Summary
Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.
Abstract
Die Ratte ist ein wichtiges Tiermodell, das in der Herz-Kreislauf-Forschung verwendet wird, und Ratten-Herzzellen werden routinemäßig zur in-vitro- Analyse der molekularen Mechanismen der kardiovaskulären Erkrankung wie Herzhypertrophie, Fibrose und Atherosklerose verwendet. Obwohl mehrere Versuche mit variablem Erfolg gemacht wurden, um immortalisierte Zelllinien aus dem kardiovaskulären System zu entwickeln, um diese zellulären Mechanismen zu verstehen, bieten primäre Zellen eine natürliche und nahe an in vivo Umgebung für solche Studien. Daher haben verschiedene Laboratorien, die an einem bestimmten Zelltyp arbeiten, Protokolle entwickelt, um einzelne Arten von Ratten-Herzzellen von Interesse zu isolieren. Ein Protokoll, das die Isolierung von mehr als einem Zelltyp erlaubt, fehlt jedoch. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht und es ermöglichtEinsatz für zelluläre Analysen. Dies ermöglicht eine effizienteste Nutzung der verfügbaren Ressourcen, die Zeit sparen und die Forschungskosten senken können.
Introduction
Nagetiermodelle werden seit langem als Werkzeuge verwendet, um unser Verständnis der Herz-Kreislauf-Physiologie in Gesundheit und Krankheit zu erweitern. 1 Obwohl diese Tiermodelle es uns erlauben, die Pathophysiologie einer Erkrankung auf organischer Ebene zu verstehen und die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik verschiedener pharmakologischer Mittel zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, des Verständnisses der molekularen Mechanismen der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Beitrags eines bestimmten zu analysieren Zelltyp erfordert die Verwendung von in vitro Zellkulturmodellen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene immortalisierte Zelllinien aus dem Herz-Kreislauf-System entwickelt; 2 , 3 aber frisch isolierte primäre Zellen sind physiologisch und funktionell relevanter für lebende Gewebe und Organismen.
Das Herz ist ein vielseitiges Organ, das alle gängigen Zelltypen des Herz-Kreislaufs enthältYstem, und das Rattenherz ist immer noch ein häufig verwendetes Modell für das Verständnis der Herz-Kreislauf-Physiologie. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Methoden zur Isolierung einzelner Zelltypen aus Herzgewebe beschrieben; 4 , 5 , 6 , 7 Diese Methoden konzentrieren sich jedoch nur auf die Isolierung eines spezifischen Zelltyps, was zum Verlust von anderen Zelltypen führt, die für die zelluläre Analyse nicht mehr verwendet werden können. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die gleichzeitige und qualitativ hochwertige Isolierung der wichtigsten Zelltypen von Herzgewebe, dh Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten, ermöglicht. Alle diese Zelltypen können in verschiedenen Versuchsaufbauten 8 , 9 , 10 und zur Analyse von Zell-Zell-Wechselwirkungen aus demselben Tier verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Untersuchung entspricht dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht von den US National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 85-23 1985) und wurde vom örtlichen Ethikkomitee der Universität Giessen genehmigt. Erwachsene männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200 - 250 g wurden in dieser Studie verwendet.
1. Autoklavieren
- Mindestens einen Tag vor der Durchführung des Verfahrens müssen alle chirurgischen Instrumente, Pipettenspitzen und Pasteurpipetten im Isolationsverfahren bei 121 ° C für 30 min autoklaviert werden.
2. Vorbereitung von Medien und Lösungen
HINWEIS: Die Lösungen aus den Schritten 2.1-2.4 können bis zu einer Woche vor der Isolierung vorbereitet und bei 4 ° C gelagert werden, aber die Lösungen in den Schritten 2.5-2.8 am Tag der Isolierung vorbereiten. Die vollständigen Rezepte der Puffer und Medien sind in Tabelle 1 angegeben . Warm alle Medien und Lösungen auf 37 ° C in aWasserbad vor Beginn der Vorbereitung.
- Das Powell-Medium durch Auflösen der in Tabelle 1 aufgeführten Chemikalien in 4,5 l H 2 O bei Raumtemperatur (RT) vorbereiten. Den pH-Wert auf 7,4 mit 2,0 N NaOH einstellen und das Volumen auf 5,0 l bringen. Steril filtriere die Lösung und lagere sie bei 4 ° C.
- Kreatin, L-Carnitin und Taurin (CCT) -Medium durch Auflösen von M199-Pulvermedium in 4,5 l H & sub2 ; O vorbereiten. Das HEPES-Pulver gemäß Tabelle dem Medium zugeben und 15 min lang mischen. Fügen Sie Kreatin, Carnitin, Taurin und Ara-C gemäß Tabelle 1 hinzu. Gut mischen, den pH-Wert mit pH-Meter auf 7,4 mit 2,0 N NaOH einstellen und das Volumen auf 5,0 l bringen. Sterilfilter und bei 4 ° C aufbewahren.
- Bereiten Sie Zellkulturmedium für Fibroblasten vor, indem Sie 10% fötales Kälberserum (FCS) und 2% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) zu mittlerem M199 hinzufügen. DMEM eignet sich gleichermaßen als M199 und kann auch für die Fibroblastenzellkultur eingesetzt werden.
- Vorbereitung MV2 ZellkulturE Medium für Endothelzellen durch Zugabe aller Inhalte der Ergänzungsmischung zum Basal MV2 Medium nach Herstellerangaben. Nehmen Sie ein 5 ml Aliquot und wärmen Sie es auf 37 ° C in einem Wasserbad.
- Den endothelialen Zellisolationspuffer durch Auflösen von 0,05 g Rinderserumalbumin (BSA) in 50 ml Hanks-ausgewogener Salzlösung (HBSS) und Zugabe von 0,5 ml einer 200 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung zuzugeben. Steril filtrieren und bei 4 ° C aufbewahren.
- Den Endothelzell-Waschpuffer durch Zugabe von 0,1 ml 200 mM zu 9,9 ml PBS zubereiten und bei 4 ° C aufbewahren.
- Die Kollagenase-Lösung wird durch Auflösen von 27 mg Kollagenase in 5 ml Powell-Medium und Zugabe von 12,5 & mgr; l 100 mM CaCl 2 -Lösung zubereitet. Warm es auf 37 ° C im Wasserbad.
- Vorbereitung von inkrementellen Ca 2+ -Restaurationslösungen 1, 2 und 3 für Kardiomyozyten durch Zugabe von 12,5 μl, 25 μl und 120 μl 100 mM CaCl 2 -LöselIon bis 6 ml, 6 ml und 12 ml Powell-Medium.
- Vorbereiten der Zellkulturschalen für Kardiomyozyten einen Tag vor der Isolierung durch Zugabe von 1 ml Vorbeschichtungsmedium, das Laminin enthält, zu jeder 35 mm Zellkulturschale. Inkubieren sie in den Zellkulturinkubator bei 37 ° C über Nacht.
3. Herstellung von Magnetperlen
- Platzieren Sie 0,5 ml des Endothelzellen-Isolationspuffers in einem 1,5 ml Probenröhrchen auf Eis.
- Fügen Sie 5 μl (2 x 10 6 ) der Pan-Maus-IgG-Magnetperlen hinzu und mischen Sie gut.
- Legen Sie das Röhrchen für 1 Minute in das Magnetgestell. Die Perlen haften an der Wand des Rohres zum Magneten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1 mL Pipette.
- Wiederholen Sie das Waschen zweimal und wiederholen Sie die Perlen in 50 μl Endothelzellen-Isolationspuffer und legen Sie sie bei 4 ° C bis zum Gebrauch auf.
4. Vorbereitung des Langendorff Perfusionssystems
- Reinigen tEr Langendorff System durch Perfusion mit 2 l destilliertem Wasser.
- 50 ml Powell-Medium durch das System für 5 min zirkulieren und das Medium verwerfen.
- Füge 80 ml frisches Powell Medium hinzu. Kontinuierlich perfusieren sie mit "carbogen" durch Blasen mit einer Glas-Pasteurpipette aus der Gasflasche. Lassen Sie das Medium durch das System rezirkulieren. Das System ist nun bereit, das Herz zu benennen (Abbildung 1A ).
5. Dissektion der Ratte
- Legen Sie die Ratte in einen 5-l-Exsikkator unter eine Dunstabzugshaube und fügen Sie 1,5 ml 4-5% Isofluran durch die Entlüftungsöffnung hinzu und schließen Sie den Deckel.
HINWEIS: Legen Sie das Tier auf erhöhte perforierte Platte innerhalb des Exsikkators, um einen direkten Kontakt des Tieres mit dem flüssigen Isofluran zu vermeiden. - Warten Sie, bis die Ratte ihren Deckelreflex verliert (normalerweise ~ 5 min), und nehmen Sie dann die Ratte aus dem Exsikkator heraus. Euthanasiere die Ratte durch zervikale Versetzung.
- Schneide die Bauchhaut und den darunter liegenden MuskelhohlraumVerbündete in der Mitte mit einer scharfen Schere. Danach schneide den Muskel senkrecht zum Brustbein der Ratte und öffne den Thorax. Entfernen Sie das Herz mit den Lungen und legen Sie die Organe sofort in eiskalte 0,9% NaCl-Lösung.
- Die Lungen mit Hilfe einer Schere entfernen und entsorgen. Reinigen Sie das Herz eines Bindegewebes und schneiden Sie die Aorta kaudal am Zweig des brachiocephalischen Stammes.
6. Perfusion des Herzens und Verdauung mit Collagenase
- Montiere das Herz über die Aorta im Langendorff Perfusionssystem (Abschnitt 4) mit zwei Paaren dünner, gebogener Pinzette. Um sicherzustellen, dass das Myokard in einer retrograden Weise perfundiert wird, legen Sie das Ende der Kanüle des Perfusionssystems zwischen den ersten Aortenzweig und die Aortenklappe. Fixieren Sie die Aorta mit einer Krokodilklemme.
- Fix das Herz mit einer chirurgischen Naht, und entfernen Sie die Krokodilklemme (Abbildung 1B ).
- Öffnen Sie das Ventil der Kanüle, damit das Perfusionsmedium (35 ml) durch das Herz tropfenweise (60 Tropfen / min, 5 ml / min) gelangen kann, um restliches Blut zu waschen. Verwerfe jeden Durchfluss in diesem Stadium.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen in jedem Stadium der Perfusion, da dies zu einer unvollständigen Verdauung und einem Versagen des Zellisolationsverfahrens führen wird. - Legen Sie das hängende Herz in den Sammeltrichter (Herzkammer, Abbildung 1B ) und starten Sie die peristaltische Pumpe, die das Perfusionsmedium aus dem Sammeltrichter in den Vorratsbehälter zurückführt (Abbildung 1A ).
- Füge die Kollagenase-Lösung (ab Schritt 2.8) zum Perfusionsmedium hinzu. Perfekt das Herz mit rezirkulierender Kollagenase-Lösung für 30 min.
HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig für die Optimierung der Zellausbeute. Die Perfusionszeit hängt von der Aktivität der Kollagenase ab, die je nach Charge variieren kann. Testen Sie 3-4 Chargen von Kollagenase, um das mit opti zu findenMal Aktivität; Dann können große Mengen der am besten geeigneten Charge gekauft werden, die für mindestens ein Jahr für reproduzierbare Ergebnisse ausreichen. - Am Ende der Verdauungszeit, stoppen Sie die Perfusion, entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-System mit einer Schere, und legen Sie es in eine Glas-Petrischale.
- Schneiden Sie ab und verwerfen Sie beide Atrien, und entfernen Sie alle übrig gebliebenen Fettgewebe. Das Pericardium mit Hilfe von zwei Pinzettenpaaren vorsichtig abziehen, um eine Kontamination der Epithelzellen zu vermeiden.
HINWEIS: Das Perikard kann mit Kollagenase weiter verdaut werden, um bei Bedarf reine Herzepithelzellen zu erhalten. Ein detailliertes Protokoll ist in der vorliegenden Studie nicht gegeben, da dies außerhalb des Geltungsbereichs des vorliegenden Protokolls liegt. - Schneide das Herz mit einer Schere in die Mitte und stecke es in den Gewebehäcksler. Das Herz 2-3 mal zerkleinern und das gehackte Gewebe in 12 ml des Verdauungspuffers aus der Langendorff-Perfusion wieder suspendieren.
HINWEIS: Hacke nicht hEart übermäßig, da dies zu einem höheren Anteil an toten Kardiomyozyten führen wird. - Übertragen Sie das gehackte Gewebe in 15 ml Kollagenase-haltiges Dissoziationsmedium und lassen Sie es in einem Wasserbad für eine 5-10 min mit gelegentlichem Mischen durch erneute Suspension unter Verwendung einer 5-ml-Einweg-Plastikpipette verdauen.
- Am Ende der Verdauungsperiode die Zellsuspension durch ein 100 μm Sieb filtrieren. Verwerfen Sie den Gewebe und das unverdaute Material.
- Am Ende der Langendorff-Perfusion das Perfusionssystem sofort mit mindestens 1 l destilliertem Wasser spülen. Setzen Sie das System durch Umwälzen von 100 ml 0,1 N NaOH für 30 min und schließlich spülen Sie das System mit 2-3 L destilliertem Wasser. Trocknen Sie das System durch Spülen von Luft und bedecken Sie die Öffnung mit para-Film.
7. Ratten-Herzzell-Isolierung
- Isolierung und Kultur der Kardiomyozyten
- Die Zellsuspension bei 25 xg für 1 min zentrifugieren (ohne brUm die Kardiomyozyten zu pelletieren. Kardiomyozyten können sich auch 10 min bei RT ohne Zentrifugation absetzen lassen.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, der Endothelzellen und Fibroblasten enthält, mit Hilfe einer Einweg-Plastikpipette in einem neuen 50-ml-Röhrchen.
- Das Kardiomyozytenpellet in Ca 2+ 6 mL Lösung 1 resuspendieren (Schritt 2.9). Erlaube 1 min für die Zellen, um die niedrige Ca 2+ -Konzentrationsumgebung einzustellen und die Zellsuspension erneut bei 25 xg für 1 min (ohne Bremsen) zu zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 6 ml Ca 2+ Lösung 2 (Schritt 2.9). Lassen Sie die Zellen 1 min auf die Zwischenkonzentration von Ca 2+ einstellen und schließlich 12 ml Ca 2+ Lösung 3 (Schritt 2,9) zu den Zellen hinzufügen. Mischen Sie mit Hilfe einer Einweg-Plastikpipette.
- Die Zellsuspension bei 25 xg für 1 min zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in 20 ml vor-warmed CCT Medium. Fügen Sie 1 ml der Zellsuspension zu jeder von 20 sterilen 35 mm Zellkulturschale hinzu, die mit Laminin vorbeschichtet ist (Schritt 2.9) und lassen Sie die Zellen für 2 h in einem CO 2 -freien Zellkulturinkubator anhaften.
HINWEIS: Die Kardiomyozyten können auch unter CO 2 -Umgebung kultiviert werden. In diesem Fall sollten jedoch Medien mit Bicarbonat-Puffersystem verwendet werden. - Nach 2 h ersetzen Sie das Medium durch neue 2 ml CCT-Medium, um alle toten Zellen zu entfernen.
HINWEIS: Die Zellen sind für alle geplanten Experimente bereit und können bis zu 3 Tage in einem typischen Zellkulturinkubator (CO 2 frei) ohne signifikanten Verlust an lebenden Zellen kultiviert werden. Typische gesunde stabförmige Kardiomyozyten sind in Fig. 2A gezeigt .
- Isolierung von Endothelzellen und Fibroblasten
- Zentrifugieren des Überstandes, der Endothelzellen und Fibroblasten enthält (aus Schritt 7.1.2) bei 250 xg für 10 min.
- VerwerfenRnatant und resuspendieren das Zellpellet in 1,5 ml Endothelzellen-Isolationspuffer in einem 2 ml Probenröhrchen.
- Füge 3 μg (1: 500) Maus-anti-Ratten-CD31-Antikörper der Zellsuspension hinzu und inkubiere sie bei 4 ° C für 30 min mit End-to-End-Rotation.
HINWEIS: Eine Titration des Antikörpers zur optimalen Verdünnung wird empfohlen. Dieser Schritt sollte bei 4 ° C durchgeführt werden, da bei RT eine schnelle Internalisierung des Antikörpers durch Endothelzellen zu einer niedrigen Ausbeute führen wird. - Fügen Sie die zuvor vorbereiteten (Abschnitt 3) Pfanne Anti-Maus-IgG-Kügelchen der Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C mit einer End-to-End-Rotation.
HINWEIS: Alternativ kann der Maus-Anti-Ratten-CD31-Antikörper an die magnetischen Kügelchen vorgebunden und dann der Zellsuspension zugesetzt werden. Dies erhöht jedoch die Zeit der Inkubation der Perlen mit der Zellsuspension und kann zu einer erhöhten unspezifischen Bindung von nicht-endothelialen Zellen und damit zu einer höheren Kontamination anderer Zelltypen führen. - EINT das Ende der Antikörper-Inkubationszeit, platzieren Sie das Röhrchen, das die Zellsuspension enthält, in eine magnetische Zahnstange und lassen Sie 2 min, um die magnetischen Perlen, die an Endothelzellen an der Seite des Röhrchens befestigt sind, abzusetzen.
- Entfernen Sie vorsichtig den Rest der Zellsuspension (die hauptsächlich die Fibroblasten enthält) mit einer 1 ml Pipette und fügen Sie sie zu einer 10 cm Zellkulturschale hinzu, die 10 ml Fibroblastenzellkulturmedium enthält (Schritt 2.3). Legen Sie es in einen typischen Zellkulturinkubator mit 5% CO 2 . Die Vorgehensweise setzt sich in Schritt 7.3 fort.
- Füge 1 ml Waschpuffer in die Röhre mit magnetischen Perlen, die die Endothelzellen enthalten.
- Das Röhrchen abketten, aus dem Magnetregal nehmen und die Perlen vorsichtig durch 4- Legen Sie den Schlauch wieder in die magnetische Zahnstange, lassen Sie die Perlen auf der Wand des Röhrchens für 1 min absetzen, und entfernen Sie vorsichtig den Waschpuffer.
- Wiederholen Sie die Waschstufen 5 - 7 mal, um loszuwerden, alle kontaminierenden nOn-Endothelzellen.
- Die an den Perlen gebundenen Endothelzellen in 1 ml MV2-Endothelzellkulturmedium resuspendieren, zu einer einzigen Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzufügen und in einem CO 2 -Zellkulturinkubator inkubieren.
- Lassen Sie die Zellen über Nacht anhängen und wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und dann alle 2-3 Tage, bis die Zellen halbkonfluent werden (in der Regel 5 - 7 Tage).
ANMERKUNG: Typische nicht konfluierende Endothelzellen nach 3 - 4 Tagen und konfluenten Endothelzellen nach 7-10 Tagen Isolierung sind in den Fig. 3A bzw. 3B gezeigt . Die Zellen können dann trypsinisiert werden (Abschnitt 7.4) und in einen T25-Zellkulturkolben ausgesät werden.
- Waschen und Kultur von Fibroblasten (weiter ab Schritt 7.2.6)
- Nach 1 h Inkubation aspirieren das Medium und waschen die an der Zellkulturschale angebrachten Fibroblasten durch Zugabe eines geeigneten Volumens von vorgewärmtem PBS. Aspirieren Sie die PBS und wiederholen Sie die sTep 2-3 mal und schließlich fügen Sie vorgewärmten frischen Fibroblasten Zellkultur Medium.
- Waschen Sie die angehängten Zellen am nächsten Tag mit vorgewärmtem PBS (wie im vorherigen Schritt) und fügen Sie vorgewärmtes frisches Medium hinzu. Ändern Sie das Medium nach allen 2-3 Tagen. Ein typischer Phänotyp von Fibroblasten am Tag 2 der Isolierung ist in 4A gezeigt .
HINWEIS: Die Fibroblasten werden in der Regel innerhalb von 5-7 Tagen halbkonfluent und sind dann bereit, trypsinisiert zu werden (Abschnitt 7.4) und für geplante Experimente verwendet. Bei diesem Verfahren erhalten wir gewöhnlich 95-99% reine Fibroblasten. Ein typischer Phänotyp von Fibroblasten am Tag 7 der Isolierung ist in Fig. 4B gezeigt .
- Trypsinisierung von Endothelzellen und Fibroblasten
- Aspirieren Sie das Medium aus der Zellkulturschale und fügen Sie genug vorgewärmtes PBS hinzu, um die Zellen zu bedecken.
- Aspiration von PBS und Zugabe von genügend Trypsin-EDTA-Lösung (0,05% bzw. 0,02%) zur Abdeckung der Zellen und Platzierung in thE 37 ° C Inkubator für 5 min.
- Resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren der Zellen auf und ab mit Hilfe einer 1-ml-Pipette und stoppen Trypsin-Aktion durch Zugabe von 10% FCS.
- Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation bei 250 xg für 10 min bei RT.
- Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen des vorgewärmten Zellkulturmediums.
8. Endothelzellencharakterisierung
HINWEIS: Die Reinheit der Endothelzellen wird durch Dil-Ac-LDL-Aufnahme und Immunfärbung von von Willebrand-Faktor (vWF) bestimmt. Die Zellen werden durch Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie visualisiert ( Fig. 3C-3E ).
- Dil-Ac-LDL-Aufnahme durch Endothelzellen
- Trypsinieren der Endothelzellen (Schritt 7.4) und kultivieren sie über Nacht auf Glasdeckgläschen in einer 12-Well-Platte (ca. 10 x 10 4 Zellen / cm 2 ).
- Das Medium ausspülen und die Zellen mit 1 ml Vor-w-Spülung ausspülenBewaffneten HBSS.
- Aspirieren Sie das HBSS und fügen Sie 1 ml Endothelzellkulturmedium hinzu, das 10 μg / ml Dil-Ac-LDL enthält und die Zellen im 37 ° C-Inkubator für 4 h belassen.
- Das Medium spülen und die Zellen mit vorgewärmtem PBS dreimal spülen und mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA, gelöst in PBS) fixieren. Inkubieren Sie sie mit PFA bei 37 ° C für 20 min.
HINWEIS: PFA ist korrosiv; Verwenden Sie bei der Handhabung von PFA-Lösungen stets säurebeständige Handschuhe. - Aspirieren Sie die PFA, spülen Sie die Zellen auf Deckglas in 12-Well-Platte mit 1 ml PBS dreimal und inkubieren sie mit Kernfärbelösung TO-PRO (10 μM) für 1 h bei RT.
HINWEIS: Wenn der entsprechende Filter für das Mikroskop zur Verfügung steht, können auch 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1 μg / ml) verwendet werden. In diesem Fall sollte die Inkubationszeit auf 10 min reduziert werden. - Spülen Sie Zellen auf Deckglas in 12-Well-Platte mit 1 ml PBS, aspirieren Sie die PBS, und wiederholen Sie den Schritt dreimal.
- Nimm die cÜberholen Sie die 12-Well-Platte und montieren Sie sie auf einem Glasschieber mit einem Tropfen Montagemedium. Die Zellen sind bereit, unter einem fluoreszierenden / konfokalen Mikroskop visualisiert zu werden. Für Dil-Ac-LDL, 640 nm für TO-PRO und 340-380 nm für DAPI ein Anregungsfilter von 530-560 nm verwenden.
- Von Willebrand (vWF) Färbung
- Kultur die Endothelzellen wie in Schritt 8.1.1 beschrieben.
- Das Medium ausspülen und die Zellen mit 1 ml vorgewärmtem HBSS ausspülen; Danach mit 4% PFA fixieren, wie in Schritt 8.1.4 beschrieben.
- Aspirieren Sie die PFA, spülen Sie die Zellen auf Deckglas in 12-Well-Platte mit 1 ml PBS zweimal und permeabilisieren die Zellen mit 1 ml 0,1% Triton X-100 (in PBS) für 20 min bei RT.
- Die permeabilisierende Lösung einatmen und die Zellen mit einer Blockierungslösung (5% BSA / 5% FCS in PBS) für 1 h inkubieren.
- Inkubieren Sie die Zellen mit Kaninchen anti-vWF Antikörper (1: 100) bei 4 ° C über Nacht in einer befeuchteten Kammer. Füge ein Deckglas ohne ThE primärer Antikörper als Negativkontrolle.
- Spülen Sie die Zellen auf dem Deckglas in 12-Well-Platte mit 1 ml PBS dreimal und inkubieren Sie die Zellen mit Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor-488 Antikörper (1: 500) und Kernfärbung Lösung TO-PRO (10 μM) für 1 h Bei RT
- Spülen Sie die Zellen auf dem Deckglas in 12-Well-Platte mit 1 ml PBS, aspirieren Sie die PBS, und wiederholen Sie den Schritt dreimal.
- Nehmen Sie das Deckglas aus der 12-Well-Platte und montieren Sie es auf eine Glasrutsche mit einem Tropfen Montagemedium. Die Zellen sind bereit, unter einem fluoreszierenden / konfokalen Mikroskop visualisiert zu werden. Für die Kernfärbung ein Anregungsfilter von 490 nm für vWF und 640 nm verwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das Isolationsverfahren führt zu einer Ausbeute von 70 - 80% lebensfähigen, stabförmigen, gestreiften Kardiomyozyten ( Abb. 2A und 2C ), die für geplante Experimente verwendet werden können. In unserem Labor werden Kardiomyozyten routinemäßig zur Analyse der Ca 2+ -Signalisierung verwendet. 5A zeigt intrazelluläre Calcium [Ca 2+ ] i- Oszillationen als Reaktion auf Ischämie / Reperfusion in Kardiomyozyten, die mit Fura-AM (5 & mgr; M) beladen sind. Abbildung 5B zeigt Veränderungen in [Ca 2+ ] i in Endothelzellen und Fibroblasten nach Zugabe von ATP (100 μM). Die Veränderungen in [Ca 2+ ] i in verschiedenen Herzzelltypen wurden wie zuvor beschrieben analysiert. 6 , 11 , 12
Re 1 "src =" / files / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
Abbildung 1: Modifiziertes Langendorff Perfusionssystem. ( A ) Das gesamte Langendorff-Perfusionssystem zur Isolierung von Herzzellen ( B ) Vergrößerte Ansicht des hängenden Herzens in der "Herzkammer", die auch für die Sammlung von Perfusionspuffer für die Rezirkulation verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Erwachsene Ratten-Kardiomyozyten. ( A ) Typische stabförmige, gesunde Kardiomyozyten 2 h nach dem Plattieren in lamininbeschichteten Zellkulturschalen ( B ) Ein typisches Beispiel für eine schlechte Vorbereitung durch unvollständige Gewebeverdauung. 2 h nach dem Plattieren in laminin-beschichteten Zellkulturschalen, moSt der Zellen sind hyperkontrahiert und schauen abgerundet, und es gibt wenige stabförmige Kardiomyozyten. Maßstab = 10 μm ( C ) Konfokale mikroskopische Aufnahme von Einzelkardiomyozyten, gefärbt für die Aktinvisualisierung, wie zuvor beschrieben. 13 Maßstab = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Rattenkardiale Endothelzellen. ( A ) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme der nichtkonfluenten Endothelzellmonoschicht 3 Tage nach der Isolierung. Dunkle Flecken sind die magnetischen Perlen, die noch an den Elternendothelzellen befestigt sind. Maßstab = 10 μm ( B ) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme der konfluenten Endothelzellmonoschicht 7 Tage nach der Isolierung ( C) Immunfärbung von Endothelzellen mit Dil-Ac-LDL-Aufnahme (Rot) und Nuklearfärbung (Blau) ( D ) Immunfärbung von Endothelzellen mit Färbung von vWF (Rot) und Nuklearfärbung (Blau) ( E ) Zellen, die nur mit Sekundärantikörper inkubiert wurden Und Kernfleck (blau) (Maßstab = 50 μm) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Ratten-Herz-Fibroblasten. ( A ) Typische spindelförmige Herzfibroblasten am zweiten Tag der Isolation. ( B ) Konfluente, reine Fibroblasten nach 7 Tagen Kultur. ( C ) Ein typisches Beispiel für eine schlechte Zubereitung, die mit Epithelzellen kontaminiert ist. Zellen, die durch Pfeilspitzen angegeben sind, sind die Herzepithelzellen . Maßstab = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Änderungen in [Ca 2+ ] i in Herzzellen. ( A ) Repräsentative Verfolgungen von Veränderungen des intrazellulären Calciums [Ca 2+ ] i, gemessen durch Fura-2-Verhältnis in Ratten-Kardiomyozyten, die einer chemischen Ischämie ausgesetzt sind (Na-Cyanat, 2 mM), gefolgt von Reperfusion ( B ) Repräsentative Spuren von Veränderungen in intrazellulärem Calcium [Ca 2+ ] i, gemessen durch Fura-2-Verhältnis in Ratten-Herzendothelzellen und Fibroblasten, behandelt mit ATP (100 & mgr; M), wie angegeben. > Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Artikel wird ein reproduzierbares Protokoll für die Isolierung und Kultur von Herz-Myozyten, Endothelzellen und Fibroblasten beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige und qualitativ hochwertige Isolierung der wichtigsten Zelltypen von Herzgewebe, dh Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten im Gegensatz zu nur einem Zelltyp. Ein kritischer Schritt in der Isolation ist die richtige Verdauung des Herzgewebes. Wenn die Verdauung unvollständig ist, kann noch eine große Anzahl von Myozyten erhalten werden, aber ihre Qualität ist sehr schlecht und sie sind meist hyperkontrahiert und runde (Abbildung 2B ) und von keinem Wert in Experimenten. Darüber hinaus wird auch die Ausbeute an Endothelzellen und Fibroblasten reduziert. Dieses Problem kann durch die Steuerung der Verdauungszeit gelöst werden. Vor dem Entfernen des Herzens aus dem Perfusionssystem kann die Weichheit des Herzens mit Hilfe von Pinzetten und Fingerspitzen überprüft werden. Ist das Gewebe noch nicht spürbar sOft kann das Herz für weitere 5-10 min perfundiert werden. Ein zweiter kritischer Schritt bei der gesunden Kardiomyozytenisolation ist die inkrementelle Wiederherstellung von Ca 2+ in den Isolationspuffern. Eine rasche Wiederherstellung hoher Konzentrationen von Ca 2+ in den Medien führt zu gerundeten Kardiomyozyten. Die Qualität des Wassers, das für die Herstellung von Puffern verwendet wird, ist ein weiterer wichtiger Faktor, der die Qualität der Kardiomyozyten beeinflusst. Daher wird die Verwendung von gutem Wasser empfohlen.
Die Reinheit der Endothelzellen hängt stark von den Waschschritten ab. EDTA muss in dem Waschpuffer vorhanden sein, um eine unspezifische Bindung von nicht-endothelialen Zellen an die magnetischen Kügelchen zu verhindern. Die Anwesenheit von Blutzellen in der Zellsuspension wird die Ausbeute an Endothelzellen stark reduzieren; Daher ist das richtige Waschen des Herzens sehr kritisch nach der Montage des Herzens im Perfusionssystem und vor der Zugabe von Kollagenase. Restliche Blutkomponenten reduzieren auch tDie Aktivität der Kollagenase und damit die Verdauung des Herzens.
Die häufigste Kontamination in der Fibroblastenzellkultur ist das Auftreten von Satellitenkolonien von Epithelzellen (Abbildung 4C ). Diese Verunreinigung kann durch zweistufige Kultivierung von Fibroblasten vermieden werden. Im ersten Schritt wird die Konzentration des FCS im Fibroblastenzellkulturmedium auf 5% reduziert und die Zellsuspension wird an der Zellkulturschale für 30 min im Inkubator haften gelassen. Epithelzellen haften schnell, aber die Fibroblastenzell-Adhäsionszeit wird in Gegenwart einer niedrigen Serumkonzentration erhöht. Nach 30 min Inkubation wird die Zellsuspension, die nicht adhärierende Fibroblasten enthält, sorgfältig zu einer neuen Zellkulturschale entfernt. Auf diese Weise kann die Ausbeute an Fibroblasten reduziert werden, aber ihre Reinheit wird stark erhöht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autoren haben nichts zu erklären.
Acknowledgments
Die technische Unterstützung von L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas und A. Weber ist dankbar anerkannt. Die Autoren danken auch Dr. E. Martinson für umfangreiche Korrekturlesen und Sprachbearbeitung des Manuskripts. Die Studie wurde von der Universität Giessen Anschubsfinanzierung für M. Aslam und D. Gündüz unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
