Summary
Her præsenteres en effektiv hydrolyse og efterfølgende Fmoc beskyttelse af en aminosyre isoleret fra en Ni-Schiff-basen kompleks. Hydrolysebetingelser præsenteret her, er egnede til anvendelse, når tilbageholdelse af syrelabilt sidekæde-beskyttende grupper er påkrævet. Denne teknik kan være tilpasses en række unaturlige aminosyre-substrater.
Abstract
Unaturlige aminosyrer, aminosyrer, der indeholder sidekædefunktionaliteter ikke almindeligvis ses i naturen, er i stigende grad findes i syntetiske peptidsekvenser. Syntese af nogle unaturlige aminosyrer indbefatter ofte anvendelsen af en precursor bestående af en Schiff-base, stabiliseret af en nikkel kation. Unaturlige sidekæder kan installeres på en aminosyre skelet fundet i denne Schiff-basen kompleks. Den resulterende unaturlige aminosyre kan derefter isoleres fra denne komplekset under anvendelse hydrolyse af Schiff-base, typisk ved anvendelse af tilbagesvaling i stærkt sur opløsning. Disse meget sure betingelser kan fjerne syrelabile sidekædebeskyttende grupper er nødvendige for de unaturlige aminosyrer, der skal anvendes i mikrobølgeassisteret fastfase-peptidsyntese. I dette arbejde, præsenterer vi en effektiv hydrolyse og efterfølgende Fmoc beskyttelse af en aminosyre isoleret fra en Ni-Schiff-base-kompleks. Hydrolysebetingelser præsenteret i dette arbejde, er egnede til tilbageholdelse af syrelabile side-kæde-beskyttende grupper og kan være tilpasses en række unaturlige aminosyre-substrater.
Introduction
Unaturlige aminosyrer (ULA s) bærende sidekæder, der varierer fra dem af de tyve naturligt forekommende aminosyrer, som findes i naturen har fundet anvendelse i en bred vifte af anvendelser. Syntese af disse ULA s kan imidlertid være vanskeligt afhængig af strukturen af sidekæderne og stereokemien af aminosyren rygrad. CH-binding aktivering af glycin i forbindelse med en nikkel Schiff-basen kompleks er blevet anvendt til at producere en lang række aminosyrederivater herunder α, p-diamino syrer 1 og UAA s bærende fluoreret 2 eller heterocykliske sidekæder. 3
Efter tilsætning af unaturlige sidekæder, funktionaliseret UAA s fjernes typisk fra Schiff-basen kompleks ved tilbagesvaling i saltsyre 4 og isoleres efterfølgende ved anvendelse af ionbytningskromatografi. Mens generelt effektiv, denne protokol genererer enMino syrer, der kan være uegnede til anvendelse i fast-fase peptidsyntese (SPPS). Arten af SPPS kræver tilstedeværelse af syrelabile sidekæde-beskyttende grupper og den stærkt sure karakter af typiske Ni-Schiff-basen nedbrydningsbetingelser forhindrer isolation ULA og har disse beskyttelsesgrupper intakte. Til vores viden, er blevet rapporteret kun ét alternativ nedbrydning fremgangsmåde: anvendelse af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og hydrazin ved forhøjede temperaturer, 5 betingelser, som i sig selv ikke kan være egnet for nogle sidekædebeskyttende grupper, såsom phthalimider.
Figur 1: Syntese af Ni-PBP-Gly fra Ni2 +, PBP, og Glycine (Gly). Klik her for at se en større version af dette tal.
Heri rapporterer vi en fremgangsmåde til hydrolyse af en Ni-Schiff-basen kompleks, Ni-PBP-Gly (figur 1). Dette kompleks, der er afledt af Ni2 +, glycin og pyridin-2-carboxylsyre (2-benzoyl-phenyl) -amid (PBP), 6 har vist sig at være et nyttigt udgangspunkt for syntese af en række ULA s og er let tilgængelige ved hjælp af en to-trins syntetisk vej. 7 Syntese af dette kompleks er litteratur-præcedens i højt udbytte. 6 Vores resultater beskrevet nedenfor demonstrerer anvendeligheden af hydrolysebetingelser anvender EDTA ved mildt sure til neutrale pH-betingelser egnede til anvendelse med UAA s bærende syrelabilt sidekædebeskyttende grupper. Efter hydrolyse kan den resulterende vandige opløsning isoleres og udsættes straks til standard Fmoc beskyttelse betingelser til opnåelse af en Fmoc-beskyttet aminosyre (Figur 2).
Figur 2: Hydrolyse og Fmoc-beskyttelse af en aminosyre Isoleret fra Ni-PBP-Gly. Reaction Betingelser: i. EDTA (12 ækv), pH 4,5; ii. Ethylacetat vask og indstilling til pH 7; iii. Fmoc-OSu (1 ækvivalent), NaHCO3 (2 ækvivalenter). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrolyse af Ni-Schiff-Base Complex
- Opløs 1 mmol af Ni-PBP-Schiff-basen kompleks i 40 ml N, N-dimethylformamid (DMF) under omrøring i en 250 ml rundbundet kolbe ved stuetemperatur.
- 60 ml 0,2 M vandig EDTA-opløsning, pH 4,5.
- Under anvendelse af en magnetisk omrører og rør plade, rør den kombinerede opløsning natten over. Som Schiff-basen kompleks hydrolyseres, vil farven skifte fra en dyb rød til hvid.
- Efter afslutning af reaktionen som angivet ved fraværet af enhver rødfarvning, overføre reaktionen til en 250 ml skilletragt.
- Der tilsættes 50 ml dichlormethan, cap skilletragten, og bland. Dræne den organiske vask i et spild bægerglas. Gentag denne proces tre gange for at fjerne PBP og enhver rest Ni-PBP-Schiff-basen kompleks. Indsamle den resterende vandige lag i en 250 ml rundbundet kolbe.
2. Fmoc Beskyttelse af Hydrolyzed Amino Acid
- Tilføj 168 mg natriumhydrogencarbonat (2,00 mmol, 2 ækvivalenter) til opløsningen, og der omrøres under anvendelse af en magnetisk omrører og omrør plade.
- Opløs 337 mg Fmoc-N-hydroxysuccinimidester (1,00 mmol, 1 ækvivalent) i en minimal mængde dioxan (ca. 4 eller 5 ml) i en 10 ml hætteglas. Opløsningen overføres til den vandige opløsning og omrøre natten over.
- Efter at reaktionsblandingen omrøre natten over, syrnes den resulterende opløsning til pH 2 med 1 M saltsyre. Check pH periodisk brug pH teststrimler.
- Overføre reaktionen til en 250 ml skilletragt og tilsættes 50 ml ethylacetat. Cap skilletragten, bland godt, og indsamle det organiske lag i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Gentag denne proces yderligere to gange, kombination af de organiske ekstrakter. Tør de kombinerede organiske ekstrakter med omtrent 3 g magnesium sulfate.
- Koncentrer de kombinerede organiske ekstrakter under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af det rå Fmoc-beskyttede aminosyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi antager, at fjernelse af Ni2 + fra Ni-PBP-Gly-komplekset kunne give en effektiv vandig hydrolyse af Schiff-basen uden behov for barske pH-betingelser. EDTA er et billigt og velundersøgte chelateringsmiddel, 10 vi den hypotese, at tilsætning af EDTA til en opløsning af Ni-PBP-Gly vil lette chelatering af Ni 2+ ioner og derved fremme hydrolyse af komplekset.
For at teste vores teori, at EDTA alene effektivt kunne fremme hydrolyse af komplekset, underkastede vi en opløsning af Ni-PBP-Gly i DMF ved stuetemperatur til stigende ækvivalenter EDTA i pH 4,5 vandig opløsning, den ujusterede pH af vandig EDTA-dinatriumsalt opløsning . Forløb hydrolysereaktionen kan overvåges ved at observere opløsningens farve; uomsat Ni-PBP-Gly i opløsning viser en dyb rød farve, mens PBP isoleretfra dette kompleks er hvid. Vi registrerede forløbet af hydrolysereaktionen ved at overvåge farveændring af opløsningen fra rød til hvid (tabel 1). Reaktioner, der involverer færre end otte ækvivalenter viste nogen overgang af farve fra rød til hvid, men reaktionen var ufuldstændig i hvert tilfælde. Ingen farveændring var tydelig for betingelser uden EDTA.
Virkningen af pH på hydrolyse blev tilsvarende vurderet. Underkastelse af Ni-PBP-Gly-komplekset til hydrolysebetingelser ved anvendelse 12 ækvivalenter EDTA natten over med varierende pH ved stuetemperatur viste vellykket hydrolyse af komplekset sker under pH-betingelser niveauet 4,5 til 7,5. Dette viser fleksibiliteten af EDTA hydrolyse; pH kan øges for at tage højde for flere syresensitiv sidekædebeskyttende grupper.
| Tilstand | pH af EDTA Solution | overnight Afslutning | |
| 1 | 0 | 4,5 | Ingen |
| 2 | 2 | 4,5 | Delvis |
| 3 | 4 | 4,5 | Delvis |
| 4 | 6 | 4,5 | Delvis |
| 5 | 8 | 4,5 | Fuld |
| 6 | 10 | 4,5 | Fuld |
| 7 | 12 | 4,5 | Fuld |
| 8 | 12 | 5.0 | Fuld |
| 9 | 12 | 5.5 | Fuld |
| 10 | 12 | 6,0 | Fuld |
| 11 | 12 | 6.5 | Fuld |
| 12 | 12 | 7,0 | Fuld |
| 13 | 12 | 7.5 | Fuld |
| 14 | 12 | 8,0 | Delvis |
Tabel 1: Ni-PBP-Gly hydrolysebetingelser.
At verificere, at hydrolysen var fuldstændig ved hjælp af den mest effektive tilstand, 7, ekstraheret vi reaktionen tre gange med dichlormethan, kombineret og tørret de organiske lag og analyseret den resulterende rest ved anvendelse af kernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR). NMR-spektret viste ingen tegn på Ni-PBP-Gly i prøven; de eneste resonanser fundet i spektret matchede litteraturrapporter PBP, hvilket antyder fuldstændig hydrolyse af komplekset.
Vi undersøgt muligheden af at vores optimale hydrolysebetingelser med aminosyrer indeholdering en række sidekæde-beskyttelsesgrupper. Prøver af Fmoc-L-glutaminsyre 5-tert-butylester (Fmoc-Glu (tBu) -OH), Fmoc- O - tert-butyl-L-threonin (Fmoc-Thr (tBu) -OH), Fmoc - O - tert-butyl-L-tyrosin (Fmoc-Tyr (tBu) -OH) og N (i) Boc-N-α-Fmoc-L-tryptophan (Fmoc-Trp (Boc) -OH) blev opløst i DMF og underkastes hydrolyse ved stuetemperatur under anvendelse 12 ækvivalenter EDTA ved pH 4,5. Efter at være blevet omrørt natten over blev opløsningerne ekstraheret med dichlormethan og analyseret ved NMR. Et repræsentativt NMR er inkluderet for Fmoc-Glu (tBu) -OH (figur 3). I hvert tilfælde viste spektrale data fuld retention af sidekæde-beskyttelsesgrupper. 11, 12, 13
Figur 3: Repræsentativ NMR af en Fmoc-monomer Bearing et syrelabilt sidekædebeskyttende Group efter udsættelse for hydrolysebetingelser.
Den syrelabile sidekædebeskyttende gruppe er fremhævet med en blå boks. Afrundede integration værdier for protonsignaler af denne forbindelse er inkluderet i parentes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter hydrolyse og ekstraktion med et organisk, den resterende vandige lag indeholder den frie aminosyre sammen med resterende EDTA og Ni 2+ ioner. At sikre, at tilstedeværelsen af disse stoffer ikke ville interferere med efterfølgende Fmoc beskyttelse af den frie aminosyre, har vi udført en test reaktion ved at opløse glycin i en vandig opløsninger indeholdende EDTA og Ni 2+ ioner med koncentrationer svarende til hydrolyse indgang 7. We derefter underkastet denne opløsning til en standard vandig Fmoc beskyttelse. 8 Efter reaktionsfærdiggørelse og oparbejdning, bestemt vi reaktionen gav et udbytte på 25% af Fmoc-beskyttede glycin. Denne procent udbytte er ikke overraskende i betragtning af den fortyndede koncentration af reaktionen og antyder, at tilstedeværelsen af Ni 2+ ioner og EDTA ikke interfererer med en standard Fmoc beskyttelsesreaktion.
Med dokumentation for, at hver enkelt bestanddel af vores metodologi (hydrolyse, isolering af fri aminosyre, og Fmoc beskyttelse) er mulig, udførte vi en proof-of-concept forsøg under anvendelse af Ni-PBP-Gly. Vi bedømte levedygtighed hydrolysebetingelser beskrevet ovenfor og efterfølgende Fmoc beskyttelse under anvendelse af en standardprotokol 8 til opnåelse af en Fmoc-beskyttet aminosyre i rimeligt udbytte. Til en omrørt opløsning af Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 ækv) i 40 ml DMF ved stuetemperaturperatur blev tilsat 0,2 M EDTA-opløsning ved pH 4,5 (65 ml, 13 mmol, 13 ækv). Reaktionen blev omrørt natten over og derefter vasket fire gange med dichlormethan. Det vandige lag blev derefter indstillet til pH 7 under anvendelse af fast natriumbicarbonat. Til det vandige lag sattes natriumbicarbonat (163 mg, 1,93 mmol, 2 ækv) og Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 ækv) opløst i en minimal mængde dioxan. Reaktionen blev omrørt natten over og derefter forsuret med 1 M saltsyre og ekstraheret tre gange med ethylacetat. De organiske ekstrakter blev kombineret, vasket seks gange med saltvand, koncentreret, tørret med magnesiumsulfat og tørret under vakuum til opnåelse af en blanding af uomsat Fmoc-OSu og Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% udbytte). Spektraldata matchede tidligere offentliggjorte spektre for Fmoc-Gly-OH. 9 Denne sidste eksperiment viser, at det er muligt at isolere fri glycin fra Ni-PBP-Gly kompleks og bære den frem til sin Fmoc-protected formular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne protokol er nyttig i dens evne til at lette isoleringen af en aminosyre rygraden fra en Ni-Schiff-basen kompleks under milde pH-betingelser og efterfølgende Fmoc beskyttelse af dette isolerede aminosyre gennem to kritiske trin. Det første trin indebærer omrøring af en DMF / vand-opløsning indeholdende EDTA til lette frigivelsen af aminosyren fra komplekset. Resterende komplekse eller organiske biprodukter kan let fjernes med ekstraktion. Det andet trin i denne protokol involverer en Fmoc beskyttelse af aminosyren fundet i det vandige lag efter isolering ved ekstraktion i det første trin. Vi har vist evnen til at modificere denne procedure i et pH-område 4,5-7,5, hvilket giver stor fleksibilitet, som kan være nødvendige for nogle pH-følsom sidekædebeskyttende grupper.
En potentiel begrænsning ved denne teknik er den lave reaktion koncentrationen af Fmoc beskyttelse af den isolerede aminosyre. Som letter efficient hydrolyse kræver flere ækvivalenter af EDTA i forhold til substrat, reaktionsbetingelserne kræver en betydelig mængde vandig EDTA-opløsning (60 ml for en 1 mmol-skala reaktion). Under anvendelse af denne volumen opløsningsmiddel i et Fmoc resultater beskyttelse i en relativ lav (~ 0,015 M) koncentration af reagenser. Mens en proof-of-concept reaktion under anvendelse af disse betingelser gav produkt i en lovende udbytte 55% på trods af de fortyndede reaktionsbetingelser, kan det være nødvendigt at øge denne koncentration, når man bruger aminosyrer med reduceret nucleophilicty forhold til glycin som følge af øget sterisk bulk.
Sammenfattende har vi vist anvendeligheden af EDTA til at fremme hydrolyse af en Ni-Schiff-base-komplekset typisk anvendes til syntese af UAA s. Disse hydrolysebetingelser kræver ikke den stærkt sure betingelser typisk til disse hydrolysen, hvilket tillader tilbageholdelse af syrelabilt sidekædebeskyttende grupper. Fremtidige forsøg bør fokusere på at anvende thans generelle strategi til en række unaturlige aminosyre-substrater. Arbejdet i denne retning er i gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering fra Slippery Rock Universitet. Vi vil gerne takke T. Bor III (Slippery Rock Universitet) og C. Haney (University of Pennsylvania) for deres indsigter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
