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Biology

Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto

Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55601
Automatic Translation
1, 1, 1
1Internal Medicine, Cardiology and Angiology, University Hospital Giessen

Summary

Vários protocolos foram desenvolvidos e descritos para o isolamento de diferentes tipos de células cardíacas a partir de um coração de rato. Aqui, descreve-se um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas maiores (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) de alta qualidade de uma única preparação, reduzindo os custos experimentais.

Abstract

O rato é um modelo animal importante utilizado na investigação cardiovascular e as células cardíacas de rato são utilizadas rotineiramente para a análise in vitro dos mecanismos moleculares da progressão da doença cardiovascular, tais como hipertrofia cardíaca, fibrose e aterosclerose. Embora tenham sido feitas várias tentativas com sucesso variável para desenvolver linhas celulares imortalizadas a partir do sistema cardiovascular para compreender estes mecanismos celulares, as células primárias oferecem um ambiente mais natural e próximo ao ambiente in vivo para tais estudos. Por conseguinte, diferentes laboratórios que trabalham num tipo de célula particular desenvolveram protocolos para isolar tipos individuais de células cardíacas de ratos de interesse. Um protocolo que permite o isolamento de mais de um tipo de célula, no entanto, está faltando. Aqui é descrito um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas principais de alta qualidade (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) a partir de uma única preparação e permiteR para análises celulares. Isso permite o uso mais eficiente dos recursos disponíveis, o que pode economizar tempo e reduzir os custos de pesquisa.

Introduction

Os modelos de roedores têm sido usados ​​há muito tempo como ferramentas para ampliar nossa compreensão da fisiologia cardiovascular na saúde e na doença. 1 Embora estes modelos animais nos permitam compreender a fisiopatologia de uma doença a nível de órgãos e analisar a farmacocinética e a farmacodinâmica de vários agentes farmacológicos utilizados no tratamento de doenças cardiovasculares, a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento de doenças cardiovasculares ea contribuição de uma determinada doença Tipo celular requer o uso de modelos de cultura celular in vitro . Para este fim foram desenvolvidas diferentes linhas celulares imortalizadas do sistema cardiovascular; 2 , 3 contudo, as células primárias recentemente isoladas são fisiológica e funcionalmente mais relevantes para os tecidos e organismos vivos.

O coração é um órgão versátil que contém todos os principais tipos de células do sistema cardiovascular.Ystem, eo rato coração ainda é um modelo comumente usado para a compreensão da fisiologia cardiovascular. Durante as últimas décadas, foram descritos métodos diferentes para o isolamento de tipos de células individuais a partir de tecido cardíaco; 4 , 5 , 6 , 7 no entanto, estes métodos centram-se apenas no isolamento de um tipo de célula específico resultando na perda de outros tipos de células que não podem mais ser utilizadas para análise celular. Descreve-se aqui um protocolo otimizado que permite o isolamento simultâneo e de alta qualidade dos principais tipos celulares de tecido cardíaco, isto é, cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos. Todos estes tipos de células podem ser utilizados em diferentes configurações experimentais 8 , 9 , 10 e para a análise de interacções célula-célula a partir do mesmo animal.

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Protocol

A investigação está em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH Publication No. 85-23 1985) e foi aprovado pelo comitê de ética local da Universidade de Giessen. Utilizaram-se ratos Wistar machos adultos pesando 200 - 250 g neste estudo.

1. Autoclavagem

  1. Pelo menos um dia antes do procedimento a ser realizado, autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, pontas de pipeta e pipetas Pasteur para ser usado no procedimento de isolamento a 121 ° C por 30 min.

2. Preparação de meios e soluções

NOTA: As soluções dos passos 2.1-2.4 podem ser preparadas até uma semana antes do isolamento e armazenadas a 4 ° C, mas preparar as soluções nos passos 2.5-2.8 no dia do isolamento. As receitas completas dos tampões e dos meios de comunicação são apresentadas na Tabela 1 . Aquecer todos os meios e soluções a 37 ° C numaÁgua antes de iniciar a preparação.

  1. Preparar o meio Powell dissolvendo os produtos químicos listados na Tabela 1 em 4,5 L de H2O à temperatura ambiente (RT). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 2,0 N e levar o volume a 5,0 L. Esterilizar a solução e armazená-la a 4 ° C.
  2. Preparar o meio de creatina, L-carnitina e taurina (CCT) dissolvendo o meio em pó M199 em 4,5 L de H2O. Adicionar HEPES em pó de acordo com a Tabela ao meio e misturar durante 15 min. Adicionar creatina, carnitina, taurina e Ara-C de acordo com a Tabela 1 . Misturar bem, ajustar o pH com pH-metro para 7,4 com NaOH 2,0 N e levar o volume a 5,0 L. Filtro esterilizado e armazenar a 4 ° C.
  3. Preparar o meio de cultura celular para fibroblastos por adição de 10% de soro de vitelo fetal (FCS) e 2% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) ao meio M199. DMEM é igualmente adequado como M199 e também pode ser utilizado para cultura de células de fibroblastos.
  4. Preparar a cultura de células MV2E para as células endoteliais, adicionando todos os conteúdos da mistura de suplementos ao meio basal MV2 de acordo com as instruções do fabricante. Tomar uma alíquota de 5 mL e aquecer a 37 ° C em banho-maria.
  5. Preparar o tampão de isolamento das células endoteliais por dissolução de 0,05 g de albumina de soro bovino (BSA) em 50 mL de solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) e adição de 0,5 mL de solução de ácido etilenodiaminotetraacético 200 mM (EDTA). Esterilizar este filtro e armazená-lo a 4 ° C.
  6. Preparar o tampão de lavagem de células endoteliais por adição de 0,1 mL de 200 mM a 9,9 mL de PBS e armazená-lo a 4 ° C.
  7. Preparar solução de colagenase por dissolução de 27 mg de colagenase em 5 mL de meio Powell e adicionar 12,5 μL de solução de CaCl 2 100 mM a ele. Aquecer a 37 ° C em banho-maria.
  8. Preparar soluções incrementais de restauração de Ca2 + 1, 2 e 3 para cardiomiócitos adicionando 12,5 μL, 25 μL e 120 μL de solução de CaCl2 100 mM6 mL, 6 mL e 12 mL de meio Powell, respectivamente.
  9. Pré-revestir as placas de cultura de células para cardiomiócitos um dia antes do isolamento adicionando 1 mL de meio de pré-revestimento contendo laminina a cada placa de cultura celular de 35 mm. Incubar em incubadora de cultura celular a 37 ° C durante a noite.

3. Preparação de grânulos magnéticos

  1. Colocar 0,5 mL do tampão de isolamento das células endoteliais num tubo de amostra de 1,5 mL em gelo.
  2. Adicionar 5 μL (2 x 10 6 ) de pérolas magnéticas de IgG de rato pan e misturar bem.
  3. Coloque o tubo no suporte magnético durante 1 min. As contas irão aderir à parede do tubo em direcção ao íman. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.
  4. Repetir a lavagem duas vezes mais e finalmente re-suspender as esferas em 50 μL de tampão de isolamento de células endoteliais e armazenar a 4 ° C até o uso.

4. Preparação do sistema de perfusão de Langendorff

  1. LimpoSistema Langendorff por perfusão com 2 L de água destilada.
  2. Circule 50 mL de meio Powell através do sistema por 5 min e descarte o meio.
  3. Adicionar 80 mL de meio Powell fresco. Perfusão contínua com "carbogen" borbulhando com uma pipeta Pasteur vidro do cilindro de gás. Deixe o meio recircular através do sistema. O sistema está agora pronto para perfundir o coração ( Figura 1A ).

5. Dissecção do Rato

  1. Coloque o rato em um dessecador de 5 L sob uma exaustão e adicione 1,5 mL de isoflurano a 4-5% através do respiradouro e feche a tampa.
    NOTA: Colocar o animal sobre uma placa perfurada elevada dentro do dessecador para evitar o contato direto do animal com o isoflurano líquido.
  2. Espere até que o rato perca o reflexo da tampa (geralmente ~ 5 min) e, em seguida, retire o rato do exsicador. Eutanizar o rato por deslocamento cervical.
  3. Corte a pele abdominal eo músculo subjacente horizontalAliado no meio usando um par de tesouras afiadas. Em seguida, corte o músculo verticalmente para o esterno do rato e abra o tórax. Remova o coração junto com os pulmões e coloque imediatamente os órgãos em solução gelada de NaCl a 0,9%.
  4. Remova os pulmões com a ajuda de um par de tesouras e descartá-los. Limpe o coração de qualquer tecido conjuntivo e corte a aorta caudalmente no ramo braquiocefálico.

6. Perfusão do Coração e Digestão com Colagenase

  1. Monte o coração através da aorta no sistema de perfusão de Langendorff (Seção 4) usando dois pares de pinças curvas e finas. Para assegurar que o miocárdio é perfundido de forma retrógrada, colocar a extremidade da cânula do sistema de perfusão entre o primeiro ramo aórtico ea válvula aórtica. Fixar a aorta usando um grampo de crocodilo.
  2. Fixar o coração com uma sutura cirúrgica, e remover o grampo de crocodilo ( Figura 1B ).
  3. Abra a válvula da cânula para permitir que o meio de perfusão (35 mL) passe através do coração gota a gota (60 gotas / min, 5 mL / min) para lavar qualquer sangue residual. Descarte qualquer fluxo através desta etapa.
    NOTA: Evite a formação de bolhas de ar em qualquer estágio da perfusão, pois isso resultará em digestão incompleta e falha no procedimento de isolamento celular.
  4. Coloque o coração pendurado no funil coletor (câmara do coração, Figura 1B ) e inicie a bomba peristáltica, que recirculará o meio de perfusão do funil coletor para o reservatório ( Figura 1A ).
  5. Adicionar a solução de colagenase (do passo 2.8) ao meio de perfusão. Perfundir o coração com solução de colagenase recirculante por 30 min.
    NOTA: Esta etapa é muito crítica para otimizar o rendimento celular. O tempo de perfusão depende da actividade da colagenase, a qual pode variar dependendo do lote. Teste 3-4 lotes de colagenase para encontrar um com optiAtividade maligna; Então grandes quantidades do lote mais adequado podem ser adquiridas que são suficientes para pelo menos um ano para resultados reprodutíveis.
  6. No final do tempo de digestão, parar a perfusão, retire o coração do sistema Langendorff usando um par de tesouras e coloque-o em uma placa de Petri de vidro.
  7. Cortar e descartar ambos os átrios, e remover quaisquer tecidos gordurosos sobra. Cuidadosamente descascar o pericárdio com a ajuda de dois pares de fórceps para evitar a contaminação das células epiteliais.
    NOTA: O pericárdio pode ser ainda digerido com colagenase para obter células epiteliais cardíacas puras, se necessário. Um protocolo detalhado não é dado no presente estudo, uma vez que está além do âmbito do presente protocolo.
  8. Corte o coração no meio com um par de tesouras e coloque-o no cortador de tecido. Picar o coração 2-3 vezes e re-suspender o tecido picado em 12 ml do tampão de digestão da perfusão Langendorff.
    NOTA: Não corte o hEart excessivamente, pois isso resultará em uma maior proporção de cardiomiócitos mortos.
  9. Transferir o tecido triturado para 15 mL de meio de dissociação contendo colagenase e deixá-lo digerir num banho de água durante 5-10 min com mistura ocasional por re-suspensão utilizando uma pipeta de plástico descartável de 5 mL.
  10. No final do período de digestão, filtrar a suspensão celular através de um crivo de 100 μm. Descarte os resíduos de tecidos e material não digerido.
  11. No final da perfusão de Langendorff, lave o sistema de perfusão imediatamente com um mínimo de 1 L de água destilada. Perfundir o sistema por recirculação de 100 mL de NaOH 0,1 N durante 30 min, e finalmente lave o sistema com 2-3 L de água destilada. Secar o sistema por descarga de ar e cobrir a abertura com para-filme.

7. Isolamento das Células Cardíacas do Rato

  1. Isolamento e cultura de cardiomiócitos
    1. Centrifugar a suspensão celular a 25 xg durante 1 min (sem brAkes) para sedimentar os cardiomiócitos. Os cardiomiócitos podem também ser deixados sedimentar durante 10 min à RT sem centrifugação.
    2. Remova cuidadosamente o sobrenadante contendo células endoteliais e fibroblastos com a ajuda de uma pipeta de plástico descartável em um novo tubo de 50 mL.
    3. Ressuspender o sedimento de cardiomiócitos em solução de Ca2 + 6 mL 1 (Passo 2.9). Deixar 1 min para que as células se ajustem ao ambiente de baixa concentração de Ca2 + e centrifugar novamente a suspensão celular a 25 xg durante 1 min (sem freios).
    4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 6 mL de solução de Ca2 + 2 (Passo 2.9). Permitir que as células 1 min para ajustar a concentração intermediária de Ca 2 + , e finalmente adicionar 12 mL de Ca 2 + solução 3 (Etapa 2.9) para as células. Misture com a ajuda de uma pipeta de plástico descartável.
    5. Centrifugar a suspensão celular a 25 xg durante 1 min.
    6. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL pré- meio CCT aquecido. Adicionar 1 mL da suspensão celular a cada um dos 20 pratos de cultura celular estéril de 35 mm previamente revestidos com laminina (Passo 2.9) e deixar as células se prenderem durante 2 h num incubador de cultura de células sem CO 2 .
      NOTA: Os cardiomiócitos também podem ser cultivados sob ambiente de CO 2 ; No entanto, neste caso deve ser utilizado meio com sistema tampão bicarbonato.
    7. Após 2 h, substitua o meio por 2 mL novos de meio CCT para remover quaisquer células mortas.
      NOTA: As células estão prontas para qualquer experimento planejado e podem ser cultivadas por até 3 dias em uma incubadora de cultura de células típica (sem CO 2 ) sem perda significativa de células vivas. Os cardiomiócitos saudáveis ​​em forma de bastão típicos são mostrados na Figura 2A .
  2. Isolamento de células endoteliais e fibroblastos
    1. Centrifugar o sobrenadante contendo células endoteliais e fibroblastos (do passo 7.1.2) a 250 xg durante 10 min.
    2. Descarte o supeRnatante e ressuspender o sedimento celular em 1,5 mL de tampão de isolamento de células endoteliais num tubo de amostra de 2 mL.
    3. Adicionar 3 μg (1: 500) de anticorpo anti-CD31 de ratinho murganho à suspensão celular e incubar a 4 ° C durante 30 min com rotação de extremidade a extremidade.
      NOTA: É aconselhável uma titulação do anticorpo para uma diluição óptima. Esta etapa deve ser realizada a 4 ° C como na RT uma rápida internalização do anticorpo pelas células endoteliais resultará em baixo rendimento.
    4. Adicionar as pérolas anti-IgG de rato previamente preparadas (Secção 3) à suspensão de células e incubar durante 20 min a 4 ° C com rotação de extremidade a extremidade.
      NOTA: Alternativamente, o anticorpo anti-CD31 de rato pode ser pré-ligado às esferas magnéticas e depois adicionado à suspensão celular. No entanto, isto irá aumentar o tempo de incubação das pérolas com a suspensão celular e pode resultar em ligação não específica aumentada de células não endoteliais e consequentemente maior contaminação de outros tipos de células.
    5. UMAT à extremidade do tempo de incubação do anticorpo, colocar o tubo contendo a suspensão celular num suporte magnético e deixar 2 min para sedimentar os grânulos magnéticos ligados às células endoteliais ao lado do tubo.
    6. Remover cuidadosamente o restante da suspensão celular (contendo principalmente os fibroblastos) utilizando uma pipeta de 1 mL e adicioná-la a um prato de cultura celular de 10 cm contendo 10 mL de meio de cultura de células de fibroblasto (Passo 2.3). Colocá-lo em uma incubadora de cultura celular típica contendo 5% de CO2. O procedimento continua na Etapa 7.3.
    7. Adicionar 1 mL de tampão de lavagem ao tubo com contas magnéticas contendo as células endoteliais.
    8. Tampe o tubo, retire-o do suporte magnético e cuidadosamente resuspenda as contas, agitando suavemente para cima e para baixo 4-5 vezes. Coloque o tubo novamente no rack magnético, deixe as contas de assentar na parede do tubo durante 1 min, e cuidadosamente remover o tampão de lavagem.
    9. Repita os passos de lavagem 5 - 7 vezes para se livrar de qualquer contaminante nEm células endoteliais.
    10. Ressuspender as células endoteliais ligadas às esferas em 1 mL de meio de cultura de células endoteliais MV2, adicionar a um único poço de uma placa de 12 poços e incubar num incubador de cultura de células CO 2 .
    11. Permitir que as células para anexar durante a noite e alterar o meio no dia seguinte e, em seguida, a cada 2-3 dias até que as células se tornam semi-confluentes (geralmente 5-7 dias).
      NOTA: As células endoteliais não confluentes típicas após 3 a 4 dias e as células endoteliais confluentes após 7-10 dias de isolamento são mostradas nas Figuras 3A e 3B , respectivamente. As células podem então ser tripsinizadas (secção 7.4) e semeadas num frasco de cultura de células T25.
  3. Lavagem e cultura de fibroblastos (continuar a partir do passo 7.2.6)
    1. Após 1 h de incubação, aspirar o meio e lavar os fibroblastos ligados ao prato de cultura celular por adição de um volume apropriado de PBS pré-aquecido. Aspirar o PBS e repetir o sTep 2-3 vezes e finalmente adicionar meio de cultura de células de fibroblasto fresco pré-aquecido.
    2. Lavar as células ligadas de novo no dia seguinte com PBS pré-aquecido (como no passo anterior) e adicionar meio fresco pré-aquecido. Mude o meio depois de 2-3 dias. Um fenotipo típico de fibroblastos no dia 2 de isolamento é mostrado na Figura 4A .
      NOTA: Os fibroblastos tornam-se semi-confluentes normalmente dentro de 5-7 dias e estão então prontos para serem tripsinizados (secção 7.4) e utilizados para experiências planeadas. Com este procedimento, usualmente obtemos 95-99% de fibroblastos puros. Um fenotipo típico de fibroblastos no dia 7 de isolamento é mostrado na Figura 4B .
  4. A tripsinização de células endoteliais e fibroblastos
    1. Aspirar o meio do prato de cultura celular e adicionar suficiente pré-aquecido PBS para cobrir as células.
    2. Aspirar PBS e adicionar suficiente solução de tripsina-EDTA (0,05% e 0,02%, respectivamente) para cobrir as células e colocar emE incubadora a 37 ° C durante 5 min.
    3. Ressuspender as células pipetando as células para cima e para baixo com a ajuda de uma pipeta de 1 ml e parar a ação de tripsina, adicionando FCS 10%.
    4. Pellet a suspensão de células por centrifugação a 250 xg durante 10 min à RT.
    5. Ressuspender as células num volume apropriado de meio de cultura celular pré-aquecido.

8. Caracterização de células endoteliais

NOTA: A pureza das células endoteliais é determinada pela absorção de Dil-Ac-LDL e imunocoloração do factor von Willebrand (vWF). As células são visualizadas por fluorescência ou microscopia confocal ( Figuras 3C-3E ).

  1. Dil-Ac-LDL por células endoteliais
    1. Trypsinize as células endoteliais (passo 7.4) e cultura-los durante a noite em lamínulas de vidro em uma placa de 12 poços (aproximadamente 10 x 104 células / cm 2 ).
    2. Aspirar o meio e enxaguar as células com 1 mL de pré-wArmado HBSS.
    3. Aspirar o HBSS e adicionar 1 mL de meio de cultura de células endoteliais contendo 10 μg / mL de Dil-Ac-LDL e deixar as células no incubador a 37 ° C durante 4 h.
    4. Aspirar o meio e enxaguar as células com PBS pré-aquecido três vezes e fixá-las com 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA, dissolvido em PBS). Incubar com PFA a 37 ° C durante 20 min.
      NOTA: PFA é corrosivo; Sempre use luvas resistentes aos ácidos ao manusear a solução PFA.
    5. Aspirar o PFA, enxaguar as células na lamela em 12-poço placa com 1 mL de PBS três vezes e incubá-los com solução de coloração nuclear TO-PRO (10 μ M) durante 1 h à RT.
      NOTA: Se o filtro apropriado estiver disponível para o microscópio, também pode ser usado 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1 μg / mL). Neste caso, o tempo de incubação deve ser reduzido para 10 min.
    6. Enxágüe as células em lamínulas em placas de 12 poços com 1 mL de PBS, aspirar o PBS e repita o passo três vezes.
    7. Pegue o cOverslip fora da placa de 12 poços e montá-lo em um slide de vidro com uma gota de mídia de montagem. As células estão prontas para serem visualizadas sob um microscópio fluorescente / confocal. Utilizar um filtro de excitação de 530-560 nm para Dil-Ac-LDL, 640 nm para TO-PRO e 340-380 nm para DAPI.
  2. Von Willebrand (vWF)
    1. Cultura das células endoteliais como descrito no passo 8.1.1.
    2. Aspirar o meio e enxaguar as células com 1 mL de HBSS pré-aquecido; Em seguida, fixar com PFA a 4% como descrito no passo 8.1.4.
    3. Aspirar o PFA, enxaguar as células na lamela em placa de 12 poços com 1 mL de PBS duas vezes, e permeabilizar as células com 1 mL de 0,1% Triton X-100 (em PBS) durante 20 min à RT.
    4. Aspirar a solução permeabilizante e incubar as células com solução de bloqueio (5% BSA / 5% FCS em PBS) durante 1 h.
    5. Incubar as células com anticorpo anti-vWF de coelho (1: 100) a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada. Adicione uma lambreta semE anticorpo primário como um controlo negativo.
    6. Enxaguar as células da lamela em placas de 12 poços com 1 mL de PBS três vezes e incubar as células com anticorpo de burro anti-coelho Alexa Fluor-488 (1: 500) e solução de coloração nuclear TO-PRO (10 μM) durante 1 h À TA.
    7. Enxaguar as células na lamela em placa de 12 poços com 1 mL de PBS, aspirar o PBS e repetir o passo três vezes.
    8. Pegue a lamela para fora da placa de 12 poços e montá-lo em uma lâmina de vidro com uma gota de mídia de montagem. As células estão prontas para serem visualizadas sob um microscópio fluorescente / confocal. Utilizar um filtro de excitação de 490 nm para vWF e 640 nm para coloração nuclear.

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Representative Results

O procedimento de isolamento resulta num rendimento de 70 a 80% de cardiomiócitos estriados viáveis, em forma de bastonete ( Figuras 2A e 2C ) que podem ser utilizados para experiências planeadas. No nosso laboratório, os cardiomiócitos são rotineiramente utilizados para análise da sinalização de Ca 2+ . A Figura 5A ilustra as oscilações intracelulares de cálcio [Ca2 + ] i em resposta à isquemia / reperfusão em cardiomiócitos carregados com Fura-AM (5 μM). A Figura 5B mostra alterações em [Ca2 + ] i em células endoteliais e fibroblastos após adição de ATP (100 μM). As alterações em [Ca2 + ] i em diferentes tipos de células cardíacas foram analisadas como descrito anteriormente. 6 , 11 , 12

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Figura 1: Sistema de perfusão de Langendorff modificado. ( A ) Todo o sistema de perfusão de Langendorff utilizado para o isolamento de células cardíacas ( B ) Vista ampliada do coração pendurado na "câmara cardíaca" também usado para a coleta de tampão de perfusão para recirculação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Cardiomiócitos de ratos adultos. ( A ) Cardiomiócitos típicos em forma de bastonete saudáveis ​​2 h após plaqueamento em placas de cultura de células revestidas com laminina ( B ) Um exemplo típico de uma má preparação devido a digestão incompleta do tecido. 2 h após plaqueamento em placas de cultura de células revestidas com laminina, moSt das células são hipercontratadas e parecem arredondadas, e há poucos cardiomiócitos em forma de bastonete. Barra de escala = 10 μm ( C ) Micrografia confocal de um cardiomiócito único corado para visualização de actina como descrito anteriormente. 13 Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Células endoteliais cardíacas de rato. ( A ) Micrografia de contraste de fase de monocamada de células endoteliais não confluentes 3 dias após isolamento. Os pontos escuros são os grânulos magnéticos que ainda estão ligados às células endoteliais precursoras. Barra de escala = 10 μm ( B ) Micrografia de contraste de fase da monocamada de células endoteliais confluentes 7 dias após o isolamento ( C) Imunomarcação de células endoteliais mostrando manuseamento de vWF (Vermelho) e coloração nuclear (Azul) ( E ) As células incubadas apenas com anticorpo secundário E mancha nuclear (Azul) (Barra de escala = 50 μm) Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4: Fibroblastos cardíacos de ratos. ( A ) Fibroblastos cardíacos típicos fusiformes no segundo dia de isolamento. ( B ) Fibroblastos puros confluentes após 7 dias de cultura. ( C ) Um exemplo típico de uma preparação pobre contaminada com células epiteliais. As células indicadas por pontas de seta são as células epiteliais cardíacas . Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Alterações em [Ca2 + ] i em Células Cardíacas. ( A ) Traçados representativos de alterações no cálcio intracelular [Ca2 + ] i medidos pela relação Fura-2 em cardiomiócitos de ratos expostos a isquemia química (cianato de Na, 2 mM) seguida de reperfusão ( B ) Traçados representativos de alterações no cálcio intracelular [Ca2 + ] i medido pela relação Fura-2 em células endoteliais cardíacas de ratos e fibroblastos, tratados com ATP (100 μM) como indicado. > Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste artigo, descreve-se um protocolo reprodutível para o isolamento e cultura de miócitos cardíacos, células endoteliais e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento simultâneo e de alta qualidade dos principais tipos celulares de tecido cardíaco, isto é , cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos em oposição a apenas um tipo de célula. Um passo crítico no procedimento de isolamento é a digestão adequada do tecido cardíaco. Se a digestão estiver incompleta, ainda pode ser obtido um grande número de miócitos, mas a sua qualidade é muito fraca e são em grande parte hipercontratados e redondos ( Figura 2B ) e sem valor em experiências. Além disso, o rendimento de células endoteliais e fibroblastos também será reduzido. Este problema pode ser resolvido controlando o tempo de digestão. Antes de remover o coração do sistema de perfusão, a suavidade do coração pode ser verificada com a ajuda de fórceps e pontas dos dedos. Se o tecido ainda nãoFrequentemente, o coração pode ser perfundido durante mais 5-10 minutos. Um segundo passo crítico no isolamento saudável de cardiomiócitos é a restauração incremental de Ca2 + nos tampões de isolamento. Uma rápida restauração de altas concentrações de Ca2 + nos meios resultará em cardiomiócitos arredondados. A qualidade da água utilizada para a preparação de tampões é outro factor importante que afecta a qualidade dos cardiomiócitos. Portanto, o uso de água de boa qualidade é recomendado.

A pureza das células endoteliais é altamente dependente dos passos de lavagem. O EDTA deve estar presente no tampão de lavagem para evitar a ligação não específica de células não endoteliais às pérolas magnéticas. A presença de células sanguíneas na suspensão celular irá reduzir grandemente o rendimento das células endoteliais; Portanto, lavagem adequada do coração é muito crítico após a montagem do coração no sistema de perfusão e antes da adição de colagenase. Os componentes sanguíneos residuais tambémAtividade da colagenase e, portanto, dificultar a digestão do coração.

A contaminação mais comum na cultura de células de fibroblastos é o aparecimento de colónias satélites de células epiteliais ( Figura 4C ). Esta contaminação pode ser evitada através da cultura em dois passos de fibroblastos. No primeiro passo, a concentração de FCS no meio de cultura de células de fibroblasto é reduzida para 5% e a suspensão de células é deixada aderir ao prato de cultura de células durante 30 min na incubadora. As células epiteliais aderem rapidamente, mas o tempo de adesão das células fibroblastos aumenta na presença de uma baixa concentração de soro. Após 30 min de incubação, a suspensão celular contendo fibroblastos não aderentes é cuidadosamente removida para um novo prato de cultura celular. Deste modo, o rendimento de fibroblastos pode ser reduzido mas a sua pureza é grandemente aumentada.

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Disclosures

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgments

O apoio técnico de L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas e A. Weber é reconhecido com gratidão. Os autores também desejam agradecer Dr. E. Martinson para extensa leitura de prova e edição de linguagem do manuscrito. O estudo foi apoiado pela Universidade de Giessen Anschubsfinanzierung concessão a M. Aslam e D. Gündüz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-vWF Santa Cruz Biotech. SC-14014
Calcium chloride Merck 102378
Carnitin Sigma-Aldrich C0283
Collagenase type II Worthington LS004176
Creatin Sigma-Aldrich C0780
D-Glucose Merck 108342
Dil-Ac-LDL Thermo Scientific L3484
EDTA Solution (0.2 M) Biochrome AG L2113
Embeding solution Citiflour AF1-25
Endothelial cell medium MV2 PromoCell C-22022
Foetal calf serum (FCS) Biochrome AG S0615
Gentamicin Serva Chemicals 47991
HEPES Sigma-Aldrich H0887
Isoflurane Abbott TU 061219
Laminin  Roche/Sigma 11243217001
M199 medium Thermo Scientific 11150059
M199 medium (Powder) Biochrome AG T061
Magnesium sulphate Sigma-Aldrich 63138
Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) Thermo Scientific MA1-81051
NaCl solution (0.9%), Sterile B. Braun 30820080
Pan mouse IgG beads (Dynabeads) Thermo Scientific 11041
Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution Santa Cruz Biotech. sc-281692
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063
Phosphate buffer saline (PBS) 1x  PAN-Biotech P04-36500
Plastic consumables Greiner Bio-One
Potassium Chloride Merck 4933
Potassium dihydrogen phosphate Merck 7873
Sodium Chloride Merck 6404
Sodium Hydroxide Solution (2 N) Merck 109136
Sterile filtration system Thermo Scientific 5660020
Taurine Sigma-Aldrich T8691
TO-PRO Thermo Scientific T3605
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma-Aldrich T4174
Water, Sterile B. Braun

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References

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Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto
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Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. J. Vis. Exp. (123), e55601, doi:10.3791/55601 (2017).

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