Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55601
Automatic Translation
1, 1, 1
1Internal Medicine, Cardiology and Angiology, University Hospital Giessen

Summary

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

Abstract

החולדה היא מודל חייתי חשוב המשמש במחקר לב וכלי דם, תאי חולדה חולדה משמשים באופן שגרתי לניתוח במבחנה של המנגנונים המולקולריים של התקדמות מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה לבבית, פיברוזיס וטרשת עורקים. למרות מספר ניסיונות עם הצלחה משתנה נעשו לפתח שורות תאים נצח מן המערכת הלב וכלי הדם כדי להבין את המנגנונים הסלולר, תאים ראשוניים מציעים סביבה טבעית קרוב יותר in vivo עבור מחקרים כאלה. לכן, מעבדות שונות העובדות על סוג תא מסוים פיתחו פרוטוקולים לבודד סוגים בודדים של תאי חולדה מעניינים של עניין. פרוטוקול המאפשר בידוד של יותר מסוג תא אחד, עם זאת, חסר. כאן פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של באיכות גבוהה סוגי תאים לב גדולים (cardiomyocytes, תאי האנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת ומאפשרתR לניתוחים סלולריים. זה מאפשר שימוש יעיל ביותר של המשאבים הזמינים, אשר עשוי לחסוך זמן ולצמצם עלויות מחקר.

Introduction

מודלים מכרסמים כבר זמן רב שימשו כלים כדי להרחיב את ההבנה שלנו של פיזיולוגיה לב וכלי דם בבריאות ומחלות. 1 למרות שמודלים אלו מאפשרים לנו להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלה ברמת האורגן ולנתח את הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של סוכני תרופה שונים המשמשים לטיפול במחלות לב וכלי דם, הבנה של המנגנונים המולקולריים של התפתחות מחלות לב וכלי דם ותרומתו של גורם מסוים סוג התא דורש שימוש במודלים תרבות תאים חוץ גופית . לשם כך פותחו קווי תאים שונים הנפתחים ממערכת הלב וכלי הדם; 2 , 3 עם זאת, תאים מבודדים טרי טרי הם פיזיולוגית ופונקציונלית רלוונטי יותר רקמות חיות אורגניזמים.

הלב הוא איבר צדדי המכיל את כל סוגי התאים העיקריים של הלב וכלי הדםYstem, ואת הלב חולדה הוא עדיין מודל נפוץ להבנת פיזיולוגיה של הלב וכלי הדם. במהלך העשורים האחרונים, שיטות שונות לבידוד של סוגי תאים בודדים מרקמת הלב תוארו; 4 , 5 , 6 , 7 עם זאת, שיטות אלה מתמקדים רק על בידוד של סוג תא מסוים אחד וכתוצאה מכך אובדן סוגים אחרים של תאים שאינם יכולים לשמש עוד לניתוח הסלולר. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד בו זמנית באיכות גבוהה של סוגי תאים עיקריים של רקמת הלב, כלומר cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts. כל סוגי תאים אלה ניתן להשתמש setups ניסיוני שונים 8 , 9 , 10 ו לניתוח של תא אינטראקציות התא מאותו בעל חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

החקירה תואמת את המדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים בארה"ב (פרסום NIAH 85-23 1985) ואושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת גיסן. עכברים Wistar גברים בוגר במשקל 200-200 גרם שימשו במחקר זה.

1. מעוקר

  1. לפחות יום אחד לפני ההליך הוא להתבצע, החיטוי כל כלי ניתוח, טיפים פיפטה, ו pipettes פסטר לשמש בהליך בידוד על 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

2. הכנת מדיה ופתרונות

הערה: ניתן להכין פתרונות מ - 2.1-2.4 עד שבוע לפני הבידוד ומאוחסנים ב 4 ° C, אך מכינים את הפתרונות במדרגות 2.5-2.8 ביום הבידוד. המתכונים המלאים של המאגרים והמדיה מוצגים בטבלה 1 . חם כל התקשורת ופתרונות ל 37 מעלות צלזיוס באמבטיה לפני תחילת ההכנה.

  1. הכן בינוני פאוול על ידי המסת הכימיקלים המפורטים בטבלה 1 ב 4.5 L של H 2 O בטמפרטורת החדר (RT). התאם את ה- pH 7.4 עם 2.0 N NaOH, ולהביא את עוצמת הקול ל 5.0 L. מסנן סטרילית הפתרון, ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן קריאטין, L- קרניטין, וטאורין (CCT) בינוני על ידי המסת בינוני אבקת M199 ב 4.5 L של H 2 O. הוסף אבקה HEPES על פי הטבלה בינוני ולערבב במשך 15 דקות. הוסף קריאטין, קרניטין, טאורין וערה-C על פי טבלה 1 . מערבבים היטב, להתאים את ה- pH עם מטר pH 7.4 עם 2.0 N NaOH, ולהביא את עוצמת הקול ל 5.0 L. מסנן סטרילי חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו בינוני תרבות התא עבור fibroblasts על ידי הוספת 10% עגל בסרום בסרום (FCS) ו 2% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפט) כדי M199 בינוני. DMEM מתאים באותה מידה כמו M199 והוא יכול לשמש גם לתרבות תאים fibroblast.
  4. הכן תרבית תאים MV2בינוני עבור תאי האנדותל על ידי הוספת כל התוכן של תערובת תוספת בינוני בינוני MV2 בהתאם להוראות היצרן. קח 5 aliquot מ"ל וחמם אותו 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  5. הכנת חיץ בידוד האנדותל התא על ידי המסת 0.05 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA) ב 50 מ"ל של תמיסת מלח Hanks מאוזן (HBSS) והוספת 0.5 מ"ל של 200 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון זה. מסנן סטרילי זה ולאחסן אותו ב 4 ° C.
  6. הכנת חיץ לשטוף תא האנדותל על ידי הוספת 0.1 מ"ל של 200 מ"מ ל 9.9 מ"ל של PBS ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. הכן פתרון collagenase על ידי המסת 27 מ"ג של collagenase ב 5 מ"ל של מדיום Powell והוספת 12.5 μL של 100 מ"מ CaCl 2 פתרון זה. חם עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  8. הכן מצטבר Ca 2 + פתרונות שיקום 1, 2, ו 3 עבור cardiomyocytes על ידי הוספת 12.5 μL, 25 μL, ו 120 μL של 100 מ"מ CaCl 2 solutיון ל 6 מ"ל, 6 מ"ל, ו 12 מ"ל של מדיום פאוול, בהתאמה.
  9. טרום המעיל מנות תרבות התא עבור cardiomyocytes יום לפני הבידוד על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום ציפוי מראש המכיל laminin לכל 35 מ"מ צלחת תרבות התא. דגירה אותם בתא תרבות חממה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

3. הכנת חרוזים מגנטיים

  1. מקום 0.5 מ"ל של חיץ בידוד תא האנדותל בצינור מדגם 1.5 מ"ל על הקרח.
  2. הוסף 5 μL (2 x 10 6 ) של מחבת עכבר IgG חרוזים מגנטיים ומערבבים היטב.
  3. מניחים את הצינור במעמד מגנטי במשך 1 דקות. החרוזים ידבקו לקיר הצינור לכיוון המגנט. בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה 1 מ"ל.
  4. חזור על הכביסה פעמיים נוספות ולבסוף מחדש להשעות את החרוזים 50 חיץ בידוד האנדותל μL בידוד לחנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

הכנת מערכת Langendorff זלוף

  1. נקה tהוא מערכת Langendorff ידי זלוף עם 2 L של מים מזוקקים.
  2. להפיץ 50 מ"ל של מדיום פאוול דרך המערכת במשך 5 דקות וזורקים את המדיום.
  3. הוסף 80 מ"ל מדיום פאוול טרי. ברציפות perfuse זה עם "carbogen" על ידי מבעבע עם כוס פיפטה פסטר מגליל הגז. תן בינוני recirculate דרך המערכת. המערכת מוכנה כעת perfuse הלב ( איור 1 א ).

5. דיסקציה של החולדה

  1. מניחים את החולדה ב 5 l desiccator מתחת למכסה המנוע קטר ולהוסיף 1.5 מ"ל של isoflurane 4-5% דרך פתח האוורור, ולסגור את המכסה.
    הערה: מניחים את החיה על צלחת מחורר גבוה בתוך desiccator, כדי למנוע מגע ישיר של החיה עם isoflurane נוזלי.
  2. חכה עד חולדה מאבד רפלקס מכסה שלה (בדרך כלל ~ 5 דקות), ולאחר מכן לקחת את החולדה מתוך desiccator. להרדים את החולדה על ידי נקע צוואר הרחם.
  3. חותכים את העור הבטן ואת השרירים הבסיסיים horizontברית באמצע באמצעות זוג מספריים חדים. לאחר מכן, לחתוך את השרירים אנכית אל עצם החזה של החולדה ולפתוח את בית החזה. הסר את הלב יחד עם הריאות ומיד למקם את האיברים קר כקרח 0.9% פתרון NaCl.
  4. הסר את הריאות בעזרת זוג מספריים וזורקים אותם. נקו את הלב של כל רקמת חיבור, וחתכו את אבי העורקים caudally על הענף של גזע brachiocephalic.

6. זלוף של הלב העיכול עם Collagenase

  1. הר את הלב באמצעות אבי העורקים במערכת זלוף Langendorff (סעיף 4) באמצעות שני זוגות של מלקחיים דקים, מעוקל. על מנת להבטיח כי שריר הלב הוא perfused באופן מדרדר, במקום הקצה של צינורית של מערכת זלוף בין ענף אבי העורקים הראשון ואת שסתום אבי העורקים. תקן את אבי העורקים באמצעות מהדק תנין.
  2. תקן את הלב עם תפר כירורגי, ולהסיר את התנין מהדק ( איור 1 ב ).
  3. פתח את שסתום של צינורית כדי לאפשר המדיום זלוף (35 מ"ל) לעבור דרך הלב ירידה חכם (60 טיפות / min, 5 מ"ל / דקה) לשטוף את כל הדם שיורית. מחק את כל זרימת דרך בשלב זה.
    הערה: הימנע היווצרות של בועות אוויר בכל שלב של זלוף כמו זה יגרום לעיכול שלם כשל של הליך בידוד התא.
  4. מניחים את הלב התלוי במשפך איסוף (תא הלב, איור 1B ) ולהתחיל את המשאבה peristaltic, אשר יהיה recirculate המדיום זלוף מן המשפך איסוף למאגר ( איור 1 א ).
  5. מוסיפים את הפתרון collagenase (משלב 2.8) למדיום זלוף. Perfuse את הלב עם פתרון collagenase recirculase למשך 30 דקות.
    הערה: שלב זה הוא קריטי מאוד עבור אופטימיזציה של תשואה התא. זמן זלוף תלוי בפעילות של collagenase, אשר עשוי להשתנות בהתאם אצווה. מבחן 3-4 אצוות של collagenase למצוא את אחד עם Optiפעילות mal; אז כמויות גדולות של אצווה המתאימה ביותר ניתן לרכוש כי הם מספיקים לפחות שנה אחת עבור תוצאות לשחזור.
  6. בסוף זמן העיכול, לעצור את הזלוף, להסיר את הלב ממערכת Langendorff באמצעות זוג מספריים, ומניחים אותו בצלחת פטרי זכוכית.
  7. לחתוך ולזרוק הן אטריה, ולהסיר כל שאריות שומן שנותרו. בזהירות לקלף את קרום הלב בעזרת שני זוגות מלקחיים, כדי למנוע זיהום של תאים אפיתל.
    הערה: קרום הלב יכול להיות מעוכל יותר עם collagenase להשיג תאים טהורים אפיתל לב אם נדרש. פרוטוקול מפורט לא ניתן במחקר הנוכחי כמו זה מעבר לתחום של הפרוטוקול הנוכחי.
  8. חותכים את הלב באמצע עם זוג מספריים והכניסו אותו לתוך מסוק רקמות. Mince הלב 2-3 פעמים מחדש להשעות את הרקמה טחון 12 מ"ל של חיץ העיכול מן זלוף Langendorff.
    הערה: אין לקצץ את hEart מוגזם, כמו זה יגרום שיעור גבוה יותר של cardiomyocytes מתים.
  9. מעבירים את הרקמה טחון לתוך 15 מ"ל של collagenase המכיל בינוני דיסוציאציה ולתת לו digest באמבט מים עבור 5-10 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי ההשעיה מחדש באמצעות פיפטה 5 מ"ל פלסטיק חד פעמי.
  10. בסוף תקופת העיכול, לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסננת 100 מיקרומטר. מחק את פסולת רקמות חומר מעוכל.
  11. בסוף זלוף Langendorff, לשטוף את מערכת זלוף מיד עם מינימום של 1 ליטר של מים מזוקקים. Perfuse את המערכת על ידי recirculating 100 מ"ל של 0.1 N NaHH N למשך 30 דקות, ולבסוף לשטוף את המערכת עם 2-3 L של מים מזוקקים. יבש את המערכת על ידי שטיפה האוויר לכסות את הפתיחה עם הסרט פרה.

7. עכברוש תא בידוד לב

  1. בידוד ותרבות של cardiomyocytes
    1. צנטריפוגה ההשעיה התא ב XG 25 דקות 1 (ללא brAkes) כדי pellet cardiomyocytes. Cardiomyocytes עשוי גם להיות מותר להסתפק 10 דקות ב RT ללא צנטריפוגה.
    2. בזהירות להסיר את supernatant המכיל תאים אנדותל fibroblasts בעזרת פיפטה פלסטיק חד פעמי צינור חדש 50 מ"ל.
    3. Resuspend את גלולה cardiomyocyte ב Ca 2 + פתרון 6 מ"ל 1 (שלב 2.9). אפשר 1 דקות עבור התאים כדי להתאים את Ca נמוך 2 + סביבת ריכוז, צנטריפוגה ההשעיה התא שוב ב 25 xg במשך דקה 1 (ללא בלמים).
    4. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 6 מ"ל Ca 2 + פתרון 2 (שלב 2.9). אפשר לתאים 1 דקות כדי להתאים לריכוז ביניים של Ca 2 + , ולבסוף להוסיף 12 מ"ל של Ca 2 + פתרון 3 (שלב 2.9) לתאים. מערבבים בעזרת פיפטה פלסטיק חד פעמיות.
    5. צנטריפוגה ההשעיה תא ב XG 25 במשך 1 דקות.
    6. מחק supernatant ו resuspend התאים 20 מ"ל מראשבינוני- CCT. הוסף 1 מ"ל של ההשעיה תא לכל אחד 20 צלחת סטרילית 35 מ"מ תרבות התא מראש מצופה laminin (שלב 2.9) ולאפשר לתאים לצרף במשך 2 שעות CO 2- CO חינם בתרבות החממה.
      הערה: cardiomyocytes יכול גם להיות מתורבת תחת CO 2 הסביבה; עם זאת, במקרה זה התקשורת עם מערכת חיץ bicarbonate יש להשתמש.
    7. לאחר 2 שעות, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל חדש של בינוני CCT כדי להסיר את כל התאים המתים.
      הערה: התאים מוכנים לכל ניסויים מתוכננים יכול להיות מתורבת עד 3 ימים בתא טיפוסי תרבות חממה (CO 2 חינם) ללא הפסד משמעותי של תאים חיים. טיפוסית cardiomyocytes בריא בצורת מוט מוצגים בתרשים 2A .
  2. בידוד של תאים אנדותל fibroblasts
    1. צנטריפוגה supernatant המכיל תאים אנדותל fibroblasts (משלב 7.1.2) ב 250 xg במשך 10 דקות.
    2. מחק את סופהRnatant ו resuspend תא גלולה ב 1.5 מ"ל של חיץ בידוד תא האנדותל בצינור מדגם 2 מ"ל.
    3. הוסף 3 מיקרוגרם (1: 500) של העכבר נגד נוגדן CD31 עכברוש ההשעיה תא דגירה אותו ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם סיבוב מקצה לקצה.
      הערה: טיטרציה של הנוגדנים לדילול אופטימלי מומלץ. צעד זה צריך להתבצע ב 4 ° C כמו ב RT הפנמה מהירה של נוגדנים על ידי תאים אנדותל תגרום תשואה נמוכה.
    4. מוסיפים את מוכן בעבר (סעיף 3) מחבת אנטי עכבר חרוזים IgG ההשעיה התא דגירה של 20 דקות ב 4 ° C עם סיבוב מקצה לקצה.
      הערה: לחלופין, עכבר נגד עכברוש CD31 נוגדנים ניתן מראש המצורפת חרוזים מגנטיים ולאחר מכן הוסיף ההשעיה התא. עם זאת, זה יגדיל את הזמן של הדגירה של החרוזים עם ההשעיה התא עלול לגרום להגדלת הלא ספציפית מחייב של תאים שאינם האנדותל ולכן זיהום גבוה יותר של סוגי תאים אחרים.
    5. אלא סוף הזמן הדגירה נוגדן, במקום הצינור המכיל את ההשעיה תא במעמד מגנטי ולאפשר 2 דקות כדי ליישב את חרוזים מגנטיים המצורפת לתאי אנדותל בצד של הצינור.
    6. בזהירות להסיר את שאר ההשעיה התא (המכיל בעיקר fibroblasts) באמצעות פיפטה 1 מ"ל ולהוסיף אותו צלחת 10 ס"מ תרבות התא המכיל 10 מ"ל של fibroblast בינוני תרבית תאים (שלב 2.3). מניחים אותו בתא טיפוסי תרבות חממה המכילה 5% CO 2 . ההליך נמשך בשלב 7.3.
    7. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף את הצינור עם חרוזים מגנטיים המכילים את התאים האנדותל.
    8. מכסה את הצינור, להסיר אותו מן המדף מגנטי, בזהירות resuspend החרוזים על ידי רועד בעדינות מעלה ומטה 4 - 5 פעמים. מניחים את הצינור שוב את המדף מגנטי, לאפשר חרוזים להתיישב על הקיר של הצינור עבור 1 דקות, בזהירות להסיר את חיץ לשטוף.
    9. חזור על שלבי כביסה 5 - 7 פעמים כדי להיפטר מכל זיהום nעל תאים אנדותל.
    10. Resuspend התאים האנדותל המצורפת חרוזים ב 1 מ"ל של MV2 האנדותל בתרבות המדיום התא, להוסיף היטב אחת של צלחת 12 היטב, ו דגירה בתא CO 2 תרבות חממה.
    11. אפשר לתאים לצרף לילה ולשנות את המדיום למחרת ולאחר מכן כל 2-3 ימים עד התאים להיות חצי confluent (בדרך כלל 5-7 ימים).
      הערה: תאים אנדותל לא קונפלונט אופייני לאחר 3 - 4 ימים תאים אנדותל ומחוברות לאחר 7-10 ימים של בידוד מוצגים איורים 3A ו 3B , בהתאמה. התאים יכולים לאחר מכן trypsinized (סעיף 7.4) ו seeded לתוך T25 תא תרבות הבקבוק.
  3. שטיפה ותרבות של fibroblasts (המשך משלב 7.2.6)
    1. לאחר 1 שעה של הדגירה, לשאוב את המדיום לשטוף את fibroblasts המצורפת לתרבית תרבות התא על ידי הוספת נפח מתאים מראש חימם PBS. לשאוב את PBS ולחזור על sTep 2-3 פעמים ולבסוף להוסיף מראש חימם טריים fibroblast תרבית בינוני בינוני.
    2. שטפו את התאים המצורפים שוב למחרת עם מראש חימם PBS (כמו בשלב הקודם) ולהוסיף מראש חימם בינוני טרי. שנה את המדיום לאחר כל 2-3 ימים. פנוטיפ טיפוסי של fibroblasts ביום 2 של בידוד מוצג באיור 4 א .
      הערה: fibroblasts להיות חצי confluent בדרך כלל בתוך 5-7 ימים ולאחר מכן הם מוכנים להיות trypsinized (סעיף 7.4) ושימשו עבור ניסויים מתוכננים. עם הליך זה, אנחנו בדרך כלל להשיג 95-99% fibroblasts טהור. פנוטיפ טיפוסי של fibroblasts ביום 7 של בידוד מוצג באיור 4 ב .
  4. Trypsinization של תאים אנדותל fibroblasts
    1. לשאוב את המדיום מהצלחת תרבות התא ולהוסיף מספיק חימם מראש PBS כדי לכסות את התאים.
    2. לשאוב PBS ולהוסיף מספיק פתרון טריפסין- EDTA (0.05% ו 0.02%, בהתאמה) כדי לכסות את התאים במקוםE 37 ° C חממה במשך 5 דקות.
    3. Resuspend התאים על ידי pipetting התאים למעלה ולמטה בעזרת פיפטה 1 מ"ל להפסיק פעולה טריפסין על ידי הוספת FCS 10%.
    4. גלולה ההשעיה תא ידי צנטריפוגה ב 250 xg במשך 10 דקות ב RT.
    5. Resuspend התאים בנפח המתאים מראש חימם בינוני התרבות התא.

8. אפיון תא האנדותל

הערה: הטוהר של תאי האנדותל נקבע על ידי ספיגת Dil-Ac-LDL ו immunostaining של פון Willebrand גורם (vWF). תאים דמיינו ידי פלואורסצנטי או מיקרוסקופיה confocal ( דמויות 3C-3E ).

  1. דיל Ac-LDL ספיגה על ידי תאים אנדותל
    1. Trypsinize בתאי האנדותל (שלב 7.4) ותרבות אותם לילה על coverslips זכוכית בצלחת 12 גם (כ 10 x 10 4 תאים / ס"מ 2 ).
    2. לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של טרום wחמוש HBSS.
    3. לשאוב את HBSS ולהוסיף 1 מ"ל המדיום תא התרבות האנדותל המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​Dil-Ac-LDL ולהשאיר את התאים 37 ° C חממה במשך 4 שעות.
    4. לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם חימם מראש PBS שלוש פעמים ולתקן אותם עם 1 מ"ל של paraformaldehyde 1% (PFA, מומס PBS). דגירה אותם עם PFA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: PFA הוא קורוזיבי; תמיד להשתמש כפפות עמיד חומצה תוך טיפול פתרון PFA.
    5. לשאוב את PFA, לשטוף את התאים על coverslip צלחת 12 גם עם 3 מ"ל שלוש פעמים PBS ו דגירה אותם עם פתרון מכתים גרעיני ל- PRO (10 מיקרומטר) במשך שעה 1 ב RT.
      הערה: אם המסנן המתאים זמין עבור המיקרוסקופ, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 מיקרוגרם / מ"ל) עשוי לשמש גם. במקרה זה דגירה במקרה צריך להיות מופחת ל 10 דקות.
    6. שוטפים תאים על coverslip צלחת 12 גם עם 1 מ"ל PBS, לשאוב את PBS, לחזור על הצעד שלוש פעמים.
    7. קח את cOverslip מתוך צלחת 12 היטב ולהרכיב אותו על שקופית זכוכית עם טיפה של המדיום הרכבה. התאים מוכנים להיות דמיינו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי / confocal. השתמש מסנן עירור של 530-560 ננומטר עבור Dil-Ac-LDL, 640 ננומטר עבור TO-PRO, ו 340-380 ננומטר עבור DAPI.
  2. פון וילברנד (vWF) מכתים
    1. תרבות תאים אנדותל כמתואר בשלב 8.1.1.
    2. לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של חימם מראש HBSS; לאחר מכן, לתקן עם PFA 4% כפי שמתואר בשלב 8.1.4.
    3. לשאוב את PFA, לשטוף את התאים על coverslip צלחת 12 גם עם 1 מ"ל של PBS פעמיים, permeabilize התאים עם 1 מ"ל של 0.1% Triton X-100 (ב PBS) במשך 20 דקות ב RT.
    4. לשאוב את הפתרון permeabilizing ו דגירה התאים עם פתרון חסימה (5% BSA / 5% FCS ב PBS) עבור 1 ח.
    5. דגירה התאים עם נוגדנים נגד ארנב vWF (1: 100) ב 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה בחדר humidified. הוסף אחד coverslip ללא הE הנוגדן העיקרי כבקרה שלילית.
    6. שוטפים את התאים על coverslip צלחת 12 גם עם 1 מ"ל PBS שלוש פעמים דגירה התאים עם חמור נגד ארנבת Alexa פלואוריד 488 נוגדן (1: 500) ופתרון מכתים גרעיני TO-PRO (10 מיקרומטר) במשך שעה ב RT.
    7. שוטפים את התאים על coverslip צלחת 12 גם עם 1 מ"ל PBS, לשאוב את PBS, לחזור על הצעד שלוש פעמים.
    8. קח את coverslip מתוך צלחת 12 היטב ולהרכיב אותו על שקופית זכוכית עם טיפה של המדיום הרכבה. התאים מוכנים להיות דמיינו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי / confocal. השתמש מסנן עירור של 490 ננומטר עבור vWF ו 640 ננומטר עבור מכתים גרעיני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הליך הבידוד גורם תשואה של 70-80% קיימא, בצורת מוט, cardiomyocytes מופשטים ( תרשימים 2A ו 2C ) שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים מתוכננים. ב cardiomyocytes המעבדה שלנו משמשים באופן שגרתי לניתוח Ca 2 + איתות. איור 5A מראה סידן תאיים [Ca 2 + ] תנודה אני בתגובה איסכמיה / reperfusion cardiomyocytes טעון עם Fura-AM (5 מיקרומטר). איור 5 ב מראה שינויים [Ca 2 + ] i בתאי האנדותל fibroblasts לאחר תוספת של ה- ATP (100 מיקרומטר). השינויים [Ca 2 + ] i שונים סוגי תאים לב נותחו כמתואר לעיל. 6 , 11 , 12

Re 1 "src =" / files / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
איור 1: שינוי Langendorff מערכת זלוף. ( A ) מערכת זלוף Langendorff כולו המשמש לבידוד של תאים לב ( B ) תצוגה מוגדלת של הלב התלוי "חדר הלב" משמש גם עבור אוסף של חיץ זלוף עבור recirculation. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 איור 2. קרדיומיומיטים עכברוש מבוגר. ( א ) טיפוסית בצורת מוט, cardiomyocytes בריא 2 שעות לאחר ציפוי ב laminin מצופה מנות התרבות התא ( ב ) דוגמה טיפוסית של הכנה לקויה בשל עיכול רקמות לא שלם. 2 שעות לאחר ציפוי ב laminin מצופה מנות תרבות התא, מוSt של התאים הם hypercontracted ונראה מעוגל, ויש כמה cardiomyocytes בצורת מוט. קנה מידה בר = 10 מיקרומטר ( C ) מיקרוסקופ confocal של cardiomyocyte אחת מוכתמים להדמיה actin כמתואר לעיל. 13 סולם בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: חולדה תאים אנדותל קרדיאלי. ( A ) שלב מיקרוסקופ בניגוד של monolayer non-confluent תא האנדותל 3 ימים לאחר בידוד. כתמים כהים הם חרוזים מגנטיים כי הם עדיין מחוברת לתאי האנדותל האב. סולם בר = 10 מיקרומטר (שלב ב ' ) מיקרוסקופ שלב של monolayer תא אנדותל ומחוברות 7 ימים לאחר בידוד ( C) Immunostaining של תאים אנדותל מראה כתמי דיל-Ac-LDL (אדום) מכתים גרעיני (כחול) ( D ) Immunostaining של תאים האנדותל מראה מכתים של vWF (אדום) וכתם גרעיני (כחול) ( E ) תאים מודגרות רק עם נוגדנים משני ו כתם גרעיני (כחול) (קנה מידה בר = 50 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: Fibroblasts חולדה לב. ( A ) fibroblasts טיפוסיים בצורת ציר על היום השני של בידוד. ( ב ) fiblublasts קונבולנטית, טהורה לאחר 7 ימים של תרבות. ( ג ) דוגמה טיפוסית של הכנה עניים מזוהמים עם תאים אפיתל. תאים המסומנים על ידי ראשי חץ הם תאים אפיתל הלב . סולם בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: שינויים [Ca 2 + ] i בתאי לב. ( A ) נציג tracings של שינויים סידן תאיים [Ca 2 + ] אני נמדד על ידי יחס Fura-2 ב cardiomyocytes חולדה חשופים איסכמיה כימית (Na- ציאנאט, 2 מ"מ) ואחריו reperfusion ( ב ) נציג tracings של שינויים בסידן תאיים [Ca 2 + ] אני נמדד על ידי יחס Fura-2 בתאי האנדותל חולדה לב fibroblasts, מטופלים עם ה- ATP (100 מיקרומטר) כפי שצוין. > אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, פרוטוקול לשחזור לבידוד ותרבויות של myocytes לב, תאי האנדותל, fibroblasts מתואר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד בו זמנית באיכות גבוהה של סוגי תאים עיקריים של רקמת לב, כלומר cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts לעומת סוג אחד בלבד התא. שלב קריטי בהליך הבידוד הוא העיכול הנכון של רקמת הלב. אם העיכול אינו שלם, מספר גדול של myocytes עדיין ניתן להשיג אבל האיכות שלהם היא גרועה מאוד והם בעיקר hypercontracted ו עגול ( איור 2 ב ) ואין ערך בניסויים. יתר על כן, התשואה של תאים אנדותל fibroblast יהיה גם מופחת. בעיה זו יכולה להיפתר על ידי שליטה על זמן העיכול. לפני הסרת הלב ממערכת זלוף, את הרכות של הלב ניתן לבדוק בעזרת מלקחיים וקצות האצבעות. אם הרקמה היא עדיין לא ניכר sOf, הלב עשוי להיות perfused עבור 5-10 דקות נוספות. צעד קריטי נוסף בבידוד cardiomyocyte בריא הוא שיקום מצטבר של Ca 2 + במאגרים בידוד. שחזור מהיר של ריכוזים גבוהים של Ca 2 + בתקשורת תגרום cardiomyocytes מעוגל. איכות המים המשמשים להכנת מאגרים היא גורם חשוב נוסף המשפיע על איכות cardiomyocytes. לכן, מומלץ להשתמש במים באיכות טובה.

טוהר תאי האנדותל תלוי מאוד בצעדי כביסה. EDTA חייב להיות נוכח במאגר כביסה כדי למנוע מחייב הלא ספציפיים של תאים שאינם האנדותל על חרוזים מגנטיים. נוכחות של תאי דם ההשעיה התא יהיה להפחית באופן משמעותי את התשואה של תאים האנדותל; לכן, ראוי כביסה של הלב הוא קריטי מאוד לאחר הרכבה את הלב במערכת זלוף ולפני תוספת של collagenase. שרידי רכיבי הדם גם להפחית tהוא פעילות של collagenase ולכן לעכב עיכול של הלב.

הזיהום הנפוץ ביותר בתרבית תאים fibroblast הוא המראה של מושבות לווין של תאים אפיתל ( איור 4 ג ). זיהום זה עשוי להימנע על ידי שני שלבים culturing של fibroblasts. בשלב הראשון, הריכוז של FCS במדיום fibroblast תרבות התא מצטמצם ל 5% ההשעיה התא מותר לדבוק בצלחת תרבות התא 30 דקות בחממה. תאי אפיתל לדבוק במהירות אבל זמן fibroblast הידבקות התא הוא גדל בנוכחות ריכוז נמוך של סרום. לאחר 30 דקות של הדגירה, ההשעיה התא המכיל fibroblasts חסין הוא הוסר בקפידה לתרבית חדשה תא התרבות. בדרך זו את התשואה של fibroblasts עשוי להיות מופחת אבל הטוהר שלהם משופרת מאוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברים אין מה להכריז.

Acknowledgments

התמיכה הטכנית של L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas ו- A. Weber מודה בהכרת תודה. המחברים מבקשים גם להודות לד"ר א. מרטינסון על הוכחות מקיפות לקריאה ועריכה בשפה של כתב היד. המחקר נתמך על ידי אוניברסיטת ג 'סן Anschubsfinanzierung מענק מ' אסלאם וד 'Gündüz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-vWF Santa Cruz Biotech. SC-14014
Calcium chloride Merck 102378
Carnitin Sigma-Aldrich C0283
Collagenase type II Worthington LS004176
Creatin Sigma-Aldrich C0780
D-Glucose Merck 108342
Dil-Ac-LDL Thermo Scientific L3484
EDTA Solution (0.2 M) Biochrome AG L2113
Embeding solution Citiflour AF1-25
Endothelial cell medium MV2 PromoCell C-22022
Foetal calf serum (FCS) Biochrome AG S0615
Gentamicin Serva Chemicals 47991
HEPES Sigma-Aldrich H0887
Isoflurane Abbott TU 061219
Laminin  Roche/Sigma 11243217001
M199 medium Thermo Scientific 11150059
M199 medium (Powder) Biochrome AG T061
Magnesium sulphate Sigma-Aldrich 63138
Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) Thermo Scientific MA1-81051
NaCl solution (0.9%), Sterile B. Braun 30820080
Pan mouse IgG beads (Dynabeads) Thermo Scientific 11041
Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution Santa Cruz Biotech. sc-281692
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063
Phosphate buffer saline (PBS) 1x  PAN-Biotech P04-36500
Plastic consumables Greiner Bio-One
Potassium Chloride Merck 4933
Potassium dihydrogen phosphate Merck 7873
Sodium Chloride Merck 6404
Sodium Hydroxide Solution (2 N) Merck 109136
Sterile filtration system Thermo Scientific 5660020
Taurine Sigma-Aldrich T8691
TO-PRO Thermo Scientific T3605
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma-Aldrich T4174
Water, Sterile B. Braun

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
  2. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  3. Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
  4. Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
  5. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
  6. Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
  7. Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
  8. Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
  9. Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
  10. Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
  11. Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
  12. Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
  13. Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).

Tags

ביולוגיה סלולרית גליון 123 תאי אנדותל קרדיומיוציטים פיברובלסטים Langendorff בידוד תרבות התא
בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gündüz, D., Hamm, C. W.,… More

Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. J. Vis. Exp. (123), e55601, doi:10.3791/55601 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter