Summary
Flera protokoll har utvecklats och beskrivits för isolering av olika hjärtceller från ett råtthjärta. Här beskrivs ett optimerat protokoll som möjliggör isolering av högkvalitativa viktiga hjärtceller (kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster) från en enda beredning, vilket minskar försökskostnaderna.
Abstract
Råttan är en viktig djurmodell som används vid kardiovaskulär forskning, och råtta hjärtceller används rutinmässigt för in vitro- analys av de molekylära mekanismerna för kardiovaskulär sjukdomsprogression såsom hjärthypertrofi, fibros och ateroskleros. Även om flera försök med varierande framgång har gjorts för att utveckla odödliga cellinjer från hjärt-kärlsystemet för att förstå dessa cellulära mekanismer, erbjuder primära celler en mer naturlig och nära in vivo- miljö för sådana studier. Därför har olika laboratorier som arbetar med en viss celltyp utvecklat protokoll för att isolera enskilda typer av råttkardialceller av intresse. Ett protokoll som tillåter isolering av mer än en celltyp saknas emellertid. Här beskrivs ett optimerat protokoll som möjliggör isolering av högkvalitativa stora hjärtceller (kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster) från en enda beredning och möjliggör denR används för cellanalyser. Detta möjliggör den mest effektiva användningen av tillgängliga resurser, vilket kan spara tid och minska forskningskostnaderna.
Introduction
Gnagare modeller har länge använts som verktyg för att bredda vår förståelse för kardiovaskulär fysiologi inom hälsa och sjukdom. 1 Även om dessa djurmodeller tillåter oss att förstå patofysiologin hos en sjukdom på orgennivå och att analysera farmakokinetiken och farmakodynamiken hos olika farmakologiska medel som används för att behandla hjärt-kärlsjukdomar, förståelse av de molekylära mekanismerna för utveckling av kardiovaskulär sjukdom och bidraget från en särskild Celltyp kräver användning av in vitro cellodlingsmodeller. För detta ändamål har olika immortaliserade cellinjer från kardiovaskulärsystemet utvecklats; 2 , 3 är färskt isolerade primära celler emellertid fysiologiskt och funktionellt mer relevanta för levande vävnader och organismer.
Hjärtat är ett mångsidigt organ som innehåller alla större typer av celler i hjärt-kärlsjukdomarYstem och råtthjärtat är fortfarande en vanlig modell för förståelse av kardiovaskulär fysiologi. Under de senaste decennierna har olika metoder för isolering av individuella celltyper från hjärtvävnad beskrivits; 4 , 5 , 6 , 7, men dessa metoder fokuserar endast på isoleringen av en specifik celltyp som resulterar i förlusten av andra typer av celler som inte längre kan användas för cellanalys. Här beskrivs ett optimerat protokoll som möjliggör samtidig och högkvalitativ isolering av de huvudsakliga celltyperna av hjärtvävnad, dvs kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster. Alla dessa celltyper kan användas i olika experimentella inställningar 8 , 9 , 10 och för analys av cell-cell-interaktioner från samma djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersökningen överensstämmer med handledningen för vård och användning av laboratoriedjur som publicerades av US National Institute of Health (NIH Publication No. 85-23 1985) och godkändes av den lokala etiska kommittén vid universitetet i Giessen. Vuxna manliga Wistar-råttor som väger 200-250 g användes i denna studie.
1. Autoklavering
- Åtminstone en dag innan proceduren ska utföras, autoklavera alla kirurgiska instrument, pipettips och Pasteur pipetter som ska användas i isoleringsförfarandet vid 121 ° C i 30 minuter.
2. Förberedelse av media och lösningar
OBS! Lösningar från steg 2.1-2.4 kan beredas upp till en vecka före isoleringen och lagras vid 4 ° C, men förbered lösningarna i steg 2.5-2.8 på isoleringsdagen. De fullständiga recepten av buffertarna och medierna anges i tabell 1 . Värm alla medier och lösningar till 37 ° C i enVattenbad innan du börjar beredningen.
- Förbered Powell-medium genom att lösa de kemikalier som anges i tabell 1 i 4,5 liter H2O vid rumstemperatur (RT). Ställ in pH till 7,4 med 2,0 N NaOH och häll volymen till 5,0 L. Sterilfiltrera lösningen och förvara den vid 4 ° C.
- Förbered kreatin, L-karnitin och taurin (CCT) -medium genom att lösa M199-pulvermedium i 4,5 liter H2O. Lägg HEPES-pulver enligt tabell till mediet och blanda i 15 minuter. Tillsätt kreatin, karnitin, taurin och Ara-C enligt tabell 1 . Blanda väl, justera pH med pH-mätare till 7,4 med 2,0 N NaOH och sätt volymen till 5,0 L. Sterilfilter och förvara vid 4 ° C.
- Förbered cellodlingsmedium för fibroblaster genom tillsats av 10% fetalt kalvserum (FCS) och 2% penicillin / streptomycin (Pen / Strep) till medium M199. DMEM är lika lämplig som M199 och kan också användas för fibroblastcellodling.
- Förbered MV2-cellkulturE-medium för endotelceller genom att tillsätta allt innehållet i tilläggsmixen till det basala MV2-mediet enligt tillverkarens instruktioner. Ta en 5 ml alikvot och värm den till 37 ° C i ett vattenbad.
- Förbereda endotelcellsisoleringsbuffert genom att lösa 0,05 g bovint serumalbumin (BSA) i 50 ml Hanks balanserad saltlösning (HBSS) och tillsätta 0,5 ml 200 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) -lösning till den. Sterilfiltrera detta och förvara det vid 4 ° C.
- Förbered endotelcells tvättbuffert genom att tillsätta 0,1 ml 200 mM till 9,9 ml PBS och förvara den vid 4 ° C.
- Beredning av kollagenaslösning genom upplösning av 27 mg kollagenas i 5 ml Powell-medium och tillsättning av 12,5 pi 100 mM CaCl2-lösning till den. Värm den till 37 ° C i ett vattenbad.
- Förbered inkrementella Ca 2+ -restaureringslösningar 1, 2 och 3 för kardiomyocyter genom att tillsätta 12,5 pi, 25 pi och 120 pi 100 mM CaCl2-lösningJon till 6 ml, 6 ml och 12 ml Powell-medium.
- Pre-coat cellodlingsdisken för kardiomyocyter en dag före isoleringen genom tillsats av 1 ml förbeläggningsmedium innehållande laminin till varje 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 Inkubera dem i cellodlingsinkubatorn vid 37 ° C över natten.
3. Framställning av magnetiska pärlor
- Placera 0,5 ml av endotelcellerisoleringsbufferten i ett 1,5 ml provrör på is.
- Tillsätt 5 μL (2 x 106 ) av pan-mus IgG magnetiska pärlor och blanda väl.
- Placera röret i magnetstativet i 1 min. Pärlorna kommer att fästa vid rörets vägg mot magneten. Ta noga av supernatanten med en 1 ml pipett.
- Upprepa tvätten två gånger och slutligen suspendera pärlorna i 50 μl endotelcellsisoleringsbuffert och förvara vid 4 ° C tills användning.
4. Framställning av Langendorff Perfusion System
- Rengör tHan Langendorff-systemet genom perfusion med 2 liter destillerat vatten.
- Cirkulera 50 ml Powell-medium genom systemet i 5 minuter och kassera mediet.
- Tillsätt 80 ml färskt Powell-medium. Fortsätt perfusera det med "karbogen" genom att bubbla med en glaspasteurpipett från gascylindern. Låt medium recirkulera genom systemet. Systemet är nu redo att perfekta hjärtat ( Figur 1A ).
5. Dissektion av råtta
- Placera råttan i en 5 liter desikcator under en avluftningsdräkt och sätt 1,5 ml 4-5% isofluran genom luftventilen och stäng locket.
OBS! Placera djuret på förhöjd perforerad platta inuti torkmedlet för att undvika direkt kontakt med djuret med isofluranvätskan. - Vänta tills råttan förlorar lockets reflex (vanligtvis ~ 5 min), och ta sedan råttan ur torkmedlet. Euthanize råttan genom cervikal dislokation.
- Klipp bukhuden och den underliggande muskelhöjdenAllierade i mitten med hjälp av ett par skarpa saxar. Därefter skär muskeln vertikalt mot råttorns bryst och öppna thoraxen. Ta bort hjärtat tillsammans med lungorna och lägg omedelbart organen i iskall 0,9% NaCl-lösning.
- Ta bort lungorna med hjälp av ett sax och kassera dem. Rengör hjärtat av bindväv och skär aortan caudalt vid bröstet i brachiocephalic stammen.
6. Perfusion av hjärtat och digestion med kollagenas
- Montera hjärtat via aortan i Langendorff-perfusionssystemet (avsnitt 4) med två par tunna, krökta tångar. För att säkerställa att myokardiet perfuseras på retrograd sätt, placera änden av perfusionssystemets kanyl mellan den första aortaförgreningen och aortaklaven. Fixa aortan med en krokodilklämma.
- Fixera hjärtat med en kirurgisk sutur och ta bort krokodilklämman ( Figur 1B ).
- Öppna kanylens ventil för att tillåta perfusionsmediet (35 ml) att passera genom hjärtat droppvis (60 droppar / min, 5 ml / min) för att tvätta bort eventuellt kvarvarande blod. Kasta bort någon genomströmning i detta skede.
OBS: Undvik bildandet av luftbubblor vid något stadium av perfusionen, eftersom detta kommer att resultera i ofullständig matsmältning och fel i cellisoleringsproceduren. - Placera det hängande hjärtat i uppsamlingstrattet (hjärtkammaren, Figur 1B ) och starta den peristaltiska pumpen, som återcirkulerar perfusionsmediet från uppsamlingstrattet till behållaren ( Figur 1A ).
- Tillsätt kollagenaslösningen (från steg 2.8) till perfusionsmediet. Perfuse hjärtat med recirkulerande kollagenaslösning under 30 minuter.
OBS! Detta steg är mycket viktigt för att optimera cellutbytet. Perfusionstiden beror på aktiviteten av kollagenas, som kan variera beroende på sats. Testa 3-4 satser av kollagenas för att hitta den med optiMalaktivitet Då kan stora mängder av den bäst lämpade batchen köpas som är tillräckliga i minst ett år för reproducerbara resultat. - Vid slutet av digestionstiden, sluta perfusion, ta bort hjärtat från Langendorff-systemet med ett sax och placera det i en petriskål med glas.
- Skär av och kassera båda atria och ta bort eventuella kvarvarande fettvävnader. Avlägsna försiktigt perikardiet med hjälp av två par tångar för att undvika kontaminering av epitelcellerna.
OBS: Perikardiet kan ytterligare smältas med kollagenas för att erhålla rena hjärt-epitelceller om så krävs. Ett detaljerat protokoll ges inte i den föreliggande studien, eftersom detta ligger utanför tillämpningsområdet för föreliggande protokoll. - Klipp hjärtat ner i mitten med ett sax och sätt det i vävnadshackaren. Mince hjärtat 2-3 gånger och åter suspendera den malda vävnaden i 12 ml av digestionsbufferten från Langendorff perfusion.
OBS: Hack inte hÖron för mycket, eftersom detta kommer att resultera i en högre andel döda kardiomyocyter. - Överför den malda vävnaden till 15 ml kollagenasinnehållande dissociationsmedium och låt det smälta i ett vattenbad under 5-10 minuter med tillfällig blandning genom återuppslamning med användning av en 5 ml engångspipett.
- Vid slutet av matsmältningsperioden, filtrera cellsuspensionen genom en 100 μm sikt. Kassera vävnadsskräp och osmält material.
- Vid slutet av Langendorff-perfusion spolas perfusionssystemet omedelbart med minst 1 liter destillerat vatten. Perfekta systemet genom att recirkulera 100 ml 0,1 N NaOH under 30 minuter, och slutligen spola systemet med 2-3 liter destillerat vatten. Torka systemet genom att spola luft och täcka öppningen med parafilm.
7. Råtta hjärtcellerisolering
- Isolering och odling av kardiomyocyter
- Centrifugera cellsuspensionen vid 25 xg under 1 min (utan brAkes) för att pelletsa kardiomyocyterna. Kardiomyocyter kan också tillåtas att sedimentera i 10 minuter vid RT utan centrifugering.
- Ta försiktigt bort supernatanten innehållande endotelceller och fibroblaster med hjälp av en engångspipett i ett nytt 50 ml rör.
- Resuspendera kardiomyocytpelleten i Ca2 + 6 ml lösning 1 (steg 2.9). Tillåt 1 minut för cellerna att anpassa sig till den låga Ca 2+ -koncentrationsmiljön och centrifugera cellsuspensionen igen vid 25 xg under 1 min (utan bromsar).
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 6 ml Ca 2+ lösning 2 (steg 2.9). Låt cellerna 1 min anpassa sig till mellanskoncentrationen Ca 2+ och tillsätt till slut 12 ml Ca 2+ lösning 3 (steg 2.9) till cellerna. Blanda med hjälp av en engångspipett.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 25 xg under 1 min.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellerna i 20 ml pre-värmt CCT-medium. Tillsätt 1 ml av cellsuspensionen till var och en av 20 sterila 35 mm cellodlingsskålen förbehandlade med laminin (steg 2.9) och låta cellerna fästa i 2 h i en CO 2 -fri cellodlings-inkubator.
OBS: Kardiomyocyterna kan också odlas under CO 2 -miljön; I detta fall bör media med bikarbonatbuffertsystem användas. - Efter 2 h byt ut mediet med nytt 2 ml CCT-medium för att ta bort eventuella döda celler.
OBS: Cellerna är klara för alla planerade experiment och kan odlas i upp till 3 dagar i en typisk cellodlings-inkubator (CO 2 -fri) utan signifikant förlust av levande celler. Typiska friska stavformade kardiomyocyter visas i figur 2A .
- Isolering av endotelceller och fibroblaster
- Centrifugera supernatanten innehållande endotelceller och fibroblaster (från steg 7.1.2) vid 250 xg under 10 min.
- Kassera supeRennant och resuspendera cellpelleten i 1,5 ml endotelcellsisoleringsbuffert i ett 2 ml provrör.
- Tillsätt 3 μg (1: 500) av mus anti-rått-CD31-antikropp mot cellsuspensionen och inkubera den vid 4 ° C under 30 minuter med rotationsändning mot slutet.
OBS: En titrering av antikroppen för optimal utspädning rekommenderas. Detta steg bör utföras vid 4 ° C vid RT. En snabb internalisering av antikropp med endotelceller kommer att resultera i lågt utbyte. - Lägg till de tidigare beredda (avsnitt 3) pan-anti-mus-IgG-pärlorna till cellsuspensionen och inkubera i 20 minuter vid 4 ° C med änd-till-ände rotation.
ANMÄRKNING: Alternativt kan anti-rått-CD31-antikropp mot musen vara förbunden till magnetiska pärlorna och sedan tillsättas till cellsuspensionen. Detta kommer emellertid öka tiden för inkubation av pärlorna med cellsuspensionen och kan resultera i ökad icke-specifik bindning av icke-endotelceller och därmed högre förorening av andra celltyper. - enT slutet av antikroppsinkubationstiden, placera röret som innehåller cellsuspensionen i ett magnetiskt hylla och låt 2 min för att sedimentera magnetiska pärlorna fästade vid endotelcellerna till rörets sida.
- Ta försiktigt bort resten av cellsuspensionen (innehållande främst fibroblasterna) med en 1 ml pipett och sätt den till en 10 cm-cellodlingsskål innehållande 10 ml fibroblastcellodlingsmedium (steg 2.3). Placera den i en typisk cellodlings-inkubator innehållande 5% CO2. Förfarandet fortsätter i steg 7.3.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert till röret med magnetiska pärlor innehållande endotelcellerna.
- Lossa röret, ta bort det från magnetstativet och försiktigt resuspendera pärlorna genom att skaka försiktigt upp och ner 4 - 5 gånger. Placera röret igen i magnetstativet, låt pärlorna sätta sig på rörets vägg i 1 min och ta försiktigt bort tvättbufferten.
- Upprepa tvättsteg 5-7 gånger för att bli av med eventuella föroreningarOn-endotelceller.
- Resuspendera endotelcellerna fästa till pärlorna i 1 ml MV2 endotelceller odlingsmedium, tillsätt till en enkel brunn i en 12-brunnsplatta och inkubera i en CO-cell-odlingsinkubator.
- Låt cellerna fästa över natten och byt mediet nästa dag och därefter var 2-3 dagar tills cellerna blir halvkonfluenta (vanligtvis 5-7 dagar).
OBS: Typiska icke-sammanfogade endotelceller efter 3-4 dagar och konfluenta endotelceller efter 7-10 dagars isolering visas i figurerna 3A respektive 3B . Cellerna kan sedan trypsiniseras (avsnitt 7.4) och seedas i en T25-cellodlingskolv.
- Tvättning och odling av fibroblaster (fortsätt från steg 7.2.6)
- Efter 1 timmars inkubering, aspirera mediet och tvätta fibroblasterna fästa vid cellodlingsskålen genom att tillsätta en lämplig volym föruppvärmd PBS. Aspirera PBS och upprepa sTippa 2-3 gånger och tillsätt till sist förvärmt friskt fibroblastcellodlingsmedium.
- Tvätta de bifogade cellerna igen nästa dag med förvärmd PBS (som i föregående steg) och tillsätt förvärmt friskt medium. Byt mediet efter 2-3 dagar. En typisk fenotyp av fibroblaster på dag 2 av isolering visas i figur 4A .
OBS: Fibroblasterna blir semi-konfluenta vanligtvis inom 5-7 dagar och är sedan redo att trypsiniseras (avsnitt 7.4) och används för planerade experiment. Med denna procedur erhåller vi vanligtvis 95-99% rena fibroblaster. En typisk fenotyp av fibroblaster på dag 7 av isolering visas i figur 4B .
- Trypsinisering av endotelceller och fibroblaster
- Aspirera mediet från cellodlingsskålen och tillsätt tillräckligt med förvärmd PBS för att täcka cellerna.
- Aspirera PBS och tillsätt tillräckligt med trypsin-EDTA-lösning (0,05% respektive 0,02%) för att täcka cellerna och placera iE 37 ° C inkubator i 5 min.
- Resuspendera cellerna genom att pipettera cellerna upp och ner med hjälp av en 1 ml pipett och stoppa trypsinverkan genom att tillsätta 10% FCS.
- Pellets cellsuspensionen genom centrifugering vid 250 xg i 10 min vid RT.
- Resuspendera cellerna i en lämplig volym förvärmt cellodlingsmedium.
8. Endotelcellerkarakterisering
OBS: Renheten hos endotelceller bestäms genom upptag av Dil-Ac-LDL och immunförstoring av von Willebrand-faktor (vWF). Celler visualiseras genom fluorescens eller konfokal mikroskopi (figurerna 3C-3E ).
- Dil-Ac-LDL upptag av endotelceller
- Trypsinera endotelcellerna (steg 7.4) och odla dem över natten på glasöverdrag i en 12-brunnsplatta (ungefär 10 x 10 4 celler / cm 2 ).
- Aspirera mediet och skölj cellerna med 1 ml pre-wBeväpnad HBSS.
- Aspirera HBSS och tillsätt 1 ml endotelceller odlingsmedium innehållande 10 | ig / ml Dil-Ac-LDL och lämna cellerna i inkubatorns 37 ° C under 4 timmar.
- Aspirera mediet och skölj cellerna med förvärmd PBS tre gånger och fixa dem med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA, upplöst i PBS). Inkubera dem med PFA vid 37 ° C under 20 minuter.
OBS: PFA är frätande; Använd alltid syrafasta handskar när du hanterar PFA-lösningen. - Aspirera PFA, skölj cellerna på täckglas i 12-brunnsplatta med 1 ml PBS-tre gånger och inkubera dem med nukleär färglösning TO-PRO (10 μM) i 1 h vid RT.
OBS! Om det lämpliga filtret är tillgängligt för mikroskopet kan 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; 1 μg / ml) också användas. I detta fall bör inkubationstiden minskas till 10 minuter. - Skölj celler på täckglas i 12-brunnsplatta med 1 ml PBS, aspirera PBS och upprepa steget tre gånger.
- Ta cÖverlappa ur 12-brunnsplattan och montera den på en glasruta med en droppe monteringsmedium. Cellerna är redo att visualiseras under ett fluorescerande / konfokalt mikroskop. Använd ett exciteringsfilter av 530-560 nm för Dil-Ac-LDL, 640 nm för TO-PRO och 340-380 nm för DAPI.
- Von Willebrand (vWF) färgning
- Kultur endotelcellerna som beskrivs i steg 8.1.1.
- Aspirera mediet och skölj cellerna med 1 ml förvärmd HBSS; Därefter fixeras med 4% PFA enligt beskrivningen i steg 8.1.4.
- Aspirera PFA, skölj cellerna på täckglas i 12-brunnsplatta med 1 ml PBS två gånger och permeabilisera cellerna med 1 ml 0,1% Triton X-100 (i PBS) i 20 minuter vid RT.
- Aspirera den permeabiliserande lösningen och inkubera cellerna med blockerande lösning (5% BSA / 5% FCS i PBS) i 1 timme.
- Inkubera cellerna med kanin-anti-vWF-antikropp (1: 100) vid 4 ° C över natten i en fuktad kammare. Lägg till en täckglas utan thE primär antikropp som en negativ kontroll.
- Skölj cellerna på täckglaset i en 12-brunnsplatta med 1 ml PBS tre gånger och inkubera cellerna med Alexa-488-antikropp (1: 500) och nukleär färglösning TO-PRO (10 μM) i 1 h Vid RT.
- Skölj cellerna på täckglaset i 12-brunnsplattan med 1 ml PBS, aspirera PBS och upprepa steget tre gånger.
- Ta täckglaset ur 12-brunnsplattan och montera det på en glasskiva med en droppe monteringsmedium. Cellerna är redo att visualiseras under ett fluorescerande / konfokalt mikroskop. Använd ett exciteringsfilter av 490 nm för vWF och 640 nm för kärnfärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringsproceduren resulterar i ett utbyte av 70-80% livskraftiga, stavformade, strimmiga kardiomyocyter (figurerna 2A och 2C ) som kan användas för planerade experiment. I vårt laboratorium används kardiomyocyter rutinmässigt för analys av Ca 2+ -signaleringen. Figur 5A visar intracellulär kalcium [Ca2 + ] i- oscillationer som svar på ischemi / reperfusion i kardiomyocyter laddade med Fura-AM (5 | im). Figur 5B visar förändringar i [Ca2 + ] i i endotelceller och fibroblaster efter tillsats av ATP (100 | iM). Förändringarna i [Ca2 + ] i i olika hjärtcells-typer analyserades som beskrivits tidigare. 6 , 11 , 12
Re 1 "src =" / files / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
Figur 1: Modifierat Langendorff Perfusion System. ( A ) Hela Langendorff-perfusionssystemet som används för isolering av hjärtceller ( B ) Förstorad vy av det hängande hjärtat i "hjärtkammaren" som också används för uppsamling av perfusionsbuffert för recirkulation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Vuxna råttkardiomyocyter. ( A ) Typiska stavformade hälsosamma kardiomyocyter 2 timmar efter plätering i lamininbelagda cellodlingsskålar ( B ) Ett typiskt exempel på en dålig beredning på grund av ofullständig vävnadsdigestion. 2 h efter plätering i lamininbelagda cellodlingsrätter, moSt av cellerna är hyperkontraherade och ser rundade, och det finns få stavformade kardiomyocyter. Skalstång = 10 μm ( C ) Konfokal mikrografi av enkel kardiomyocyt färgad för aktinvisualisering som beskrivits tidigare. 13 Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Rat-hjärt-endotelceller. ( A ) Fas-kontrastmikrografi av icke-konfluent endotelcellmonolag 3 dagar efter isolering. Mörka fläckar är de magnetiska kulorna som fortfarande är fästade vid moderendotelcellerna. Skalbalk = 10 μm ( B ) Fas-kontrastmikrografi av konfluent endotelcellmonolag 7 dagar efter isolering ( CImmunostaining av endotelceller som visar färgning av vWF (Red) och nukleär färgning (Blå) ( E ) Celler som inkuberas endast med sekundär antikropp (Red) och nukleär färgning (Blå) Och kärnfärg (Blå) (Skala bar = 50 μm) Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Rat-hjärtfibroblaster. ( A ) Typiska spindelformade hjärtfibroblaster på den andra dagen av isolering. ( B ) Konfluenta rena fibroblaster efter 7 dygn av odling. ( C ) Ett typiskt exempel på en dålig beredning förorenad med epitelceller. Celler som indikeras av pilhuvuden är hjärt-epitelcellerna . Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Förändringar i [Ca 2+ ] i i hjärtceller. ( A ) Representativa spår av förändringar i intracellulärt kalcium [Ca 2+ ] , mätt med Fura-2-förhållandet i råttkardiomyocyter utsatta för kemisk ischemi (Na-cyanat, 2 mM) följt av reperfusion ( B ) Representativa spår av förändringar i intracellulärt kalcium [Ca2 + ] , mätt med Fura-2-förhållandet i hjärtkardialendotelceller och fibroblaster, behandlade med ATP (100 | iM) enligt vad som anges. > Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel beskrivs ett reproducerbart protokoll för isolering och kultur av hjärtmyocyter, endotelceller och fibroblaster. Detta protokoll beskriver samtidig och högkvalitativ isolering av de huvudsakliga celltyperna av hjärtvävnad, dvs kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster i motsats till bara en celltyp. Ett kritiskt steg i isoleringsförfarandet är den korrekta matsmältningen av hjärtvävnaden. Om matsmältningen är ofullständig kan ett stort antal myocyter fortfarande uppnås, men deras kvalitet är mycket dålig och de är oftast hyperkontraherade och runda ( Figur 2B ) och utan värde i experiment. Dessutom kommer utbytet av endotelceller och fibroblast också att reduceras. Detta problem kan lösas genom att styra digestionstiden. Innan hjärtat tas bort från perfusionssystemet kan hjärtets mjukhet kontrolleras med hjälp av tång och fingertopp. Om vävnaden fortfarande inte är märkbart sOfta kan hjärtat perfuseras i ytterligare 5-10 min. Ett andra kritiskt steg i hälsosam kardiomyocytisolering är inkrementell återställning av Ca2 + i isolationsbuffertarna. En snabb återställning av höga koncentrationer av Ca2 + i mediet kommer att resultera i rundade kardiomyocyter. Kvaliteten på vatten som används för beredning av buffertar är en annan viktig faktor som påverkar kardiomyocyternas kvalitet. Därför rekommenderas användning av vatten av god kvalitet.
Renheten hos endotelceller är starkt beroende av tvättstegen. EDTA måste vara närvarande i tvättbufferten för att förhindra icke-specifik bindning av icke-endotelceller till magnetpärlorna. Förekomsten av blodkroppar i cellsuspensionen kommer kraftigt att minska utbytet av endotelceller; Därför är korrekt tvättning av hjärtat väldigt kritiskt efter att hjärtat har monterats i perfusionssystemet och före tillsats av kollagenas. Återstående blodkomponenter kommer också att minska tHan aktiviteten av kollagenas och därigenom hindrar matsmältningen av hjärtat.
Den vanligaste föroreningen i fibroblastcellkulturen är utseendet av satellitkolonier av epitelceller ( Figur 4C ). Denna kontaminering kan undvikas genom tvåstegs odling av fibroblaster. I det första steget reduceras koncentrationen av FCS i fibroblastcellodlingsmediet till 5% och cellsuspensionen adhereras till cellodlingsskålen i 30 min i inkubatorn. Epitelceller fastnar snabbt, men vidhäftningstiden för fibroblastcell ökas i närvaro av en låg koncentration av serum. Efter 30 min inkubation avlägsnas cellsuspensionen innehållande icke-vidhäftande fibroblaster försiktigt till en ny cellodlingsskål. På detta sätt kan utbytet av fibroblaster reduceras men deras renhet förbättras väsentligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att deklarera.
Acknowledgments
Det tekniska stödet från L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas och A. Weber erkänns tacksamt. Författarna vill också tacka Dr. E. Martinson för omfattande bevisläsning och språkredigering av manuskriptet. Studien stöddes av Universitetet i Giessen Anschubsfinanzierung bevilja till M. Aslam och D. Gündüz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
