Summary
Flere protokoller er blitt utviklet og beskrevet for isolering av forskjellige hjertecelletyper fra et rottehjerte. Her beskrives en optimalisert protokoll som muliggjør isolering av store hjertecelletyper av høy kvalitet (kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster) fra et enkelt preparat, noe som reduserer forsøkskostnadene.
Abstract
Rotta er en viktig dyremodell som brukes i kardiovaskulær forskning, og rottekardiale celler brukes rutinemessig for in vitro analyse av molekylære mekanismer for kardiovaskulær sykdomsprogresjon som hjertehypertrofi, fibrose og aterosklerose. Selv om flere forsøk med variabel suksess har blitt gjort for å utvikle immortaliserte cellelinjer fra kardiovaskulærsystemet for å forstå disse cellemekanismer, tilbyr primære celler et mer naturlig og nær in vivo miljø for slike studier. Derfor har forskjellige laboratorier som arbeider med en bestemt celletype utviklet protokoller for å isolere individuelle typer rotte-hjerteceller av interesse. En protokoll som tillater isolering av mer enn en celletype, mangler imidlertid. Her beskrives en optimalisert protokoll som muliggjør isolering av store hjertecelletyper av høy kvalitet (kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster) fra et enkelt preparat og gjør det mulig for deiR bruk for cellulære analyser. Dette tillater den mest effektive bruken av tilgjengelige ressurser, noe som kan spare tid og redusere forskningskostnadene.
Introduction
Gnagere har lenge vært brukt som verktøy for å utvide vår forståelse av kardiovaskulær fysiologi i helse og sykdom. 1 Selv om disse dyremodellene tillater oss å forstå patofysiologien til en sykdom på orgelnivå og å analysere farmakokinetikken og farmakodynamikken til ulike farmakologiske midler som brukes til behandling av kardiovaskulære sykdommer, forståelse av molekylære mekanismer for utvikling av kardiovaskulær sykdom og bidrag fra en bestemt Celletype krever bruk av in vitro -celledyrkningsmodeller. For dette formål er forskjellige immortaliserte cellelinjer fra kardiovaskulærsystemet blitt utviklet; 2 , 3 er ferske isolerte primære celler imidlertid fysiologisk og funksjonelt mer relevante for levende vev og organismer.
Hjertet er et allsidig organ som inneholder alle hovedtyper av celler i kardiovaskulære sYstem og rottehjerte er fortsatt en vanlig modell for forståelse av kardiovaskulær fysiologi. I de siste årtier har forskjellige metoder for isolering av individuelle celletyper fra hjertevev blitt beskrevet; 4 , 5 , 6 , 7, men disse metodene fokuserer kun på isolering av en bestemt celletype, noe som resulterer i tap av andre typer celler som ikke lenger kan brukes til cellulær analyse. Her beskrives en optimalisert protokoll som muliggjør samtidig og høy kvalitet isolering av de viktigste celletyper av hjertevev, dvs. kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster. Alle disse celletyper kan brukes i forskjellige eksperimentelle oppsett 8 , 9 , 10 og for analyse av celle-celle-interaksjoner fra samme dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøkelsen er i samsvar med veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr utgitt av US National Institutes of Health (NIH-publikasjon nr. 85-23 1985) og ble godkjent av det lokale etikkutvalget ved Giessen Universitet. Voksne mannlige Wistar-rotter med en vekt på 200-250 g ble brukt i denne studien.
1. Autoklavering
- Minst en dag før prosedyren skal utføres, autoklaver alle kirurgiske instrumenter, pipettespisser og Pasteur pipetter som skal brukes i isolasjonsprosedyren ved 121 ° C i 30 minutter.
2. Forberedelse av medier og løsninger
MERK: Løsninger fra trinn 2.1-2.4 kan tilberedes opp til en uke før isolasjonen og lagres ved 4 ° C, men lag opp løsningene i trinn 2.5-2.8 på isolasjonsdagen. De komplette oppskrifter av buffere og medier er gitt i tabell 1 . Varm alt media og løsninger til 37 ° C i aVannbad før du starter preparatet.
- Forbered Powell medium ved å oppløse kjemikaliene oppført i tabell 1 i 4,5 liter H20 ved romtemperatur (RT). Juster pH til 7,4 med 2,0 N NaOH, og bring volumet til 5,0 L. Sterilfiltrer oppløsningen og oppbevar den ved 4 ° C.
- Forbered kreatin, L-karnitin og taurin (CCT) medium ved å oppløse M199 pulver medium i 4,5 L H20. Tilsett HEPES pulver i henhold til Tabell til mediet og bland i 15 minutter. Legg til kreatin, karnitin, taurin og Ara-C i henhold til tabell 1 . Bland godt, juster pH med pH-meter til 7,4 med 2,0 N NaOH, og bring volumet til 5,0 L. Sterile filter og lagre ved 4 ° C.
- Forbered cellekulturmedium for fibroblaster ved å tilsette 10% føtalt kalveserum (FCS) og 2% penicillin / streptomycin (Pen / Strep) til medium M199. DMEM er like egnet som M199 og kan også brukes til fibroblastcellekultur.
- Forbered MV2 cellekulturE-medium for endotelceller ved å legge til alt innholdet i tilskuddsmixet til det basale MV2-mediumet i henhold til produsentens instruksjoner. Ta en 5 ml alikvot og varm den til 37 ° C i et vannbad.
- Klargjør endotelcelleisoleringsbuffer ved å oppløse 0,05 g bovint serumalbumin (BSA) i 50 ml Hanks balansert saltløsning (HBSS) og tilsette 0,5 ml 200 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) -løsning til den. Steril filter dette og lagre det ved 4 ° C.
- Klargjør endotelcellevaskebuffer ved å tilsette 0,1 ml 200 mM til 9,9 ml PBS og lagre den ved 4 ° C.
- Klargjør kollagenaseoppløsning ved å oppløse 27 mg kollagenase i 5 ml Powell-medium og tilsetning av 12,5 μl 100 mM CaCl2-løsning. Varm det til 37 ° C i et vannbad.
- Forbered inkrementelle Ca 2+ restaureringsløsninger 1, 2 og 3 for kardiomyocytter ved å tilsette 12,5 μl, 25 μl og 120 μl 100 mM CaCl2-oppløsningIon til henholdsvis 6 ml, 6 ml og 12 ml Powell medium.
- Pre-coat cell culture dishes for kardiomyocytter en dag før isoleringen ved å tilsette 1 mL pre-coating medium inneholdende laminin til hver 35 mm cellekulturskål. Inkubér dem i cellekultur-inkubatoren ved 37 ° C over natten.
3. Fremstilling av magnetiske perler
- Plasser 0,5 ml av endotelcelleisolasjonsbufferen i et 1,5 ml prøverør på is.
- Tilsett 5 μL (2 x 10 6 ) av pan-mus IgG magnetiske perler og bland godt.
- Plasser røret i magnetstativet i 1 min. Perlene vil feste seg på veggen av røret mot magneten. Fjern forsiktig supernatanten med en 1 ml pipette.
- Gjenta vasken to ganger og til slutt suspendere perlene i 50 μl endotelcelleisolasjonsbuffer og lagre ved 4 ° C til bruk.
4. Fremstilling av Langendorff Perfusion System
- Rengjør tHan Langendorff-systemet ved perfusjon med 2 liter destillert vann.
- Sirkuler 50 ml Powell medium gjennom systemet i 5 minutter og kast mediet.
- Tilsett 80 ml frisk Powell medium. Fortsett perfusjon det med "karbogen" ved å boble med et glass Pasteur pipette fra gassylinderen. La medium gjennomsirkulere gjennom systemet. Systemet er nå klar til å perfisere hjertet ( figur 1A ).
5. Disseksjon av rotten
- Plasser rotte i en 5 L desiccator under en avtrekksvifte og sett 1,5 ml 4-5% isofluran gjennom luftluften og lukk lokket.
MERK: Legg dyret på forhøyet perforert plate inne i ekssikatoren for å unngå direkte kontakt av dyret med væsken isofluran. - Vent til rotten mister lokk refleksen (vanligvis ~ 5 min), og deretter ta rotten ut av ekssikatoren. Euthanize rotten ved cervikal dislokasjon.
- Kutt bukhuden og den underliggende muskel horisontenAlliert i midten ved hjelp av et par skarpe saks. Deretter kutt muskelen vertikalt til brystbenet og åpne thoraxen. Fjern hjertet sammen med lungene og legg organene umiddelbart i iskald 0,9% NaCl-løsning.
- Fjern lungene ved hjelp av et saks og kast dem. Rengjør hjertet av bindevev, og kutt aorta caudalt ved grenen av brakiocephalic stammen.
6. Perfusjon av hjertet og fordøyelse med kollagenase
- Monter hjerteet via aorta i Langendorff perfusjonssystemet (Seksjon 4) ved å bruke to par tynne, buede tang. For å sikre at myokardiet blir perfusjonert på retrograd måte, plasser slutten av kanylen i perfusjonssystemet mellom den første aorta-grenen og aortaklappen. Fest aorta med en krokodil klemme.
- Fest hjertet med en kirurgisk sutur, og fjern krokodilklemmen ( Figur 1B ).
- Åpne kanylens ventil for å la perfusjonsmediet (35 ml) passere gjennom hjertefallet (60 dråper / min, 5 ml / min) for å vaske ut resterende blod. Kast bort noe gjennomstrømning på dette stadiet.
MERK: Unngå dannelse av luftbobler i et hvilket som helst stadium av perfusjonen, da dette vil resultere i ufullstendig fordøyelse og svikt i cellisolasjonsprosedyren. - Plasser det hengende hjertet i oppsamlingstragten (hjertekammeret, Figur 1B ) og start peristaltisk pumpe, som vil resirkulere perfusjonsmediet fra oppsamlingstragten til reservoaret ( Figur 1A ).
- Tilsett kollagenaseoppløsningen (fra trinn 2.8) til perfusjonsmediet. Perfuse hjertet med resirkulerende kollagenase-oppløsning i 30 minutter.
MERK: Dette trinnet er svært viktig for å optimalisere celleutbyttet. Perfusjonstiden avhenger av aktiviteten av kollagenase, som kan variere avhengig av partiet. Test 3-4 grupper kollagenase for å finne den med optiMal aktivitet; Så kan store mengder av den best egnede batchen kjøpes som er tilstrekkelig i minst ett år for reproducerbare resultater. - Ved slutten av fordøyelsestiden, stopp perfusjonen, fjern hjertet fra Langendorff-systemet ved hjelp av et saks, og legg det i en glassfett.
- Klipp av og kast bort begge atria, og fjern eventuelle rester av fettvev. Skyll forsiktig av perikardiet ved hjelp av to par tapper for å unngå forurensning av epitelceller.
MERK: Perikardiet kan fordøyes videre med kollagenase for å oppnå rene kardiale epitelceller om nødvendig. En detaljert protokoll er ikke gitt i denne studien, da dette er utenfor anvendelsesområdet for den nåværende protokollen. - Kutt hjertet nedover i midten med et saks og legg det inn i vevhakkeren. Hakk hjerteet 2-3 ganger og res suspender det hakkede vevet i 12 ml fordøyelsesbufferen fra Langendorff perfusjonen.
MERK: Ikke hakk hEart overdreven, da dette vil resultere i en høyere andel av døde kardiomyocytter. - Overfør det hakkede vevet til 15 ml kollagenaseholdig dissosjonsmedium og la det fordøye i et vannbad i 5-10 minutter med sporadisk blanding ved re-suspensjon ved bruk av en 5 ml engangs plastpipette.
- Ved slutten av fordøyelsestiden, filtrer cellesuspensjonen gjennom en 100 μm sigte. Kast vevsrester og ufordøyd materiale.
- På slutten av Langendorff-perfusjonen, skyl perfusjonssystemet umiddelbart med minst 1 liter destillert vann. Perfuse systemet ved å resirkulere 100 ml 0,1 N NaOH i 30 minutter, og til slutt skylle systemet med 2-3 liter destillert vann. Tørk systemet ved å skylle luft og dekke åpningen med parafilm.
7. Rat-hjertecelleisolasjon
- Isolasjon og kultur av kardiomyocytter
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 25 xg i 1 min (uten brAkes) for å pellere kardiomyocyttene. Kardiomyocytter kan også få lov til å avgjøre i 10 minutter ved romtemperatur uten sentrifugering.
- Fjern forsiktig supernatanten som inneholder endotelceller og fibroblaster ved hjelp av en engangs plastpipett i et nytt 50 ml rør.
- Resuspender kardiomyocytpellet i Ca 2 + 6 ml løsning 1 (trinn 2.9). Tillat 1 min for cellene å justere seg til lav Ca 2+ konsentrasjonsmiljø, og sentrifuger cellesuspensjonen igjen ved 25 xg i 1 min (uten bremser).
- Kast supernatanten og resuspender cellepellet i 6 ml Ca 2+ løsning 2 (trinn 2.9). La cellene 1 min til å justere til mellomkonsentrasjonen av Ca 2+ , og til slutt tilsette 12 ml Ca 2+ løsning 3 (trinn 2.9) til cellene. Bland med hjelp av en engangs plastpipett.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 25 xg i 1 min.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 20 ml pre-warmed CCT medium. Tilsett 1 ml av cellesuspensjonen til hver av 20 sterile 35 mm cellekulturskål pre-belagt med laminin (trinn 2.9) og la cellene feste i 2 timer i en CO 2 -fri cellekultur-inkubator.
MERK: Kardiomyocyttene kan også dyrkes under CO 2 -miljøet; I dette tilfellet skal imidlertid media med bikarbonatbuffersystem brukes. - Etter 2 timer, bytt mediet med nytt 2 ml CCT medium for å fjerne eventuelle døde celler.
MERK: Cellene er klare for planlagte eksperimenter og kan dyrkes i opptil 3 dager i en typisk cellekultur-inkubator (CO 2 fri) uten signifikant tap av levende celler. Typiske sunne stavformede kardiomyocytter er vist i figur 2A .
- Isolering av endotelceller og fibroblaster
- Sentrifuger supernatanten som inneholder endotelceller og fibroblaster (fra trinn 7.1.2) ved 250 xg i 10 minutter.
- Kast av supeRantant og resuspenge cellepellet i 1,5 ml endotelcelleisolasjonsbuffer i et 2 ml prøverør.
- Tilsett 3 μg (1: 500) av anti-rotte CD31-antistoff mot muscelsuspensjonen og inkuber det ved 4 ° C i 30 minutter med end-to-end rotasjon.
MERK: En titrering av antistoffet for optimal fortynning anbefales. Dette trinnet bør utføres ved 4 ° C som ved RT En rask internisering av antistoff ved endotelceller vil resultere i lavt utbytte. - Tilsett de tidligere preparerte (del 3) pan-anti-mus-IgG-perlene til cellesuspensjonen og inkuber i 20 minutter ved 4 ° C med ende-til-ende-rotasjon.
MERK: Alternativt kan mus anti-rotte CD31 antistoff være forhåndsbestemt til magnetiske perler og deretter tilsatt til celle suspensjon. Dette vil imidlertid øke inkubasjonstidspunktet for perlene med cellesuspensjonen og kan resultere i økt ikke-spesifikk binding av ikke-endotelceller og dermed høyere forurensning av andre celletyper. - ENT slutten av antistoffinkubasjonstiden, plasser røret som inneholder cellesuspensjonen i et magnetisk stativ og la 2 minutter til å sedimentere de magnetiske perlene festet til endotelceller til siden av røret.
- Fjern forsiktig resten av cellesuspensjonen (inneholder hovedsakelig fibroblastene) ved å bruke en 1 ml pipette og legg den til en 10 cm cellekulturskål inneholdende 10 ml fibroblastcellekulturmedium (trinn 2.3). Plasser den i en typisk cellekultur-inkubator som inneholder 5% C02. Prosedyren fortsetter i trinn 7.3.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer til røret med magnetiske perler som inneholder endotelceller.
- Kast røret, fjern det fra magnetstativet, og forsiktig resuspender perlene ved å svake forsiktig opp og ned 4-5 ganger. Plasser røret igjen i magnetstativet, la perlene settes på rørveggen i 1 min, og fjern vaskebufferen forsiktig.
- Gjenta vaske trinnene 5-7 ganger for å bli kvitt forurensende nOn-endotelceller.
- Resuspender endotelceller festet til perlene i 1 ml MV2 endotelcellekulturmedium, tilsett til en enkelt brønn i en 12-brønnplate og inkuber i en CO 2 -kultekultur-inkubator.
- Tillat at cellene festes over natten og bytt mediet neste dag og deretter hver 2-3 dager til cellene blir halvkonfluente (vanligvis 5-7 dager).
MERK: Typiske ikke-konfluente endotelceller etter 3-4 dager og konfluente endotelceller etter 7-10 dager isolasjon er vist i henholdsvis figur 3A og 3B . Cellene kan deretter trypsiniseres (pkt. 7.4) og podes inn i en T25-celledyrkolbe.
- Vasking og kultur av fibroblaster (fortsett fra trinn 7.2.6)
- Etter 1 time inkubering, aspirere mediet og vask fibroblastene festet til cellekulturskål ved å tilsette et passende volum forvarmet PBS. Aspirer PBS og gjenta sTep 2-3 ganger og til slutt tilsette forvarmet friskt fibroblastcellekulturmedium.
- Vask de vedlagte cellene igjen neste dag med forvarmet PBS (som i forrige trinn) og legg til forvarmet friskt medium. Bytt mediet etter hver 2-3 dag. En typisk fenotype av fibroblaster på dag 2 av isolasjon er vist i figur 4A .
MERK: Fibroblastene blir halvkonfluente vanligvis innen 5-7 dager og er så klar til trypsinering (avsnitt 7.4) og brukes til planlagte eksperimenter. Med denne prosedyren oppnår vi vanligvis 95-99% rene fibroblaster. En typisk fenotype av fibroblaster på dag 7 av isolasjon er vist i figur 4B .
- Trypsinisering av endotelceller og fibroblaster
- Aspirere mediet fra cellekulturretten og tilsett nok forvarmet PBS til å dekke cellene.
- Aspirer PBS og tilsett nok trypsin-EDTA-løsning (0,05% og 0,02% henholdsvis) for å dekke cellene og plassere iE 37 ° C inkubator i 5 min.
- Resuspender cellene ved å pipettere cellene opp og ned ved hjelp av en 1 ml pipette og stopp trypsinvirkning ved å legge til 10% FCS.
- Pell cellesuspensjonen ved sentrifugering ved 250 xg i 10 minutter ved RT.
- Resuspender cellene i et passende volum forvarmet cellekulturmedium.
8. Endotelcellekarakterisering
MERK: Renheten av endotelceller bestemmes ved opptak av Dil-Ac-LDL og immunfarging av von Willebrand-faktor (vWF). Celler visualiseres ved fluorescens eller konfokalmikroskopi ( figur 3C-3E ).
- Dil-Ac-LDL opptak av endotelceller
- Trypsiniser endotelcellene (trinn 7.4) og dyrk dem over natten på glassdeksler i en brønn med 12 brønner (ca. 10 x 10 4 celler / cm 2 ).
- Aspirere mediet og skyll cellene med 1 ml pre-wVæpnet HBSS.
- Aspirer HBSS og tilsett 1 ml endotelcellekulturmedium inneholdende 10 μg / ml Dil-Ac-LDL og la cellene i 37 ° C inkubatoren i 4 timer.
- Aspirer mediet og skyll cellene med forvarmet PBS tre ganger og fest dem med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA, oppløst i PBS). Inkuber dem med PFA ved 37 ° C i 20 minutter.
MERK: PFA er etsende; Bruk alltid syrefaste hansker mens du håndterer PFA-løsningen. - Aspirer PFA, skyll cellene på deksel i 12-brønn plate med 1 ml PBS tre ganger og inkuber dem med nukleær fargeløsning TO-PRO (10 μM) i 1 time ved RT.
MERK: Hvis det aktuelle filteret er tilgjengelig for mikroskopet, kan også 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; 1 μg / ml) brukes. I dette tilfellet bør inkubasjonstiden reduseres til 10 min. - Skyll cellene på deksel i 12-brønn plate med 1 ml PBS, aspirer PBS, og gjenta trinn tre ganger.
- Ta cOverslip ut av 12-brønn plate og monter den på en glidelås med en dråpe monteringsmedium. Cellene er klare til å bli visualisert under et fluorescerende / konfokalt mikroskop. Bruk et eksitasjonsfilter på 530-560 nm for Dil-Ac-LDL, 640 nm for TO-PRO og 340-380 nm for DAPI.
- Von Willebrand (vWF) farging
- Kultur endotelcellene som beskrevet i trinn 8.1.1.
- Aspirer mediet og skyll cellene med 1 ml forvarmet HBSS; Deretter fikseres med 4% PFA som beskrevet i trinn 8.1.4.
- Aspirer PFA, skyll cellene på deksel i en brønn med 12 brønner med 1 ml PBS to ganger, og permeabiliser cellene med 1 ml 0,1% Triton X-100 (i PBS) i 20 minutter ved RT.
- Aspirer den permeabiliserende løsningen og inkuber cellene med blokkeringsløsning (5% BSA / 5% FCS i PBS) i 1 time.
- Inkuber cellene med kanin anti-vWF antistoff (1: 100) ved 4 ° C over natten i et fuktet kammer. Legg til en deksel uten detE primært antistoff som negativ kontroll.
- Skyll cellene på dekselplaten i 12-brønnsplaten med 1 ml PBS tre ganger og inkuber cellene med Alexa Fluor-488-antistoff (1: 500) og kjernefargeløsning TO-PRO (10 μM) i 1 time Ved RT.
- Skyll cellene på dekslet i 12-brønnsplate med 1 ml PBS, aspirer PBS, og gjenta trinn tre ganger.
- Ta dekselet ut av brønnen med 12 brønner og fest den på en glidelås med en dråpe monteringsmedium. Cellene er klare til å bli visualisert under et fluorescerende / konfokalt mikroskop. Bruk et eksitasjonsfilter på 490 nm for vWF og 640 nm for nukleær farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolasjonsprosedyren resulterer i et utbytte på 70-80% levedyktige, stavformede, strierte kardiomyocytter ( fig. 2A og 2C ) som kan brukes til planlagte eksperimenter. I vårt laboratorium brukes kardiomyocytter rutinemessig til analyse av Ca 2+ -signalering. Figur 5A viser intracellulær kalsium [Ca 2+ ] i oscillasjoner som respons på iskemi / reperfusjon i kardiomyocytter lastet med Fura-AM (5 uM). Figur 5B viser endringer i [Ca2 + ] i i endotelceller og fibroblaster etter tilsetning av ATP (100 μM). Endringene i [Ca 2+ ] i i forskjellige hjertecelletyper ble analysert som beskrevet tidligere. 6 , 11 , 12
Re 1 "src =" / files / ftp_upload / 55601 / 55601fig1.jpg "/>
Figur 1: Modifisert Langendorff Perfusion System. ( A ) Hele Langendorff perfusjonssystemet som brukes til isolering av hjerteceller ( B ) Forstørret utsikt over hengende hjerte i "hjertekammeret" som også brukes til oppsamling av perfusjonsbuffer for resirkulering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Voksenratkardiomyocytter. ( A ) Typiske stavformede, sunne kardiomyocytter 2 timer etter plating i lamininbelagte cellekulturretter ( B ) Et typisk eksempel på dårlig fremstilling på grunn av ufullstendig vævsfordøyelse. 2 timer etter plating i lamininbelagte cellekulturretter, moSt av cellene er hyperkontraktert og ser avrundet, og det er få stavformede kardiomyocytter. Skalbjelke = 10 μm ( C ) konfokal mikrografi av enkelt kardiomyocyt farget for actin visualisering som tidligere beskrevet. 13 Skalbjelke = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Rat-endotelceller. ( A ) Fase-kontrastmikrografi av ikke-konfluent endotelcelle-monolag 3 dager etter isolasjon. Mørke flekker er de magnetiske perlene som fremdeles er festet til de overordnede endotelceller. Skalbjelke = 10 μm ( B ) Fase-kontrastmikrograf av konfluent endotelcelle-monolag 7 dager etter isolering ( C) Immunostaining av endotelceller som viser Dil-Ac-LDL opptak (Rød) og nukleær farging (Blå) ( D ) Immunostaining av endotelceller som viser farging av vWF (Rød) og nukleær farging (Blå) ( E ) Celler inkubert bare med sekundært antistoff Og nukleær flekk (Blå) (Scale bar = 50 μm) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Rat-hjertefibroblaster. ( A ) Typiske spindelformede hjertefibroblaster på den andre isolasjonsdagen. ( B ) Konfluente, rene fibroblaster etter 7 dager med kultur. ( C ) Et typisk eksempel på en dårlig forberedelse forurenset med epitelceller. Celler som er angitt av pilehoder, er hjerteepitelceller . Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Endringer i [Ca 2+ ] i i hjerteceller. ( A ) Representative spor av endringer i intracellulært kalsium [Ca 2+ ] målt ved Fura-2-forhold i rottekardiomyocytter utsatt for kjemisk iskemi (Na-cyanat, 2 mM) etterfulgt av reperfusjon ( B ) Representative sporinger av endringer i intracellulært kalsium [Ca 2+ ] målt ved Fura-2-forhold i rotte-hjerte endotelceller og fibroblaster behandlet med ATP (100 uM) som indikert. > Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen er en reproduserbar protokoll for isolering og kultur av hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster beskrevet. Denne protokollen beskriver samtidig og høy kvalitet isolering av de viktigste celletyper av hjertevev, dvs. kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster i motsetning til bare en celletype. Et kritisk trinn i isolasjonsprosedyren er riktig fordøyelse av hjertevevet. Hvis fordøyelsen er ufullstendig, kan det fortsatt oppnås et stort antall myocytter, men kvaliteten er svært dårlig, og de er for det meste hyperkontrakterte og runde ( figur 2B ) og uten verdi i eksperimenter. Videre vil utbyttet av endotelceller og fibroblast også bli redusert. Dette problemet kan løses ved å kontrollere fordøyelsestiden. Før du fjerner hjertet fra perfusjonssystemet, kan mykheten i hjertet kontrolleres ved hjelp av tanger og fingertupper. Hvis vevet fortsatt ikke er merkbart sOfte kan hjertet bli perfusjonert i ytterligere 5-10 min. Et annet kritisk trinn i sunn kardiomyocytisolasjon er inkrementell restaurering av Ca2 + i isolasjonsbufferne. En rask gjenoppretting av høye konsentrasjoner av Ca 2+ i media vil resultere i avrundede kardiomyocytter. Kvaliteten på vann som brukes til fremstilling av buffere er en annen viktig faktor som påvirker kvaliteten på kardiomyocytter. Derfor anbefales bruk av god kvalitet vann.
Renheten av endotelceller er sterkt avhengig av vaske-trinnene. EDTA må være tilstede i vaskebufferen for å forhindre ikke-spesifikk binding av ikke-endotelceller til magnetkulene. Tilstedeværelsen av blodceller i cellesuspensjonen vil i stor grad redusere utbyttet av endotelceller; Derfor er riktig vask av hjertet svært kritisk etter montering av hjertet i perfusjonssystemet og før tilsetning av kollagenase. Resterende blodkomponenter vil også redusere tHan aktivitet av kollagenase og dermed hindrer fordøyelsen av hjertet.
Den vanligste forurensningen i fibroblastcellekulturen er utseendet på satellittkolonier av epitelceller ( figur 4C ). Denne forurensningen kan unngås ved to-trinns dyrkning av fibroblaster. I det første trinnet blir konsentrasjonen av FCS i fibroblastcelledyrkningsmediet redusert til 5%, og cellesuspensjonen får lov til å klebe seg til cellekulturretten i 30 minutter i inkubatoren. Epitelceller kleber seg fast, men adhesjonstiden for fibroblastcellene økes i nærvær av en lav konsentrasjon av serum. Etter 30 min inkubering fjernes cellesuspensjonen som inneholder ikke-adherente fibroblaster forsiktig til en ny cellekulturskål. På denne måten kan utbyttet av fibroblaster reduseres, men deres renhet blir sterkt forbedret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å erklære.
Acknowledgments
Den tekniske støtten til L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas og A. Weber er takknemlig anerkjent. Forfatterne ønsker også å takke Dr. E. Martinson for omfattende bevislesning og språkredigering av manuskriptet. Studien ble støttet av Universitetet i Giessen Anschubsfinanzierung til M. Aslam og D. Gündüz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
