные неконфлюэнтные эндотелиальные клетки через 3 - 4 дня и сливные эндотелиальные клетки после 7-10 дней изоляции показаны на фиг.3А и 3В соответственно. Затем клетки могут быть трипсинизированы (раздел 7.4) и засеяны в колбу для культуры клеток Т25.
- Промывка и культивирование фибробластов (продолжение с шага 7.2.6)
- После 1 ч инкубации аспирируют среду и промывают фибробласты, прикрепленные к чашке для культивирования клеток, добавляя соответствующий объем предварительно нагретого PBS. Аспирируйте PBS и повторите процедуруТЭП 2-3 раза и, наконец, добавить предварительно подогретую среду для культивирования клеток фибробластов.
- Смытые клетки снова на следующий день снова подогревают PBS (как на предыдущем этапе) и добавляют предварительно нагретую свежую среду. Меняйте среду каждые 2-3 дня. Типичный фенотип фибробластов на 2-й день изоляции показан на фиг. 4А .
ПРИМЕЧАНИЕ. Фибробласты становятся полуконфлюэнтными обычно в течение 5-7 дней и затем готовы к трипсинизации (раздел 7.4) и используются для запланированных экспериментов. При этой процедуре мы обычно получаем чистые фибробласты на 95-99%. Типичный фенотип фибробластов на 7-й день изоляции показан на рисунке 4B .
- Трипсинизация эндотелиальных клеток и фибробластов
- Аспирируйте среду из чашки для культивирования клеток и добавьте достаточное количество предварительно подогретого PBS для покрытия клеток.
- Аспирируют PBS и добавляют достаточное количество раствора трипсина-ЭДТА (0,05% и 0,02%, соответственно), чтобы покрыть клетки и поместить в thИнкубатор 37 ° C в течение 5 мин.
- Ресуспендируйте клетки, пипетируя клетки вверх и вниз с помощью 1 мл пипетки и прекратите действие трипсина, добавляя 10% FCS.
- Гранулировали суспензию клеток центрифугированием при 250 xg в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют клетки в соответствующем объеме предварительно нагретой клеточной культуральной среды.
8. Характеристика эндотелиальных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота эндотелиальных клеток определяется поглощением Dil-Ac-LDL и иммуноокрашиванием фактора фон Виллебранда (vWF). Клетки визуализируют с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии ( фигуры 3C-3E ).
- Прием Dil-Ac-LDL эндотелиальными клетками
- Трипсинизируют эндотелиальные клетки (шаг 7.4) и культивируют их в течение ночи на покровных стеклах в 12-луночном планшете (приблизительно 10 × 10 4 клеток / см 2 ).
- Аспирируйте среду и промойте клетки с 1 мл предварительно-wВооруженный HBSS.
- Аспирируйте HBSS и добавьте 1 мл культуральной среды для эндотелиальных клеток, содержащей 10 мкг / мл Dil-Ac-LDL, и оставьте клетки в инкубаторе при 37 ° C в течение 4 часов.
- Аспирируют среду и ополаскивают клетки предварительно подогретым PBS три раза и фиксируют их 1 мл 4% параформальдегида (PFA, растворенного в PBS). Инкубируйте их с PFA при 37 ° C в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: PFA является коррозионным; Всегда используйте кислотостойкие перчатки при работе с раствором PFA. - Аспирируйте PFA, промывайте клетки покровным в 12-луночном планшете 1 мл PBS трижды и инкубируйте их с окрашивающим ядерным раствором TO-PRO (10 мкМ) в течение 1 часа при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если для микроскопа доступен подходящий фильтр, можно также использовать 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 1 мкг / мл). В этом случае время инкубации должно быть уменьшено до 10 мин. - Промойте клетки на покровном в 12-луночный планшет с 1 мл PBS, аспирации PBS, и повторите шаг в три раза.
- Возьмите cВыскользните из 12-луночного планшета и установите его на предметное стекло с каплей монтажной среды. Клетки готовы визуализироваться под флуоресцентным / конфокальным микроскопом. Используйте фильтр возбуждения 530-560 нм для Dil-Ac-LDL, 640 нм для TO-PRO и 340-380 нм для DAPI.
- Окрашивание фон Виллебрандом (vWF)
- Культурируйте эндотелиальные клетки, как описано на этапе 8.1.1.
- Аспирируют среду и промывают клетки 1 мл предварительно нагретого HBSS; После этого фиксируют 4% PFA, как описано на шаге 8.1.4.
- Аспирируйте PFA, промойте клетки на покровном стекле 12-луночного планшета 1 мл PBS дважды и пропертибите клетки 1 мл 0,1% Triton X-100 (в PBS) в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Аспирируйте проницаемый раствор и инкубируйте клетки с блокирующим раствором (5% BSA / 5% FCS в PBS) в течение 1 часа.
- Инкубируйте клетки с кроличьим анти-vWF антителом (1: 100) при 4 ° С в течение ночи во влажной камере. Добавить покровное стекло безПервичное антитело как отрицательный контроль.
- Промывайте клетки на покровном стекле 12-луночного планшета 1 мл PBS три раза и инкубируйте клетки с антителом Alexa Fluor-488 осла антитела против кролика (1: 500) и окрашивающим раствором TO-PRO (10 мкМ) в течение 1 часа При RT.
- Промойте клетки на покровном в 12-луночный планшет с 1 мл PBS, аспирации PBS, и повторите шаг три раза.
- Выньте покровное стекло из 12-луночного планшета и установите его на предметное стекло с каплей монтажной среды. Клетки готовы визуализироваться под флуоресцентным / конфокальным микроскопом. Используйте фильтр возбуждения 490 нм для vWF и 640 нм для ядерного окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедура выделения приводит к урожаю 70-80% жизнеспособных, стержневидных, поперечнополосатых кардиомиоцитов ( рис. 2А и 2С ), которые могут быть использованы для запланированных экспериментов. В нашей лаборатории кардиомиоциты регулярно используются для анализа передачи сигналов Ca 2+ . На фиг.5А показаны внутриклеточные кальциевые [Ca 2+ ] i колебания в ответ на ишемию / реперфузию в кардиомиоцитах, загруженных Fura-AM (5 мкМ). На фиг.5B показаны изменения в [Ca 2+ ] i в эндотелиальных клетках и фибробластах после добавления АТФ (100 мкМ). Изменения в [Ca 2+ ] i в разных типах клеток сердца анализировались, как описано ранее. 6 , 11 , 12
Re 1 "src =" / files / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Модифицированная система перфузии Лангендорфа. ( A ) Вся система перфузии Лангендорфа, используемая для изоляции клеток сердца ( B ). Увеличенный вид висячего сердца в «камере сердца» также использовался для сбора перфузионного буфера для рециркуляции. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Кардиомиоциты взрослых крыс. ( A ) Типичные палочковидные здоровые кардиомиоциты через 2 часа после посева в чашках для культивирования клеток с ламинином ( B ) Типичный пример плохого приготовления из-за неполного тканевого пищеварения. Через 2 ч после высевания в чашках для культивирования клеток, покрытых ламинином, moЙ клетки гиперконтрагированы и выглядят округлыми, а кардиомиоцитов в виде стержней мало. Шкала шкалы = 10 мкм ( C ) Конфокальная микрофотография одиночного кардиомиоцита, окрашенная для визуализации актина, как описано ранее. 13 Масштаб шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Крысиные сердечные эндотелиальные клетки. ( A ) Фазоконтрастная микрография монослоя не слившихся эндотелиальных клеток через 3 дня после выделения. Темные пятна - это магнитные шарики, которые все еще прикреплены к родительским эндотелиальным клеткам. Шкала шкалы = 10 мкм ( B ) Фазоконтрастная микрофотография монослоя слившихся эндотелиальных клеток через 7 дней после выделения ( C) Иммунное окрашивание эндотелиальных клеток, демонстрирующих поглощение Dil-Ac-LDL (красный) и ядерное окрашивание (Blue) ( D ) Иммунное окрашивание эндотелиальных клеток с окрашиванием vWF (красным) и ядерным окрашиванием (Blue) ( E ) Клетки инкубируют только с вторичными антителами И ядерное окрашивание (синий цвет) (Шкала масштабирования = 50 мкм). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Крысиные сердечные фибробласты. ( A ) типичные веретенообразные сердечные фибробласты на второй день изоляции. ( B ) Конфлюэнтные чистые фибробласты после 7 дней культивирования. ( C ) Типичный пример плохого препарата, загрязненного эпителиальными клетками. Клетки, обозначенные стрелками, представляют собой эпителиальные клетки сердца , Шкала шкалы = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Изменения в [Ca 2+ ] i в сердечных клетках. ( A ) Репрезентативные данные об изменениях внутриклеточного кальция [Ca 2+ ] i, измеренных отношением Fura-2 в кардиомиоцитах крыс, подвергнутых химической ишемии (Na-цианат, 2 мМ), с последующей реперфузией ( B ). Репрезентативные данные об изменениях внутриклеточного кальция [Ca 2+ ] i измеряли по соотношению Fura-2 в эндотелиальных клетках сердца крыс и фибробластах, обработанных АТФ (100 мкМ), как указано. > Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описан воспроизводимый протокол для изоляции и культивирования сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов. Этот протокол описывает одновременное и высокое качество изоляции основных типов клеток сердечной ткани, то есть кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, в отличие от одного типа клеток. Критическим шагом в процессе изоляции является надлежащее переваривание сердечной ткани. Если пищеварение неполное, может быть получено еще большое количество миоцитов, но их качество очень низкое, и они в основном гиперконтрагированы и округлы ( рис. 2Б ) и не имеют ценности в экспериментах. Более того, выход эндотелиальных клеток и фибробластов также будет снижен. Эта проблема может быть решена путем контроля времени вываривания. Перед удалением сердца из перфузионной системы, мягкость сердца можно проверить с помощью щипцов и кончиков пальцев. Если ткань все еще не заметно sЧасто сердце можно перфузировать в течение дополнительных 5-10 мин. Вторым критическим шагом в выделении здоровых кардиомиоцитов является инкрементное восстановление Са 2+ в буферных растворах. Быстрое восстановление высоких концентраций Ca 2+ в средах приведет к округлению кардиомиоцитов. Качество воды, используемой для приготовления буферов, является еще одним важным фактором, влияющим на качество кардиомиоцитов. Поэтому рекомендуется использовать воду хорошего качества.
Чистота эндотелиальных клеток сильно зависит от стадий промывки. ЭДТА должна присутствовать в промывочном буфере, чтобы предотвратить неспецифическое связывание неэндотелиальных клеток с магнитными гранулами. Наличие клеток крови в суспензии клеток значительно снижает выход эндотелиальных клеток; Поэтому правильное промывание сердца очень важно после установки сердца в перфузионной системе и перед добавлением коллагеназы. Остаточные компоненты крови также уменьшают тАктивность коллагеназы и, следовательно, затрудняет пищеварение сердца.
Наиболее распространенным загрязнением в культуре клеток фибробластов является появление спутниковых колоний эпителиальных клеток ( рисунок 4C ). Этого загрязнения можно избежать путем двухступенчатого культивирования фибробластов. На первой стадии концентрацию FCS в культуральной среде фибробластов снижают до 5% и клеточной суспензии дают возможность прилипать к чашке для культивирования клеток в течение 30 мин в инкубаторе. Эпителиальные клетки быстро адгезируют, но время адгезии фибробластов увеличивается в присутствии низкой концентрации сыворотки. После 30 мин инкубации клеточная суспензия, содержащая неадгезивные фибробласты, осторожно удаляется в новую чашку для культивирования клеток. Таким образом, выход фибробластов может быть уменьшен, но их чистота значительно повышается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего декларировать.
Acknowledgments
С благодарностью признается техническая поддержка Л. Ринальди, С. Шеффера, Д. Рейтца, Х. Томаса и А. Вебера. Авторы также хотели бы поблагодарить доктора Э. Мартинсона за обширное чтение корректуры и редактирование текста рукописи. Исследование было поддержано грантом Университета Гиссена Аншубсфинансирунг для М. Аслама и Д. Гюндюза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
