Summary
Flere protokoller er blevet udviklet og beskrevet for isolering af forskellige hjertecelletyper fra et rottehjerte. Her beskrives en optimeret protokol, der gør det muligt at isolere højkvalitets hovedkardiale celletyper (kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster) fra et enkelt præparat, hvilket reducerer forsøgsudgifterne.
Abstract
Rotten er en vigtig dyremodel, der anvendes i kardiovaskulær forskning, og rotte-hjerteceller anvendes rutinemæssigt til in vitro- analyse af de molekylære mekanismer for kardiovaskulær sygdomsprogression, såsom hjertehypertrofi, fibrose og aterosklerose. Selv om adskillige forsøg med variabel succes er blevet gjort for at udvikle immortaliserede cellelinier fra kardiovaskulærsystemet for at forstå disse cellulære mekanismer, tilbyder primære celler et mere naturligt og tæt på in vivo- miljø til sådanne undersøgelser. Derfor har forskellige laboratorier, der arbejder på en bestemt celletype, udviklet protokoller til isolering af individuelle typer af hjerteceller af rotteceller af interesse. En protokol, der tillader isolering af mere end en celletype, mangler imidlertid. Her beskrives en optimeret protokol, der muliggør isolering af store hjertecelletyper af høj kvalitet (cardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster) fra et enkelt præparat og muliggørR bruges til cellulære analyser. Dette tillader den mest effektive udnyttelse af tilgængelige ressourcer, hvilket kan spare tid og reducere forskningsomkostningerne.
Introduction
Rodent modeller er længe blevet brugt som redskaber til at udvide vores forståelse af kardiovaskulær fysiologi i sundhed og sygdom. 1 Selvom disse dyremodeller giver os mulighed for at forstå patofysiologien af en sygdom på orgenniveau og at analysere farmakokinetikken og farmakodynamikken af forskellige farmakologiske midler anvendt til behandling af hjerte-kar-sygdomme, forståelse af de molekylære mekanismer for udvikling af hjerte-kar-sygdomme og bidrag fra en bestemt Celle type kræver brug af in vitro cellekultur modeller. Til dette formål er der udviklet forskellige immortaliserede cellelinier fra det kardiovaskulære system; 2 , 3 er frisk isolerede primære celler imidlertid fysiologisk og funktionelt mere relevante for levende væv og organismer.
Hjertet er et alsidigt organ, der indeholder alle hovedtyper af celler i kardiovaskulære sYstem, og rottehjerte er stadig en almindeligt anvendt model til forståelse af kardiovaskulær fysiologi. I de sidste par årtier er forskellige metoder til isolering af individuelle celletyper fra hjertevæv blevet beskrevet; 4 , 5 , 6 , 7, men disse metoder fokuserer kun på isolering af en specifik celletype, hvilket resulterer i tab af andre typer celler, der ikke længere kan anvendes til cellulær analyse. Her beskrives en optimeret protokol, som muliggør samtidig og højkvalitets isolering af de vigtigste celletyper af hjertevæv, dvs. cardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster. Alle disse celletyper kan anvendes i forskellige eksperimentelle opsætninger 8 , 9 , 10 og til analyse af cellecelleinteraktioner fra det samme dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen er i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr udgivet af US National Institutes of Health (NIH-publikation nr. 85-23 1985) og blev godkendt af det lokale etiske udvalg ved universitetet i Giessen. Voksne hanlige Wistar-rotter med en vægt på 200-250 g blev anvendt i denne undersøgelse.
1. Autoklavering
- Mindst en dag før proceduren skal udføres autoklaveres alle kirurgiske instrumenter, pipettespidser og Pasteur pipetter, der skal anvendes i isoleringsproceduren ved 121 ° C i 30 minutter.
2. Forberedelse af medier og løsninger
BEMÆRK: Løsninger fra trin 2.1-2.4 kan fremstilles op til en uge før isoleringen og opbevares ved 4 ° C, men forbered opløsningerne i trin 2.5-2.8 på isoleringsdagen. De fuldstændige opskrifter af buffere og medier er angivet i tabel 1 . Varm alle medier og opløsninger til 37 ° C i aVandbad før påbegyndelse af præparatet.
- Forbered Powell medium ved at opløse de kemikalier, der er anført i tabel 1 i 4,5 liter H20 ved stuetemperatur (RT). Juster pH til 7,4 med 2,0 N NaOH, og bring volumenet til 5,0 L. Sterilfiltrer opløsningen og opbevar den ved 4 ° C.
- Forbered kreatin, L-carnitin og taurin (CCT) medium ved at opløse M199 pulvermedium i 4,5 L H20. Tilsæt HEPES-pulver ifølge tabel til mediet og bland i 15 min. Tilsæt kreatin, carnitin, taurin og Ara-C ifølge tabel 1 . Bland godt, indstil pH med pH-meter til 7,4 med 2,0 N NaOH, og bring volumenet til 5,0 L. sterilt filter og opbevar ved 4 ° C.
- Forbered cellekulturmedium til fibroblaster ved at tilsætte 10% føtalt kalveserum (FCS) og 2% penicillin / streptomycin (Pen / Strep) til medium M199. DMEM er lige så velegnet som M199 og kan også anvendes til fibroblastcellekultur.
- Forbered MV2 celle kulturE-medium til endotelceller ved at tilsætte alt indholdet af tilsætningsblandingen til det basale MV2-medium i overensstemmelse med producentens anvisninger. Tag en 5 ml alikvot og varm den op til 37 ° C i et vandbad.
- Forbered enothellcelleisoleringsbuffer ved at opløse 0,05 g bovint serumalbumin (BSA) i 50 ml Hanks-afbalanceret saltopløsning (HBSS) og tilsætte 0,5 ml 200 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) -opløsning. Steril filter dette og opbevar det ved 4 ° C.
- Klargør endothelcellevaskebuffer ved at tilsætte 0,1 ml 200 mM til 9,9 ml PBS og opbevare den ved 4 ° C.
- Forbered kollagenaseopløsning ved at opløse 27 mg kollagenase i 5 ml Powell-medium og tilsætte 12,5 μl 100 mM CaCl2-opløsning til den. Varm det til 37 ° C i et vandbad.
- Forbered inkrementelle Ca 2+ restaureringsopløsninger 1, 2 og 3 for kardiomyocytter ved tilsætning af 12,5 μl, 25 μl og 120 μl 100 mM CaCl2-opløsningIon til henholdsvis 6 ml, 6 ml og 12 ml Powell-medium.
- Pre-coat celledyrkningsskålene til kardiomyocytter en dag før isoleringen ved at tilsætte 1 ml præ-coatingmedium indeholdende laminin til hver 35 mm cellekulturskål. Inkuber dem i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C natten over.
3. Fremstilling af magnetiske perler
- Anbring 0,5 ml af endotelcelleisoleringsbufferen i et 1,5 ml prøve rør på is.
- Tilsæt 5 μL (2 x 106 ) af pan-mus IgG magnetiske perler og bland godt.
- Placer røret i magnetstativet i 1 min. Perlerne vil klæbe til rørets væg mod magneten. Fjern forsigtigt supernatanten med en 1 ml pipette.
- Gentag vask to gange mere og suspender endelig perlerne i 50 μl endotelcelleisoleringsbuffer og opbevar ved 4 ° C indtil brug.
4. Fremstilling af Langendorff Perfusion System
- Rens tHan Langendorff system ved perfusion med 2 liter destilleret vand.
- Cirkuler 50 ml Powell medium gennem systemet i 5 minutter og kassér mediet.
- Tilsæt 80 ml frisk Powell medium. Fortsæt med at perfuse det med "carbogen" ved at boble med en glaspasteur pipette fra gascylinderen. Lad medium gencirkulere gennem systemet. Systemet er nu klar til at perfuse hjertet ( figur 1A ).
5. Dissektion af rotten
- Placer rotten i en 5 L tørremiddel under en gasplade, og tilsæt 1,5 ml 4-5% isofluran gennem luftudluftningen, og luk låget.
BEMÆRK: Anbring dyret på forhøjet perforeret plade inde i tørremidlet for at undgå direkte kontakt af dyret med væsken isofluran. - Vent, indtil rotten mister sin lågrefleks (normalt ~ 5 min), og tag ratten ud af tørremidlet. Euthanize rotten ved cervikal dislokation.
- Skær mavehuden og den underliggende muskel horisontAllieret i midten ved hjælp af et par skarpe saks. Derefter skæres musklerne lodret til rotens brysthul og åbner thoraxen. Fjern hjertet sammen med lungerne og læg straks organerne i iskold 0,9% NaCl-opløsning.
- Fjern lungerne ved hjælp af et saks og kassér dem. Rens hjertet af ethvert bindevæv, og skær aorta caudalt ved gren af brachiocephalic stammen.
6. Perfusion af hjertet og fordøjelse med collagenase
- Monter hjertet gennem aorta i Langendorff perfusionssystemet (afsnit 4) ved hjælp af to par tynde, buede tang. For at sikre, at myokardiet er perfuseret på retrograd måde, anbring slutningen af perfusionssystemets kanyle mellem den første aorta-gren og aortaklappen. Fix aorta ved hjælp af en krokodil klemme.
- Fastgør hjertet med en kirurgisk sutur, og fjern krokodilklemmen ( Figur 1B ).
- Åbn kanylens ventil for at lade perfusionsmediet (35 ml) passere gennem hjerte dropwise (60 dråber / min, 5 ml / min) for at vaske ud resterende blod. Kassér enhver gennemstrømning på dette stadium.
BEMÆRK: Undgå dannelsen af luftbobler på et hvilket som helst stadium af perfusionen, da dette vil resultere i ufuldstændig fordøjelse og svigt af cellisoleringsproceduren. - Anbring det hængende hjerte i opsamlingstragten (hjertekammeret, figur 1B ) og start den peristaltiske pumpe, som vil recirkulere perfusionsmediet fra opsamlingstragten til reservoiret ( figur 1A ).
- Tilsæt kollagenaseopløsningen (fra trin 2.8) til perfusionsmediet. Perfuse hjertet med recirkulerende collagenase opløsning i 30 minutter.
BEMÆRK: Dette trin er meget kritisk for at optimere celleudbyttet. Perfusionstiden afhænger af aktiviteten af collagenase, som kan variere afhængigt af batchet. Test 3-4 batcher af collagenase for at finde den med optiMal aktivitet Så kan der købes store mængder af den bedst egnede batch, der er tilstrækkelige i mindst et år til reproducerbare resultater. - Ved afslutningen af fordøjelsestiden skal du stoppe perfusionen, fjerne hjertet fra Langendorff-systemet ved hjælp af et saks, og læg det i en glasskål.
- Afskåret og kassér begge atria, og fjern eventuelt rester af fedtvæv. Skræl forsigtigt perikardiet ved hjælp af to par tænger for at undgå forurening af epithelcellerne.
BEMÆRK: Perikardiet kan fordøjes yderligere med collagenase for at opnå rene hjerteepitelceller, hvis det er nødvendigt. En detaljeret protokol er ikke angivet i den foreliggende undersøgelse, da dette er uden for rammerne af den foreliggende protokol. - Skær hjertet ned i midten med et saks og læg det i vævshakkeren. Hæld hjerte 2-3 gange og suspender det hakket væv i 12 ml fordøjelsesbufferen fra Langendorff perfusion.
BEMÆRK: Skær ikke hEart overdreven, da dette vil resultere i en højere andel af døde kardiomyocytter. - Overfør det hakket væv til 15 ml kollagenaseholdigt dissociation medium og lad det fordøje i et vandbad i 5-10 minutter med lejlighedsvis blanding ved genopslæmning ved anvendelse af en 5 ml engangs plastpipette.
- Ved slutningen af fordøjelsesperioden filtreres cellesuspensionen gennem en 100 μm sigte. Kassér vævsaffald og ufordøjet materiale.
- Ved slutningen af Langendorff-perfusion skal perfusionssystemet straks skylles med mindst 1 liter destilleret vand. Perfuse systemet ved at recirkulere 100 ml 0,1 N NaOH i 30 minutter og til sidst skylle systemet med 2-3 liter destilleret vand. Tør systemet ved at skylle luft og dække åbningen med parafilm.
7. Rat-hjertecelleisolering
- Isolering og kultur af kardiomyocytter
- Centrifug celle suspensionen ved 25 xg i 1 min (uden brAkes) for at pille kardiomyocytterne. Kardiomyocytter kan også få lov til at afregne i 10 minutter ved stuetemperatur uden centrifugering.
- Fjern forsigtigt supernatanten indeholdende endotelceller og fibroblaster ved hjælp af en engangs plastpipette i et nyt 50 ml rør.
- Resuspender kardiomyocytpellet i Ca2 + 6 ml opløsning 1 (trin 2.9). Tillad 1 minut for cellerne at justere til det lave Ca 2+ koncentrationsmiljø og centrifugere cellesuspensionen igen ved 25 xg i 1 min (uden bremser).
- Kassér supernatanten og resuspender cellepellet i 6 ml Ca 2+ opløsning 2 (trin 2.9). Lad cellerne 1 min. Justere til mellemkoncentrationen af Ca2 + og til sidst tilføje 12 ml Ca2 + opløsning 3 (Trin 2.9) til cellerne. Bland med hjælp af en engangs plastpipette.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 25 xg i 1 min.
- Kassér supernatanten og resuspender cellerne i 20 ml præ-varmet CCT-medium. Tilsæt 1 ml cellesuspension til hver af 20 sterile 35 mm cellekulturskål, der er for-belagt med laminin (trin 2.9), og lad cellerne vedhæfte i 2 timer i en CO 2 -fri cellekulturkultur.
BEMÆRK: Kardiomyocytterne kan også dyrkes under CO 2 -miljøet; I dette tilfælde skal der imidlertid anvendes medier med bicarbonatbuffersystem. - Efter 2 timer udskiftes mediet med nyt 2 ml CCT medium for at fjerne eventuelle døde celler.
BEMÆRK: Cellerne er klar til eventuelle planlagte eksperimenter og kan dyrkes i op til 3 dage i en typisk cellekultur-inkubator (CO 2 fri) uden signifikant tab af levende celler. Typiske sunde stavformede kardiomyocytter er vist i figur 2A .
- Isolering af endotelceller og fibroblaster
- Centrifuger supernatanten indeholdende endotelceller og fibroblaster (fra trin 7.1.2) ved 250 xg i 10 minutter.
- Kassér supeRnatant og resuspender cellepelleten i 1,5 ml endotelcelleisoleringsbuffer i et 2 ml prøve rør.
- Tilsæt 3 μg (1: 500) muse anti-rotte CD31 antistof til cellesuspensionen og inkuber det ved 4 ° C i 30 minutter med ende-til-ende rotation.
BEMÆRK: En titrering af antistoffet for optimal fortynding anbefales. Dette trin skal udføres ved 4 ° C som ved RT En hurtig internalisering af antistof af endotelceller vil resultere i lav udbytte. - Tilsæt de tidligere forberedte (Sektion 3) pan-anti-mus-IgG-perler til cellesuspensionen og inkuber i 20 minutter ved 4 ° C med ende-til-ende rotation.
BEMÆRK: Alternativt kan mus anti-rotte CD31 antistof være forhæftet til de magnetiske perler og derefter tilsættes til cellesuspensionen. Dette vil imidlertid øge inkubationstiden for perlerne med cellesuspensionen og kan resultere i forøget ikke-specifik binding af ikke-endotelceller og dermed højere forurening af andre celletyper. - ENT slutningen af antistofinkubationstiden, placer røret, der indeholder cellesuspensionen i et magnetisk stativ og tillade 2 minutter at afregne de magnetiske perler fæstnet til endotelcellerne til siden af røret.
- Fjern forsigtigt resten af cellesuspensionen (indeholdende hovedsagelig fibroblasterne) ved anvendelse af en 1 ml pipette og tilsæt den til en 10 cm cellekulturskål indeholdende 10 ml fibroblastcellekulturmedium (trin 2.3). Anbring den i en typisk cellekultur-inkubator indeholdende 5% C02. Proceduren fortsætter i trin 7.3.
- Tilsæt 1 ml vaskebuffer til røret med magnetiske perler indeholdende endotelcellerne.
- Løsn røret, fjern det fra magnetstativet, og forsigtigt resuspenge perlerne ved at ryste forsigtigt op og ned 4 - 5 gange. Placer røret igen i magnetstativet, lad perlerne ligge på rørets væg i 1 minut, og fjern vaskebufferen forsigtigt.
- Gentag vask trin 5-7 gange for at slippe af med nogen forurenende nOn-endotelceller.
- Resuspender endotelcellerne fastgjort til perlerne i 1 ml MV2 endotelcellekulturmedium, tilsættes til en enkelt brønd i en 12-brønds plade og inkuberes i en CO 2 -cellekultur-inkubator.
- Lad cellerne vedhæfte natten over og ændre mediet næste dag og derefter hver 2-3 dage, indtil cellerne bliver halvkonfluente (normalt 5-7 dage).
BEMÆRK: Typiske ikke-konfluente endotelceller efter 3 - 4 dage og konfluente endotelceller efter 7-10 dage isolering er vist i henholdsvis figur 3A og 3B . Cellerne kan derefter trypsiniseres (afsnit 7.4) og podes i en T25 cellekulturkolbe.
- Vask og kultur af fibroblaster (fortsæt fra trin 7.2.6)
- Efter 1 time inkubering, aspirere mediet og vaske fibroblasterne fastgjort til cellekulturskål ved tilsætning af et passende volumen af forvarmet PBS. Aspirere PBS og gentag sTep 2-3 gange og til sidst tilsættes forvarmet frisk fibroblastcellekulturmedium.
- Vask de vedhæftede celler igen den næste dag med forvarmet PBS (som i foregående trin) og tilsæt forvarmet frisk medium. Skift mediet efter hver 2-3 dage. En typisk fænotype af fibroblaster på dag 2 af isolation er vist i figur 4A .
BEMÆRK: Fibroblasterne bliver halvkonfluente normalt inden for 5-7 dage og er derefter klar til trypsinering (afsnit 7.4) og anvendt til planlagte eksperimenter. Med denne procedure opnår vi normalt 95-99% rene fibroblaster. En typisk fænotype af fibroblaster på dag 7 af isolation er vist i figur 4B .
- Trypsinisering af endotelceller og fibroblaster
- Aspirere mediet fra cellekulturskålen og tilsæt nok forvarmet PBS til at dække cellerne.
- Aspirer PBS og tilsæt nok trypsin-EDTA-opløsning (henholdsvis 0,05% og 0,02%) til at dække cellerne og placere dem iE 37 ° C inkubator i 5 minutter.
- Resuspender cellerne ved at pipettere cellerne op og ned ved hjælp af en 1 ml pipette og stoppe trypsinvirkningen ved at tilføje 10% FCS.
- Pellets cellesuspensionen ved centrifugering ved 250 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellerne i et passende volumen af forvarmet cellekulturmedium.
8. Endotelcellekarakterisering
BEMÆRK: Renheden af endotelceller bestemmes ved Dil-Ac-LDL optagelse og immunforaining af von Willebrand faktor (vWF). Celler visualiseres ved fluorescens eller konfokal mikroskopi ( figur 3C-3E ).
- Dil-Ac-LDL optagelse af endotelceller
- Trypsiniser endotelcellerne (trin 7.4) og dyrk dem natten over på glasdæksler i en 12-brønds plade (ca. 10 x 104 celler / cm2).
- Aspirere mediet og skyll cellerne med 1 ml pre-wVæbnet HBSS.
- Aspirere HBSS og tilsæt 1 ml endotelcellekulturmedium indeholdende 10 μg / ml Dil-Ac-LDL og lade cellerne i 37 ° C inkubatoren i 4 timer.
- Aspirere mediet og skyll cellerne med forvarmet PBS tre gange og fiks dem med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA, opløst i PBS). Inkuber dem med PFA ved 37 ° C i 20 minutter.
BEMÆRK: PFA er ætsende; Brug altid syrefaste handsker under håndtering af PFA-opløsningen. - Aspirer PFA, skyl cellerne på coverlip i 12-brønds plade med 1 ml PBS-tre gange og inkubér dem med nuklearfarvningsopløsning TO-PRO (10 μM) i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Hvis det passende filter er tilgængeligt for mikroskopet, kan også 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1 μg / ml) anvendes. I dette tilfælde skal inkubationstiden reduceres til 10 minutter. - Skyl cellerne på coverlip i 12-brønds plade med 1 mL PBS, aspirer PBS og gentag trin tre gange.
- Tag cOverslip ud af 12-brønds plade og monter den på et glasskinne med en dråbe monteringsmedium. Cellerne er klar til at blive visualiseret under et fluorescerende / konfokalt mikroskop. Brug et excitationsfilter med 530-560 nm for Dil-Ac-LDL, 640 nm for TO-PRO og 340-380 nm for DAPI.
- Von Willebrand (vWF) farvning
- Kultur endothelcellerne som beskrevet i trin 8.1.1.
- Aspirere mediet og skyll cellerne med 1 ml forvarmet HBSS; Derefter fikseres med 4% PFA som beskrevet i trin 8.1.4.
- Aspirer PFA, skyl cellerne på coverlip i 12-brønds plade med 1 ml PBS to gange og permeabiliser cellerne med 1 ml 0,1% Triton X-100 (i PBS) i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer den permeabiliserende opløsning og inkuber cellerne med blokerende opløsning (5% BSA / 5% FCS i PBS) i 1 time.
- Inkuber cellerne med kanin anti-vWF antistof (1: 100) ved 4 ° C natten over i et befugtet kammer. Tilføj et dækslip uden thE primært antistof som en negativ kontrol.
- Skyl cellerne på dækslet i 12-brønds plade med 1 ml PBS tre gange, og inkubér cellerne med æsel-anti-kanin Alexa Fluor-488-antistof (1: 500) og nuklearfarvningsopløsning TO-PRO (10 μM) i 1 time Ved RT.
- Skyl cellerne på dækslet i 12-brønds plade med 1 ml PBS, aspirer PBS og gentag trin tre gange.
- Tag dækslet ud af 12-brøndspladen og monter det på et glasskinne med en dråbe monteringsmedium. Cellerne er klar til at blive visualiseret under et fluorescerende / konfokalt mikroskop. Brug et excitationsfilter på 490 nm til vWF og 640 nm til nuklear farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringsproceduren resulterer i et udbytte på 70-80% levedygtige stangformede, striberede kardiomyocytter ( fig. 2A og 2C ), der kan anvendes til planlagte eksperimenter. I vores laboratorium anvendes kardiomyocytter rutinemæssigt til analyse af Ca 2+ -signalering. Figur 5A viser intracellulær calcium [Ca2 + ] i- oscillationer som reaktion på iskæmi / reperfusion i cardiomyocytter ladet med Fura-AM (5 μM). Figur 5B viser ændringer i [Ca2 + ] i i endotelceller og fibroblaster efter tilsætning af ATP (100 μM). Ændringerne i [Ca2 + ] i i forskellige hjertecelletyper blev analyseret som beskrevet tidligere. 6 , 11 , 12
Re 1 "src =" / files / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
Figur 1: Modificeret Langendorff Perfusion System. ( A ) Hele Langendorff perfusionssystemet anvendt til isolering af hjerteceller ( B ) Forstørret billede af det hængende hjerte i "hjertekammeret", der også anvendes til opsamling af perfusionsbuffer til recirkulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Voksenratkardiomyocytter. ( A ) Typiske stavformede, sunde kardiomyocytter 2 timer efter plating i lamininbelagte cellekulturskåle ( B ) Et typisk eksempel på et dårligt præparat på grund af ufuldstændig vævsfordøjelse. 2 timer efter plating i lamininbelagte cellekulturskåle, moSt af cellerne er hyperkontrakterede og ser afrundede, og der er få stangformede kardiomyocytter. Skalbjælke = 10 μm ( C ) konfokal mikrografi af enkelt kardiomyocyt farvet til actin-visualisering som tidligere beskrevet. 13 målestang = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Rat-endotelceller. ( A ) Fasekontrastmikrografi af ikke-konfluent endotelcelle-monolag 3 dage efter isolering. Mørke pletter er de magnetiske perler, der stadig er knyttet til moderendotelcellerne. Scale bar = 10 μm ( B ) Fase-kontrast mikrografi af konfluent endotelcelle monolag 7 dage efter isolering ( CImmunostaining af endotelceller, der viser Dil-Ac-LDL-optagelse (Rød) og nuklear farvning (Blå) ( D ) Immunostaining af endotelceller, der viser farvning af vWF (Rød) og nuklear farvning (Blå) ( E ) Celler, der kun inkuberes med sekundært antistof Og nuklear plet (Blå) (Scale bar = 50 μm) Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Rat-hjertefibroblaster. ( A ) Typiske spindelformede hjertefibroblaster på den anden isolationsdag. ( B ) Konfluente, rene fibroblaster efter 7 dages dyrkning. ( C ) Et typisk eksempel på en dårlig præparation forurenet med epitelceller. Celler indikeret af pilehoveder er hjerteepitelcellerne . Skalestang = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ændringer i [Ca 2+ ] i i hjerteceller. ( A ) Repræsentative spor af ændringer i intracellulært calcium [Ca2 + ] i målt ved Fura-2-forhold i rottekardiomyocytter udsat for kemisk iskæmi (Na-cyanat; 2 mM) efterfulgt af reperfusion ( B ) Repræsentative spor af ændringer i intracellulært calcium [Ca 2+ ] målt ved Fura-2-forhold i rottekardiale endotelceller og fibroblaster behandlet med ATP (100 μM) som angivet. > Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel beskrives en reproducerbar protokol til isolationen og kulturen af hjertemyocytter, endotelceller og fibroblaster. Denne protokol beskriver den samtidige og højkvalitets isolering af de vigtigste celletyper af hjertevæv, dvs. cardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster i modsætning til blot en celletype. Et kritisk trin i isoleringsproceduren er den korrekte fordøjelse af hjertevævet. Hvis fordøjelsen er ufuldstændig, kan der stadig opnås et stort antal myocytter, men deres kvalitet er meget dårlig, og de er for det meste hyperkontrakterede og runde ( Figur 2B ) og uden værdi i forsøg. Endvidere vil udbyttet af endotelceller og fibroblast også blive reduceret. Dette problem kan løses ved at kontrollere fordøjelsestiden. Før hjertet fjernes fra perfusionssystemet, kan hjertets blødhed kontrolleres ved hjælp af tang og fingerspidser. Hvis vævet stadig ikke er mærkbart sOfte kan hjertet blive perfunderet i yderligere 5-10 minutter. Et andet kritisk trin i sund kardiomyocytisolation er inkrementel restaurering af Ca2 + i isolationsbufferne. En hurtig genopretning af høje koncentrationer af Ca 2+ i medierne vil resultere i afrundede kardiomyocytter. Kvaliteten af vand anvendt til fremstilling af buffere er en anden vigtig faktor, der påvirker kardiomyocytternes kvalitet. Derfor anbefales brug af vand af god kvalitet.
Renheden af endotelceller er stærkt afhængig af vaskningstrinnene. EDTA skal være til stede i vaskebufferen for at forhindre ikke-specifik binding af ikke-endotelceller til de magnetiske perler. Tilstedeværelsen af blodceller i cellesuspensionen vil i høj grad reducere udbyttet af endotelceller; Derfor er korrekt vask af hjertet meget kritisk efter montering af hjertet i perfusionssystemet og før tilsætning af collagenase. Resterende blodkomponenter vil også reducere tHan aktivitet af kollagenase og dermed hindrer fordøjelsen af hjertet.
Den mest almindelige forurening i fibroblastcellekulturen er udseendet af satellitkolonier af epithelceller ( figur 4C ). Denne forurening kan undgås ved to-trins dyrkning af fibroblaster. I det første trin reduceres koncentrationen af FCS i fibroblastcellekulturmediet til 5%, og cellesuspensionen tillades at klæbe til cellekulturskålen i 30 minutter i inkubatoren. Epitelceller klæber hurtigt, men fibroblastcelleadhæsionstid øges i nærvær af en lav koncentration af serum. Efter 30 minutters inkubation fjernes cellesuspensionen, som indeholder ikke-adhærente fibroblaster, omhyggeligt til en ny cellekulturskål. På denne måde kan udbyttet af fibroblaster reduceres, men deres renhed er stærkt forbedret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at erklære.
Acknowledgments
Den tekniske støtte fra L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas og A. Weber anerkendes taknemmeligt. Forfatterne ønsker også at takke Dr. E. Martinson for omfattende bevislæsning og sprogredigering af manuskriptet. Studiet blev støttet af University of Giessen Anschubsfinanzierung til M. Aslam og D. Gündüz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
