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Biochemistry

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

Abstract

미토콘드리아 전자 수송 사슬 (ETC)은 다양한 연료의 분해로 인해 생성 된 에너지를 세포의 ATP 인 생물 에너지로 변환시킵니다. ETC는 respirasomes (CI, C-III, C-IV) 및 전자 전달 및 ATP 생산의 효율성을 증가시키는 synthasomes (CV)라고 불리는 supercomplexes로 조립되는 5 개의 거대한 단백질 복합체로 구성됩니다. ETC 기능을 측정하기 위해 50 년 이상 다양한 방법이 사용되었지만 이러한 프로토콜은 개별 복합체와 수퍼 콤플렉스의 조립에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 ETC 복잡한 구조를 연구하기 위해 20 년 이상 전에 수정 된 방법 인 고유 겔 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE) 기술을 설명합니다. 네이티브 전기 영동으로 ETC 복합체를 활성 형태로 분리 할 수 ​​있으며,이 복합체는 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔화 분석 (IGA) 및 전기 분해로 정제 할 수 있습니다. 다시 조합하여네이티브 젤 PAGE와 다른 미토콘드리아 분석 결과를 비교해 보면 ETC 활동, 동적 인 조립 및 분해, 그리고 이것이 미토콘드리아 구조와 기능을 어떻게 조절하는지에 대한 완성도를 얻을 수 있습니다. 이 작품은 또한 이러한 기술의 한계를 논의 할 것입니다. 요약하면, 네이티브 PAGE 기술은 면역 블로 팅, IGA, 전기 분해가 뒤 따르는 것으로 미토콘드리아 ETC 수퍼 콤플렉스의 기능과 구성을 조사하는 강력한 방법입니다.

Introduction

ATP 형태의 미토콘드리아 에너지는 세포 생존에 필수적 일뿐만 아니라 세포 사멸의 조절에도 필수적이다. 산화 적 인산화에 의한 ATP의 생성에는 기능적 전자 전달 사슬 (ETC, Cx-1 내지 IV) 및 미토콘드리아 ATP 신타 제 (Cx-V)가 필요하다. 최근의 연구에 따르면 이러한 큰 단백질 복합체는 respirasomes 및 synthasomes 1 , 2 라고 불리는 수퍼 콤플렉스로 구성되어 있습니다. 이러한 대규모 단지와 수퍼 콤플렉스의 조립, 역학 및 활동 규제를 분석하는 것은 어려운 일입니다. 분광 광도계를 사용하여 수행 한 산소 전극 및 효소 분석으로 얻은 산소 소비 측정은 ETC 복합체 활성에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있지만이 분석법은 관련된 단백질 복합체 또는 수퍼 콤플렉스의 존재, 크기 및 하위 구성에 관한 정보를 제공 할 수 없습니다. 그러나, 청색 및 투명한 천연 (BN 및 CN) PAGE 3 은 복잡한 구성 및 조립 / 해체에 대한 중요한 정보와 생리 및 병리학 적 조건 하에서 이들 중요한 호흡 복합체의 초분자 조직의 동적 조절에 대한 강력한 도구를 창출했습니다.

이러한 복합체를 고차 수퍼 콤플렉스로 조립하면 미토콘드리아 구조와 기능을 조절하는 것으로 보인다 5 . 예를 들어 respirasome assembly는 전자 이동의 효율과 미토콘드리아 내부 막을 가로 지른 양성자 원동력의 생성을 증가시킵니다 5 . 또한, synthasomes의 조립은 ATP 생산의 효율과 세포질 2 로의 에너지 등가물의 전달을 증가시킬뿐만 아니라 미토콘드리아 내부 막을 관상의 cristae 6 로 몰드시킨다 </ sup> 7 . 마우스 배아에서 심장 발달 중 supercomplex assembly에 대한 연구는 심장에서 Cx-I- 함유 supercomplexes의 생성이 대략 배아 일 13.5 8 에서 시작한다는 것을 보여준다. 다른 사람들은 노화 또는 허혈 / 재관류 손상으로 인해 Cx-I- 함유 수퍼 콤플렉스의 양이 심장에서 감소하거나 신경 퇴행성 질환의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다 11 .

이 프로토콜은 ETC 복합체 및 supercomplexes의 조립 및 활동을 조사하는 데 사용할 수있는 원시 젤 페이지에 대한 방법을 설명합니다. 미토콘드리아 supercomplexes의 대략 분자량은 CN 또는 BN polyacrylamide 젤에 단백질 복합체를 분리하여 평가할 수 있습니다. CN PAGE는 또한 겔에서 직접적으로 모든 미토콘드리아 복합체의 효소 활성을 시각화합니다 (in-gel assay;IGA) 12 . 이 연구는 IGA를 통해 NADH를 산화시키는 Cx-I의 능력과 IGA에 의한 Cx-V의 ATP 가수 분해 활성으로 인한 신타 소솜의 존재를 강조함으로써 호흡기 활동을 입증합니다. Cx-I 및 Cx-V를 함유 한 복합체 및 수퍼 콤플렉스는 또한 단백질을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 면역 블로 팅을 수행함으로써 입증 될 수있다. 이 방법의 장점은 일반적으로 BN 또는 CN PAGE가 생리 학적 크기 및 조성을 기반으로 단백질 복합체를 분리한다는 점입니다. 멤브레인으로의 전달은 이러한 밴드 패턴을 보존합니다. BN 또는 CN PAGE에서 단백질 복합체를 분석하는 것은 2D-PAGE (Fiala 등 13 참조) 또는 자당 밀도 원심 분리 14 , 15 를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 특정 밴드를 추가로 분석하기 위해 BN PAGE에서 추출 할 수 있으며이 단백질 복합체의 단백질을 정제 할 수 있습니다d. 네이티브 전기 분해는 몇 시간 내에 수행 될 수 있는데, 이것은 겔로부터 주변 완충액으로의 단백질의 수동 확산 (참조 문헌 16에서 사용 된 바와 같이)에 상당한 차이를 만들 수있다.

요약하면, 이들 방법은 미토콘드리아 막으로부터의 고 분자량 수퍼 콤플렉스의 추가 특성 결정을 가능하게하는 몇 가지 접근법을 기술한다.

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Protocol

모든 실험은 C57BL / 6N 마우스 (야생형)의 심장을 사용하여 수행 하였다. 쥐는 자궁 경부 전위 이전에 이산화탄소로 마취되었고, 모든 절차는 로체스터 대학의 실험실 동물 의학부에 따라 주법, 연방 법령 및 NIH 정책에 따라 엄격하게 수행되었다. 의정서는 로체스터 대학 동물 동물 보호 및 사용위원회 (동물 자원위원회)의 승인을 받았습니다.

1. CN 및 BN 페이지

참고 : BN 및 CN PAGE에 사용되는 모든 장비는 세제가 없어야합니다. 이것을 보장하기 위해 모든 장비를 0.1M 염산으로 씻은 다음 탈 이온화 된 H 2 O로 광범위하게 헹구십시오.

  1. 예비
    1. 4 ° C에서 25 MM imidazole, pH 7.0으로 구성된 양극 완충액을 준비하십시오. 4 ° C에서 보관하십시오.
    2. CN 또는 BN PAGE 용 음극 완충액을 준비하십시오.
      1. CN PAGE의 경우 7.5 mM imidazole과 50 mM tricine을 사용하십시오. 1 리터의 완충액에 sodium deoxycholate 0.5g과 lauryl maltoside 0.2g을 넣는다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
      2. BN PAGE의 경우, 7.5 mM imidazole과 50 mM tricine을 사용하고 4 ℃에서 7.0으로 pH를 조정한다. 4 ° C에서 보관하십시오.
      3. 하늘색 BN 음극 완충액의 경우, 7.5 mM imidazole과 50 mM tricine을 사용하십시오. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 완충액 1 리터당 20 mg의 쿠마시를 첨가한다. 4 ° C에서 보관하십시오.
    3. 50 MM NaCl, 50 MM 이미 다졸, 2 MM aminocaproic 산성 및 1 MM EDTA로 추출 버퍼 (EB)를 준비합니다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    4. 75 MM 이미 다졸과 1.5 M 아미노 카프로 산과 함께 3X 젤 버퍼 (BN 및 CN 젤에 사용)를 준비합니다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    5. 0.01g의 Ponceau S, 5g의 글리세롤, 5mL의 H 2 O 로딩 완충액 (LB)을 준비하십시오.온도.
    6. 500 mM 6- 아미노 헥산 산 1 mL에 50 mg의 쿠마시를 첨가하여 쿠마시 블루를 준비한다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    7. H 2 O에서 20 mM과 200 mM 라 우릴 말 토 시드를 준비한다. 분량을 200 μL로하여 냉동 보관한다. 사용하기 전에 세제를 해동하십시오.
3 % ~ 8 % (미니) 4 % ~ 10 % (맥시)
0.5 젤 (밝은) 0.5 젤 (무거운) 0.5 젤 (밝은) 0.5 젤 (무거운)
AAB (mL) 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN 완충액 (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H2O (mL) 2.7 1.4 14 6.3
글리세롤 (g) 0 0.47 0 2.5
부피 (mL) 4.72 4.77 25 세 25 세
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

표 1 : 미니 또는 맥시 (Maxi-PAGE) 1 개를 주입 할 때 필요한 성분의 양. 이 표에 사용 된 부피는 1 최소 또는 최대 맥 1 겔, 1.5 mm 두께로 계산됩니다. AAB의 부피는 40 % 저장 용액을 기준으로합니다. 가볍고 무거운 것이 집중자를 가리킨다.AAB의 이온. 그라디언트 믹서의 각 컬럼을 AAB 용액으로 채운 후에 APS 및 TEMED를 첨가한다.

  1. 쏟아져 흐르는 젤
    참고 : CN 또는 BN 젤에 3-8 % 또는 4-10 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (AAB) 그라디언트를 각각 사용하십시오. 표 1 은 미니 젤 (폭 85mm x 높이 73mm x 두께 1.5mm) 또는 맥시 겔 (160mm) 용으로 사용 된 완충액, AAB, H 2 O, 글리세롤, 암모늄 퍼 술 페이트 (APS) 및 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED) 폭 x 높이 200 mm x 두께 1.5 mm). CN 또는 BN 겔을 사용한 유리판 어셈블리는 1x 젤 버퍼가 몇 mL 인 백에서 냉장 보관하거나 저장 용 1x 겔 버퍼로 적신 페이퍼 타월로 싸서 보관할 수 있습니다. 젤은 최대 일주일 동안 사용하기에 안정적입니다.
    1. 겔을 부어 넣으려면 겔이 중력에 의해 준비된 젤 챔버로 흐를 수 있도록 상승 된 교반 판에 그라디언트 믹서를 놓습니다.
    2. 그라디언트 믹서의 유출 챔버를 4.77 / 25 mL로 채우십시오 (미니 / 맥시) (AAB의 농도가 더 높음).
    3. 가볍고 가벼운 챔버 사이의 스톱 코크 연결부를 부드럽게 열고 한 방울의 용액이 다른 쪽을 통과하도록하십시오.
      참고 : 이것은 연결 튜브와 스톱 콕에서 공기 방울을 밀어내어 두 챔버 사이의 흐름을 막습니다. 동등한 압력으로 버블이 움직이는 것을 막을 수 있기 때문에 양측이 이미 채워져 있다면이를 수행 할 수 없습니다.
    4. 그라디언트 믹서의 다른 챔버를 4.72 / 25 mL (mini / maxi)의 가벼운 용액으로 채 웁니다.
    5. 무거운 솔루션과 유출 챔버에 저어 막대를 놓고 감동 시작. 버블 링을 일으키지 않는 교반 막대 속도를 사용하십시오.
    6. 각 chamber에 APS와 TEMED를 신속하게 첨가하여 중합을 시작하십시오.
    7. 그라디언트 믹서의 두 챔버 사이의 연결을 열고 유출 챔버를 열기 전에 젤을 부어 수 초 동안 혼합을 허용하십시오.
      참고 : Gravity wi두 챔버 모두 똑같이 배수하고, 무거운 용액에 빛을 혼합하면 아크릴 아마이드 밀도가 겔의 바닥에서 상단으로 서서히 감소합니다. 그라디언트 믹서에있는 전체 내용물을 사용하여 젤을 부으십시오.
      1. 마지막에 조심스럽게 빗을 넣고 거품과 섞임을 피하기 위해 겔을 넣으십시오.
    8. 즉시 에탄올로 그라디언트 믹서를 씻어 젤을 헹구십시오. 물로 헹구고 두 번째 젤을 부으십시오. 겔을 중합 시키십시오 (보통 mini-gel에는 20 분 미만이 필요합니다).
    9. 젤을 실행하려면 전극 어셈블리 클램프에 장착하고 중앙 또는 상부 챔버를 CN 또는 연한 파란색 BN 음극 완충액으로 채 웁니다. 외부 / 하부 챔버에 양극 버퍼를 추가하기 전에 누출 여부를 확인하기 위해 몇 분 기다립니다.
      1. 부드럽게 잘 빗을 꺼내 주사기 또는 피펫을 사용하여 음극 버퍼와 우물을 씻으십시오.
      2. 차가운 방 (4 ° C)에서 젤을 실행하거나 완전히 얼음으로 포장.
        1. CN 미니 페이지의 경우 처음 1 시간 동안 100V를 사용하고 완료 될 때까지 200V를 사용합니다. 일반적으로 추가로 1-1.5 시간이 소요됩니다. 또는 CN 미니 페이지를 30-40 V에서 밤새 실행하십시오.
          참고 : 여기서는 고 분자량 단백질 복합체에 중점을두고 있으므로 분자량이 140 kDa 미만인 단백질 복합체가 젤을 모두 소모합니다. 저 분자량 복합체를 유지하기 위해 전기 영동을위한보다 짧은 운전 시간을 사용할 수 있습니다.
        2. BN 맥시 - 페이지 (BN maxi-PAGE)의 경우, 100V를 사용하고 밤새 (약 18 시간) 젤을 흐르게하십시오.
          참고 : 전류가 매우 낮아 (<15mA), 이러한 조건을 처리 할 수있는 전원 공급 장치가 필요합니다. 이 시점에서 젤은 IGA 또는 면역 블로 팅에 사용할 수 있습니다. 경우에 따라 전기 분해를 위해 유리판에 면도날을 사용하여 밴드 또는 레인을 젤에서 잘라낼 수 있습니다.
  2. 샘플 준비
    참고 : 멤브레인 바인딩 된 mitochondrial supercomplexes는에서 추출해야합니다내부 미토콘드리아 막. 미토콘드리아 supercomplexes을 보존하기 위하여는, 신선한 격리 한 mitochondria 또는 동결되고 해빙 된 견본을 한 번만 사용하십시오. 아래의 계산 / 부피는 미니 젤 (1.5 ㎜ 두께의 겔에서 10 웰 빗의 웰은 35-40 μL까지 유지) 및 맥시 겔 (15 웰 빗의 웰은 200 μL). 또한, 각 시료의 분량 (보통 10 μL)을 저장하여 로딩 제어로서 전압 의존성 음이온 채널 (VDAC)을 검출하기위한 변성 SDS 겔에서 작동시킵니다.
    1. 4 ℃에서 10-15 분 동안 17,000 xg에서 원심 분리하고 마이크로 튜브에 분리 된 미토콘드리아 또는 조직 균질 액을 적절한 양 ( 예 : 미니 젤의 경우 10-50 μg 및 맥시 - 젤의 경우 50 - 200 μg)에 놓습니다.
      참고 :이 단계는 일부 가용성 mitochondrial 매트릭스 및 / 또는 cytosolic 단백질을 제거합니다.
    2. 흡인하고 뜨는 버리고 원하는 양의 추출 버퍼를 추가하십시오젤에로드합니다. 부드럽게 얼음에 침전물을 다시 일시 중지하십시오. 원할 경우이 시점에서 일반적인 프로테아제 억제제 혼합물을 첨가하십시오.
      참고 : 여기에 사용 된 장비를 기준으로 mini-gel에는 30 μL를, maxi-gel에는 100 μL를 사용하여 단백질 / 완충 용액 비율을 완충 용액 1 μL에 대해 2 μg 이하로 제한했습니다.
    3. 세제를 첨가하십시오 ( 예 : 2 μg의 라 우릴 말 토 시드 / 1 μg의 단백질; 자세한 정보는 대표 결과 및 토론 참조).
      참고 : 일반적으로 라 우릴 말 토 시드가 사용되지만 digitonin도 사용할 수 있습니다.
    4. 얼음 위에서 20 분 동안 품어 낸다. 처음에는 가볍게 혼합하고 가끔 배양 중에 튜브를 가라 앉히거나 교반합니다.
    5. 4에서 10 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리기 ° C 모든 막과 조직 조각을 제거합니다.
    6. 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. CN 샘플의 경우 10 μL의 샘플 볼륨마다 1 μL의 LB를 첨가하십시오. 샘플의 총 볼륨은 app이어야합니다.미니 젤의 경우 약 40 μL, 맥시 겔의 경우 130 μL입니다. BN 샘플의 경우 염료와 세제의 비율이 1 : 4 (w / w)가되도록 샘플에 쿠마시를 넣으십시오.
    7. 샘플을 최소 또는 최대 겔의 웰에 각각 30 및 120 μL 씩 넣으십시오. 로딩 컨트롤로 VDAC를 검출하기 위해 변성 SDS 겔에 대한 각 샘플에서 나머지 10 μL를 사용하십시오.
    8. 분자량 마커를 준비하려면 BN / CN 젤 완충액 60 μL에 고 분자량 보정 믹스 (자세한 내용은 표 참조) 1 병을 용해시키고 120 μL의 H 2 0 및 20 μL LB. 1 차선 당 15 μL를로드하십시오.
    9. 단계 1.2.9.2에서 설명한대로 젤을 실행하십시오.

2. Cx-I 및 Cx-V에 대한 In-gel 분석

참고 : 분석은 실온에서 수행됩니다. 문서화를 위해 개발중인 밴드의 사진, 스캔 또는 이미지를 촬영하십시오. (중요) 단백질은 전송할 수 없습니다o IGA를 완료 한 후 니트로 셀룰로스 멤브레인.

  1. Cx-1 분석
    1. 예비.
      1. pH 7.4의 H 2 O에 5mM Tris의 분석 완충액을 준비한다. 상온에서 보관하십시오.
      2. 1 mL의 분석 완충액에 10 mg의 NADH를 녹인다. 사용하기 전까지 -20 μC에서 100 μL 분취 량으로 보관하십시오. 동결과 해동을 피하십시오.
      3. 마이크로 튜브에 Nitroblue tetrazolium 25 mg을 달아보십시오.
      4. 95 mL의 H2O에 5 mL의 아세트산을 희석하여 고정액을 준비한다; 상온에서 보관하십시오.
    2. 분석 수행.
      1. Nitroblue tetrazolium 25mg (최종 농도 : 2.5mg / mL)과 10mg / mL NADH (0.1mg / mL) 100μL와 함께 분석 완충액 10mL를 합칩니다. 이것을 CN 젤에서 절제 한 전체 겔, 차선 또는 관심 영역에 첨가하십시오.
        참고 :이 작업은 투명 플라스틱 또는 유리 용기에서 수행 할 수 있습니다. BN PAGE 후에는이 분석을 수행 할 수 없습니다.
      2. 3 분 이상 부드러운 교반 (로커) 후 파란색 띠의 발달을 따라하십시오.
      3. 겔을 아세트산 용액 10 - 20 mL에 넣거나 5 mM Tris, pH 7.4로 씻어서 반응을 멈춘다. 문서화를 위해 사진을 찍으십시오 (재료 표 참조).
  2. Cx-V 분석
    참고 : Cx-V 분석은 중복 CN 또는 BN 젤을 사용하여 수행해야하며, Cx-V- 독립적 활동을 입증하기 위해 5 μg / mL oligomycin (Cx-V 억제제)과 함께 배양합니다.
    1. 예비.
      1. 35 MM 트리스와 270 MM 글리신과 분석 버퍼를 준비; 실온에서 pH를 8.3으로 조정한다. 완충액을 50mL 분량으로 냉동 보관하십시오. 그러나 동결 및 해동 후 pH를 확인하십시오.
      2. H 2 O 중 1M MgSO 4 를 준비한다. 사용하기 전까지 4 ° C에서 보관하십시오.
      3. Pb (NO 3 ) 2 27.28mg을 마이크로 튜브에 넣습니다.
      4. ATP 60mg을 마이크로 튜브에 넣습니다.
      5. 1 mg의 o를 용해시킨다.1 mL의 에탄올에 용해시켰다. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관하십시오.
      6. 50 mL의 메탄올과 50 mL의 H2O를 혼합하여 고정액을 준비한다; 상온에서 보관하십시오.
    2. 분석 수행.
      1. 분석 버퍼 ± 5 μg / ML oligomycin 10-20 ML에 부드러운 교반 (로커)와 2 시간 BN 또는 CN 젤에서 관심의 겔, 차선, 또는 관심 영역을 품어 (50-100 μL 1 MG / mL)을 실온에서 첨가 하였다.
      2. 배양 후 버퍼를 14 mL의 새로운 분석 완충액으로 교체하고 1 M MgSO 4 (14 mM) 190 μL, Pb (NO 3 ) 2 (5 mM) 27.28 mg, ATP 60 mg 8 mM) 및 올리고 마이신 75 μL (필요한 경우).
      3. oligomycin으로 처리 한 젤의 밴드가 Cx-V 의존성이 아닌 밴드를 제공하므로 부드러운 교반 (로커)으로 품어두고 흰색 침전물을 관찰합니다.
        참고 : 침전물의 모양은 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
      4. 겔을 메탄올 -( 예 : 50 % 메탄올), 산성 용액이 납 침전물을 녹일 것이기 때문이다. 결과를 사진으로 찍으십시오.
        참고 : 납 침전물은 겔의 쿠마시 염색을 방해하지 않습니다.

3. Nitrocellulose 또는 Polyvinylidene Difluoride (PVDF) 멤브레인으로 단백질 전달

  1. 25 MM 트리스와 200 밀리그램 글리신의 전송 버퍼를 준비합니다. pH를 8.3으로 조정하고 0.0005 g / L SDS와 200 mL / L 메탄올을 첨가한다. 실내 온도에 보관하십시오.
    1. 면도날이나 가위로 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막 (기공 크기 : 0.45 μm)을 젤 크기보다 약간 큰 크기로 자릅니다.
      참고 : 니트로 셀룰로오스 멤브레인은 Ponceau S 염색이 단백질 로딩을 평가하는 반면 PVDF 멤브레인은보다 명확하게 정의 된 밴드를 산출합니다.
  2. 실험 계획안.
    1. 니트로 셀룰로오스 막, 여과지 및 스폰지를전송 버퍼에서 최소 10 분. PVDF 막을 15 초 동안 100 % 메탄올에 넣거나 전달 버퍼에 넣기 전에 제조업체의 권장 사항에 따라 배치하십시오. 트랜스퍼 버퍼가있는 평평한 그릇에 트랜스퍼 키트의 오픈 카세트를 놓습니다.
    2. 카세트의 뒷면에 스폰지와 1-2 개의 여과지를 놓습니다. 거품을 제거하십시오.
    3. 젤을 여과지 위에 놓습니다. 겔 및 / 또는 멤브레인의 모서리 부분을 클리핑하여 겔의 방향을 나타냅니다.
    4. 멤브레인을 젤 위에 올려 놓습니다. 모든 거품을 제거하십시오.
    5. 멤브레인 위에 필터 종이와 스폰지를 놓습니다. 이 샌드위치에있는 모든 거품을 제거하십시오.
    6. 카세트를 닫고 전송 키트의 카세트 홀더에 넣으십시오.
    7. 단백질을 25V에서 약 12-18 시간 동안 옮긴다.

4. 면역 블로 팅

  1. 예비.
    1. Ponceau Stain (500 mL)에 25 mL의 아세트산 및 0.5 g의 폰 소우 S를 475 mL의 H2O에 첨가하고; 실온에서 보관하십시오 (재사용 가능).
    2. 200 MM NaCl, 25 MM 트리스 -베이스, 및 2.7 MM KCl와 Tris - 버퍼 식염수 (TBS)를 준비합니다. pH를 8.0으로 조정하고 실온에서 보관하십시오.
    3. TBS에 0.5 mL / L Tween 20을 첨가하여 TBS-tween (TBST)을 준비하십시오. 상온에서 보관하십시오.
    4. TBST 100 mL에 5 g의 고형 우유를 녹여서 우유 고형분 / TBST를 준비한다. 4 ° C에서 보관하고 3 일 이내에 사용하십시오.
    5. 3 g의 소 혈청 알부민 (BSA, 분획물 V)을 TBST 100 mL에 녹여 BSA / TBST를 준비한다. 4 ° C에서 보관하고 3 일 이내에 사용하십시오.
  2. 실험 계획안.
    1. 전송이 완료되면, 모든 전송 된 단백질을 시각화하기 위해 Ponceau S 솔루션에 막을 놓습니다. 멤브레인의 마커 위치를 연필로 표시하고 Ponceau-S-stained membrane을 사진 또는 스캔으로 기록합니다.
    2. 각 10 분 동안 멤브레인을 3 번 씻으십시오.TBS를 부드럽게 흔들어 준다.
    3. 멤브레인을 우유 고형물 / TBST로 상온에서 1 ~ 2 시간 동안 또는 온화한 교반하에 차가운 방에서 밤새 차단하십시오.
    4. 완만하게 교반하면서 TBST로 10 분 동안 막을 씻으십시오.
    5. 온화한 교반하에 차가운 방에서 밤새 일차 항체와 함께 품어 라. BSA / TBST에서 항체 ( 예 : 1 : 1,000의 항 ATP5A 및 -NDUFB6)를 희석하십시오.
      참고 : 대부분의 항체는 하룻밤 배양하면 원래 젤의 막에 더 좋은 신호를줍니다.
    6. 완만하게 교반하면서 TBST로 10 분 동안 막을 씻으십시오.
    7. 상온에서 최소한 60 분 동안 2 차 항체와 함께 항온 처리한다. 우유 고형물 / TBST로 항체 (1 : 5,000에서 1 : 50,000)를 희석하십시오.
    8. TBST로 부드럽게 교반하면서 상온에서 10 분 동안 3 번 멤브레인을 씻으십시오.
    9. 마지막 세척하는 동안, manufa의 지시에 따라 향상된 chemoluminescence (ECL) 기판을 준비cturer.
    10. 제조 업체가 제공 한 지침을 사용하여 ECL 기판과 멤브레인을 품어.
    11. ECL 기판 제조업체가 제공 한 지침을 사용하여 필름의 신호를 감지합니다.

5. 전기 분해

  1. 예비.
    1. 25 mM tricine, 3.75 mM 이미 다졸 (pH 7.0, 4 ℃) 및 5 mM 6- 아미노 헥산 산의 용출 완충액을 준비한다.
      참고 : 외부 단백질 오염을 방지하기 위해 전기 장비와 멤브레인 캡을 취급하는 동안 항상 장갑을 착용하십시오.
  2. 네이티브 electroelution에 대한 electroeluter를 사용하기 전날에 다음을 수행하십시오.
    1. 60 ° C에서 1 시간 동안 용리 완충액에 멤브레인 캡 (컷오프 : 3.5 kDa)을 담급니다. 새 용출 완충액으로 뚜껑을 옮기고 냉장고에 12 시간 이상 담근다.
      참고 : 3.5 kDa의 컷 - 오프 분자량은 작은 p의 손실을 방지한다관심있는 단백질 복합체에서 쉽게 해리 될 수있는 로틴 (roteins).
    2. 전기 분해기 모듈, 유리 튜브, 탱크 및 뚜껑을 에탄올로 완전히 씻으십시오. 물로 헹구고 장비를 말리십시오.
  3. 기본 전기 분해의 날에 다음을 수행하십시오.
    1. 사용할 각 유리 튜브의 바닥 (프 로스트)에 프릿을 놓습니다. 필요한 경우 유리 튜브를 용리 완충액에 넣고 프릿을 튜브의 안쪽에서 아래쪽으로 밀어 넣습니다.
    2. 유리 재 튜브가있는 유리 튜브를 전기 에너지 모듈에 밀어 넣으십시오. 용출 완충액으로 그로밋을 적신 다음 유리관을 제자리로 밀어 넣으십시오. 유리 튜브의 윗부분이 그로밋과 평평한 지 확인하십시오.
    3. 스토퍼로 빈 그로밋을 닫습니다.
    4. 실리콘 어댑터 바닥에 젖은 멤브레인 캡을 놓고 어댑터를 용리 완충액으로 채 웁니다. 어댑터의 버퍼를 천천히 피펫 팅하여 투석막 주위의 기포를 제거하십시오. </ li>
    5. 버퍼 채워진 어댑터를 유리 튜브의 바닥에 밀어 넣으십시오. 유리 튜브 안의 유리에 나타나는 모든 거품을 제거하십시오.
    6. 용리 완충액으로 각 유리관을 채 웁니다.
    7. BN PAGE의 절취 된 밴드를 유리 튜브에 넣으십시오 (1.2.9.3 단계 참조). 큰 조각을 작은 조각으로 자릅니다. 유리 튜브 내의 충전 높이가 약 1cm인지 확인하십시오.
    8. 전체 모듈을 탱크에 넣으십시오.
    9. 약 600 mL의 차가운 용리 완충액을 탱크에 첨가한다. 투석 막에 거품이 생기지 않도록 실리콘 어댑터 캡이 버퍼에 있는지 확인하십시오.
    10. 탱크 하단에 저어 막대를 놓습니다.
      참고 : 교반하면 거품이 투석 막 바닥에 달라 붙지 않습니다.
    11. 콜드 룸에서 350 V에서 4 시간 동안 단백질을 용출시킨다.
    12. 용리가 완료된 후 완충액 탱크에서 전기 에너지 모듈을 꺼내 싱크대 또는 보울에 넣으십시오.
    13. 마개가 사용 된 경우에는 마개를 사용하여 드라상부 버퍼 챔버에서. 그렇지 않으면 큰 피펫을 사용하여 버퍼를 제거하십시오.
    14. 각 유리 튜브에서 버퍼를 제거하고 버립니다. 실리콘 어댑터가 제 위치에 유지되고 프릿 아래의 액체가 방해 받거나 흔들리지 않도록하십시오.
    15. 조심스럽게 유리 어댑터의 바닥에서 멤브레인 캡과 함께 실리콘 어댑터를 제거합니다. 마이크로 튜브에 실리콘 캡의 내용물 (약 400 μL)을 채 웁니다. 용리 완충액 200 μL를 추가로 실리콘 뚜껑을 헹구고 마이크로 튜브에 추가하십시오. 모든 유리 튜브에 대해 반복합니다.
    16. 멤브레인 캡을 재사용 할 수 있으므로 0.5 mg / mL sodium azide가 포함 된 용리 완충액에 멤브레인 캡을 보관하여 보존하십시오. 그들을 냉각하십시오.
      참고 : 용리액은 단백질 농도가 낮으며 원심 분리 필터 장치를 사용하여 농축 할 수 있습니다.

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Representative Results

미토콘드리아 supercomplexes를 시각화하기 위해 쥐에서 새로 격리 mitochondria가 사용되었다 17 , 18 . Mitochondrial supercomplexes는 일부 연구자들에게는 용인 될 수 있지만, 분해 및 해동의 반복주기에 민감합니다. 보관을 위해 동결이 필요한 경우 최상의 결과를 얻으려면 샘플을 한 번 이상 동결 및 해동하지 않아야합니다.

미토콘드리아 ETC 복합체를 BN PAGE로 시각화하기 위해 분리 된 심장 미토콘드리아의 단백질 100 μg을 4-10 % 젤에 로딩했다 ( 그림 1A ). 로딩 및 음극 완충액의 쿠마시 스테인은 실행 중 단백질 복합체를 표지하기에 충분합니다. 대비를 디지털 방식으로 증가시킨 후에 수퍼 콤플렉스가 나타납니다 (표시되지 않음). CN PAGE의 경우 20 μgf 단백질은 분리 된 미토콘드리아로부터 3 내지 8 % CN 겔 상에 로딩되고 분리되었다 ( 도 1B ). CN PAGE를 Coomassie로 염색하고 단백질 복합체를 시각화하기 위해 제거 하였다. 명암을 디지털 방식으로 증가시킨 후에, Cx-I의 단량체보다 큰 분자량을 갖는 여러 단백질 복합체가 나타났다 ( 그림 1B , 오른쪽). 사용 된 AAB의 농도는 가장 큰 수퍼 콤플렉스가 우물로부터 단지 겔로 들어가는 것을 허용했습니다. 그러나, 3 % 미만의 AAB의 그래디언트로 끝나는 겔은 이동 또는 밴드 또는 레인을 절제하기에 충분히 안정하지 못합니다. 또한, 3-8 % CN 젤의 상부 부분에있는 AAB의 낮은 농도는 단백질 복합체의 일부 이동성을 유지합니다. 이는 고유의 전기 분해를 고려할 때 중요합니다 19 .

Cx-I의 단량체 및 수퍼 콤플렉스 및 C의 단량체, 이합체 및 수퍼 콤플렉스xV는 효소 적으로 활성이며 IGA ( 그림 1C- F )로 시각화 할 수 있습니다. 이 분석은 분리 된 심장 미토콘드리아에서 Cx-1과 Cx-V가 각각의 단량체보다 큰 단백질 복합체에 존재 함을 보여줍니다. Cx-I에 대한 IGA 분석에서 NADH는 산화되고 전자는 nitroblue tetrazolium을 감소시키기 위해 전달된다. 이것은 Cx-I 단량체와 Cx-I 함유 호흡기 / 수퍼 콤플렉스의 분자량에서 국부적 인 청색을 낳는다 ( 그림 1C ). Cx-V의 활성은 F1 서브 유닛이 ATP를 가수 분해하는 능력으로부터 평가되며, CN 또는 BN 겔을 사용하여 수행 될 수있다 ( 도 1D- F ). 이 반응에서 생성 된 ADP는 납과 상호 작용하여 Cx-V 단량체, 이합체, 신타 소솜 및 하위 복합체 (Cx-V의 조립되지 않은 F1 부분 일 가능성이 높음)의 수준에서 흰색 침전물을 생성합니다. 올리고 마이신은 l이 밴드가 abeling되어 Cx-V가 포함되어 있음을 확인했습니다 ( 그림 1E ).

여기에 설명 된 모든 실험에서 양성 이온 성 세제 인 lauryl maltoside는 2 μg / 1 μg의 단백질 농도로 사용되었으며, 이는 일관되고 재현성있는 결과를 제공하면서 수퍼 콤플렉스를 보존하는 가능한 최고 농도입니다 ( 그림 1F ). 그러나 라 우릴 말 토 시드의 효과는 로트 번호, 저장 조건 및 나이에 달려 있습니다. 따라서 한 실험실에서 사용 된 정확한 농도는 원고에서보고 된 농도와 반드시 동일하지는 않습니다. 세제의 적절한 농도는 멤브레인을 가용화하지만 복합체와 수퍼 콤플렉스는 손상시키지 않고 다양한 농도의 라 우릴 말 토 시드 ( 그림 1F )를 사용하여 결정해야합니다. CN PAGE의 경우, 웰당 40 μL의 총 샘플 부피가 준비되었다여기에 단백질 / 세제 비율 1 μg / 2 μg 또는 세제 / 버퍼 비율 1 μg / 1 μL (1.9 mM과 동일)가됩니다. 40 μL에서 미니 젤의 각 웰당 30 μL가 적용되었습니다. 나머지는 로딩 대조군 인 VDAC의 검출을위한 분액으로 사용되었다 ( 도 2D ).

면역 블로 팅의 경우 CN이 BN PAGE보다 선호되는데, 그 이유는 단백질이 항체에 의한 검출을 방해 할 수있는 쿠마시 (Coomassie)가 없기 때문입니다. 그림 2 는 분리 된 심장, 간 및 뇌 미토콘드리아의 Cx-I 및 Cx-V 단백질 NDUFB6 및 ATP5A를 함유 한 수퍼 콤플렉스 검출을 보여줍니다. 전달 후 면역 블 롯팅 전의 Ponceau S 라벨링은 분자량 마커를 표시하고 단백질 로딩을 제어하는 ​​데 사용할 수 있습니다 ( 그림 2A ). 이것은 nitrocellul에 ETC의 단백질 복합체의 단량체를 시각화합니다그러나 Ponceau S 라벨링은 면역 블로 팅으로 얻을 수있는 미토콘드리아 supercomplexes ( 그림 2A )의 시각화에 항상 충분하지 않습니다.

Cx-I는 그 자체로 이합체 및 4 량체로 조립되지 않지만 Cx-III 및 Cx-IV 14 , 20 , 21 과 함께 점점 더 높은 분자량의 수퍼 콤플렉스를 형성한다. 여기서 NDUFB6에 대한 항체를 사용하여 심장에서 채취 한 시료가 간 또는 뇌에서 미토콘드리아보다 더 많은 Cx-I 단량체와 고 분자량 수퍼 콤플렉스 (상위 밴드)를 포함한다는 것을 보여줍니다 ( 그림 2B ). mid-range respirasome supercomplexes의 양은 다른 조직보다 심장에서 훨씬 높았다 ( 그림 2B ).

항 -ATP5A 항체를 사용하여,Cx-V의 단량체는 모든 조직으로부터 미토콘드리아에서 검출 가능하지만, 심장 미토콘드리아에서 명확히 볼 수있는 이량 체 (D) 및 큰 수퍼 콤플렉스 (SC)를 나타내는 밴드의 뚜렷한 패턴은 간 및 뇌 미토콘드리아에서 현저하지 않다 도 2c ). 면역 블롯의 과다 노출 (1 분 대 20 초)은 여러 가지 Cx-V- 함유 수퍼 콤플렉스를 보여 주며, 이는 테트라 머 및 신타 소솜을 나타낼 수 있습니다 ( 그림 2C ). 심장, 간, 및 뇌 미토콘드리아에서 Cx-V- 함유 단백질 복합체의 이러한 패턴은 조직 특이성 일 수 있고 아직 탐구되지 않은 차이를 나타낸다.

이러한 도말의 단백질 로딩은 Ponceau S 염색 및 SDS PAGE에 의한 상기 분취 량의 VDAC 검출에 의해 수행 될 수있다 ( 도 2D 에서 입증 됨).

모든 항생제가 아님다이는 천연 PAGE 후 단백질 복합체의 4 차 또는 3 차 구조 내의 단백질을 검출하는데 적합하다. 이 문제를 극복하기 위해 네이티브 젤의 전체 및 부분 레인을 2 차원 (2D 겔, 데모 용 참조 13 참조)의 변성 젤에 장착 할 수 있습니다. 2D 전기 영동은 초분자 복합체에서 단백질을 시각화하는 데 유용한 도구입니다. 그러나 그림 2 에서 볼 수 있듯이 수퍼 콤플렉스는 다양한 양으로 존재하며 수퍼 콤플렉스의 개별 단백질 신호는 두 번째 변성 차원에서 시각화하기 어려울 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해, 네이티브 젤로부터 단백질 복합체의 전기 용출이 여기에 사용되었습니다. 이것은 다중 레인에서 수퍼 콤플렉스 (supercomplex) 밴드를 분리하여 향후 연구를위한 더 많은 재료를 생산합니다.

전기 분해를 사용할 때, IGA에 의해 확인되고 BN PAGE에서 시각화 된 관심 밴드 만이 excised; 이 젤 조각으로부터 얻은 단백질은 겔로부터의 용출에 의해 추가로 정제됩니다. 도 3A 는 단량체를 나타내는 밴드가 전기 분해를 위해 절제 된 BN PAGE의 레인을 도시한다. 전기 분해 후 단량체의 Cx-V 활성을 평가하기 위해 용출액을 두 번째 CN PAGE에 적용했다. 단량체의 용리액은 여전히 ​​효소 적으로 활성 인 Cx-V를 포함하고 있지만 부 콤플렉스도 나타납니다 ( 그림 3B ). 네이티브 CN PAGE ( 그림 3C ) 또는 변성 SDS 페이지 ( 그림 3D ) 후 eluate의 실버 얼룩은 용출액에 단백질의 존재를 나타내며 ATP5A에 대한 immunoblotting은 두 샘플 모두에서 Cx-V의 존재를 나타냅니다 ( 그림 3D ).

그림 1
그림 1 : Mitoch의 시각화ondrial Supercomplexes. ( A ) 분리 된 심장 미토콘드리아의 샘플을 가지고 4-10 % BN maxi-gel 2 차선. 동일한 샘플의 분취 량을 두 개의 레인에서 웰당 100 ㎍의 단백질로 처리 하였다. ETC의 단백질 복합체 I, II, III, IV 및 V의 단량체가 명확하게 보여지고 겔의 오른쪽에 표시됩니다. ( B ) CN PAGE에서 심장 미토콘드리아 샘플 (1과 2, 20 μg protein / lane)을 분리하고 쿠마시 염색으로 시각화 하였다. SC는 젤의 윗 부분의 확대와 디지털 향상 후 supercomplexes의 위치를 ​​나타냅니다 (영역은 빨간색 화살표로 표시됨). ( C ) 미토콘드리아 단백질 20 μg을 3-8 % CN PAGE에서 분리하고 Cx-I IGA로 처리 하였다. 확대되고 디지털로 강화 된 이미지는 Cx-I 반응 생성물의 밴드를 보여줍니다. ( D ) 미토콘드리아 단백질 20 μg을 3-8 % BN PAGE에서 분리하고 Cx-V IGA로 가공 하였다. 매그 니 피 Ex 및 디지털 방식으로 강화 된 이미지는 Cx-V 반응 생성물의 밴드를 보여줍니다. ( E ) 미토콘드리아 단백질 50 μg을 5-15 % CN PAGE에서 분리하고 Cx-V IGA (-) 및 (+) 5 μg / mL oligomycin (Oligo)으로 가공 하였다. ( F ) 미토콘드리아 단백질 (20 μg / lane)을 젤 상단에 표시된대로 1 μg의 라 우릴 말토 사이드 (lauryl maltoside) 2 - 6 μg로 가용화하고 3-8 % CN 겔에서 분리 한 후 Cx- V IGA. 모든 이미지는 밝은 테이블 ( A - C ) 또는 검은 색 표면 ( D - F ) 중 하나를 사용하여 촬영되었습니다. 카메라 사양은 재료 표에 나와 있습니다. 분자량 마커 (MW)의 위치는 모든 패널의 왼쪽에 표시됩니다. 약어 : D = 이량 체; F 1 * = Cx-V의 서브 콤플렉스; LM = 라 우릴 말 토 시드; m = 분자량 마커; M = 단량체; SC = 수퍼 콤플렉스.g1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : Immunoblotting에 의한 Mitochondrial Supercomplexes의 검출. 심장 (H), 간 (Li) 및 뇌 (B) 미토콘드리아의 단백질 20 μg을 3-8 % CN PAGE에서 분리하고 니트로 셀룰로오스 막에 옮겼다. ( A ) 막의 Ponceau S 염색은 단백질 복합체와 분자량 마커 (m)의 존재를 나타냅니다. 파란색 화살표는 젤의 상단을 가리 킵니다. ( B ) Cx-1 단백질 인 NDUFB6를 (A)에 나타낸 얼룩에서 면역 표지 하였다 (1 분 노출 시간). ( C ) 항 -ATP5A 항체로 Cx-V를 시각화 하였다 (표시된 바와 같이 20 초 및 1 분 노출). (B)와 (C)의 빨간색 화살표는 확대 된 영역을 표시하고 디지털로 확대 표시됩니다Cx-I- 및 Cx-V- 함유 수퍼 콤플렉스의 라이 제이션, 및 파란색 화살표는 겔의 상부를 가리킨다. ( D ) Ponceau S 및 (A), (B) 및 (C)에 사용 된 각 추출물의 VDAC 분취 량을 SDS PAGE로 분리하고 니트로 셀룰로오스로 옮긴 면역 표지. 약어 : M = Cx-I 또는 Cx-V의 단량체, D = Cx-V의 이량 체, SC = Cx-I 또는 Cx-V를 함유하는 수퍼 콤플렉스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : Cx-V의 전기 분해. ( A ) 미토콘드리아 샘플의 BN 페이지. 박스 밴드는 excised 및 electroeluted Cx-V의 단량체를 나타냅니다. ( B ) 용출액을 CN PAGE에 적용한 후, Cx-V에 대한 IGA는 단량체 (M)및 Cx-V의 F1을 함유하는 서브 콤플렉스를 포함한다. ( C ) 용출액의 CN PAGE의은 염색은 단량체 (M)를 나타낸다. ( D ) 변성 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)의 ATP5A (오른쪽 패널)에 대한 은색 염색 (왼쪽 패널) 및 면역 블롯. 용출액의 PAGE는 Cx-V의 존재를 나타낸다. SDS 페이지는 다른 곳에서 출판 된 프로토콜을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

기능적 ETC는 미토콘드리아 ATP 생성에 필요합니다. ETC의 복합체는 respirasomes (Cx-I, -III 및 -IV) 1 과 신타 소솜 (Cx-V) 2의 두 가지 유형의 수퍼 콤플렉스를 형성 할 수 있습니다. ETC를 supercomplexes로 편성하는 것은 전반적인 ETC 효율성을 증가시키는 것으로 생각되는 반면, 각 복합체의 조립은 손상되지 않은 ETC에 필요하다. 이러한 수퍼 콤플렉스가 어떻게 조립 및 분해되는지는 잘 알려져 있지 않지만 여기에 제시된 프로토콜은 이러한 프로세스를 더 잘 이해할 수 있습니다.

ETC 어셈블리 연구의 주요 과제는 이러한 단백질 복합체의 크기입니다. 예를 들어, 미토콘드리아 호흡기는 Cx-I (약 880 kDa)와 하나 이상의 Cx-III 분자 (460 kDa) 및 Cx-IV (200 kDa, 이량 체로 활성)로 구성되어 분자와의 복합체를 형성 할 수있다 약의 무게2,000 kDa. 또한, Cx-V는 약 600 kDa의 분자량을 가지지 만, 이량 체, 사량 체, 올리고머 및 이량 체 7,23의 리본으로 조립되어 분자량 2,000 kDa 이상의 초 콤플렉스를 생성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 수퍼 콤플렉스의 엄청난 크기를 고려할 때,이 실험실과 다른 사람들이이 수퍼 콤플렉스를 식별하고 특성화하기 위해 전통적으로 몇 가지 부분적으로 관련한 접근법이 사용되었습니다 ( 8 , 14 , 24) .

이 연구는 활성 단백질 복합체가 약한 세제를 사용하여 미토콘드리아 막에서 부드럽게 추출되는 고유의 겔 PAGE 기술을 입증했습니다. 복합체는 주로 크기와 고유 전하 (CN PAGE) 또는 단백질 바인딩 된 쿠마시 블루 (BN PAGE)의 크기 및 음전하 때문에 젤에서 이동합니다. 이 젤들은 C로 염색 될 수 있습니다.oomassie blue ( 예 : CN 젤) 또는 silver stain ( 예 : BN 및 CN PAGE).

Lauryl maltoside는이 세제가 가장 안정적으로 작용했기 때문에 여기에 설명 된 실험에 사용되었습니다. 또는 digitonin을 사용하여 단백질 복합체 12 를 추출 할 수 있습니다. 성인 심장, 간 및 뇌에서 분리 된 미토콘드리아 데이터가 여기에 표시되었지만 이러한 기술은 배아 및 성인 심장 균질 물질에 대해 수행되었습니다 8 . 다른 사람들은 배양 된 세포에서 분리 된 미토콘드리아를 사용하여이 기술을 수행했습니다. 그러나 높은 DNA 함량을 가진 조직 균질 액 또는 배양 된 세포를 사용하는 경우 전기 영동 중 줄기를 방지하기 위해 핵산 분해 효소를 첨가하는 것이 유용 할 수 있습니다 25 .

다른 복합체의 활성은 Cx-I 및 Cx-V 및 tec에 대해 여기에서 설명 된 것처럼 겔에서 직접 분석 할 수 있습니다또한 Cx-II, -III 및 -IV 12 의 활동을 조사 할 수 있습니다. 그러나 이러한 IGA 분석은주의 깊게 수행해야합니다. 첫째, 효소 반응은 비 ETC 효소 또는 불완전하게 조립 된 복합체 때문일 수있다. 예를 들어, 원래의 Cx-V를 억제하기 위해 oligomycin으로 처리 된 평행 겔로 Cx-V IGA를 수행하는 것은 일상적입니다 ( 그림 3 ). 또한, 다른 NADH oxidases는 Cx-1 in-gel activity를 설명 할 수 있습니다. 하나는 로테 논과 같은 Cx-I 억제제가있는 상태에서 병렬 IGA를 수행 할 수 있습니다. 그러나 그림 1 에서 분리 된 미토콘드리아가 사용되었으므로 세포질 NADH oxidases는 존재하지 않았다. 따라서, 데이터는 Cx-I- 함유 단량체 및 수퍼 콤플렉스를 나타낼 가능성이 가장 높다. 또한 이러한 결과의 정량화는 사진 또는 스캔에서 밴드의 신호 강도를 측정하여 가능합니다. 이 접근법의 단점은반응 생성물의 이동성, 겔의 깊이에 걸쳐 생성물을 적절하게 정량화 할 수 없으며, 반응의 잠재적 인 비선형 성을 나타낸다. 후자를 극복하기 위해 일련의 사진을 사용하여 반응 속도를 얻으려는 제안이 있지만 여기에서는 시도하지 않았습니다.

고유 젤의 단백질은 또한 막으로 옮겨 질 수 있으며, 밴드의 단백질 조성은 면역 블로 팅 (여기에서 설명) 또는 2D PAGE (참조 13 에서 입증)로 검사 할 수 있습니다. ETC 복합체의 단량체는 전통적으로 분리 된 미토콘드리아의 고유 겔, 젤에서의 위치 및 분자 표지 단백질에 대한 위치 ( 그림 1 )로 풍부하게 식별되었습니다. 또한, 다른 복합체의 서브 유닛에 특이적인 항체로 후속 면역 블롯을 표지하는 것은 복합체 및 조성물을 확인하는 것을 돕는다supercomplexes의. 따라서, 항 -NDUFB6 및 -ATP5A는 여기에서 설명 된 바와 같이 Cx-1 및 Cx-V를 각각 함유하는 단량체 및 수퍼 콤플렉스를 식별한다. Cx-II에서 IV에 항체는 동일한 목적으로 사용될 수 있습니다. 경우에 따라, 일부 항체가 변성 된 단백질에 특이 적이거나 또는 에피토프가 천연 복합체에서 다른 단백질에 의해 감추어 질 수 있기 때문에, 변성 겔에서 잘 작동하는 항체는 네이티브 겔에서 잘 작동하지 않을 수있다.

대부분의 이용 가능한 분자량 마커가 Cx-V 단량체의 크기보다 낮기 때문에 이러한 supercomplex의 정확한 분자량 결정은 어렵습니다. 천연 겔에서 단백질 복합체의 이동은 크기, 내재 전하 및 세제가 28 에 따라 달라집니다. 여기의 예에서, 복합체의 단량체는 겔, 마커 및 면역 블로 팅에 기초하여 동정되었다. Cx-V의 이량 체는 Cx-I 및 -V의 단량체에 비해 상대적 이동 및 면역계블로 팅. 겔, IGA 및 면역 블롯의 단량체와 이량 체 위의 다른 모든 것들은 수퍼 콤플렉스로 간주됩니다.

네이티브 면역 블롯은 또한 표준 기술을 사용하여 밴드 밀도를 분석함으로써 수퍼 콤플렉스에 대해 정량화 될 수 있습니다. 이 방법은 여기에 표시되지 않았지만 최근의 출판물에서는이 기술을 보여줍니다 8 . 단백질 로딩의 정상화는 레인의 Ponceau red 염색을 사용하거나 변성 면역 블롯상의 VDAC 밴드의 밀도를 측정하기 위해 미토콘드리아 추출물의 샘플을 저장하여 수행 할 수 있습니다 ( 그림 2A 및 D ). 또한, 같은 immunoblot에서 단량체에 대한 supercomplexes의 비율을 조사하는 것은 band density를 정량화하는 또 다른 방법이지만, blot development 동안 서로 다른 시간에 사진을 찍어 밴드가 과다 노출되지 않도록주의해야합니다.

마지막으로, 천연 겔의 밴드를 전기 분해하여 purifie를 생성 할 수 있습니다d는 고차원 복합체로 조립 될 수 있고 복잡한 기능의 추가 연구에 사용될 수있는 활성 단백질 복합체입니다. 예를 들어 Cx-V 단량체는 이전에 전기 영동되어 리포좀으로 재구성되어 전기적 기능성 29을 입증했습니다. 네이티브 전기 분해에 대한 또 다른 접근법은 주변 버퍼 ( 16 ) 로의 수동 확산에 의한 용출이지만, 이는 네이티브 전기 분해에 비해 느립니다. 마지막으로, 전기 분해의 주요 문제점은 복합체가 정제 과정에서 해리 될 수 있기 때문에 전기 분해 된 단백질 복합체의 효소 기능을 유지하는 것입니다. 따라서이 기술로 분리 한 후 기능 분석은 엄격하게 테스트해야합니다.

이들 프로토콜을 효소 분석 및 산소 소비 측정과 결합하여 개별적인 ETC 복합체의 기능 및 전체 ETC 30 의 활성 및 다른 메타ods, crystalles 31 및 복합체와 supercomplexes의 구조에 대한 전자 현미경 32 평가와 같은 ETC의 내부 작용의 완성 된 그림이 나타났습니다. 우리는 복합체의 조립 방법, 전자가 사슬을 따라 흐르는 방법, 그리고 양성자가 멤브레인을 통해 펌핑되어 그래디언트를 생성 한 다음 Cx-V를 통해 매트릭스로 역류하여 ATP를 생성하는 방법에 더 가깝습니다. 의심의 여지없이 이러한 기술은 ETC의 구조, 기능 및 동적 규제에 대한 추가 세부 정보를 제공하기 위해 더욱 개선 될 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 미국 심장 학회 설립자 제휴사 (12GRNT12060233)와 로체스터 대학의 Strong Children 's Research Center의 연구비 지원으로 이루어졌습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

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References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

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생화학 124 호 미토콘드리아 전자 전달 사슬 호흡기 신타 소솜 투명한 고유 전기 영동 in-gel assay electroelution
네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석
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Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

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