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Biochemistry

मूल विलासितालयों, इन-जेल एसेज़ और इलेक्ट्रोलाउशन के साथ मिटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन के सुपरकॉम्प्लेक्सेस का विश्लेषण करना

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक मिटोकोन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन कॉम्प्लेक्स (सीएक्स) चतुर्थ और अलग-अलग सुपर-कॉम्प्लेक्सेज को अलग-अलग वर्णित करता है, जो उनके विधानसभा और संरचना के बारे में जानकारी प्रकट करने के लिए देशी वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करते हैं। मूल जेल को इम्यूनोबलॉटिंग, इन-जेल एशेज के अधीन किया जा सकता है, और अलग-अलग कॉम्प्लेक्स की विशेषता के लिए इलेक्ट्रोलाइजेशन द्वारा शुद्धिकरण किया जा सकता है।

Abstract

मितोचोन्द्रीयल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) विभिन्न ईंधन के टूटने से प्राप्त सेल, एटीपी की बायोएनेजरेटिक मुद्रा में ऊर्जा को बदल देती है। ईटीसी 5 विशाल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से बना है, जो सुपर-कॉम्प्लेक्ज़िस (सीआई, सी-III, और सी -4) तथा सिन्थोसोम (सीवी) नामक सुपर कॉम्पलेक्स में इकट्ठा होता है जो इलेक्ट्रॉन परिवहन और एटीपी उत्पादन की दक्षता में वृद्धि करता है। ईटीसी कार्य को मापने के लिए 50 से अधिक वर्षों के लिए विभिन्न तरीकों का इस्तेमाल किया गया है, लेकिन ये प्रोटोकॉल अलग-अलग कॉम्प्लेक्स और सुपर कॉम्प्लेक्सस की विधानसभा के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। इस प्रोटोकॉल में मूल जेल पॉलिैक्लाइमाइड जेल वैद्युतकणसंच (पेज) की तकनीक का वर्णन किया गया है, जो एक विधि है जो 20 से अधिक साल पहले ईटीसी जटिल संरचना का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया था। देशी वैद्युतकणसंचिकित्सा ईटीसी परिसरों के अपने सक्रिय रूपों में अलग होने की अनुमति देता है, और इन परिसरों को फिर से इम्यूनोबलॉटिंग, इन-जेल एसेज़ (आईजीए) और इलेक्ट्रोलाउशन द्वारा शुद्धि के जरिये अध्ययन किया जा सकता है। फिर से संयोजन करकेअन्य मितोचोन्ड्रियल assays के साथ देशी जेल पेज की, यह ईटीसी गतिविधि, इसकी गतिशील विधानसभा और disassembly की एक पूर्ण चित्र प्राप्त करना और यह कैसे मिटोकोंड्रियल संरचना और कार्य को विनियमित करना संभव है। यह काम इन तकनीकों की सीमाओं पर भी चर्चा करेगा। संक्षेप में, मूल पृष्ठ की तकनीक, नीचे दी गई इम्यूनोबलॉटिंग, आईजीए, और इलेक्ट्रोलाउशन द्वारा प्रस्तुत की गई, यह एक शक्तिशाली तरीका है जो मितोचोन्ड्रियल ईटीसी सुपर कॉम्पलेक्सेज़ की कार्यक्षमता और संरचना की जांच करता है।

Introduction

एटीपी के रूप में मिटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा केवल सेल के अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं है, बल्कि सेल मृत्यु के नियमन के लिए भी है। ऑक्सीडेटिव फास्फोरेटेशन द्वारा एटीपी की पीढ़ी को एक कार्यात्मक इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी, सीएक्स-आई टू टूवीं) और मिटोकोडायड्रियल एटीपी सिंथेस (सीएक्स-वी) की आवश्यकता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इन बड़े प्रोटीन परिसरों को सुपर-कॉम्प्लेक्स में संयोजित किया जाता है, जिसे श्वासरोग और सिंथेसाम्स 1 , 2 कहा जाता है। इन बड़े परिसरों और सुपर कॉम्पलेक्सेज़ के असेंबली, गतिशीलता और गतिविधि विनियमन का विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण है जबकि एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के साथ ऑक्सीजन की खपत माप और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करते हुए एंजाइम assays ईटीसी जटिल गतिविधि के बारे में बहुमूल्य जानकारी दे सकते हैं, इन assays प्रोटीन जटिल या supercomplexes की उपस्थिति, आकार, और उप-संयोजन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकता। हालांकि, नीले और स्पष्ट देशी (बीएन और सीएन, क्रमशः) पृष्ठ 3 ने जटिल संरचना और विधानसभा / disassembly के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी और शारीरिक और रोग परिस्थितियों के तहत इन महत्वपूर्ण श्वसन परिसरों के सुप्रामोलेकुलर संगठन के गतिशील विनियमन के बारे में खुलासा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाया है।

उच्च संक्रामक सुपर कॉम्पलेक्सेज़ में इन परिसरों की विधानसभा में मिटोकॉन्ड्रियल संरचना और 5 फ़ंक्शन को विनियमित करने के लिए प्रतीत होता है। उदाहरण के लिए, श्वासशोथ विधानसभा, इलेक्ट्रो ट्रान्सफर की दक्षता और मिटोकोन्ड्रियल आंत झिल्ली 5 में प्रोटॉन प्रेरक बल की पैदावार को बढ़ाती है। इसके अलावा, सिंथासोमों की विधानसभा में एटीपी उत्पादन की दक्षता और कोशिकाप्लाज्म 2 में ऊर्जा समकक्षों का हस्तांतरण न केवल बढ़ता है, बल्कि यह ट्यूबलर क्रिस्टे 6 में मिटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली भी बनाता है , </ Sup> 7 माउस भ्रूणों में कार्डियक विकास के दौरान सुपरकम्पलेक्स असेंबली का अध्ययन दर्शाता है कि सीएक्स-आई की हालत में सुपरकॉम्प्लेक्सेज की पीढ़ी भ्रूण दिवस 13.5 8 के बारे में शुरू होती है। दूसरों ने दिखाया है कि उम्र बढ़ने या ischemia / reperfusion चोटों 9 , 10 या neurodegenerative बीमारियों 11 की प्रगति में एक भूमिका निभा सकते हैं के कारण हृदय में सीएक्स-आई युक्त supercomplexes की मात्रा कम हो जाती है।

यह प्रोटोकॉल मूल जेल पृष्ठ के लिए विधियों का वर्णन करता है जिसका उपयोग विधानसभा की जांच के लिए किया जा सकता है और ईटीसी कॉम्प्लेक्स और सुपर कॉम्पलेक्सेज़ की गतिविधि के लिए किया जा सकता है। मिटोकॉन्ड्रियल सुपर कॉम्प्लेक्स का अनुमानित आणविक भार का मूल्यांकन सीएन या बीएन पॉलीएक्लाइमाइड जैल में प्रोटीन परिसरों को अलग करके किया जा सकता है। सीएन पृष्ठ भी जेल में सीधे सभी मिटोकोडायड्रियल परिसरों की एंजाइमिक गतिविधि के दृश्य के लिए अनुमति देता है (इन-जेल एशेज;आईजीए) 12 यह काम IX के माध्यम से एनएडीएच के ऑक्सीकरण को सीएक्स-आई की क्षमता को हाइलाइट करने और आईजीए द्वारा सीएक्स-वी की एटीपी-हाइड्रोलाइजिंग गतिविधि की वजह से सिंथासॉम की उपस्थिति को दर्शाता है। प्रोटीन को नाइट्रॉसेल्यूलोज़ झिल्ली पर स्थानांतरित करके और इम्यूनोबलॉटिंग करने से सीएक्स-आई और सीएक्स-वी युक्त कई कॉम्प्लेक्स और सुपर कॉम्प्लेक्स भी प्रदर्शित किए जा सकते हैं। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि बीएन या सीएन पृष्ठ आमतौर पर उनके शारीरिक आकार और रचना के आधार पर प्रोटीन परिसरों को अलग करता है; एक झिल्ली के लिए स्थानांतरण बैंड के इस पैटर्न को बरकरार रखता है। बीएन या सीएन पृष्ठ में प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण भी 2 डी पृष्ठ (प्रदर्शन के लिए फियाला एट अल। 13 देखें) या सुक्रोज घनत्व केन्द्रापसारक 14 , 15 द्वारा किया जा सकता है । आगे एक विशिष्ट बैंड का विश्लेषण करने के लिए, इसे BN पृष्ठ से excised किया जा सकता है, और इस प्रोटीन जटिल से प्रोटीन purifie हो सकता हैघ उन्हें मूल स्थितियों के तहत electroeluting द्वारा। देशी इलेक्ट्रोलाशन कुछ घंटों के भीतर किया जा सकता है, जो आसपास के बफर में एक जेल से निष्क्रिय प्रसार (संदर्भ 16 में प्रयुक्त होता है) के लिए महत्वपूर्ण अंतर बना सकता है।

संक्षेप में, इन विधियों का वर्णन कई तरीकों से होता है जो मिटोकोन्ड्रियल झिल्ली से उच्च-आणविक-वजन सुपर कॉम्प्लेक्स के आगे लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगों को सी 57 बीएल / 6 एन चूहों (जंगली प्रकार) से दिल का उपयोग किया गया। चूहे को गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था से पहले सीओ 2 के साथ संवेदनाहट किया गया था, और रोचेस्टर विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु चिकित्सा के डिवीजन और राज्य कानून, संघीय क़ानून और एनआईएच पॉलिसी के अनुपालन के अनुसार सभी प्रक्रियाएं निष्पादित की गईं। प्रोटोकॉल को संस्थागत पशु देखभाल और रोचेस्टर विश्वविद्यालय (यूनिवर्सिटी कमेटी ऑन एनिमल रिसोर्सेज) के उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी थी।

1. सीएन और बीएन पृष्ठ

नोट: बीएन और सीएन पृष्ठ के लिए इस्तेमाल किए गए सभी उपकरण डिटर्जेंट से मुक्त होने चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए, सभी उपकरणों को 0.1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ धो लें, इसके बाद विलोनीकृत एच 2 ओ के साथ बड़े पैमाने पर रग करना।

  1. तैयारी
    1. एएनडीई बफर तैयार करें जिसमें 25 एमएम इमिजाजोल, पीएच 7.0, 4 डिग्री सेल्सियस पर; 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    2. सीएन या बीएन पृष्ठ के लिए कैथोड बफर तैयार करें।
      1. सीएन पृष्ठ के लिए, 7.5 एमएम इमिडाज़ोल और 50 मिमी ट्रिनिन का उपयोग करें; 0.5 ग्राम सोडियम डीऑनोक्लॉलेट और 0.2 ग्राम लौरिला माल्टोसाइड प्रति लीटर बफर जोड़ें। पीएच को 7.0 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
      2. बीएन पृष्ठ के लिए, 7.5 एमएम इमिडाजोल और 50 एमएम त्रिस्टिन का उपयोग करें और पीएच को 4 डिग्री सेल्सियस पर 7.0 में समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
      3. हल्के नीले बी.एन. कैथोड बफर के लिए, 7.5 मिमी इमिडाज़ोल और 50 मिमी ट्रिनिन का उपयोग करें। पीएच को 7.0 डिग्री सेल्सियस से समायोजित करें और बफर के 20 मिलीग्राम कॉओमासी प्रति लीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    3. 50 मिमी NaCl, 50 मिमी इमिडाज़ोल, 2 मिमी अमीनोकैप्रोइक एसिड और 1 एमएम ईडीटीए के साथ निष्कर्षण बफर (ईबी) तैयार करें। पीएच को 7.0 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    4. 3 मिमी जेल बफर तैयार करें (बीएन और सीएन जैल के लिए इस्तेमाल किया जाता है) 75 एमएम इमिडाज़ोल और 1.5 एम एमिनोकेप्राइक एसिड के साथ। पीएच को 7.0 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    5. पॉन्सेऊ एस के 0.01 ग्राम लोडिंग बफर (एलबी) तैयार करें, ग्लिसरॉल के 5 ग्राम और एच 2 ओ के 5 एमएल कमरे में स्टोर करें।तापमान।
    6. 50 मिलीग्राम कॉमससी को 500 मिलीमीटर 6 एमिनोहेक्सानिक एसिड के 1 एमएल तक जोड़कर कूमैसी नीली तैयार करें। पीएच को 7.0 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    7. एच 2 ओ में 20 मिमी और 200 मिमी लौरिल माल्टोसाइड तैयार करें। 200 μL के अलिक्टुव करें और उन्हें जमी रखें। उपयोग करने से पहले डिटर्जेंट पिघलना
3% से 8% (मिनी) 4% से 10% (मैक्सी)
0.5 ग्राम (प्रकाश) 0.5 ग्राम (भारी) 0.5 ग्राम (प्रकाश) 0.5 ग्राम (भारी)
एएबी (एमएल) 0.42 1.3 2.5 7.7
सीएन / बी एन बफर (एमएल) 1.6 1.6 8.5 8.5
एच 2 ओ (एमएल) 2.7 1.4 14 6.3
ग्लिसरॉल (जी) 0 0.47 0 2.5
वॉल्यूम (एमएल) 4.72 4.77 25 25
एपीएस (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

तालिका 1: 1 मिनी या मैक्सी-पेज को डालने के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा इस तालिका में इस्तेमाल होने वाली मात्रा 1 मिनी- या 1 मैक्सी-जेल, 1.5 मिमी मोटी के लिए गणना की जाती है। एएबी की मात्रा 40% स्टॉक समाधान पर आधारित है। प्रकाश और भारी ध्यान केंद्रित करने के लिए देखेंएएबी का आयन एडीएस और TEMED ढाल मिश्रक के प्रत्येक स्तंभ के बाद एएबी समाधान से भर जाता है जोड़ा जाता है।

  1. डालें और चलने वाले जैल
    नोट: क्रमशः सीएन या बीएन जैल के लिए 3-8% या 4-10% एसीलामाइड / बीआईएसएक्रैलामाइड (एएबी) ढाल का प्रयोग करें। तालिका 1 में बफर, एएबी, एच 2 ओ, ग्लिसरॉल, अमोनियम एम्फ़करेट (एपीएस) और टेट्रामथाइलएंडेमिन (टीईएमईडी) की मात्रा का इस्तेमाल होता है जिसमें मिनी-जेल (85 मिमी चौड़े x 73 मिमी उच्च x 1.5 मिमी मोटी) या मैक्सी-जेल (160 मिमी चौड़ा x 200 मिमी उच्च x 1.5 मिमी मोटी)। सीएन या बीएन जैल के साथ गिलास प्लेटों की विधानसभाएं एक बैग में 1 एक्स जेल बफर के कुछ एमएल के साथ प्रशीतित हो सकती हैं या भंडारण के लिए 1x जेल बफर के साथ गीले पका हुआ कागज तौलिया में लपेटा जा सकता है। जेल एक सप्ताह तक उपयोग के लिए स्थिर होते हैं
    1. जेल डालना, ढाल मिक्सर को एक ऊर्ध्वाधर सरगर्मी प्लेट पर रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि जेल तैयार की गई जेल चैम्बर में गुरुत्वाकर्षण से बह जाएगा।
    2. 4.77 / 25 एमएल के साथ ढाल मिश्रक के बहिर्वाह कक्ष को भरें (मिनी / मैक्सी) (भारी मात्रा में एएबी के साथ)।
    3. धीरे से भारी और हल्के कक्ष के बीच रोक-मुर्गा कनेक्शन को खोलें और दूसरे पक्ष के माध्यम से जाने के लिए समाधान की एक बूंद की अनुमति दें।
      नोट: यह कनेक्टिंग ट्यूब और स्टॉप-कॉक से हवा के बुलबुले को धकेलता है, जो दो कक्षों के बीच के प्रवाह को रोक देगा। यह तब तक नहीं किया जा सकता है जब दोनों पक्ष पहले से ही भर गए हों, क्योंकि समान दबाव बुलबुले को आगे बढ़ने से रोका जाएगा।
    4. प्रकाश समाधान के 4.72 / 25 एमएल (मिनी / मैक्सी) के साथ ढाल मिश्रक के दूसरे कक्ष को भरें।
    5. भारी समाधान के साथ बहिर्वाह कक्ष में एक हलचल बार रखें और सरगर्मी शुरू करें। एक हलचल बार की गति का उपयोग करें जो बुदबुदाती कारण नहीं है।
    6. पोलीमराइजेशन आरंभ करने के लिए प्रत्येक कमरे में एपीएस और TEMED जल्दी से जोड़ें
    7. ढाल मिश्रक के दो कक्षों के बीच कनेक्शन खोलें और जेल डालना करने के लिए बहिर्वाह कक्ष खोलने से पहले कुछ सेकंड के लिए मिश्रण की अनुमति दें।
      नोट: गुरुत्वाकर्षण वाईदोनों कमरे समान रूप से पलायन करेंगे, और भारी समाधान में प्रकाश के मिश्रण धीरे धीरे नीचे से जेल के शीर्ष तक acrylamide घनत्व कम हो जाएगा। जेल डालने के लिए ढाल मिश्रक में मौजूद संपूर्ण सामग्री का उपयोग करें।
      1. अंत में, बुलबुले और परत मिश्रण से बचने के लिए जेल के अंदर कुएं के साथ कंघी को ध्यान से माउंट करें।
    8. तुरंत किसी भी जेल को कुल्ला करने के लिए इथेनॉल के साथ ढाल मिश्रक को धो लें। पानी से कुल्ला और दूसरा जेल डालना जैल को पॉलिमराइज़ करने दें (आमतौर पर मिनी-जैल के लिए 20 मिनट से कम की आवश्यकता होती है)
    9. जैल चलाने के लिए, उन्हें इलेक्ट्रोड विधानसभा क्लैंप में माउंट करें और सीएन या हल्के नीले रंग के बीएन कैथोड बफर के साथ केंद्र / ऊपरी कक्ष भरें। बाहरी / निचली कक्ष में एनोड बफर जोड़ने से पहले लीक की जांच के लिए कुछ मिनट रुको।
      1. धीरे से अच्छी तरह से कंबल खींचें और सिरिंज या पिपेट का उपयोग करके कैथोड बफर के साथ कुएं धो लें।
      2. जैल को एक ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में चलाएं या बर्फ में पूरी तरह से पैक किया गया।
        1. सीएन मिनी-पेज के लिए, पहले घंटे के लिए 100 वी और 200 वी का उपयोग समाप्त होने पर, आमतौर पर एक अतिरिक्त 1-1.5 एच। वैकल्पिक रूप से, सीएन मिनी-पेज को 30-40 वी रात भर में चलाएं।
          नोट: यहां फोकस उच्च आणविक-वजन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स पर है, इसलिए प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जिसमें कम से कम 140 केडीए के आणविक वजन जेल से निकलेगा। वैद्युतकणसंचलन के लिए कम चलने का समय कम आणविक-वजन परिसरों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
        2. बीएन मैक्सी-पेज के लिए, 100 वी का उपयोग करें और रातोंरात जैल चलाएं (लगभग 18 घंटे)।
          नोट: वर्तमान बहुत कम होगा (<15 एमए), इसलिए एक बिजली की आपूर्ति जो इन शर्तों को संभालने की जरूरत है। इस बिंदु पर, जैल IGA या immunoblotting के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कुछ मामलों में, इलेक्ट्रॉल्शन के लिए ग्लास प्लेट पर रेजर ब्लेड का इस्तेमाल करते हुए बैंड या लेन का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. नमूना तैयार करना
    नोट: झिल्ली-बाध्य मीइटोचोन्ड्रियल सुपर कॉम्प्लेक्सस को वें से निकाला जाना चाहिएई भीतरी मिटोकॉन्ड्रियल झिल्ली मिटोकॉन्ड्रियल सुपर कॉम्प्लेक्सस को संरक्षित करने के लिए, ताजे पृथक मिटोकोंड्रिया या नमूनों का उपयोग करें जिन्हें जमे हुए और केवल एक बार पानी पिलाया गया है। नीचे की गणना / मात्रा मिनी-जैल के लिए दी जाती है (एक 10-अच्छी तरह से कंबल का कण जो 1.5 मिमी मोटी में होता है, 35-40 μL तक की होती है) और मैक्सी-जैल (15-अच्छी तरह से कंबल का खंभा 200 μL)। इसके अलावा, प्रत्येक नमूना (आमतौर पर 10 μL) के एक विभाज्य को बचाने के लिए, लोडिंग कंट्रोल के रूप में वोल्टेज-आश्रित आयनों चैनल (वीडीएसी) की पहचान के लिए एसडीएस जेल को छेड़ने के लिए चलाया जाना चाहिए।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए 17,000 xg पर उचित मात्रा में ( जैसे, 10-50 माइक्रोग्राम प्रोटीन मिनी-जैल और 50-200 मिलीग्राम मैक्सी-जैल) माइक्रोट्यूब में सेंटीफ्यूज और पृथक मिटोकोंड्रिया या ट्यूस्यू होमोजेनेट में रखें।
      नोट: यह चरण कुछ घुलनशील मिटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स और / या साइटोसोलिक प्रोटीन को निकालता है।
    2. आकांक्षा और सतह पर तैरनेवाला त्याग दें और व्यय बफर को वांछित राशि में जोड़ेंजेल पर लोड करने के लिए धीरे बर्फ पर तलछट resuspend। यदि वांछित है, तो इस बिंदु पर एक सामान्य प्रोटीज अवरोधक मिश्रण जोड़ें।
      नोट: यहां इस्तेमाल किए गए उपकरण के आधार पर, 30 μL का इस्तेमाल मैक्सी-जेल के लिए एक मिनी-जेल और 100 μL के लिए किया गया था, प्रोटीन / बफर अनुपात को 2 μg प्रोटीन से 1 μL बफर तक नहीं सीमित किया गया था।
    3. डिटर्जेंट जोड़ें ( उदाहरण के लिए, 2 माइक्रोग्राम लौरिल माल्टोसाइड / 1 ग्राम प्रोटीन, अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम और चर्चा देखें)
      नोट: आम तौर पर, लाउरिल माल्टोसाइड का उपयोग किया जाता है, लेकिन डिजीटोनिन भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं ट्रिटेटिंग और / या ट्यूब को उत्तेजित करके ऊष्मायन के दौरान धीरे-धीरे शुरुआत में और कभी-कभी मिश्रण करें।
    5. किसी भी झिल्ली और ऊतक के टुकड़े को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 xg पर अपकेंद्रित्र।
    6. एक नई ट्यूब पर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण सीएन नमूनों के लिए नमूना मात्रा के हर 10 μL के लिए एलबी का 1 μ एल जोड़ें; नमूना की कुल मात्रा एप्लिकेशन होना चाहिएएक मिनी-जेल के लिए 40 μL और मैक्सी-जेल के लिए 130 μL। बी एन के नमूनों के लिए, नमूनों के लिए कॉमेसी को जोड़ दें ताकि डाई के डिटर्जेंट का अनुपात 1: 4 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) हो।
    7. नमूने के 30 और 120 μL को मिनी या मैक्सी-जेल के कुएं में लोड करें, क्रमशः। प्रत्येक नमूने से शेष 10 μL का उपयोग एसडीएस जेल को छानने के लिए करें ताकि लोडिंग कंट्रोल के रूप में वीडीएसी को पता लगा सके।
    8. आणविक वजन चिह्नकों को तैयार करने के लिए, 60 μL बीएन / सीएन जेल बफर में एक उच्च आणविक भार अंशांकन मिश्रण (अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें) के 1 शीशी को भंग और एच 2 0 और 20 μL के 120 μL जोड़ें LB। प्रति लेन 15 μL लोड करें।
    9. चरण 1.2.9.2 में उल्लिखित जैल को चलाएं।

2. सीएक्स-आई और सीएक्स-वी के लिए इन-जेल एसेस

नोट: assays कमरे के तापमान पर किया जाता है दस्तावेजों के लिए विकासशील बैंड की फोटो, स्कैन या छवियां लें (महत्वपूर्ण) प्रोटीन को हस्तांतरित नहीं किया जा सकता ontएक आईजीए को पूरा करने के बाद नाइट्रो सेल्यूलोज़ झिल्ली।

  1. सीएक्स-आई परख
    1. तैयार करना।
      1. 7.4 मिमी पीएच के साथ एच 2 ओ में 5 मिमी ट्रिस के परख बफर तैयार करें; कमरे के तापमान पर रखो।
      2. 1 एमएल ऑफ बेस बफर में 10 एमजी का एनएडीएच भंग करना। उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL के अलक्षकों में स्टोर करें; ठंड और विगलन से बचें
      3. एक माइक्रोोट्यूब में 25 मिलीग्राम नाइट्रोब्लेयू टेट्राज़ोलियम का वजन।
      4. एच 2 ओ के 95 एमएल में 5 एमएल एसिटिक एसिड को डिलीट कर लगाने के लिए तैयार करें; कमरे के तापमान पर रखो।
    2. परख प्रदर्शन
      1. 25 मिलीग्राम नाइट्रोब्लेयू टेट्राज़ोलियम (अंतिम एकाग्रता: 2.5 मिलीग्राम / एमएल) और 100 μL 10 मिलीग्राम / एमएल एनएडीएच (0.1 एमजी / एमएल) के साथ 10 एमएल का परख बफर मिलाएं। इस पूरे जेल, एक लेन, या एक सीएन जेल से excised ब्याज का एक क्षेत्र में जोड़ें।
        नोट: यह एक स्पष्ट प्लास्टिक या ग्लास कंटेनर में किया जा सकता है। कृपया ध्यान दें कि इस परख BN पृष्ठ के बाद नहीं किया जा सकता है।
      2. 3 मिनट के लिए कोमल आंदोलन (घुमाव) के बाद नीले बैंड के विकास का पालन करें।
      3. 10 में जेल को ठीक करें - एसिटिक एसिड समाधान के 20 एमएल या प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 5 मिमी त्रिस, पीएच 7.4 में धो लें। दस्तावेज़ीकरण के लिए तस्वीरें ले लीजिए (सामग्री की तालिका देखें)
  2. Cx-V परख
    नोट: सीएक्स-वी परख डुप्लिकेट सीएन या बीएन जैल का उपयोग करके किया जाना चाहिए, जहां एक सीएक्स-वी-स्वतंत्र गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए 5 μg / mL ओलिगॉमीसीन (एक सीएक्स-वी अवरोधक) से युक्त होता है।
    1. तैयार करना।
      1. 35 मिमी ट्रिस और 270 मिमी ग्लाइसिन के साथ एक परख बफर तैयार करें; पीएच को कमरे के तापमान पर 8.3 से समायोजित करें। बफर को 50 एमएल अलोकॉट्स में जमे हुए स्टोर करें, लेकिन ठंड और विगलन के बाद पीएच की जांच करें।
      2. एच 2 हे में 1 एम एमजीएसओ 4 तैयार करें; उपयोग में 4 डिग्री सेल्सियस तक स्टोर करें।
      3. माइक्रोट्यूब में 27.28 मिलीग्राम पीबी (नं 3 ) 2 का वजन।
      4. माइक्रोट्यूब में 60 एमजीआर एटीपी वजन करें।
      5. ओ के 1 मिलीग्राम भंग1 एमएल ऑफ इथनॉल में लिगोमोसिन उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
      6. 50 एमएल एच 2 हे के साथ 50 एमएल मेथनॉल मिश्रण करके एक लगानेवाला तैयार करें; कमरे के तापमान पर रखो।
    2. परख प्रदर्शन
      1. 10-20 मिलीलीटर परख बफर ± 5 μg / एमएल ओलिगॉमीसीन (50-100 μL का 1 मिलीग्राम / प्रति मिनट) में कोमल आंदोलन (घुमाव) के साथ 2 घंटे के लिए बीएल या सीएन जेल से जेल, लेन, इथेनॉल में एमएल) कमरे के तापमान पर।
      2. ऊष्मायन के बाद, बफर को प्रतिस्थापन के साथ 14 एमएल की ताजा परख बफर और 1 9 MGSO 4 (14 मिमी), 190 एमएल 1 एम एमजीएसओ, 27.28 मिलीग्राम पीबी (नं। 3 ) 2 (5 एमएम), 60 एमजी (एटीपी) 8 मिमी), और ओलिगॉमीसीन के 75 μL (जहां आवश्यक)।
      3. कोमल आंदोलन (घुमाव) के साथ सेते हैं और एक सफेद वेग के लिए घड़ी के रूप में, oligomycin- इलाज जैल पर बैंड गैर सीएक्स- V- निर्भर बैंड दे देंगे।
        नोट: वेग की उपस्थिति में कई घंटे लग सकते हैं।
      4. मेथनॉल में जेल को ठीक करें-आधारित निर्धारण ( उदाहरण के लिए, 50% मेथनॉल), क्योंकि अम्लीय समाधान मुख्य द्रव को भंग कर देगा। तस्वीरों के परिणाम
        नोट: लीड एक्सपिटिशन जैल के कॉमेस्सी स्नेनिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है।

3. प्रोटीन नाइट्रोकेलुलोज़ या पोलिविनालिडीन डिस्ट्लोराइड (पीवीडीएफ) मेम्ब्रेन में स्थानांतरण

  1. 25 एमएम ट्रिस और 200 एमएम ग्लाइसिन के ट्रांसफर बफर को तैयार करें। पीएच को 8.3 में समायोजित करें और 0.0005 जी / एल एसडीएस और 200 एमएल / एल मेथनॉल जोड़ें। कमरे के तापमान पर रखो।
    1. एक रेज़र ब्लेड या कैंची के साथ एक नाइट्रो सेलुलोज़ या पीवीडीएफ झिल्ली (पोर का आकार: 0.45 माइक्रोन) कट करें, जो जेल की तुलना में थोड़ा बड़ा है।
      नोट: नाइट्रॉसेललोज़ झिल्ली प्रोटीन लोडिंग का आकलन करने के लिए पोंसेऊ एस स्टेंसिंग की अनुमति देते हैं, जबकि पीवीडीएफ झिल्ली अधिक तेज परिभाषित बैंड उत्पन्न करते हैं।
  2. मसविदा बनाना।
    1. नाइट्रोसेल्यूलोज़ झिल्ली, फिल्टर पेपर, और एक के लिए स्पंजस्थानांतरण बफर में कम से कम 10 मिनट। 15% के लिए 100% मेथनॉल में पीवीडीएफ झिल्ली रखें या स्थानांतरण बफर में रखने से पहले निर्माता की सिफारिश के अनुसार। स्थानान्तरण किट के खुले कैसेट को स्थानान्तरण बफर के साथ एक फ्लैट कटोरे में रखें।
    2. कैसेट के पीछे की ओर स्पंज और फिल्टर पेपर की 1-2 परतें रखें। बुलबुले निकालें
    3. फ़िल्टर पेपर पर जेल रखें जेल के एक कोने और / या झिल्ली को कतरन करके जेल की अभिविन्यास को इंगित करें।
    4. जेल के शीर्ष पर झिल्ली रखें। सभी बुलबुले निकालें
    5. झिल्ली के ऊपर फिल्टर पेपर और स्पंज लगाएं इस सैंडविच में सभी बुलबुले निकालें
    6. कैसेट को बंद करें और उसे स्थानांतरण किट के कैसेट धारक में रखें।
    7. लगभग 12-18 घंटे के लिए 25 वी पर प्रोटीन स्थानांतरण।

4. Immunoblotting

  1. तैयार करना।
    1. 25 एमएल जोड़कर एक पोंसेउ दाग (500 एमएल) तैयार करेंएसीटिक एसिड का और 0.5 ग्राम पोंसेऊ एस से 475 एमएल एच 2 ओ; कमरे के तापमान पर स्टोर (पुनः उपयोग किया जा सकता है)।
    2. 200 एमएम NaCl, 25 मिमी ट्राइस बेस और 2.7 मिमी केएलएल के साथ ट्रिस्-बफरेड खारा (टीबीएस) तैयार करें। पीएच को 8.0 में समायोजित करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें
    3. 0.5 एमएल / एल के बीच 20 से टीबीएस जोड़कर टीबीएस-टीइन (टीबीएसटी) तैयार करें; कमरे के तापमान पर रखो।
    4. टीबीएसटी के 100 एमएल में दूध के ठोस 5 ग्राम भंग करके दूध के ठोस पदार्थ / टीबीएसटी तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 3 दिनों के भीतर उपयोग करें।
    5. टीबीएसटी के 100 एमएल में गोजाइन सीरम एल्बूमिन (बीएसए, अंश वी) के 3 ग्राम को भंग करके बीएसए / टीबीएसटी तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 3 दिनों के भीतर उपयोग करें।
  2. मसविदा बनाना।
    1. जब स्थानांतरण पूरा हो जाता है, तो सभी स्थानांतरित प्रोटीन की कल्पना करने के लिए पोंसेऊ एस के समाधान में झिल्ली को रखें। पेंसिल के साथ झिल्ली पर मार्करों की स्थिति को लेबल करें और पोंसेऊ-एस-सना हुआ झिल्ली को तस्वीर या स्कैन करें।
    2. झिल्ली को 10 मिनट प्रत्येक वाइ के लिए 3 बार धोएंवें टीबीएस कोमल आंदोलन के तहत
    3. दूध के साथ झिल्ली को ब्लॉक करें / टीबीएसटी कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे या कोमल आंदोलन के साथ एक ठंडे कमरे में रात भर।
    4. कोमल आंदोलन के तहत टीबीएसटी के साथ 10 मिनट के लिए झिल्ली को धोएं।
    5. कोमल आंदोलन के तहत ठंडे कमरे में रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी से सेते। बीएसए / टीबीएसटी में एंटीबॉडी को पतला ( जैसे, एटीपी 5 ए और -एनडीयूएफबी 6 के लिए 1: 1,000)
      नोट: रातोंरात सेते हुए अधिकांश एंटीबॉडी देशी जैल से झिल्ली पर बेहतर संकेत देते हैं।
    6. कोमल आंदोलन के तहत टीबीएसटी के साथ 10 मिनट के लिए झिल्ली को धोएं।
    7. कमरे के तापमान पर कम से कम 60 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी से ऊष्मा कोमल आंदोलन सेते हैं। दूध के ठोस पदार्थ / टीबीएसटी में एंटीबॉडी (1: 5,000 से 1: 50,000) को पतला।
    8. टीबीएसटी के साथ नरम आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए झिल्ली को 3 बार धोएं।
    9. आखिरी धोने के दौरान, मैनुफा के निर्देशों के अनुसार बढ़ाए गए केमोलामिंसिसेंस (ईसीएल) सब्सट्रेट तैयार करेंcturer।
    10. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों का उपयोग करते हुए ईसीएल सब्सट्रेट के साथ झिल्ली सेते हैं।
    11. ईसीएल सब्सट्रेट के निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों का उपयोग करके फिल्म पर सिग्नल का पता लगाएं।

5. इलेक्ट्रोलाउशन

  1. तैयार करना।
    1. 25 एमएम ट्रिनिसिन, 3.75 एमएम इमिजाजोल (पीएच 7.0 डिग्री सेल्सियस), और 5 एमएम 6-एमिनोहेक्नोनोइक एसिड के एयूशन बफर को तैयार करें।
      नोट: बाह्य प्रोटीन के साथ प्रदूषण को रोकने के लिए इलेक्ट्रोलाउटर और झिल्ली के कैप्स को संभालने के दौरान हर समय दस्ताने पहनें।
  2. देशी इलेक्ट्रोलाउशन के लिए इलेक्ट्रोलाउटर का उपयोग करने से पहले, निम्न करें:
    1. एल्यूएशन बफर में झिल्ली के कैप (कट-ऑफ: 3.5 केडीए) को 1 डिग्री सेल्सियस पर 60 डिग्री सेल्सियस तक भिगोएँ। कैप्स को ताजा अल्युशन बफर पर स्थानांतरण करें और रेफ्रिजरेटर में 12 घंटे या उससे अधिक समय तक उन्हें भिगो दें।
      नोट: 3.5 केडीए का कट-ऑफ आणविक वजन छोटे पी के नुकसान को रोकता हैरटियां जो आसानी से ब्याज की प्रोटीन जटिलता से अलग कर सकते हैं।
    2. इलेक्ट्रोलाउटर मॉड्यूल, गिलास ट्यूब, टैंक, और ढक्कन पूरी तरह से इथेनॉल के साथ धो लें। पानी से कुल्ला और उपकरण सूखा दो।
  3. देशी इलेक्ट्रोलीशन के दिन, निम्नलिखित करें:
    1. प्रत्येक गिलास ट्यूब के नीचे (पाले सेओढ़ लिया) का उपयोग करने के लिए एक फ्रेट रखें। यदि आवश्यक हो, तो एल्यूशन बफर में ग्लास ट्यूब को रखें और ट्यूब के अंदर से अंदर से फेट को दबाएं।
    2. इलेक्ट्रोलाउटर के मॉड्यूल में फ्रेट के साथ ग्लास ट्यूब को दबाएं। एल्यूशन बफर के साथ ग्रामेट को गीला करें और ग्लास ट्यूब को जगह में स्लाइड करें। सुनिश्चित करें कि ग्लास ट्यूबों के शीर्ष ग्रामेट के साथ भी हैं।
    3. स्टॉपर्स के साथ खाली ग्रामेट्स को बंद करें
    4. सिलिकॉन एडाप्टर के नीचे एक गीली झिल्ली टोपी रखें और एडाप्टर को एट्यूशन बफर के साथ भरें। धीरे-धीरे डायलिसिस झिल्ली के आसपास किसी भी हवाई बुलबुले को हटाने के लिए ऊपर और नीचे एडाप्टर में बफर पिपेट करें।/ Li>
    5. ग्लास ट्यूब के नीचे बफर-भर वाले एडाप्टर को स्लाइड करें। गिलास ट्यूब के अंदर फेट पर आने वाले सभी बुलबुले निकालें।
    6. एल्यूशन बफर के साथ प्रत्येक गिलास ट्यूब भरें।
    7. कांच की नलियों में बीएन पृष्ठ के excised बैंड रखें (कदम 1.2.9.3 देखें)। छोटे टुकड़ों में बड़े टुकड़ों को काट लें सुनिश्चित करें कि ग्लास ट्यूब के भीतर भरण ऊँचाई लगभग 1 सेमी है।
    8. पूरे मॉड्यूल को टैंक में रखें।
    9. टैंक को लगभग 600 एमएल का ठंडा अलौकिक बफर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि डायलिसिस झिल्ली पर बुलबुले को रोकने के लिए सिलिकॉन एडाप्टर कैप बफर में हैं
    10. टैंक के तल पर एक हलचल बार रखें।
      नोट: बहार बुलबुले को डायलिसिस झिल्ली के नीचे चिपकाने से रोकेगा।
    11. एक ठंडे कमरे में 4 घंटे के लिए प्रोटीन को 350 डिग्री सेल्सियस में हटा दें।
    12. चूषण समाप्त हो जाने के बाद, बफर टैंक से इलेक्ट्रोलाउटर मॉड्यूल को हटा दें और उसे सिंक या कटोरे में रखें।
    13. यदि एक डाट इस्तेमाल किया गया था, तो इसे हटा देंऊपरी बफर कक्ष में अन्यथा, बफर को हटाने के लिए एक बड़े पिपेट का उपयोग करें।
    14. प्रत्येक गिलास ट्यूब से बफर निकालें और त्यागें। सुनिश्चित करें कि सिलिकॉन एडाप्टर जगह पर रहता है और यह कि फ्रेट के नीचे के तरल को परेशान या हिलाना नहीं है।
    15. गिलास ट्यूब के नीचे से झिल्ली टोपी के साथ सिलिकॉन एडाप्टर को सावधानीपूर्वक हटा दें एक माइक्रोोट्यूब में सिलिकॉन टोपी की सामग्री (लगभग 400 μL) पिपेट करें अलौकिक बफर के एक और 200 μL के साथ, सिलिकॉन कैप कुल्ला और माइक्रोोट्यूब में जोड़ें। सभी ग्लास ट्यूबों के लिए दोहराएं।
    16. जैसे झिल्ली के कैप का पुन: उपयोग किया जा सकता है, उन्हें 0.5 मिलीग्राम / एमएल सोडियम अजाइड वाले अल्युशन बफर में डालकर झिल्ली के कैप को सुरक्षित रखें। उन्हें फ्रिजेट करें
      नोट: एल्यूएट कम प्रोटीन एकाग्रता है और केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों का उपयोग कर केंद्रित किया जा सकता है।

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Representative Results

मिटोकॉन्ड्रियल सुपर कॉम्प्लेक्सिस को देखने के लिए, चूहों से ताजा पृथक मिटोकोंड्रिया 17 , 18 का इस्तेमाल किया गया था। Mitochondrial supercomplexes ठंड और विघटित होने के दोहराए गए चक्रों के प्रति संवेदनशील होते हैं, जिससे विघटित हो जाते हैं, हालांकि यह कुछ शोधकर्ताओं के लिए संतोषजनक हो सकता है। अगर भंडारण के लिए जरूरी है, तो सबसे अच्छा परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, नमूनों को ठंड और विगलन के एक से अधिक चक्र से गुजरना नहीं चाहिए।

बीएन पृष्ठ के साथ मिटोकोंड्रियल ईटीसी कॉम्प्लेक्स को देखने के लिए, पृथक दिल मिटोकोंड्रिया से 100 ग्राम प्रोटीन को 4-10% जेल ( चित्रा 1 ए ) पर लोड किया गया था। लोड हो रहा है और कैथोड बफर में Coomassie दाग रन के दौरान प्रोटीन परिसरों लेबल करने के लिए पर्याप्त है। सुपर कॉम्पलेक्सेज़ डिटेटल डिटेटल (बढ़े हुए नहीं) को बढ़ाने के बाद दिखाई देते हैं। सीएन पृष्ठ के लिए, 20 μg ओ के दो नमूनेअलग-अलग मितोचोन्द्रिया से एफ प्रोटीन 3 से 8% सीएन जेल और अलग ( चित्रा 1 बी ) पर भरे गए थे। सीएन पेज Coomassie के साथ दाग था और प्रोटीन परिसरों की कल्पना करने के लिए मशगूल सीडी-आई के मोनोमर से अधिक आणविक भार वाले कई प्रोटीन परिसरों (डिजिटाइटी के विपरीत) को बढ़ाने के बाद ( चित्रा 1 बी , दाएं) दिखाई दिया। एएबी की सांद्रता ने सबसे बड़ी सुपर कॉम्पलेक्सेज़ के लिए अनुमति दी है जो सिर्फ अच्छी तरह से जेल में प्रवेश करती है हालांकि, 3% से कम एएएबी के ढाल के साथ समाप्त होने वाला एक जेल स्थानांतरण के लिए हेरफेर करने के लिए पर्याप्त नहीं है या बैंड या लेन का अनुमान लगाने के लिए पर्याप्त नहीं है। इसके अलावा, 3-8% सीएन जैल के ऊपरी हिस्से में एएबी की कम एकाग्रता प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की कुछ गतिशीलता को बनाए रखती है, जो महत्वपूर्ण है अगर देशी इलेक्ट्रोल्यूशन 19 पर विचार करना ।

मोनोमर्स और सीएक्स-आई के सुपर कॉम्प्लेक्स और मोनोमर, डिमर्स और सी के सुपर कॉम्प्लेक्सएक्सवी एंजाइमेटिक सक्रिय है और आईजीए ( चित्रा 1 सी- एफ ) द्वारा देखा जा सकता है। Assays बताते हैं कि, पृथक दिल में mitochondria, सीएक्स-आई और सीएक्स-वी प्रोटीन परिसरों में उनके संबंधित मोनोमोर्स से अधिक मौजूद हैं। सीएक्स-आई के लिए आईजीए परख में, एनएडीएच ऑक्सीकरण होता है और इलेक्ट्रॉनों को नाइट्रोब्रू टेट्राजोलियम को कम करने के लिए स्थानांतरित किया जाता है। इसका परिणाम सीएक्स-आई मोनोमर के आणविक वजन पर एक स्थानीय नीले रंग में होता है और सीएक्स-आई युक्त श्वसनमार्ग / सुपर कॉम्प्लेक्स ( चित्रा -1 सी ) होता है। सीएक्स-वी की गतिविधि एफ 1 सबयूनेट की हाइड्रोलाइज एटीपी की क्षमता से मूल्यांकन की जाती है और इसे सीएन या बीएन जैल ( चित्रा 1 डी- एफ ) का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रतिक्रिया से उत्पन्न एडीपी सीएक्स-वी मोनोमर्स, डिमर्स, सिन्थोसोम, और सब कॉम्प्लेक्स (सीएक्स-वी के सबसे ज्यादा असंतोषित एफ 1 भाग) के स्तर पर सफेद झुकाव में सीसा और परिणामों से संपर्क करता है। ध्यान दें कि एलिगोमोसिन एल को समाप्त करता हैइन बैंडों को दबाते हुए, पुष्टि करते हुए कि उन्हें सीएक्स-वी ( चित्रा 1 ई ) शामिल है।

यहाँ वर्णित सभी प्रयोगों के लिए, zvitterionic डिटर्जेंट, lauryl maltoside, 2 μg / 1 μg प्रोटीन की एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया था, जो उच्चतम संभव एकाग्रता है जो संगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम ( चित्रा 1 एफ ) प्रदान करते हुए supercomplexes को संरक्षित करता है। हालांकि, लॉरिल माल्टोसाइड की प्रभावशीलता बहुत संख्या, भंडारण की स्थिति और उम्र पर निर्भर करती है। इस प्रकार, एक प्रयोगशाला में प्रयुक्त सटीक एकाग्रता जरूरी नहीं है जैसा कि पांडुलिपियों में बताया गया है। डिटर्जेंट की उचित एकाग्रता, झिल्ली को सुलझाने पर परिसरों और सुपर-कॉम्प्लेक्स को बरकरार रखेगी और लौरिल माल्टोसाइड ( चित्रा 1 एफ ) की विविधता का उपयोग करके निर्धारित किया जाना चाहिए। सीएन पृष्ठ के लिए, प्रति व्यक्ति 40 μL का कुल नमूना मात्रा तैयारी कर रहा थायहां एड, जिसके परिणामस्वरूप 1 माइक्रोग्राम / 2 माइक्रोग्राम के प्रोटीन / डिटर्जेंट अनुपात या 1 माइक्रोग्राम / 1 μL (1.9 एमएम के बराबर) के डिटर्जेंट / बफर अनुपात में पैदा होता है। 40 μL से 30 μL मिनी-जेल के प्रति अच्छी तरह लागू किया गया था; शेष वीडीएसी, एक लोडिंग कंट्रोल ( चित्रा 2 डी ) की पहचान के लिए एक विभाजक के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

Immunoblotting के लिए, CN बीएन पृष्ठ के लिए पसंद किया जाता है क्योंकि प्रोटीन Coomassie के साथ नहीं भरा है, जो एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने में हस्तक्षेप कर सकते हैं। चित्रा 2 चित्रा 2 सीक्स-आई और सीएक्स-वी प्रोटीन एनडीएफबी 6 और एटीपी 5 ए को पृथक दिल, यकृत, और मस्तिष्कशोथ से युक्त supercomplexes का पता चलता है। हस्तांतरण के बाद पोंसेऊ एस लेबलिंग और इम्यूनोबलॉटिंग का उपयोग आणविक वजन चिह्नकों को चिह्नित करने और प्रोटीन लोडिंग ( चित्रा 2 ए ) के लिए नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है। यह नाईट्रोसेल्यूल पर ईटीसी के प्रोटीन परिसरों के मोनोमर्स को कल्पना करेगाया झिल्ली, लेकिन पोंसेऊ एस लेबलिंग हमेशा मिटोकॉन्ड्रियल सुपर कॉम्प्लेक्सस ( चित्रा 2 ए ) के दृश्य के लिए पर्याप्त नहीं है, जिसे इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

Cx-I dimers और tetramers में इकट्ठा नहीं है, प्रति है, लेकिन Cx-III और Cx-IV 14 , 20 , 21 के साथ अधिक उच्च आणविक वजन सुपरcomप्लेक्स के रूप में। यहां, एनडीएफबी 6 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करने से पता चलता है कि दिल से नमूना में अधिक सीएक्स-ए मोनोमर और उच्च आणविक वजन सुपर कॉम्प्लेक्स (शीर्ष बैंड) होता है जो यकृत या मस्तिष्क ( चित्रा 2 बी ) से मिटोकोंड्रिया होता है। मधुमेह रेजिरासोमिक सुपरकमप्लेक्स की मात्रा अन्य ऊतकों ( चित्रा 2 बी ) की तुलना में हृदय में बहुत अधिक थी।

एंटी-एटीपी 5 ए एंटीबॉडी का उपयोग करना,सीएक्स-वी के मोनोमर्स मिटोकोंड्रिया में सभी ऊतकों से पहचाने जाते हैं, जबकि डिमर्स (डी) और बड़े सुपर कॉम्प्लेक्सिस (एससी) के बैंड के एक विशिष्ट पैटर्न, जो हृदय मितोचोनड्रिया में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, यकृत और मस्तिष्क में मित्सुबिन्द्रिया चित्रा 2 सी ) Immunoblot के Overexposure (1 मिनट बनाम 20 एस) से पता चलता है कि सीएक्स-वी युक्त सुपर कॉम्पलेक्सेज़, जो टेट्रामर्स और सिंथेसाम्स ( चित्रा 2 सी ) का प्रतिनिधित्व कर सकता था। दिल, यकृत, और मस्तिष्कशोथ में सीएक्स-वी युक्त प्रोटीन परिसरों के ये पैटर्न ऊतक-विशिष्ट हो सकते हैं और अभी तक इसका पता नहीं लगाया गया है।

चित्रा 2 डी में दिखाए गए अनुसार इन ब्लोटों के प्रोटीन लोडिंग को एसडीएस पेज द्वारा पोंसेऊ एस स्टेंसिंग और उपर्युक्त विभाजित करने के वीडीएसी का पता लगाया जा सकता है।

सभी एंटिबो नहींदेशी पृष्ठ के बाद एक प्रोटीन जटिल के चतुर्भुज या तृतीयक संरचना के भीतर एक प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं। इस समस्या को दूर करने के लिए, मूल जेल से पूरे और आंशिक लेन एक दूसरे आयाम (2 डी जैल, एक प्रदर्शन के लिए संदर्भ 13 देखें) के लिए एक डेल्टिंग जेल पर रखा जा सकता है। 2 डी वैद्युतकणसंचलन एक सुपरमौलिक्यूलर कॉम्प्लेक्स में प्रोटीन को देखने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। हालांकि, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, सुपर-कॉम्प्लेक्सेज़ चर मात्रा में मौजूद हैं, और सुपर कॉम्पलेक्सेज़ से अलग-अलग प्रोटीन का संकेत दूसरे में चित्रित करने में मुश्किल हो सकता है, डिप्लेयरिंग आयाम। इस समस्या पर काबू पाने के लिए, मूल जैल से प्रोटीन परिसरों के विद्युतीकरण का उपयोग यहां किया गया था। यह कई लेन से सुपर-कॉम्पलेक्स बैंड को अलग-अलग अध्ययन के लिए और अधिक सामग्री बनाने के लिए अलग करता है।

इलेक्ट्रोल्यूशन का उपयोग करते समय, केवल ब्याज का बैंड, जिसे आईजीए द्वारा पहचाना गया है और / या बीएन पृष्ठ पर विज़ुअलाइज़ किया गया है, यहised; जेल के इस टुकड़े से प्रोटीन आगे जेल से अलौकिक द्वारा शुद्ध किया जाता है। चित्रा 3 ए एक बीएन पृष्ठ का एक लेन दिखाता है जिसमें से मोनोमर का प्रतिनिधित्व करने वाले बैंड इलेक्ट्रोलाशन के लिए उत्सुक थे। इलेक्ट्रोलाउशन के बाद मोनोमर के सीएक्स-वी गतिविधि का आकलन करने के लिए, एल्यूट दूसरे सीएन पृष्ठ पर लागू किया गया था। मोनोमर के eluate अभी भी enzymatically सक्रिय सीएक्स-वी, लेकिन subcomplexes भी दिखाई देते हैं ( चित्रा 3 बी )। देशी सीएन पृष्ठ ( चित्रा -3 सी ) या एसडीएस पेज ( चित्रा 3 डी ) को दर्शाने के बाद रजत की धुंधला हो जाना एटपीट में प्रोटीनों की उपस्थिति को इंगित करता है, और एटीपी 5 ए के खिलाफ इम्यूनोब्लॉटिंग दोनों नमूने ( चित्रा 3 डी ) में सीएक्स-वी की मौजूदगी का संकेत देता है।

आकृति 1
चित्रा 1: मिचोक का विज़ुअलाइज़ेशनऑनडियल सुपरकॉम्प्लेक्सेस ( ए ) 4-10% बीएन मैक्सी-जेल के दो लेन, पृथक हृदय मिटोकोंड्रिया के नमूनों के साथ। एक ही नमूना के अलंकट दोनों लेन में चल रहे थे, प्रति 100 ग्राम प्रोटीन प्रति अच्छी तरह से। ईटीसी के प्रोटीन परिसरों के I, II, III, IV, और V के मोनोमर स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं और जेल के दायरे के लिए लेबल किए जाते हैं। ( बी ) हृदय मिटोकोंड्रिया (1 और 2, 20 माइक्रोग्राम प्रोटीन / लेन) के दो नमूनों को सीएन पृष्ठ पर अलग किया गया और कूमेसी स्टैनिंग द्वारा देखा गया। अनुसूचित जाति जेल के ऊपरी भाग (क्षेत्र लाल तीरों द्वारा इंगित किया गया है) की बढ़ाई और डिजिटल वृद्धि के बाद supercomplexes की स्थिति को इंगित करता है। ( सी ) 20 माइक्रोग्राम माइइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन 3-8% सीएन पृष्ठ पर अलग हो गए थे और सीएक्स-आई आईजीए के लिए संसाधित किया गया था। भव्य और डिजिटल रूप से बढ़ायी गई छवियां सीएक्स-आई रिएक्शन उत्पाद के बैंड प्रदर्शित करती हैं ( डी ) 20 माइक्रोग्राम मिटोचोनड्रियल प्रोटीन 3-8% बीएन पृष्ठ पर अलग हो गए और सीएक्स-वी आईजीए के लिए प्रोसेस किया गया। magnifi एड और डिजिटल रूप से बढ़ाई गई छवियां सीएक्स-वी रिजेक्शन उत्पाद के बैंड प्रदर्शित करती हैं। ( ई ) 50 μg मिटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन 5-15% सीएन पृष्ठ पर अलग किया गया था और (-) बिना सीएक्स-वी IGA के लिए प्रोसेस किया गया था और (+) 5 माइक्रोग्राम / एमएल ओलिगॉमीसीन (ओलिगो) के साथ। ( एफ ) मिटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (20 माइक्रोग्राम / लेन) को 2-6 μg लौरिल माल्टोसाइड / 1 माइक्रोग्राम प्रोटीन के साथ सुलझाया गया था, जैसा कि जेल के शीर्ष पर दिखाया गया है, और 3-8% सीएन जेल पर सीएक्स- वी आईजीए सभी छवियों को या तो एक लाइट टेबल ( ए - सी ) या एक काले रंग की सतह ( डी - एफ ) का उपयोग करके खींचा गया था। कैमरा विनिर्देश सामग्री की तालिका में हैं आणविक वजन चिह्नकों (मेगावाट) का स्थान सभी पैनलों के बाईं तरफ इंगित किया गया है। संकेताक्षर: डी = डिमर; एफ 1 * = सीएक्स-वी के सबकमप्लेक्स; एलएम = लौरिल माल्टोसाइड; एम = आणविक भार मार्कर; एम = मोनोमर्स; एससी = सुपरकमप्लेक्सG1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Immunoblotting द्वारा मिटोकॉन्ड्रियल सुपरकॉम्प्लेक्स की जांच। हृदय (एच), लीवर (ली), और मस्तिष्क (बी) मिटोकोंड्रिया से 20 माइक्रोग्राम प्रोटीन को 3-8% सीएन पृष्ठ पर अलग किया गया था और नाइट्रोकेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया था। ( ए ) झिल्ली के पोंसेऊ एस धुंधला हो जाना प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और आणविक वजन मार्कर (एम) की उपस्थिति दर्शाता है। नीले तीर जेल के शीर्ष पर इंगित करता है ( बी ) सीएक्स-आई प्रोटीन, एनडीएफबी 6, (ए) (1 मिनट के एक्सपोज़र समय) में दिखाए गए दाग पर immunolabeled था। ( सी ) सीएक्स-वी को एंटी-एटीपी 5 ए एंटीबॉडी (20 एस और 1 मिनट का एक्सपोजर, जैसा कि संकेत दिया गया) के साथ देखा गया था। (बी) में लाल तीर और (सी) क्षेत्र को बढ़ाया और डिजिटली रूप से विज़ुआ के लिए बढ़ाया गया हैसीएक्स-आई- और सीएक्स-वी युक्त सुपर कॉम्पलेक्सस का ढक्कन, और जेल के शीर्ष पर नीले तीर अंक। ( डी ) पोंसेऊ एस और (ए), (बी), और (सी) में उपयोग किए गए प्रत्येक निकालने के वीडीएसी विभाज्य के immunolabeling, जो एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और नाइट्रो सेलुलोज को स्थानांतरित कर दिया गया था। संकेताक्षर: एम = सीएक्स-आई या सीएक्स-वी के मोनोमर्स, सी = सीएक्स-वी के डीआर, एससी = सीएक्स-आई या सीएक्स-वी युक्त सुपर कॉम्पलेक्स इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: सीएक्स-वी के इलेक्ट्रोलायटेशन ( ए ) एक एमआईटीओकोड्रियल नमूने का बीएन पृष्ठ। बॉक्स्ड बैंड सीएक्स-वी के मोनोमर का प्रतिनिधित्व करता है जिसे उत्तेजित किया गया और इलेक्ट्रोला्यूट किया गया था। ( बी ) ईएलयूई सीएन पेज के अधीन था, और सीएक्स-वी के बाद के आईजीए मोनोमर्स (एम) को दर्शाता है,और सीक्स-वी के एफ 1 युक्त उप-समीक्षकों ( सी ) ईएलयूईट के सीएन पृष्ठ का रजत का धुंधला मोनोमर (एम) दर्शाता है। ( डी ) सिल्वर डाइडेस्किल सल्फेट (एसडीएस) के एटीपी 5 ए के एटीपी 5 ए (दाएं पैनल) के लिए रजत ब्लेंसिंग (बाएं पैनल) और इम्यूनोबलॉट सीएक्स-वी की मौजूदगी का संकेत देता है एसडीएस पेज के लिए, कृपया कहीं और प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

मिटोकॉन्ड्रियल एटीपी पीढ़ी के लिए एक कार्यात्मक ईटीसी आवश्यक है। ईटीसी के परिसरों में दो प्रकार के सुपर कॉम्प्लेक्स हैं: श्वसनसॉम्स (सीएक्स-आई, -III, और -IV) 1 और सिंथेसाम्स (सीएक्स-वी) 2 । प्रत्येक कॉम्प्लेक्स की विधानसभा एक अनिवार्य ईटीसी के लिए आवश्यक होती है, जबकि इटसी के सुपर कॉम्पलेक्स में संगठन को समग्र ईटीसी दक्षता 5 , 22 को बढ़ाने के लिए माना जाता है। ये सुपर-कॉम्प्लेक्स कैसे इकट्ठा और अलग करना ठीक नहीं है, लेकिन यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन प्रक्रियाओं की बेहतर समझ पाने की अनुमति दे सकते हैं।

ईटीसी विधानसभा के अध्ययन की प्रमुख चुनौती इन प्रोटीन परिसरों का आकार है। उदाहरण के लिए, mitochondrial respirasom में सीएक्स-आई (लगभग 880 केडीए) और सीएक्स -3 (460 केडीए) और सीएक्स -4 (200 केडीए, एक डिमर के रूप में सक्रिय) के एक या एक से अधिक अणु शामिल हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक आणविक के साथ एक सुपर कॉम्प्लेक्स के बारे में के वजन2,000 केडीए इसके अलावा, सीएक्स-वी के बारे में 600 केडीए का आणविक भार है, लेकिन डिमर्स, टेट्रमर्स, ओलिगोमर्स और डिमर्स 7 , 23 के रिबन में इकट्ठा करने के लिए दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप कम से कम 2,000 केडीए के आणविक वजन वाले सुपर कॉम्पलेक्सेज़ इन सुपर कॉम्पलेक्सेज के विशाल आकार को देखते हुए, इस प्रयोगशाला द्वारा और इनके द्वारा 8 , 14 , 24 के द्वारा इन सुपर कॉम्पलेक्सेज़ की पहचान करने और इनकी पहचान करने के लिए कई आंशिक रूप से संबंधित तरीकों का उपयोग पारंपरिक रूप से किया गया है।

इस काम ने देशी जेल पेज की तकनीक का प्रदर्शन किया है, जहां हल्के डिटर्जेंट का उपयोग करते हुए सक्रिय प्रोटीन परिसरों को धीरे-धीरे मिटोकॉन्ड्रियल झिल्ली से निकाला जाता है। परिसरों मुख्य रूप से उनके आकार और आंतरिक प्रभार (सीएन पृष्ठ) या प्रोटीन बाउंड कॉमॉसी नीले (एनएन पृष्ठ) के आकार और नकारात्मक चार्ज के कारण जैल में पलायन करते हैं। इन जैल सी का उपयोग कर दाग किया जा सकता हैओमोसी नीली ( जैसे, सीएन जैल में) या चांदी के दाग ( जैसे, बीएन और सीएन पृष्ठ में) प्रोटीन बैंड प्रकट करने के लिए।

लुरीइल माल्टोसाइड का प्रयोग यहां प्रदर्शित प्रयोगों के लिए किया गया था क्योंकि यह डिटर्जेंट सबसे अधिक मज़बूती से काम किया था वैकल्पिक रूप से, डिजीटोनिन का उपयोग प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 12 को निकालने के लिए किया जा सकता है। वयस्क हृदय, यकृत, और दिमाग से पृथक मिटोकोंड्रिया से डेटा यहां दिखाया गया है, लेकिन इन तकनीकों को भ्रूण और वयस्क दिल homogenates 8 पर किया गया है। दूसरों ने इस तकनीक को सुसंस्कृत कोशिकाओं 24 से पृथक मिटोकोंड्रिया का उपयोग करते हुए किया है। हालांकि, उच्च ऊतक डीएनए सामग्री के साथ ऊतक होमोजनेट या सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करते समय, इलैक्ट्रोफोरेसीस 25 के दौरान खरोंच को रोकने के लिए न्युकेल को जोड़ना उपयोगी हो सकता है।

सीएक्स-आई और सीएक्स-वी के लिए अलग-अलग कॉम्प्लेक्स की गतिविधियों को सीधे जेल में देखा जा सकता है, और टीसीसीसीएनजी -2, -III और -IV 12 की गतिविधियों की जांच के लिए मुख्यालय भी उपलब्ध हैं हालांकि, इन आईजीए का विश्लेषण करना सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। सबसे पहले, एंजाइमी प्रतिक्रिया गैर- ETC एंजाइम या अपूर्ण इकट्ठे परिसरों के कारण हो सकती है। उदाहरण के लिए, एक समानांतर जेल के साथ सीएक्स-वी आईजीए प्रदर्शन करने के लिए यह नियमित होता है जिसे बरकरार सीएक्स-वी ( चित्रा 3 ) को बाधित करने के लिए ओलिगॉमीसीन के साथ इलाज किया गया है। इसके अलावा, अन्य एनएडीएच ऑक्सीडेज सीएक्स-1 इन जेल गतिविधि के लिए खाते हैं। कोई सीएक्स-आई अवरोधक की उपस्थिति में समानांतर आईजीए प्रदर्शन कर सकता है, जैसे कि रोटोनोन हालांकि, चित्रा 1 में , पृथक मिटोकोंड्रिया का उपयोग किया गया था, इसलिए साइटोप्लाज्मिक एनएएडीएच ऑक्सीडेज मौजूद नहीं थे; इस प्रकार, डेटा सबसे अधिक संभावना Cx-I युक्त मोनोमर्स और सुपर कॉम्प्लेक्सेस का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, तस्वीरों या स्कैन पर बैंड के संकेत तीव्रता को मापने के द्वारा इन परिणामों की मात्रा का ठहराव संभव है। इस दृष्टिकोण में कमी के बीच अंतर और बीच में शामिल हैंजैल के अंदर, प्रतिक्रिया उत्पाद की गतिशीलता, जेल की गहराई में उत्पाद को पर्याप्त रूप से मापने में असमर्थता, और प्रतिक्रिया की संभावित गैर-रैखिकता 27 । उत्तरार्द्धों को दूर करने के लिए, कुछ लोगों ने धारावाहिक तस्वीरों का उपयोग करते हुए प्रतिक्रियाओं की दरों को प्राप्त करने का सुझाव दिया है, लेकिन ये यहां की कोशिश नहीं की गई है।

देशी जैल में प्रोटीन को झिल्ली में स्थानांतरित किया जा सकता है, और बैंड की प्रोटीन संरचना को इम्यूनोब्लॉटिंग (यहां प्रदर्शित किया गया) या 2 डी पृष्ठ (संदर्भ 13 में दिखाया गया) द्वारा जांच की जा सकती है। ईटीसी परिसरों के मोनोमर्स को पारंपरिक रूप से अलग-थलग मितोचोन्द्रिया के देशी जैल, जेल में उनका स्थान, और आणविक मार्कर प्रोटीन ( चित्रा 1 ) के सापेक्ष उनकी स्थिति में उनके बहुतायत से पहचान की गई है। इसके अलावा, विभिन्न परिसरों के उप-इकाइयों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ आने वाले इम्युनोब्लॉट का लेबलिंग जटिल और संरचना की पहचान करने में मदद करता हैसुपर कॉम्पलेक्सस का इसलिए, एनडीयूडीबी 6 और-एटीपी 5 ए के अनुक्रम क्रमशः सीएक्स-1 और सीएक्स-वी वाले मोनोमर्स और सुपर कॉम्पलेक्सेज को पहचानते हैं, जैसा कि यहां दिखाया गया है। सीएनजी -2 से IV तक एंटीबॉडी एक ही उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ मामलों में, एंटीबॉडी जो अच्छी तरह से काम करने वाले जैल में काम करते हैं, वे मूल जैल में अच्छी तरह से काम नहीं कर सकते हैं, क्योंकि यह तथ्य है कि कुछ एंटीबॉडी विकृत प्रोटीन के लिए विशिष्ट हैं या एक सम्मिलित पैतृक परिसर के अन्य प्रोटीनों द्वारा नकाबपोश किया जा सकता है।

इन सुपर-कॉम्प्लेक्स के आणविक वजन का सटीक निर्धारण मुश्किल है, क्योंकि अधिकांश उपलब्ध आणविक वजन मार्कर सीएक्स-वी मोनोमर के आकार से नीचे हैं। देशी जेल में प्रोटीन परिसरों का प्रवास आकार, आंतरिक प्रभार और डिटर्जेंट पर निर्भर करता है जो 28 का इस्तेमाल करता है। उदाहरणों में, परिसरों के मोनोमर्स की पहचान जैल, मार्कर और इम्यूनोब्लॉटिंग के आधार पर की गई थी। सीएक्स-वी के दीमर्स को सीएक्स-आई और वी के मोनोमर्स और इम्युनो की तुलना में सापेक्ष माइग्रेशन के आधार पर पहचाना गया।सोख्ता। जैल, आईजीए, और इम्यूनोबलॉट्स में मोनोमर्स और डिमर्स के ऊपर सब कुछ सुपर कॉम्पलेक्सेज़ माना जाता है।

मूल तकनीकों का उपयोग करते हुए बैंड घनत्व का विश्लेषण करके मूल इम्यूनोब्लॉट्स को सुपर कॉम्पलेक्सेज़ के लिए भी मापा जा सकता है। यह विधि यहाँ नहीं दिखाया गया था, लेकिन एक हालिया प्रकाशन इस तकनीक को 8 दर्शाता है प्रोटीन लोडिंग का सामान्यकरण लेन के पोंसेऊ लाल धुंधला का उपयोग करके किया जा सकता है या मिटोकॉन्ड्रियल निकालने का एक नमूना बचाकर वीडीएसी बैंड के घनत्व को मापने के लिए इम्यूनोबलॉट ( चित्रा 2 ए और डी ) पर किया जा सकता है। इसके अलावा, एक ही इम्यूनोबलॉट में सुपर कॉम्पलेक्स के अनुपात की जांच करना बैंड घनत्व को मापने का एक और तरीका है, लेकिन एक को ब्लोट विकास के दौरान अलग-अलग समय पर चित्र लेने के लिए सावधान रहना चाहिए ताकि बैंड अधिक से अधिक न हो।

अंत में, देशी जैल से बैंड को प्योरीफी बनाने के लिए इलेक्ट्रोलाइट किया जा सकता हैडी, सक्रिय प्रोटीन परिसरों जो उच्च-क्रम परिसरों में इकट्ठा हो सकते हैं और जटिल कार्य के आगे के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सीएक्स-वी मोनोमर पहले बिजली की कार्यक्षमता 29 प्रदर्शित करने के लिए लिपोसॉम्स में इलेक्ट्रोलाइट और पुनर्गठन किया गया था। देशी इलेक्ट्रोल्यूशन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आस-पास के बफर 16 में निष्क्रिय प्रसार द्वारा क्षीणन है, लेकिन यह मूल इलेक्ट्रोलाउशन की तुलना में धीमी है। अंत में, विद्युतचलन के साथ एक बड़ी समस्या इलेक्ट्रोलाइट प्रोटीन परिसर के एंजाइमिक फ़ंक्शन को बनाए रखती है, क्योंकि जटिल शुद्धिकरण के दौरान अलग हो सकता है। इसलिए, इस तकनीक के अलगाव के बाद किसी भी कार्य के किसी भी परख को कड़ाई से जांचना होगा।

एंजाइमेटिक एसेज और ऑक्सीजन की खपत माप के साथ इन प्रोटोकॉल के संयोजन से, जो व्यक्तिगत ईटीसी परिसरों के कार्य की जांच करते हैं और पूरे ईटीसी 30 की गतिविधि और अन्य मेथऑड्स, जैसे क्रिस्टलोग्राफिक 31 और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म 32 परिसरों और सुपर कॉम्पलेक्सेज की संरचना का मूल्यांकन, ईटीसी के आंतरिक कामकाज की एक पूर्ण चित्र और उभरा है। हम यह समझने के करीब हैं कि परिसरों को इकट्ठा कैसे किया जाता है, कैसे इलेक्ट्रॉनों को श्रृंखला के नीचे प्रवाह होता है और एडीपी बनाने के लिए सीएक्स-वी के माध्यम से मैट्रिक्स में वापस प्रवाह करते हुए प्रोटॉन को झिल्ली में पंप किया जाता है। निस्संदेह, इन तकनीकों को ईटीसी की संरचना, कार्य और गतिशील विनियमन के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए और परिष्कृत किया जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के संस्थापक के संबद्ध [12GRNT12060233] और रोचेस्टर विश्वविद्यालय में मजबूत बच्चों के अनुसंधान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

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References

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जैव रसायन अंक 124 मितोचोन्द्रिया इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला श्वसनसूत्र सिंथेसाम्स स्पष्ट देशी वैद्युतकणसंचलन इन-जेल एशेज इलेक्ट्रोल्यूशन
मूल विलासितालयों, इन-जेल एसेज़ और इलेक्ट्रोलाउशन के साथ मिटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन के सुपरकॉम्प्लेक्सेस का विश्लेषण करना
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Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

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