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Biology

एक प्रौढ़ चूहा दिल से उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल सेल और फाइब्रोब्लस्ट्स के साथ-अलगाव

Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55601
Automatic Translation
1, 1, 1
1Internal Medicine, Cardiology and Angiology, University Hospital Giessen

Summary

चूहे के दिल से विभिन्न हृदय कोशिका प्रकारों के अलगाव के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित और वर्णित किए गए हैं। यहां एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो प्रायोगिक लागतों को कम करने, एक ही तैयारी से उच्च-गुणवत्ता प्रमुख कार्डियक सेल प्रकार (कार्डियोयोमोसाइटोइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं और फाइब्रोब्लैस्ट्स) के अलगाव की अनुमति देता है।

Abstract

चूहा एक महत्वपूर्ण जानवर मॉडल है जो हृदय संबंधी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, और कार्डियोवस्कुलर रोग की प्रगति जैसे कि हृदय संबंधी अतिवृद्धि, फाइब्रोसिस और एथेरोस्लेरोसिस के आणविक तंत्र के इन विट्रो विश्लेषण के लिए चूहे कार्डियक कोशिकाओं को नियमित रूप से उपयोग किया जाता है। यद्यपि इन सेलुलर तंत्रों को समझने के लिए कार्डियोवस्कुलर सिस्टम से अमर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए चरणीय सफलता के कई प्रयास किए गए हैं, हालांकि प्राथमिक कोशिकाओं ने इस तरह के अध्ययनों के लिए विवो पर्यावरण में और अधिक प्राकृतिक और निकटता प्रदान की है। इसलिए, किसी विशेष सेल प्रकार पर काम करने वाले विभिन्न प्रयोगशालाओं ने हितों के व्यक्तिगत प्रकार के चूहा कार्डियक कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। एक प्रोटोकॉल जो एक से अधिक सेल प्रकार के अलगाव की अनुमति देता है, हालांकि, अनुपलब्ध है। यहां एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो एक ही तैयारी से उच्च-गुणवत्ता प्रमुख कार्डियक सेल प्रकार (कार्डियोयोमोसाइटोइट्स, एंडोथिलियल कोशिकाएं, और फाइब्रोब्लास्ट) के अलगाव की अनुमति देता है और सक्षम बनाता हैसेलुलर विश्लेषण के लिए उपयोग करें इससे उपलब्ध संसाधनों का सबसे कुशल उपयोग परमिट होता है, जो समय की बचत कर सकता है और अनुसंधान लागत को कम कर सकता है।

Introduction

स्वास्थ्य और रोग में कार्डियोवस्कुलर फिजियोलॉजी की हमारी समझ को व्यापक बनाने के लिए कृत्रिम मॉडेल्स का इस्तेमाल लंबे समय तक किया गया है। 1 हालांकि इन जानवरों के मॉडल हमें अंग के स्तर पर बीमारी के पैथोफिसियोलॉजी को समझने और कार्डियोवस्कुलर रोगों का इलाज करने के लिए प्रयुक्त विभिन्न औषधीय एजेंटों के फार्माकोकाइनेटिक्स और फार्माकोडायनामिक्स का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देते हैं, हृदय रोग के विकास के आणविक तंत्र की समझ और विशेष रूप से योगदान सेल प्रकार इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग की आवश्यकता है। इस प्रयोजन के लिए कार्डियोवास्कुलर सिस्टम से अलग-अलग अमर सेल लाइनें विकसित की गई हैं; 2 , 3 हालांकि, नए सिरे से अलग-अलग प्राथमिक कोशिका भौतिक और शारीरिक रूप से जीवित ऊतकों और जीवों के लिए अधिक प्रासंगिक हैं।

हृदय एक बहुमुखी अंग है जिसमें हृदय संबंधी सभी प्रमुख प्रकार के कोशिकाएं होती हैंयकृत, और हृदय हृदय अभी भी हृदय संबंधी शरीर विज्ञान की समझ के लिए एक सामान्यतः इस्तेमाल किया मॉडल है। पिछले कुछ दशकों के दौरान, हृदय कोशिकाओं से अलग-अलग सेल प्रकारों के अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है; 4 , 5 , 6 , 7 हालांकि, ये पद्धति केवल एक विशिष्ट सेल प्रकार के अलगाव पर ध्यान केंद्रित करते हैं जिसके परिणामस्वरूप अन्य प्रकार के कोशिकाओं के नुकसान हो सकते हैं जो अब सेलुलर विश्लेषण के लिए उपयोग नहीं किए जा सकते हैं। यहां, एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो प्रमुख सेल प्रकार के हृदय के ऊतकों, यानी कार्डियओमायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं, और फाइब्रोब्लैस्ट्स के युगपत और उच्च गुणवत्ता अलगाव को सक्षम बनाता है। इन सभी प्रकार की कोशिकाओं का इस्तेमाल विभिन्न प्रायोगिक सेटअप 8 , 9 , 10 में किया जा सकता है और एक ही जानवर से सेल-सेल इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

यह जांच अमेरिकी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच प्रकाशन नं। 85-23, 1 9 85) द्वारा प्रकाशित की गई देखभाल और उपयोगशाला के प्रयोग के गाइड के अनुरूप है और इसे गिसेन विश्वविद्यालय की स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में 200-250 जी वजन वाले पुरूष पुरुष विस्टार चूहों का उपयोग किया गया था।

1. आटोक्लेविंग

  1. प्रक्रिया से पहले कम से कम एक दिन पहले ही, सभी सर्जिकल उपकरणों, विंदुक युक्तियों, और पाश्चर पिपेट का इस्तेमाल, अलग-अलग प्रक्रिया में 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए किया जा सकता है।

2. मीडिया और समाधान की तैयारी

नोट: चरण 2.1-2.4 से हल अलगाव के एक सप्ताह तक तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन अलगाव के दिन 2.5-2.8 चरणों में समाधान तैयार कर सकता है। बफ़र्स और मीडिया के पूरे व्यंजनों को तालिका 1 में दिया गया है सभी मीडिया और समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करेंतैयारी शुरू करने से पहले जल स्नान

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 4.5 एल एच एच 2 ओ में तालिका 1 में सूचीबद्ध रसायनों को भंग करके पावेल मध्यम तैयार करें। 2.0 एनओओएचएच के साथ पीएच को समायोजित करें, और मात्रा को 5.0 एल ले जाएं। समाधान निकालें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  2. 4.5 लीटर एच 2 ओ में एम 1 9 9 पाउडर माध्यम को भंग करके क्रिएटिन, एल कार्निटाइन और टॉरिन (सीसीटी) माध्यम तैयार करें। माध्यम से तालिका के अनुसार हेफ़ेस पाउडर जोड़ें और 15 मिनट तक मिश्रण करें। टेबल 1 के अनुसार क्रिएटिन, कार्निटाइन, टॉरिन और आरा-सी जोड़ें अच्छी तरह मिक्स करें, पीएच मीटर को 2.0 एनओओएच के साथ पीएच मीटर से समायोजित करें और वॉल्यूम को 5.0 एल ले जाएं। स्ट्रेइल फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 10% भ्रूण का बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 2% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) को मध्यम एम -1 9 9 जोड़कर फाइब्रोब्लैस्ट के लिए सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें। डीएमईएम समान रूप से एम 1 9 9 के रूप में उपयुक्त है और इसे फाइब्रोब्लास्ट सेल संस्कृति के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. एमवी 2 सेल कल्चर तैयार करेंनिर्माता के निर्देशों के अनुसार बेसल एमवी 2 माध्यम को पूरक मिश्रण की सभी सामग्री जोड़कर एंडोथेलियल सेल के लिए ई माध्यम। एक 5 एमएल विभाज्य ले लो और इसे पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  5. 50 एमएल ऑफ हेंड्स संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में 0.05 ग्राम गोजाइन सीरम एल्बूमिन (बीएसए) को भंग करके एंडोथेलियल सेल अलगाव बफर तैयार करें और इसमें 0.5 एमएल की 200 एमएम एथिलीनएमेनेटेटेट्रैसिसेटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान शामिल करें। बाँझ फ़िल्टर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  6. पीबीएस की 9.9 एमएल के 0.1 एमएल को जोड़कर एंडोथेलियल सेल धो बफर तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर इसे स्टोर करें।
  7. पावेल मध्यम के 5 एमएल में 27 मिलीग्राम कोलेजनज़ को भंग करने और इसे 12.5 μL का 100 एमएम CaCl 2 समाधान जोड़ने से कोलेजनेज समाधान तैयार करें। पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  8. 12.5 μL, 25 μL, और 120 μL का 100 मिमी CaCl 2 सोलट जोड़कर, कार्योमोओसाइट्स के लिए वृद्धिशील सीए 2 + बहाली समाधान 1, 2, और 3 तैयार करेंआयन से 6 एमएल, 6 एमएल, और 12 एमएल पावेल मध्यम क्रमशः।
  9. पूर्व 35 मिमी कोशिका संस्कृति डिश के लिए लएमिनिन वाले पूर्व कोटिंग माध्यम के 1 एमएल को जोड़कर अलगाव के एक दिन पहले कार्डिओमोसाइट्स के लिए कोशिका संस्कृति बर्तन। 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में उन्हें सेते हैं।

3. चुंबकीय मोती की तैयारी

  1. बर्फ पर 1.5 एमएल नमूना ट्यूब में एंडोथेलियल सेल अलगाव बफर के 0.5 एमएल रखें।
  2. पैन माउस आईजीजी चुंबकीय मोतियों के 5 μL (2 x 10 6 ) जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक में ट्यूब रखें मोती ट्यूब की दीवार को चुंबक की तरफ रखते हैं। 1 एमएल विंदुक के साथ सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें।
  4. धोने को दो बार दोहराएं और अंत में 50 μL एंडोथेलियल सेल अलगाव बफर में मोती को फिर से निलंबित कर दें और 4 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग करें।

4. लैंगेंडॉरफ परफ्यूजन सिस्टम की तैयारी

  1. साफ टीवह लैंडेंडॉरफ़ सिस्टम द्वारा 2 एल डिस्टिल्ड वॉटर के साथ छिड़काव करके।
  2. 5 मिनट के लिए 50 मिलीलीटर पॉवेल माध्यम को प्रसारित करें और मध्यम त्यागें।
  3. 80 एमएल ताजा पावेल मध्यम जोड़ें गैस सिलेंडर से पाश्चर विंदुक के गिलास के साथ बुदबुदाते हुए इसे "कार्बोजेन" के साथ लगातार छेड़ो। प्रणाली के माध्यम से मध्यम पुनरावृत्ति करने दें। सिस्टम अब दिल को छूने के लिए तैयार है ( चित्रा 1 ए )।

5. चूहा के विच्छेदन

  1. एक धूआं हुड के तहत 5 एल डिसेकेटर में चूहा रखें और वायु निकालने के माध्यम से 4-5% आईसोफ्लुरेन के 1.5 एमएल को जोड़ने और ढक्कन को बंद करें।
    नोट: तरल isoflurane के साथ जानवर के सीधे संपर्क से बचने के लिए desiccator के अंदर ऊंचा छिद्रित प्लेट पर पशु रखें।
  2. जब तक चूहे अपने ढक्कन पलटा (आमतौर पर ~ 5 मिनट) खो देता है तब तक रुको, और फिर चूहे को डिसेकेटर से बाहर निकालना। ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा चूहा का नामकरण करना।
  3. पेट की त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशी क्षितिज काट लेंतेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके मध्य में सहयोगी इसके बाद, चूहे की उरोस्थि को मांसपेशियों को खड़ी करना और छाती को खोलना। फेफड़ों के साथ हृदय निकालें और तुरंत बर्फ के ठंडे 0.9% NaCl समाधान में अंगों को रखें।
  4. कैंची की एक जोड़ी के साथ फेफड़ों को निकालें और उन्हें त्याग दें। किसी भी संयोजी ऊतक का दिल साफ करें, और ब्रोचियोसेफेलिक ट्रंक की शाखा में वायुमंडल में महाधमनी काटा।

6. दिल और पाचन के collagenase साथ छिड़काव

  1. लैंगेंडॉरफ छिड़काव प्रणाली (धारा 4) में महाधमनी के माध्यम से हृदय को पतला, घुमावदार संदंश के दो जोड़े के माध्यम से माउंट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि मायोकार्डियम एक प्रतिगामी तरीके से छिड़का हुआ है, पहले महाधमनी शाखा और महाधमनी वाल्व के बीच छिड़काव प्रणाली के प्रवेशनी के अंत को रखें। मगरमच्छ दबाना का उपयोग करके महाधमनी को ठीक करना।
  2. सर्जिकल सिवनी के साथ दिल को ठीक करें, और मगरमच्छ क्लैंप ( चित्रा 1 बी ) को हटा दें।
  3. किसी भी अवशिष्ट रक्त को धोने के लिए छिड़काव माध्यम (35 एमएल) को दिल ड्रॉप-वार (60 बूंदों / मिनट; 5 एमएल / मिनट) से गुजरने के लिए प्रवेशनी के वाल्व को खोलें। इस स्तर पर किसी भी प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    नोट: छिड़काव के किसी भी स्तर पर हवा के बुलबुले के गठन से बचें क्योंकि इससे अधूरा पाचन और कोशिका अलगाव प्रक्रिया की विफलता होगी।
  4. फेंकिंग दिल को एकत्रित फनेल (ह्रदय कक्ष, चित्रा 1 बी ) में रखें और इमरिकलेटिक पंप शुरू करें, जो जलाशय ( चित्रा 1 ए ) को इकट्ठा करने के लिए छिड़काव माध्यम से पुनर्चक्रण करेगा।
  5. Collagenase समाधान (चरण 2.8 से) छिड़काव माध्यम को जोड़ें। 30 मिनट के लिए collagenase समाधान recirculating के साथ दिल perfuse
    नोट: यह कदम सेल उपज के अनुकूलन के लिए बहुत ही महत्वपूर्ण है। छिड़काव का समय collagenase की गतिविधि पर निर्भर करता है, जो बैच के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। ओपटी के साथ एक को खोजने के लिए कोलेजनसे के 3-4 बैचों का परीक्षण करेंखराब गतिविधि; तो सबसे अच्छी-अनुकूल बैच की बड़ी मात्रा खरीदा जा सकता है जो कम से कम एक साल के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए पर्याप्त हैं।
  6. पाचन समय के अंत में, छिड़काव को रोकें, कैंसर की एक जोड़ी का उपयोग करके लैंगेंडॉरफ सिस्टम से दिल को हटा दें और इसे एक ग्लास पेट्री डिश में रखें।
  7. कटौती और दोनों atria त्यागें, और किसी भी बचे हुए फैटी ऊतकों को हटा दें उपकला कोशिकाओं के प्रदूषण से बचने के लिए संदंश के दो जोड़े की मदद से पेरीकार्डियम को दूर छील कर दें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो पेरिकार्डियम को शुद्ध हृदय एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कोलेजनज़ के साथ और पच किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में एक विस्तृत प्रोटोकॉल नहीं दिया गया है क्योंकि यह वर्तमान प्रोटोकॉल के दायरे से परे है।
  8. कैंची की एक जोड़ी के साथ मध्य को मध्य में कट कर इसे ऊतक हेलिकॉप्टर में डाल दें। 2-3 बार दिल खोदें और लैंगेंडॉरफ छिड़काव से पाचन बफर के 12 एमएल में कीमा बनाया हुआ ऊतक को फिर से निलंबित करें।
    नोट: एच काट मत करोअधिक खाएं, क्योंकि इससे मृत कार्डियोयोमोसाइट्स का उच्च अनुपात होगा।
  9. कीमा बनाया हुआ टिशू को 15 मिलीलीटर कोलेजनज़ युक्त पृथक्करण माध्यम में ट्रांसफर करें और 5 एमएल डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक का उपयोग करके फिर से निलंबन के द्वारा कभी-कभी मिश्रण के साथ 5-10 मिनट के लिए पानी के नहाने में पचाने दें।
  10. पाचन अवधि के अंत में, सेल निलंबन को 100 माइक्रोन चलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। ऊतक मलबे और अपवित्र सामग्री को त्यागें
  11. लैंगेंडॉरफ छिड़काव के अंत में, छिड़काव तंत्र को तत्काल 1 एल डिस्टिल्ड वॉटर के साथ फ्लश करें। प्रणाली को 100 एमएल 0.1 एनओओएचएच 30 मिनट के लिए पुनर्गठन करके और अंत में 2-3 एल डिस्टिल्ड वॉटर के साथ प्रणाली को फ्लश कर दें। हवा को फ्लाई करके सिस्टम को सूखा और पैरा-फिल्म के साथ खोलने को कवर करें।

7. रट कार्डिएक सेल अलगाव

  1. कार्डियोमायोसाइट्स की अलगाव और संस्कृति
    1. 1 मिनट के लिए 25 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र (बिना ब्रांडेड)Akes) कार्डियोयोमोसाइट्स गोली के लिए कार्डियोमायसाइट्स को भी बिना सेंटीग्यूशन के आरटी पर 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दी जा सकती है।
    2. एक नई 50 एमएल ट्यूब में डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक की सहायता से एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट वाले सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    3. सीए 2 + 6 एमएल समाधान 1 (चरण 2.9) में कार्डियोयोमोसाइटेटलेट को फिर से खोलें। कोशिकाओं को कम सीए 2+ एकाग्रता माहौल में समायोजित करने के लिए 1 मिनट की अनुमति दें, और सेल निलंबन को फिर से 25 मिनट में 1 मिनट (बिना ब्रेक के) के लिए सेंटीफ्यूज करें
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 6 मिलीलीटर सीए 2 + समाधान 2 (चरण 2.9) में सेल गोली resuspend। कोशिकाओं 1 मिनट को सीए 2 + के मध्यवर्ती एकाग्रता में समायोजित करने की अनुमति दें, और अंत में कोशिकाओं के लिए 12 एमएल का सीए 2 + समाधान 3 (चरण 2.9) जोड़ें। एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक की मदद से मिलाएं।
    5. 1 मिनट के लिए 25 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र
    6. सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और 20 एमएल पूर्व में कोशिकाओं को फिर से खोलेंभयानक सीसीटी माध्यम लैमिनेइन (चरण 2.9) के साथ पूर्व लेपित 20 बाँझ 35 एमएम सेल कल्चर डिश में से प्रत्येक के लिए सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को CO 2 -free सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें।
      नोट: कार्योयोमोसाइट्स को सीओ 2 पर्यावरण के तहत सुसंस्कृत किया जा सकता है; हालांकि, इस मामले में बिकारबोनेट बफर सिस्टम के साथ मीडिया का उपयोग किया जाना चाहिए।
    7. 2 घंटे के बाद, किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए सीसीटी माध्यम के नए 2 एमएल के साथ माध्यम की जगह दें।
      नोट: कोशिकाएं किसी भी नियोजित प्रयोगों के लिए तैयार हैं और एक विशिष्ट सेल कल्चर इनक्यूबेटर (CO 2 मुक्त) में रहने वाले कोशिकाओं के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना 3 दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है। विशिष्ट स्वस्थ छड़ी के आकार का कार्डियोयोमोसाइट्स चित्रा 2 ए में दिखाए जाते हैं।
  2. एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लैस्टों का अलगाव
    1. 10 मिनट के लिए 250 xg पर एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट वाले स्टेरनेटेंट (चरण 7.1.2 से) अपकेंद्रित्र
    2. सुपे को त्यागें2 एमएल नमूना ट्यूब में एंडोथेलियल सेल अलगाव बफर के 1.5 मिलीलीटर में रैनेटेट और सेल गोली resuspend।
    3. सेल निलंबन के लिए माउस विरोधी-चूहा सीडी 31 एंटीबॉडी के 3 माइक्रोग्राम (1: 500) जोड़ें और अंत में अंत रोटेशन के साथ 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इसे सेते।
      नोट: इष्टतम कमजोर पड़ने के लिए एंटीबॉडी का एक अनुमापन सलाह दी जाती है। यह चरण 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी पर किया जाना चाहिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा एंटीबॉडी का एक तीव्र आंतरिकीकरण कम उपज में होगा।
    4. पहले से तैयार (धारा 3) को सेल निलंबन के लिए पैन एंटी-माउस आईजीजी मोती जोड़ें और अंत में एंड रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते रहें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, माउस एंटी-राउड सीडी 31 एंटीबॉडी चुंबकीय मोती से पूर्व-संलग्न हो सकते हैं और फिर सेल निलंबन में जोड़ा जा सकता है। हालांकि, यह सेल निलंबन के साथ मोतियों के ऊष्मायन के समय में वृद्धि होगी और नॉन एंडोथिलियल कोशिकाओं के गैर-विशिष्ट बंधन में वृद्धि हो सकती है और इसलिए अन्य कोशिका प्रकारों के उच्च संदूषण।
    5. एएंटीबॉडी ऊष्मायन समय के अंत में, एक चुंबकीय रैक में सेल निलंबन युक्त ट्यूब रखें और ट्यूब के किनारे एंडोथिलियल कोशिकाओं से जुड़े चुंबकीय मोतियों को व्यवस्थित करने के लिए 2 मिनट की अनुमति दें।
    6. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके शेष सेल निलंबन (मुख्य रूप से फाइब्रोब्लैस्ट युक्त) को सावधानीपूर्वक हटा दें और इसे 10 मिलीलीटर फाइब्रोब्लैस्ट सेल संस्कृति माध्यम (चरण 2.3) युक्त 10 सेमी सेल कल्चर डिश में जोड़ें। इसे 5% सीओ 2 युक्त एक विशिष्ट सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें प्रक्रिया चरण 7.3 में जारी है।
    7. एंडोथेलियल कोशिकाओं युक्त चुंबकीय मोतियों के साथ ट्यूब में 1 एमएल का वॉश बफर जोड़ें।
    8. ट्यूब कैप करें, इसे चुंबकीय रैक से हटा दें, और धीरे-धीरे 4 से 5 गुना धीरे-धीरे मिलाते हुए मोती को फिर से बारीक करें। ट्यूब को फिर से चुंबकीय रैक में रखें, मोती को 1 मिनट के लिए ट्यूब की दीवार पर व्यवस्थित करने दें, और धोने बफर को ध्यान से हटा दें।
    9. धोने के चरणों को दोहराएं 5-7 बार किसी भी दूषित पदार्थ से छुटकारा पाने के लिएऑन-एन्डोथेलियल कोशिकाएं
    10. एमओ 2 एन्डोथेलियल सेल संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में मोती से जुड़ी एंडोथेलियल कोशिकाओं को फिर से खोलें, 12-अच्छी तरह से एक प्लेट की एक अच्छी तरह से जोड़ें, और सीओ 2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    11. कोशिकाओं को रात भर संलग्न करने की अनुमति दें और अगले दिन माध्यम बदल दें और फिर हर 2-3 दिन तक कोशिकाओं को अर्ध-मिला हुआ (आमतौर पर 5-7 दिन) बनने तक।
      नोट: 7-10 दिनों के अलगाव के बाद 3-4 दिनों के बाद विशिष्ट नॉन-कन्फ्यूमेट एंडोथिलियल कोशिकाओं क्रमशः आंकड़े 3 ए और 3 बी में दिखाए जाते हैं। तब कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज किया जा सकता है (अनुभाग 7.4) और टी -25 सेल कल्चर फ्लास्क में वरीयता दी जा सकती है।
  3. धुआं और फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृति (चरण 7.2.6 से जारी)
    1. ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, मध्यम को महाप्राणित करें और पूर्व-गर्म पीबीएस के उपयुक्त मात्रा को जोड़कर कोशिका संस्कृति पकवान से जुड़े फाइब्रोब्लैस्टों को धो लें। पीबीएस की तरक्की करें और एस को दोहराएं2-3 बार चापलूसी और अंत में ताजा फाइब्रोब्लास्ट सेल संस्कृति माध्यम से प्री-वार्मिंग जोड़ें।
    2. अगले दिन फिर से प्री-वार्मिंग पीबीएस (पिछले चरण में) के साथ संलग्न कोशिकाओं को धो लें और प्री-हॉट ताजे माध्यम जोड़ें। हर 2-3 दिनों के बाद मध्यम बदलें अलगाव के दिन 2 पर फाइब्रोब्लास्ट की एक विशिष्ट फेनोटाइप चित्रा 4 ए में दिखाया गया है।
      नोट: फाइब्रोब्लास्ट आम तौर पर 5-7 दिनों के भीतर अर्ध-संगम हो जाते हैं और फिर ट्रायप्सीन किए जाने के लिए तैयार होते हैं (अनुभाग 7.4) और नियोजित प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है। इस प्रक्रिया के साथ, आम तौर पर हम 95-99% शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट प्राप्त करते हैं। अलगाव के दिन 7 पर फाइब्रोब्लास्ट का एक विशिष्ट फेनोटाइप चित्रा 4 बी में दिखाया गया है।
  4. एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स के ट्रिप्सिनिज़ेशन
    1. सेल संस्कृति डिश के माध्यम से मध्यम महाप्राणित करें और कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त पूर्व-गर्म पीबीएस जोड़ें।
    2. पीबीएस की तरक्की करें और कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (क्रमशः 0.05% और 0.02%) जोड़ें और वें स्थान पर रखेंई 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर 5 मिनट के लिए
    3. एक एमएल विंदुक की मदद से कोशिकाओं को ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को पुन: resuspend और 10% एफसीएस जोड़कर trypsin कार्रवाई बंद करो।
    4. सैट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल निलंबन को आरटी के 10 मिनट के लिए 250 xg पर रखें
    5. पूर्व-गर्म सेल संस्कृति माध्यम की एक उचित मात्रा में कोशिकाओं को पुन: resuspend।

8. एंडोथेलियल सेल कैरेक्टराइजेशन

नोट: एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्धता दिल-एसी-एलडीएल के तेज और वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) के प्रतिरक्षण द्वारा निर्धारित की जाती है। कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी ( आंकड़े 3 सी -3 ई ) द्वारा देखा जाता है।

  1. एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा दिल-एसी-एलडीएल तेज
    1. एंडोथेलियल कोशिकाओं (चरण 7.4) की कोशिश करो और उन्हें 12-अच्छी तरह से प्लेट (लगभग 10 x 10 4 कोशिकाओं / सेमी 2 ) में कांच के कटोरे पर रातोंरात कैंप करें।
    2. मध्यम की इच्छाशक्ति और पहले एम के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं कुल्लासशस्त्र एचबीएसएस
    3. एचबीएसएस की तरक्की करें और 10 मिलीग्राम / एमएल दिल-एसी-एलडीएल वाले 1 मिलीलीटर एन्डोथेलियल सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को छोड़ दें।
    4. मध्यम की इच्छाशक्ति और पूर्व गर्म पीबीएस तीन बार कोशिकाओं कुल्ला और उन्हें 4% पैराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए, पीबीएस में भंग) के 1 एमएल के साथ ठीक करें। उन्हें पीएफए ​​से 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से सेते हैं
      नोट: पीएफए ​​संक्षारक है; पीएफए ​​समाधान को संभालने के दौरान हमेशा एसिड प्रतिरोधी दस्ताने का उपयोग करें
    5. पीएफए ​​की इच्छाशक्ति, 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट में कंसोल पर कोशिकाओं को कुल्ला, और उन्हें आरटी पर 1 घंटे के लिए परमाणु धुंधला समाधान टो-प्रो (10 माइक्रोग्राम) के साथ सेते।
      नोट: यदि उपयुक्त फिल्टर माइक्रोस्कोप के लिए उपलब्ध है, तो 4 ', 6-डायरीडिनो-2-फेनिलंडोल (डीएपीआई; 1 माइक्रोग्राम / एमएल) भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में ऊष्मायन समय को 10 मिनट तक घटाया जाना चाहिए
    6. 1 एमएल पीबीएस के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट में कंसलिप पर कोशिकाओं को कुल्ला, पीबीएस की aspirate, और चरण तीन बार दोहराएं।
    7. सी लो12-अच्छी तरह से थाली से बाहर निकलते हैं और इसे माउंटिंग माध्यम की एक बूंद के साथ एक गिलास स्लाइड पर माउंट करते हैं। एक फ्लोरोसेंट / कन्वर्स्कल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाएं देखने के लिए तैयार हैं। दिल-एसी-एलडीएल के लिए 530-560 एनएम, टीओ-प्रो के लिए 640 एनएम और डीएपीआई के लिए 340-380 एनएम का उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करें।
  2. वॉन विलेब्रांड (वीडब्ल्यूएफ) धुंधला हो जाना
    1. चरण 8.1.1 में बताए गए अनुसार एंडोथेलियल कोशिकाओं की संस्कृति।
    2. मध्यम की इच्छाशक्ति और पूर्व गर्म एचबीएसएस के 1 एमएल युक्त कोशिकाओं को कुल्ला; इसके बाद, चरण 8.1.4 में वर्णित 4% पीएफए ​​के साथ ठीक करें।
    3. पीएफए ​​की इच्छाशक्ति, 12-अच्छी तरह से प्लेट में कंसलिप पर कोशिकाओं को दो बार पीबीएस के 1 एमएल के साथ कुल्ला, और आरटी के 20 मिनट के लिए 1 एमएल 0.1% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएस में) के साथ कोशिकाओं को प्रचलित करें।
    4. 1 घंटे के लिए permeabilizing समाधान Aspirate और अवरुद्ध समाधान (5% बीएसए / पीबीएस में 5% एफसीएस) के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
    5. खरगोश विरोधी- vWF एंटीबॉडी (1: 100) के साथ कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified चैम्बर में रातोंरात सेते हैं। वें के बिना एक कवरलाप जोड़ेंई प्राथमिक एंटीबॉडी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में
    6. 1-एमएल पीबीएस के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट में कंसलिप पर कोशिकाओं को कुल्ला करें और गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोअर -488 एंटीबॉडी (1: 500) और परमाणु धुंधला हो जाना समाधान 1-पी (10 माइक्रोग्राम) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। आरटी पर
    7. 12 मिलीलीटर प्लेट में 1 एमएल पीबीएस के साथ कंसलिप पर कोशिकाओं को कुल्ला, पीबीएस की aspirate, और चरण तीन बार दोहराएं।
    8. 12-अच्छी तरह से प्लेट के कंडोली को बाहर ले जाओ और माउंटिंग माध्यम की एक बूंद के साथ एक ग्लास स्लाइड पर माउंट करें। एक फ्लोरोसेंट / कन्वर्स्कल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाएं देखने के लिए तैयार हैं। परमाणु धुंधला हो जाने के लिए 490 एनएम के लिए उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करें और 640 एनएम के लिए।

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Representative Results

अलगाव प्रक्रिया का परिणाम 70-80% व्यवहार्य, रॉड-आकार वाले, धारीदार कार्डियोयोमोओसाइट्स ( आंकड़े 2 ए और 2 सी ) की उपज में होता है, जो कि योजनागत प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। हमारे प्रयोगशाला कार्डियोयोमोसाइट्स में नियमित रूप से Ca 2+ सिग्नलिंग के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। चित्रा 5 ए फुरा-एएम (5 सुक्ष्ममापी) के साथ लोड किए गए कार्डिय्योमायसाइट्स में ischemia / reperfusion के जवाब में इंट्राससेल्यूलर कैल्शियम [सीए 2 + ] आई ओसीलन दिखाती है। चित्रा 5 बी एटीपी (100 सुक्ष्ममापी) को जोड़ने के बाद एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स में [सीए 2+ ] में बदलाव दर्शाता है। [सीए 2 + ] में परिवर्तन अलग-अलग कार्डियक सेल प्रकारों में पहले से बताए गए अनुसार विश्लेषण किया गया था। 6 , 11 , 12

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चित्रा 1: संशोधित लैंगेंडॉरफ़ परफ्यूजन सिस्टम। ( ए ) कार्डोनिक कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला संपूर्ण लैंडेंडॉरफ़ छिड़काव प्रणाली ( बी ) "ह्रदय कक्ष" में फांसी के दिल के बढ़े हुए दृश्य को पुनर्क्रयन के लिए छिड़काव बफर के संग्रह के लिए भी इस्तेमाल किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: प्रौढ़ चूहे कार्डिओमोओसाइट्स ( ए ) ठेठ रॉड-आकार, स्वस्थ कार्डिओमायसाइट्स, लैमिनिन-लेपित सेल कल्चर डिश में चढ़ाना के बाद 2 घंटे ( बी ) अपूर्ण टिशू पाचन के कारण खराब तैयारी का एक विशिष्ट उदाहरण। Laminin लेपित सेल संस्कृति बर्तन में चढ़ाना के बाद 2 घंटे, मोकोशिकाओं में से एक हाइपर-कॉन्ट्रैक्ट किया जाता है और गोल दिखाई देता है, और कुछ रॉड-आकार वाले कार्डियोमोओसाइट्स हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन ( सी ) एन्टीन विज़ुअलाइजेशन के लिए दाग वाले एकल कार्डियोमायोसाइट के कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ, जैसा पहले बताया गया है। 13 स्केल बार = 50 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: चूहा कार्डिएक एंडोथेलियल सेल ( ए ) अलग-अलग अलगाव के 3 दिनों के बाद गैर-संयुग्मित endothelial सेल monolayer के चरण-विपरीत माइक्रोग्राफ। डार्क स्पॉट चुंबकीय मोती हैं जो अभी भी माता-पिता एंडोथेलियल कोशिकाओं से संलग्न हैं। स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी ( बी ) मिलाया endothelial सेल monolayer के चरण-विपरीत माइक्रोग्राफ 7 दिनों के अलगाव के बाद ( सी) दिल-एसी-एलडीएल तेज (लाल) और परमाणु धुंधला (नीला) ( डी ) दिखाए गए एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रतिरक्षण को vWF (रेड) और परमाणु धुंधला (नीला) ( ई ) कोशिकाओं के धुंधला हो जाने वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रतिरक्षण को केवल माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु दाग ​​(नीला) (स्केल बार = 50 माइक्रोन) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: चूहा कार्डिएक फाइब्रोब्लास्ट्स। ( ए ) अलगाव के दूसरे दिन विशिष्ट स्पाइंडल-आकार वाले कार्डियाक फाइब्रोब्लास्ट। ( बी ) 7 दिनों की संस्कृति के बाद, संगम, शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट। ( सी ) उपकला कोशिकाओं के साथ दूषित तैयारी के एक विशिष्ट उदाहरण। एरोहेड्स द्वारा दर्शाए गए कक्षों में हृदय उपकला कोशिकाएं हैं । स्केल बार = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: कार्डियाक कोशिकाओं में [सीए 2+ ] में परिवर्तन। ( ए ) इंट्रासेल्युलर कैल्शियम [सीए 2 + ] में परिवर्तनों के प्रतिनिधि ट्रेसिंग, मैं रासायनिक इस्किमिया (ना-साइनाटेट; 2 एमएम) के सामने चूहे कार्डियोयोमोसाइट्स में फुरा -2 अनुपात द्वारा मापा जाता है, जिसके बाद रीपरफ्यूजन ( बी ) इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में परिवर्तन के प्रतिनिधि ट्रेसिंग [सीए 2 + ] मैं चूहा कार्डियक एंडोथिलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स में फुरा -2 अनुपात द्वारा मापा जाता है, जो एटीपी (100 माइक्रोन) के साथ इलाज किया गया है, जैसा कि संकेत दिया गया है। > इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस लेख में, कार्डियक मायोकॉइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लैस्ट्स के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह प्रोटोकॉल केवल एक कोशिका प्रकार के विरोध में प्रमुख सेल प्रकार के हृदय ऊतक, यानी कार्डियओमायोसाइट्स, एंडोथिलियल कोशिकाओं, और फाइब्रोब्लास्ट की एक साथ और उच्च गुणवत्ता अलगाव का वर्णन करता है। अलगाव की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम हृदय के ऊतकों का उचित पाचन है। यदि पाचन अपूर्ण है, तो बड़ी संख्या में माइकोटाइट अभी भी प्राप्त किए जा सकते हैं लेकिन उनकी गुणवत्ता बहुत खराब है और ये अधिकतर हाइपर-कॉन्ट्रैक्टेड और गोल ( चित्रा 2 बी ) और प्रयोगों में कोई भी मूल्य नहीं है। इसके अलावा, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट की पैदावार भी कम हो जाएगी। इस समस्या को पाचन समय को नियंत्रित करके हल किया जा सकता है। छिड़काव प्रणाली से दिल को हटाने से पहले, संदंश और उंगलियों की मदद से हृदय की कोमलता की जांच की जा सकती है। यदि ऊतक अभी भी ज़ाहिर नहीं हैइसके अतिरिक्त, दिल को अतिरिक्त 5-10 मिनट के लिए परिरक्षित किया जा सकता है स्वस्थ कार्डियोयोमोसाइट्स अलगाव में दूसरा महत्वपूर्ण चरण अलगाव बफ़र्स में सीए 2 + की वृद्धिशील पुनर्स्थापना है। मीडिया में सीए 2 + के उच्च सांद्रता की एक तेजी से बहाली के परिणामस्वरूप गोल कार्डियोयोमोसाइट्स होंगे। बफ़र्स की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला पानी की गुणवत्ता कार्डियोयोमोसाइट्स की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाला एक और महत्वपूर्ण कारक है। इसलिए, अच्छी गुणवत्ता वाले पानी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्धता अत्यधिक धोने के चरणों पर निर्भर होती है। गैर-एन्डोथेलियल कोशिकाओं के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी चुंबकीय मोतियों को रोकने के लिए वॉशिंग बफ़र में EDTA मौजूद होना चाहिए। सेल निलंबन में रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति बहुत endothelial कोशिकाओं की उपज कम हो जाएगी; इसलिए, छिड़काव प्रणाली में दिल बढ़ाना और कोलेजनज़ को जोड़ने से पहले दिल की उचित धुलाई बहुत महत्वपूर्ण है। अवशिष्ट रक्त घटक भी टी को कम करेगावह कोलेजनज़ की गतिविधि और इसलिए दिल की पाचन में बाधा डालना

फाइब्रोब्लास्ट सेल संस्कृति में सबसे आम संदूषण उपकला कोशिकाओं ( चित्रा 4 सी ) के उपग्रह कालोनियों की उपस्थिति है। फाइब्रोब्लास्ट्स के दो-चरण संवर्धन द्वारा यह संदूषण टाला जा सकता है पहले चरण में, फाइब्रोब्लास्ट सेल संस्कृति माध्यम में एफसीएस की एकाग्रता को घटाकर 5% कर दिया गया है और सेल निलंबन इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेल कल्चर डिश का पालन करने की अनुमति है। उपकला कोशिकाओं का तेजी से पालन होता है लेकिन सीरम की कम एकाग्रता की उपस्थिति में फाइब्रोब्लैस्ट सेल आसंजन समय बढ़ जाता है। ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, गैर-पक्षपाती फाइब्रोब्लैस्ट युक्त सेल निलंबन को ध्यान से एक नए सेल कल्चर डिश में हटा दिया जाता है। इस प्रकार फाइब्रोब्लास्ट की उपज कम हो सकती है लेकिन उनकी पवित्रता बहुत बढ़ी है।

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Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

एल। रैनलडी, एस। स्कैफ़र, डी। रीट्स, एच। थॉमस और ए। वेबर की तकनीकी सहायता की सराहना की गई है। लेखक पांडुलिपि के व्यापक प्रमाण पढ़ने और भाषा संपादन के लिए डॉ। ई। मार्टिन्सन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन को एमएस असलम और डी। गुंडुज़ को जीससन एज़ेब्ब्सफिनानजीरंग अनुदान के लिए विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-vWF Santa Cruz Biotech. SC-14014
Calcium chloride Merck 102378
Carnitin Sigma-Aldrich C0283
Collagenase type II Worthington LS004176
Creatin Sigma-Aldrich C0780
D-Glucose Merck 108342
Dil-Ac-LDL Thermo Scientific L3484
EDTA Solution (0.2 M) Biochrome AG L2113
Embeding solution Citiflour AF1-25
Endothelial cell medium MV2 PromoCell C-22022
Foetal calf serum (FCS) Biochrome AG S0615
Gentamicin Serva Chemicals 47991
HEPES Sigma-Aldrich H0887
Isoflurane Abbott TU 061219
Laminin  Roche/Sigma 11243217001
M199 medium Thermo Scientific 11150059
M199 medium (Powder) Biochrome AG T061
Magnesium sulphate Sigma-Aldrich 63138
Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) Thermo Scientific MA1-81051
NaCl solution (0.9%), Sterile B. Braun 30820080
Pan mouse IgG beads (Dynabeads) Thermo Scientific 11041
Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution Santa Cruz Biotech. sc-281692
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063
Phosphate buffer saline (PBS) 1x  PAN-Biotech P04-36500
Plastic consumables Greiner Bio-One
Potassium Chloride Merck 4933
Potassium dihydrogen phosphate Merck 7873
Sodium Chloride Merck 6404
Sodium Hydroxide Solution (2 N) Merck 109136
Sterile filtration system Thermo Scientific 5660020
Taurine Sigma-Aldrich T8691
TO-PRO Thermo Scientific T3605
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma-Aldrich T4174
Water, Sterile B. Braun

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References

  1. Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
  2. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  3. Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
  4. Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
  5. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
  6. Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
  7. Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
  8. Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
  9. Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
  10. Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
  11. Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
  12. Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
  13. Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 123 एंडोथेलियल कोशिकाएं कार्डियोमोसाइट्स फाइब्रोब्लस्ट्स लैन्डेन्डरफ़ अलगाव सेल संस्कृति
एक प्रौढ़ चूहा दिल से उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल सेल और फाइब्रोब्लस्ट्स के साथ-अलगाव
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Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. J. Vis. Exp. (123), e55601, doi:10.3791/55601 (2017).

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