Summary
Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.
Abstract
La rata es un importante modelo animal utilizado en la investigación cardiovascular, y las células cardíacas de rata se utilizan rutinariamente para el análisis in vitro de los mecanismos moleculares de la progresión de la enfermedad cardiovascular, tales como hipertrofia cardíaca, fibrosis y aterosclerosis. Aunque se han hecho varios intentos con éxito variable para desarrollar líneas celulares inmortalizadas desde el sistema cardiovascular para comprender estos mecanismos celulares, las células primarias ofrecen un entorno más natural y cercano al in vivo para tales estudios. Por lo tanto, diferentes laboratorios que trabajan en un tipo particular de células han desarrollado protocolos para aislar tipos individuales de células cardíacas de rata de interés. Sin embargo, falta un protocolo que permita el aislamiento de más de un tipo de célula. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación y permiteR para análisis celulares. Esto permite el uso más eficiente de los recursos disponibles, lo que puede ahorrar tiempo y reducir los costos de investigación.
Introduction
Los modelos de roedores se han utilizado durante mucho tiempo como herramientas para ampliar nuestra comprensión de la fisiología cardiovascular en la salud y la enfermedad. 1 Aunque estos modelos animales nos permiten comprender la fisiopatología de una enfermedad a nivel de órganos y analizar la farmacocinética y farmacodinámica de diversos agentes farmacológicos utilizados para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, la comprensión de los mecanismos moleculares del desarrollo de enfermedades cardiovasculares y la contribución de una enfermedad particular Tipo de célula requiere el uso de modelos de cultivo celular in vitro . Para este propósito se han desarrollado diferentes líneas celulares inmortalizadas del sistema cardiovascular; 2 , 3 sin embargo, las células primarias recién aisladas son fisiológica y funcionalmente más relevantes para los tejidos y organismos vivos.
El corazón es un órgano versátil que contiene todos los tipos principales de células del sistema cardiovascular.Y el corazón de la rata sigue siendo un modelo comúnmente utilizado para la comprensión de la fisiología cardiovascular. Durante las últimas décadas, se han descrito diferentes métodos para aislar tipos de células individuales del tejido cardíaco; 4 , 5 , 6 , 7 sin embargo, estos métodos se centran solamente en el aislamiento de un tipo celular específico que da como resultado la pérdida de otros tipos de células que ya no se pueden usar para el análisis celular. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento simultáneo y de alta calidad de los principales tipos celulares de tejido cardíaco, es decir, cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos. Todos estos tipos de células se pueden utilizar en diferentes configuraciones experimentales 8 , 9 , 10 y para el análisis de las interacciones célula-célula del mismo animal.
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Protocol
La investigación se ajusta a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NIH Publication No. 85-23 1985) y fue aprobada por el comité local de ética de la Universidad de Giessen. En este estudio se usaron ratas Wistar macho adultas que pesaban 200 - 250 g.
1. Autoclave
- Al menos un día antes de que se lleve a cabo el procedimiento, esterilice en autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, las puntas de pipeta y las pipetas Pasteur que se utilizarán en el procedimiento de aislamiento a 121 ° C durante 30 min.
2. Preparación de medios y soluciones
NOTA: Las soluciones de los pasos 2.1-2.4 se pueden preparar hasta una semana antes del aislamiento y almacenarse a 4 ° C, pero preparar las soluciones en los pasos 2.5-2.8 el día del aislamiento. Las recetas completas de los tampones y los medios se dan en la Tabla 1 . Calentar todos los medios y soluciones a 37 ° C en unaBaño de agua antes de comenzar la preparación.
- Preparar el medio Powell disolviendo los productos químicos enumerados en la Tabla 1 en 4,5 L de H 2 O a temperatura ambiente (RT). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 2,0 N, y llevar el volumen a 5,0 L. Filtrar la solución estéril y almacenarla a 4 ° C.
- Preparar el medio de creatina, L-carnitina y taurina (CCT) disolviendo el medio en polvo M199 en 4,5 L de H 2 O. A~nadir polvo HEPES de acuerdo con Table al medio y mezclar durante 15 min. Añadir creatina, carnitina, taurina y Ara-C de acuerdo con la Tabla 1 . Mezclar bien, ajustar el pH con pH metro a 7,4 con NaOH 2,0 N, y llevar el volumen a 5,0 L. Filtro estéril y almacenar a 4 ° C.
- Preparar el medio de cultivo celular para los fibroblastos mediante la adición de 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 2% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) al medio M199. El DMEM es igualmente adecuado como M199 y también puede usarse para el cultivo de células de fibroblastos.
- Preparar la cultura celular MV2E para las células endoteliales mediante la adición de todos los contenidos de la mezcla de suplementos al medio basal MV2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tomar una alícuota de 5 ml y calentarla a 37 ° C en un baño de agua.
- Preparar el tampón de aislamiento de células endoteliales disolviendo 0,05 g de albúmina de suero bovino (BSA) en 50 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y añadiendo 0,5 ml de solución de ácido etilendiaminotetraacético 200 mM (EDTA). Filtre el filtro estéril y guárdelo a 4 ° C.
- Preparar el tampón de lavado de células endoteliales mediante la adición de 0,1 ml de 200 mM a 9,9 ml de PBS y almacenar a 4 ° C.
- Preparar solución de colagenasa mediante la disolución de 27 mg de colagenasa en 5 ml de medio Powell y la adición de 12,5 μ l de 100 mM CaCl 2 solución a la misma. Calentar a 37 ° C en un baño de agua.
- Prepare soluciones incrementales de restauración de Ca 2 + 1, 2 y 3 para cardiomiocitos mediante la adición de 12,5 μL, 25 μL y 120 μL de solución de CaCl2 100 mMIon a 6 ml, 6 ml y 12 ml de medio Powell, respectivamente.
- Pre-recubrir las placas de cultivo celular para cardiomiocitos un día antes del aislamiento mediante la adición de 1 ml de medio de pre-recubrimiento que contiene laminina a cada plato de cultivo celular de 35 mm. Incubarlos en el incubador de cultivo celular a 37ºC durante la noche.
3. Preparación de cuentas magnéticas
- Coloque 0,5 ml del tampón de aislamiento de células endoteliales en un tubo de muestra de 1,5 ml en hielo.
- Añadir 5 μl (2 x 10 6 ) de perlas magnéticas de ratón de ratón y mezclar bien.
- Coloque el tubo en el soporte magnético durante 1 min. Las perlas se adherirán a la pared del tubo hacia el imán. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 1 ml.
- Repetir el lavado dos veces más y finalmente volver a suspender las perlas en 50 μ l de aislamiento celular de células endoteliales y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
4. Preparación del sistema de perfusión de Langendorff
- LimpioEl sistema de Langendorff por perfusión con 2 L de agua destilada.
- Circule 50 ml de medio Powell a través del sistema durante 5 min y deseche el medio.
- Añadir 80 ml de medio Powell fresco. Perfundir continuamente con "carbogen" burbujeando con una pipeta Pasteur de vidrio del cilindro de gas. Deje que el medio recircule a través del sistema. El sistema está ahora listo para perfundir el corazón ( Figura 1A ).
5. Disección de la Rata
- Coloque la rata en un desecador de 5 l bajo una campana extractora de humos y añada 1,5 ml de isoflurano al 4-5% a través del respiradero y cierre la tapa.
NOTA: Colocar el animal sobre una placa perforada elevada dentro del desecador para evitar el contacto directo del animal con el isoflurano líquido. - Espere hasta que la rata pierda su reflejo de la tapa (generalmente ~ 5 min), y entonces tome la rata del desecador. Eutanasia de la rata por dislocación cervical.
- Corte la piel abdominal y el músculo subyacente horizontalAliado en el medio usando un par de tijeras afiladas. Después, corte el músculo verticalmente al esternón de la rata y abra el tórax. Retire el corazón junto con los pulmones e inmediatamente coloque los órganos en una solución de NaCl al 0,9% enfriada con hielo.
- Retire los pulmones con la ayuda de un par de tijeras y deséchelos. Limpiar el corazón de cualquier tejido conectivo, y cortar la aorta caudalmente en la rama del tronco braquiocefálico.
6. Perfusión del corazón y digestión con colagenasa
- Monte el corazón a través de la aorta en el sistema de perfusión de Langendorff (sección 4) usando dos pares de fórceps finos y curvos. Para asegurar que el miocardio se perfunde de manera retrógrada, coloque el extremo de la cánula del sistema de perfusión entre la primera rama aórtica y la válvula aórtica. Fijar la aorta con una abrazadera de cocodrilo.
- Fijar el corazón con una sutura quirúrgica, y quitar la abrazadera de cocodrilo ( Figura 1B ).
- Abra la válvula de la cánula para permitir que el medio de perfusión (35 ml) pase a través del corazón gota a gota (60 gotas / min, 5 ml / min) para lavar cualquier sangre residual. Deseche cualquier flujo a través de esta etapa.
NOTA: Evite la formación de burbujas de aire en cualquier etapa de la perfusión ya que esto resultará en una digestión incompleta y un fallo en el procedimiento de aislamiento celular. - Coloque el corazón colgante en el embudo de recogida (cámara del corazón, Figura 1B ) e inicie la bomba peristáltica, que recirculará el medio de perfusión desde el embudo de recogida hasta el depósito ( Figura 1A ).
- Añadir la solución de colagenasa (del paso 2.8) al medio de perfusión. Perfundir el corazón con la solución de colagenasa recirculante durante 30 min.
NOTA: Este paso es muy crítico para optimizar el rendimiento celular. El tiempo de perfusión depende de la actividad de la colagenasa, que puede variar dependiendo del lote. Pruebe 3-4 lotes de colagenasa para encontrar el uno con optiMal actividad; Entonces se pueden comprar grandes cantidades del lote más adecuado que son suficientes por lo menos un año para obtener resultados reproducibles. - Al final del tiempo de digestión, detener la perfusión, quitar el corazón del sistema de Langendorff con un par de tijeras, y colocarlo en una placa de Petri de vidrio.
- Cortar y descartar ambas aurículas, y eliminar los tejidos grasos sobrantes. Cuidadosamente pelar el pericardio con la ayuda de dos pares de fórceps para evitar la contaminación de las células epiteliales.
NOTA: El pericardio puede ser digerido adicionalmente con colagenasa para obtener células epiteliales cardiacas puras si es necesario. No se da un protocolo detallado en el presente estudio ya que esto está más allá del alcance del presente protocolo. - Cortar el corazón por el centro con un par de tijeras y ponerlo en el helicóptero de tejido. Picar el corazón 2-3 veces y volver a suspender el tejido fino en 12 ml del tampón de la digestión de la perfusión de Langendorff.
NOTA: No corte la hEart en exceso, ya que esto dará lugar a una mayor proporción de cardiomiocitos muertos. - Transferir el tejido picadito en 15 ml de medio de disociación que contiene colagenasa y dejar que digerir en un baño de agua durante 5-10 min con mezclas ocasionales por resuspensión utilizando una pipeta de plástico desechable de 5 ml.
- Al final del período de digestión, filtrar la suspensión celular a través de un tamiz de 100 μm. Deseche los restos de tejido y el material no digerido.
- Al final de la perfusión de Langendorff, enjuague inmediatamente el sistema de perfusión con un mínimo de 1 L de agua destilada. Perfundir el sistema mediante la recirculación de 100 mL de NaOH 0,1 N durante 30 min, y finalmente enjuagar el sistema con 2-3 l de agua destilada. Seque el sistema por lavado de aire y cubra la abertura con para-película.
7. Aislamiento celular de la rata
- Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos
- Centrifugar la suspensión celular a 25 xg durante 1 min (sin brAkes) para sedimentar los cardiomiocitos. También se puede permitir que los cardiomiocitos se sedimenten durante 10 minutos a RT sin centrifugación.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante que contiene células endoteliales y fibroblastos con la ayuda de una pipeta de plástico desechable en un nuevo tubo de 50 ml.
- Resuspender el sedimento de cardiomiocitos en Ca 2 + 6 ml de solución 1 (Etapa 2.9). Dejar 1 minuto para que las células se ajusten al bajo ambiente de concentración de Ca2 + , y centrifugar la suspensión celular de nuevo a 25 xg durante 1 minuto (sin frenos).
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 6 ml de solución de Ca 2+ 2 (Etapa 2.9). Permitir que las células de 1 minuto para ajustar a la concentración intermedia de Ca 2 + , y, finalmente, añadir 12 ml de Ca 2 + solución 3 (Paso 2.9) a las células. Mezclar con la ayuda de una pipeta de plástico desechable.
- Centrifugar la suspensión celular a 25 xg durante 1 min.
- Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 20 ml pre- medio CCT calentado. Añadir 1 ml de la suspensión celular a cada una de 20 placas de cultivo celular estériles de 35 mm previamente recubiertas con laminina (Etapa 2.9) y dejar que las células se unan durante 2 h en una incubadora de cultivo celular libre de CO 2 .
NOTA: Los cardiomiocitos también pueden ser cultivados bajo ambiente de CO 2 ; Sin embargo, en este caso se deben usar medios con sistema tampón de bicarbonato. - Después de 2 h, reemplace el medio con 2 mL nuevos de medio CCT para eliminar las células muertas.
NOTA: Las células están listas para cualquier experimento planeado y se pueden cultivar hasta 3 días en una incubadora de cultivo de células típica (sin CO 2 ) sin pérdida significativa de células vivas. Los cardiomiocitos sanos típicos en forma de varilla se muestran en la Figura 2A .
- Aislamiento de células endoteliales y fibroblastos
- Centrifugar el sobrenadante que contiene células endoteliales y fibroblastos (del paso 7.1.2) a 250 xg durante 10 min.
- Descarta la supeRnatant y resuspender el sedimento celular en 1,5 mL de tampón de aislamiento de células endoteliales en un tubo de muestra de 2 mL.
- Añadir 3 μg (1: 500) de anticuerpo CD31 de ratón anti-rata a la suspensión celular e incubar a 4 ° C durante 30 min con rotación de extremo a extremo.
NOTA: Se recomienda una titulación del anticuerpo para una dilución óptima. Esta etapa se debe realizar a 4 ° C como en RT una rápida internalización de anticuerpos por las células endoteliales resultará en un bajo rendimiento. - Añadir las perlas de IgG anti-ratón de pan preparadas previamente (Sección 3) a la suspensión de células e incubar durante 20 minutos a 4ºC con rotación de extremo a extremo.
NOTA: Alternativamente, el anticuerpo CD31 de ratón anti-rata puede ser pre-unido a las perlas magnéticas y luego añadido a la suspensión celular. Sin embargo, esto aumentará el tiempo de incubación de las perlas con la suspensión celular y puede dar como resultado un aumento de la unión no específica de células no endoteliales y, por lo tanto, una mayor contaminación de otros tipos de células. - UNAl final del tiempo de incubación del anticuerpo, coloque el tubo que contiene la suspensión de células en un estante magnético y deje 2 minutos para asentar las perlas magnéticas unidas a las células endoteliales al lado del tubo.
- Se retira cuidadosamente el resto de la suspensión celular (que contiene principalmente los fibroblastos) usando una pipeta de 1 ml y se añade a un plato de cultivo celular de 10 cm que contiene 10 ml de medio de cultivo celular de fibroblastos (Etapa 2.3). Colóquelo en una incubadora de cultivo celular típica que contenga 5% de CO 2 . El procedimiento continúa en el paso 7.3.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado al tubo con perlas magnéticas que contienen las células endoteliales.
- Tape el tubo, retírelo de la rejilla magnética y cuidadosamente resuspenda las perlas agitando suavemente 4 y 5 veces. Coloque de nuevo el tubo en el estante magnético, permita que las perlas se depositen en la pared del tubo durante 1 minuto, y retire cuidadosamente el tampón de lavado.
- Repita los pasos de lavado 5 - 7 veces para deshacerse de cualquier contaminante nEn células endoteliales.
- Resuspender las células endoteliales unidas a las perlas en 1 mL de medio de cultivo de células endoteliales MV2, agregar a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos e incubar en un incubador de cultivo de células de CO 2 .
- Deje que las células se adhieran durante la noche y cambie el medio al día siguiente y luego cada 2-3 días hasta que las células se conviertan en semi-confluentes (normalmente de 5 a 7 días).
NOTA: Las células endoteliales no confluentes típicas después de 3 - 4 días y las células endoteliales confluentes después de 7-10 días de aislamiento se muestran en las Figuras 3A y 3B , respectivamente. Las células pueden entonces ser tripsinizadas (sección 7.4) y sembradas en un matraz de cultivo celular T25.
- Lavado y cultivo de fibroblastos (continúe desde el paso 7.2.6)
- Después de 1 h de incubación, se aspira el medio y se lavan los fibroblastos unidos al plato de cultivo celular añadiendo un volumen apropiado de PBS precalentado. Aspirar el PBS y repetir el sTep 2-3 veces y finalmente añadir medio de cultivo de células de fibroblastos precalentados.
- Lavar las células unidas de nuevo al día siguiente con PBS precalentado (como en el paso anterior) y agregar medio fresco precalentado. Cambie el medio cada 2-3 días. Un fenotipo típico de fibroblastos en el día 2 de aislamiento se muestra en la Figura 4A .
NOTA: Los fibroblastos se vuelven semi-confluentes usualmente dentro de 5-7 días y luego están listos para ser tripsinizados (sección 7.4) y se usan para los experimentos planificados. Con este procedimiento, usualmente obtenemos 95-99% de fibroblastos puros. Un fenotipo típico de fibroblastos en el día 7 de aislamiento se muestra en la Figura 4B .
- Tripsinización de células endoteliales y fibroblastos
- Aspirar el medio de la placa de cultivo celular y añadir suficiente precalentado PBS para cubrir las células.
- Aspirar PBS y añadir suficiente solución de tripsina-EDTA (0,05% y 0,02%, respectivamente) para cubrir las células y colocar enE incubadora a 37ºC durante 5 min.
- Resuspender las células pipeteando las células hacia arriba y hacia abajo con la ayuda de una pipeta de 1 ml y detener la acción de tripsina mediante la adición de FCS al 10%.
- Se pelete la suspensión de células por centrifugación a 250 xg durante 10 min a TA.
- Resuspender las células en un volumen apropiado de medio de cultivo celular precalentado.
8. Caracterización celular endotelial
NOTA: La pureza de las células endoteliales se determina por la absorción de Dil-Ac-LDL y la inmunotinción del factor de von Willebrand (vWF). Las células se visualizan por fluorescencia o microscopía confocal ( Figuras 3C-3E ).
- Absorción de Dil-Ac-LDL por células endoteliales
- Se tripsinizan las células endoteliales (etapa 7.4) y se cultivan durante la noche sobre cubreobjetos de vidrio en una placa de 12 pocillos (aproximadamente 10 x 104 células / cm2).
- Aspirar el medio y enjuagar las células con 1 mL de pre-wHBSS armado.
- Aspirar el HBSS y agregar 1 mL de medio de cultivo de células endoteliales que contenga 10 μg / mL de Dil-Ac-LDL y dejar las células en el incubador a 37 ° C durante 4 h.
- Aspirar el medio y enjuagar las células con PBS precalentado tres veces y fijarlas con 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA, disuelto en PBS). Incubarlos con PFA a 37 ° C durante 20 min.
NOTA: El PFA es corrosivo; Siempre use guantes resistentes a los ácidos mientras maneja la solución de PFA. - Aspirar la PFA, enjuagar las células en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con 1 mL de PBS tres veces e incubarlos con solución de tinción nuclear TO-PRO (10 μM) durante 1 h a RT.
NOTA: Si el filtro apropiado está disponible para el microscopio, también se puede usar 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 μg / mL). En este caso, el tiempo de incubación debe reducirse a 10 min. - Enjuague las células en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con 1 mL de PBS, aspire el PBS y repita el paso tres veces.
- Toma el cOverslip fuera de la placa de 12 pozos y montar en una diapositiva de vidrio con una gota de medio de montaje. Las células están listas para ser visualizadas bajo un microscopio fluorescente / confocal. Utilizar un filtro de excitación de 530-560 nm para Dil-Ac-LDL, 640 nm para TO-PRO y 340-380 nm para DAPI.
- Tinción de Von Willebrand (vWF)
- Cultivo de las células endoteliales como se describe en el paso 8.1.1.
- Aspirar el medio y enjuagar las células con 1 mL de HBSS precalentado; Después, fijar con PFA al 4% como se describe en el paso 8.1.4.
- Aspirar el PFA, enjuagar las células en cubreobjetos en placas de 12 pocillos con 1 mL de PBS dos veces, y permeabilizar las células con 1 mL de Triton X-100 al 0,1% (en PBS) durante 20 min a RT.
- Aspirar la solución permeabilizing e incubar las células con solución de bloqueo (5% BSA / 5% FCS en PBS) durante 1 h.
- Incubar las células con anticuerpo de conejo anti-vWF (1: 100) a 4 ° C durante la noche en una cámara humidificada. Añadir un cubreobjeto sinE anticuerpo primario como control negativo.
- Enjuague las células en la placa de 12 pocillos con 1 mL de PBS tres veces e incube las células con anticuerpo Alexa Fluor-488 (1: 500) y solución de tinción nuclear TO-PRO (10 μM) durante 1 h A la temperatura ambiente.
- Enjuague las células en el cubreobjetos en una placa de 12 pocillos con 1 mL de PBS, aspire el PBS y repita el paso tres veces.
- Tome el cubreobjetos de la placa de 12 pocillos y montarlo en un portaobjetos de vidrio con una gota de medio de montaje. Las células están listas para ser visualizadas bajo un microscopio fluorescente / confocal. Utilizar un filtro de excitación de 490 nm para vWF y 640 nm para tinción nuclear.
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Representative Results
El procedimiento de aislamiento da como resultado un rendimiento de 70 - 80% de cardiomiocitos estriados viables, en forma de varilla ( Figuras 2A y 2C ) que pueden usarse para experimentos planificados. En nuestro laboratorio los cardiomiocitos se usan rutinariamente para el análisis de la señalización de Ca 2+ . La Figura 5A muestra las oscilaciones intracelulares de calcio [Ca2 + ] i en respuesta a isquemia / reperfusión en cardiomiocitos cargados con Fura-AM (5 μM). La Figura 5B muestra cambios en [Ca2 + ] i en células endoteliales y fibroblastos después de la adición de ATP (100 μM). Los cambios en [Ca 2 + ] i en diferentes tipos de células cardíacas se analizaron como se describe anteriormente. 6 , 11 , 12
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Figura 1: Sistema de perfusión de Langendorff modificado. ( A ) El sistema entero de perfusión de Langendorff usado para el aislamiento de células cardíacas ( B ) Vista agrandada del corazón colgante en la "cámara cardíaca" también usada para la recolección de tampón de perfusión para recirculación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cardiomiocitos de rata adultos. ( A ) Cardiomiocitos sanos, típicos en forma de varilla, 2 h después de revestidos en placas de cultivo de células revestidas con laminina ( B ) Un ejemplo típico de una preparación pobre debido a una digestión incompleta del tejido. 2 h después de plaquear en placas de cultivo celular revestidas con laminina, moSt de las células están hipercontractadas y parecen redondeadas, y hay pocos cardiomiocitos en forma de varilla. Barra de escala = 10 μm ( C ) Micrografía confocal de un solo cardiomiocito teñido para la visualización de actina como se ha descrito anteriormente. 13 Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Células endoteliales cardíacas de rata. ( A ) Micrografía de contraste de fase de monocapa de células endoteliales no confluentes 3 días después del aislamiento. Las manchas oscuras son las perlas magnéticas que todavía están unidas a las células endoteliales parentales. Barra de escala = 10 μm ( B ) Micrografía de contraste de fase de la monocapa de células endoteliales confluentes 7 días después del aislamiento ( C) Inmunotinción de células endoteliales que muestran tinción de vWF (rojo) y tinción nuclear (azul) ( E ) Las células incubadas sólo con anticuerpos secundarios Y colorante nuclear (Azul) (Barra de escala = 50 μm) Pulse aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fibroblastos cardíacos de rata. ( A ) Fibroblastos cardíacos típicos en forma de huso en el segundo día de aislamiento. ( B ) fibroblastos puros confluentes después de 7 días de cultivo. ( C ) Un ejemplo típico de una preparación pobre contaminada con células epiteliales. Las células indicadas por las puntas de flecha son las células epiteliales cardiacas . Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cambios en [Ca 2+ ] i en células cardíacas. ( A ) Trazados representativos de los cambios en el calcio intracelular [Ca2 + ] i medidos por la relación Fura-2 en cardiomiocitos de rata expuestos a isquemia química (Na-cianato, 2 mM) seguido de reperfusión ( B ) Trazados representativos de cambios en el calcio intracelular [Ca2 + ] i medido por la relación Fura-2 en células endoteliales cardiacas de rata y fibroblastos, tratados con ATP (100 μM) como se indica. > Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo se describe un protocolo reproducible para el aislamiento y el cultivo de miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento simultáneo y de alta calidad de los principales tipos celulares de tejido cardíaco, es decir , cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos en oposición a un solo tipo celular. Un paso crítico en el procedimiento de aislamiento es la correcta digestión del tejido cardíaco. Si la digestión es incompleta, todavía puede obtenerse un gran número de miocitos, pero su calidad es muy pobre y en su mayoría hipercontractada y redonda ( Figura 2B ) y de ningún valor en los experimentos. Además, el rendimiento de células endoteliales y fibroblastos también se reducirá. Este problema se puede resolver controlando el tiempo de digestión. Antes de quitar el corazón del sistema de perfusión, la suavidad del corazón se puede comprobar con la ayuda de fórceps y puntas de los dedos. Si el tejido todavía no está visiblemente sFrecuentemente, el corazón puede ser perfundido durante un tiempo adicional de 5-10 min. Un segundo paso crítico en el aislamiento sano de cardiomiocitos es la restauración incremental de Ca 2+ en los tampones de aislamiento. Una rápida restauración de altas concentraciones de Ca 2 + en el medio dará lugar a cardiomiocitos redondeados. La calidad del agua utilizada para la preparación de tampones es otro factor importante que afecta la calidad de los cardiomiocitos. Por lo tanto, se recomienda el uso de agua de buena calidad.
La pureza de las células endoteliales depende en gran medida de las etapas de lavado. EDTA debe estar presente en el tampón de lavado para evitar la unión no específica de células no endoteliales a las perlas magnéticas. La presencia de células sanguíneas en la suspensión celular reducirá en gran medida el rendimiento de las células endoteliales; Por lo tanto, el lavado adecuado del corazón es muy importante después de montar el corazón en el sistema de perfusión y antes de la adición de colagenasa. Los componentes residuales de la sangre tambiénLa actividad de la colagenasa y por lo tanto dificultan la digestión del corazón.
La contaminación más común en el cultivo de células de fibroblastos es la aparición de colonias satélites de células epiteliales ( Figura 4C ). Esta contaminación puede evitarse mediante el cultivo en dos etapas de fibroblastos. En la primera etapa, la concentración de FCS en el medio de cultivo de células de fibroblastos se reduce al 5% y se deja que la suspensión celular se adhiera al plato de cultivo celular durante 30 minutos en el incubador. Las células epiteliales se adhieren rápidamente, pero el tiempo de adhesión de las células de fibroblastos aumenta en presencia de una concentración baja de suero. Después de 30 minutos de incubación, la suspensión celular que contiene fibroblastos no adherentes se retira cuidadosamente a un nuevo plato de cultivo celular. De esta manera se puede reducir el rendimiento de fibroblastos, pero su pureza se mejora mucho.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Se agradece el apoyo técnico de L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas y A. Weber. Los autores también desean agradecer al Dr. E. Martinson por la lectura extensa de la prueba y la edición del lenguaje del manuscrito. El estudio fue apoyado por la Universidad de Giessen Anschubsfinanzierung concesión a M. Aslam y D. Gündüz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
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- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
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- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
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