Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.

Abstract

Mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC), çeşitli yakıtların parçalanmasından elde edilen enerjiyi hücre ATP'nin biyoenerjetik para birimine dönüştürür. ETC, elektron taşıma ve ATP üretiminin verimliliğini arttıran respirasom (CI, C-III ve C-IV) ve synthasomes (CV) süper komplekslerine de dahil olan 5 büyük protein kompleksinden oluşur. ETC fonksiyonunu ölçmek için 50 yılı aşkın süredir çeşitli yöntemler kullanılmıştır, ancak bu protokoller bireysel komplekslerin ve süper komplekslerin montajı hakkında bilgi sağlamamaktadır. Bu protokol, yerli jel poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE), ETC karmaşık yapısını incelemek için 20 yıldan daha önce modifiye edilmiş bir yöntemi açıklar. Doğal elektroforez, ETC komplekslerinin aktif formlarına ayrılmasına izin verir ve bu kompleksler daha sonra immünoblotlama, jel içi deneyler (IGA) ve elektroliz ile saflaştırma kullanılarak incelenebilir. BirleştirerekDoğal jel PAGE'in diğer mitokondriyal deneylerle elde edildiği durumlarda, ETC aktivitesinin kompleman resmini, dinamik birleştirme ve demonte parçasını ve bunun mitokondriyal yapı ve işlevi nasıl düzenlediğini görmek mümkündür. Bu çalışma aynı zamanda bu tekniklerle ilgili sınırlamaları tartışacaktır. Özetle, aşağıda sunulan immünoblotlama, IGA ve elektroelüsyon takip eden yerli PAGE tekniği mitokondrial ETC süper komplekslerinin işlevselliğini ve kompozisyonunu araştırmanın güçlü bir yoludur.

Introduction

ATP formundaki mitokondrial enerji, sadece hücre sağkalımı için değil, aynı zamanda hücre ölümünün düzenlenmesi için de gereklidir. Oksidatif fosforilasyon ile ATP'nin üretilmesi, fonksiyonel bir elektron taşıma zinciri (ETC; Cx-I ila IV) ve mitokondriyal ATP sentaz (Cx-V) gerektirir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bu büyük protein komplekslerinin respirazomlar ve synthasomes 1 , 2 olarak adlandırılan süper kompleksler halinde düzenlendiğini göstermiştir. Bu muazzam komplekslerin ve süper komplekslerin montajını, dinamiklerini ve faaliyet düzenlemelerini analiz etmek zor. Bir oksijen elektrodu ile alınan oksijen tüketimi ölçümleri ve bir spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilen enzim analizleri, ETC karmaşık aktivitesi hakkında değerli bilgiler verebilirken, bu testler, ilgili protein kompleksinin veya süper komplekslerin varlığı, boyutu ve alt birimi kompozisyonu hakkında bilgi sağlayamaz. Bununla birlikte, mavi ve berrak yerli (BN ve CN) SAYFA 3 , fizyolojik ve patolojik koşullar altında karmaşık kompozisyon, montaj / demontaj ve bu hayati solunum komplekslerinin supramoleküler organizasyonunun dinamik düzenlenmesi hakkında önemli bilgileri açığa çıkarmak için güçlü bir araç yarattı.

Bu komplekslerin yüksek mertebeli süper komplekslere birleştirilmesi, mitokondriyal yapıyı ve fonksiyonu düzenler gibi gözükmektedir 5 . Örneğin respirasome düzeneği, elektron transferinin verimliliğini ve mitokondriyal iç zar 5 boyunca proton güdü kuvvetinin oluşmasını arttırır. Buna ek olarak, sentazomların bir araya getirilmesi sadece ATP üretiminin etkinliğini ve enerji eşdeğerlerinin sitoplazma 2'ye aktarılmasını arttırmakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal iç zar da boru şekilli cristae 6'ya kalıplar./ Sup> 7 . Fare embriyolarında kardiyak gelişim sırasında süper kompleks birleştirme çalışmaları, kalpteki Cx-I içeren süper kompleks oluşumunun yaklaşık embriyonik gün 13.5 8'de başladığını göstermektedir. Bazıları, yaşlanma veya iskemi / reperfüzyon yaralanmaları 9 , 10 nedeniyle kalpte Cx-I içeren süper kompleks miktarının azaldığını veya nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesinde rol oynayabileceğini göstermiştir.

Bu protokol, ETC kompleksleri ve süper komplekslerinin toplanması ve aktivitesini araştırmak için kullanılabilen yerli jel PAGE için yöntemleri açıklamaktadır. Mitokondriyal süper komplekslerin yaklaşık molekül ağırlığı, protein komplekslerinin CN veya BN poliakrilamid jeller ile ayrılmasıyla değerlendirilebilir. CN PAGE ayrıca tüm mitokondriyal komplekslerin enzimatik aktivitesinin jel içinde doğrudan görselleştirilmesini sağlar (in-jel deneyleri;IGA) 12 . Bu çalışma, CX-I'in IGA yoluyla NADH'yi oksitleme kabiliyetini ve IXA tarafından Cx-V'nin ATP-hidrolize edici aktivitesine bağlı olarak sentazomların varlığını vurgulayarak respirasomların aktivitesini gösterir. Cx-I ve Cx-V içeren çoklu kompleksler ve süper kompleksler, proteinlerin nitroselüloz membranlara aktarılması ve imünoblotlama yapılması ile de gösterilebilir. Bu yaklaşımın avantajı, BN veya CN PAGE'nin genellikle protein komplekslerini fizyolojik büyüklükleri ve bileşimine göre ayırmasıdır; Bir membrana transfer bu bant modelini korur. Bir BN veya CN PAGE'deki protein komplekslerinin analizi, 2D-PAGE (bir gösteri için bkz. Fiala ve diğerleri 13 ) veya sakkaroz yoğunluğu santrifüjleme 14 , 15 ile de yapılabilir. Belirli bir bandı daha ayrıntılı olarak analiz etmek için, BN PAGE'den çıkarılabilir ve bu protein kompleksinden alınan proteinler saflaştırılabilirD onları doğal koşullar altında elektro-eriterek. Doğal elektroelüsyon, birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir, bu da bir jelden proteinlerin çevresindeki tampona pasif difüzyona (Referans 16'da kullanıldığı gibi) önemli bir fark yaratabilir.

Özetle, bu yöntemler, yüksek molekül ağırlıklı süper komplekslerin mitokondriyal membranlardan daha fazla karakterize edilmesini sağlayan birkaç yaklaşımı açıklamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler, C57BL / 6N farelerinden (vahşi tip) kalpler kullanılarak gerçekleştirildi. Fareler, servikal dislokasyon öncesinde CO 2 ile anestezi altına alındı ​​ve tüm prosedürler, Rochester Üniversitesi Laboratuar Hayvanları Tıbbı Birimi'ne ve devlet yasalarına, federal tüzüğe ve NIH politikasına uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol, Rochester Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (Hayvan Kaynakları Üniversite Komitesi) tarafından onaylandı.

1. CN ve BN SAYFASI

NOT: BN ve CN PAGE için kullanılan tüm teçhizat deterjan içermemelidir. Bunu sağlamak için, tüm ekipmanı 0.1 M hidroklorik asit ile yıkayın ve bunu takiben deiyonize H20 ile durulayın.

  1. Hazırlık
    1. 4 mM'de, 25 mM imidazol, pH 7.0'dan oluşan anot tamponunu hazırlayın; 4 ° C'de saklayın.
    2. Katot tamponunu CN veya BN PAGE için hazırlayın.
      1. CN PAGE için 7.5 mM imidazol ve 50 mM trişin kullanın; Litre tampon başına 0.5 g sodyum deoksikolat ve 0.2 g lauril maltozid ilave edin. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
      2. BN PAGE için, 7.5 mM imidazol ve 50 mM trişin kullanın ve pH'yı 4 ° C'de 7.0'a ayarlayın. 4 ° C'de saklayın.
      3. Açık mavi BN katot tamponu için 7.5 mM imidazol ve 50 mM trişin kullanın. PH'ı 4 ° C'de 7.0'a ayarlayın ve litre tampon başına 20 mg Coomassie ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
    3. Ekstraksiyon tamponunu (EB) 50 mM NaCl, 50 mM imidazol, 2 mM aminokaproik asit ve 1 mM EDTA ile hazırlayın. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    4. 75 mM imidazol ve 1.5 M aminokaproik asit ile 3x jel tamponu (BN ve CN jelleri için kullanılır) hazırlayın. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    5. 0.01 g Ponceau S, 5 gr gliserol ve 5 mL H 2 O'dan oluşan bir yükleme tamponu (LB) hazırlayın. Odasıcaklık.
    6. 1 mL 500 mM 6-aminoheksanoik asite 50 mg Coomassie ekleyerek Coomassie mavisi hazırlayın. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    7. H20 içinde 20 mM ve 200 mM lauril maltozid hazırlayın. 200 uL'lik alikotları yapın ve dondurularak saklayın. Kullanmadan önce deterjanı çözün.
% 3 ila% 8 (mini) % 4 ila% 10 (maksimum)
0.5 jel (ışık) 0.5 jel (ağır) 0.5 jel (ışık) 0.5 jel (ağır)
AAB (mL) 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN tamponu (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H20 (mL) 2.7 1.4 14 6.3
Gliserol (g) 0 0,47 0 2.5
Hacim (mL) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tablo 1: 1 Mini veya Maxi-PAGE'yi Dökmek İçin Gerekli Malzemelerin Miktarları. Bu tabloda kullanılan ciltler, 1.5 mm kalınlığında 1 mini veya 1 maxi-jel için hesaplanmıştır. AAB hacmi,% 40 stok çözeltisine dayanıyor. Hafif ve ağır konsantrasyona işaret eder.AAB'nin iyonu. Degrade karıştırıcının her bir sütununun AAB çözeltisi ile doldurulmasından sonra APS ve TEMED eklenir.

  1. Dökme ve koşu jöleleri
    NOT: sırasıyla CN veya BN jelleri için% 3-8 veya% 4-10 akrilamid / bisakrilamid (AAB) gradyan kullanın. Tablo 1 , bir mini jel (85 mm genişlik x 73 mm yüksek x 1.5 mm kalınlık) veya maxi-jel (160 mm) için kullanılan tampon, AAB, H20, gliserol, amonyumperülfat (APS) ve tetrametiletilendiamin'in (TEMED) miktarlarını özetlemektedir Mm genişlik x 200 mm yükseklik x 1.5 mm kalınlık). CN veya BN jelleri ile cam plakaların montajları birkaç mL 1x jel tamponlu bir torbada soğutulabilir veya saklama için 1x jel tamponu ile ıslatılmış kağıt havlu içine sarılabilir. Jeller, bir haftaya kadar kullanım için kararlıdır.
    1. Jel dökmek için, jelin hazırlanmış jel odasına yerçekimi tarafından akmasını sağlamak için degrade karıştırıcıyı yükseltilmiş bir karıştırma plakasına yerleştirin.
    2. Degrade karıştırıcının çıkış odasını 4.77 / 25 mL (Mini / maxi) (daha yüksek AAB konsantrasyonu ile).
    3. Ağır ve hafif haznenin durdurma musluğunu yavaşça açın ve diğer tarafa doğru bir damla solüsyon akmasını sağlayın.
      NOT: Bu, iki hazne arasındaki akışı engelleyecek şekilde bağlantı tüpünden ve durdurma musluğundan gelen hava kabarcıklarını iter. Bu, her iki tarafın da zaten doldurulmuş olması halinde yapılamaz, çünkü eşit basınç kabarcığın içinden geçmesini önleyecektir.
    4. Degrade karıştırıcının diğer odasını 4.72 / 25 mL (mini / maxi) ışık özümüyle doldurun.
    5. Ağır çözelti ile dışarıya akış odasında bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırmaya başlayın. Kabarcık oluşturmayan bir karıştırma çubuğu hızı kullanın.
    6. Polimerizasyonu başlatmak için her bölmeye hızla APS ve TEMED ekleyin.
    7. Degrade mikseri iki odası arasındaki bağlantıyı açın ve jel dökmek için çıkış odası açmadan önce birkaç saniye karıştırmaya bırakın.
      NOT: Gravity wiHer iki odacığı eşit derecede boşaltacağım ve ışığın ağır çözeltiye karıştırılması akrilamid yoğunluğunu yavaş yavaş jelin tepesinden altına düşürecektir. Jel dökmek için degrade karıştırıcıdaki tüm içeriği kullanın.
      1. Sonunda, kabarcıkları ve katmanı karıştırmayı önlemek için tarağı jelin içerisindeki oyuklarla dikkatlice monte edin.
    8. Herhangi bir jelin durulanması için degrade karışım maddesini etanol ile hemen yıkayın. Su ile durulayın ve ikinci jeli dökün. Jellerin polimerize olmasına izin verin (genellikle mini jeller için 20 dakikadan az gerekir).
    9. Jelleri çalıştırmak için, elektrot montaj kelepçesine takın ve orta / üst bölmeyi CN veya açık mavi BN katot tamponu ile doldurun. Anot tamponunu dış / alt bölmeye eklemeden önce kaçak olup olmadığını kontrol etmek için birkaç dakika bekleyin.
      1. Nazikçe kuyu taraklarını çekin ve bir şırınga veya pipet kullanarak kuyuları katot tamponu ile yıkayın.
      2. Jelleri soğuk bir odada (4 ° C) çalıştırın veya tamamen buz içerisinde paketleyin.
        1. CN mini-PAGE için, ilk saat 100 V, tamamlanıncaya kadar 200 V, genelde ek bir 1-1.5 saat kullanın. Alternatif olarak, CN mini-PAGE'i gece boyunca 30-40 V'de çalıştırın.
          NOT: Buradaki odaklanma, yüksek molekül ağırlıklı protein kompleksleri üzerindedir, bu nedenle, 140 kDa'dan daha düşük bir molekül ağırlığına sahip protein kompleksleri jelden kaçacaktır. Düşük molekül ağırlıklı kompleksleri korumak için elektroforez için daha kısa çalışma süreleri kullanılabilir.
        2. BN maxi-PAGE için 100 V kullanın ve gece boyunca jelleri çalıştırın (yaklaşık 18 saat).
          NOT: Akım çok düşük (<15 mA) olacaktır, bu nedenle bu koşulları yerine getirebilecek bir güç kaynağı gerekir. Bu noktada, jeller IGA veya imünoblotlama için kullanılabilir. Bazı durumlarda, elektrik elüsyonu için bir cam plaka üzerine bir jilet kullanarak jetlerden bantlar veya şeritler kesilebilir.
  2. örnek hazırlama
    NOT: Membran bağlı mitokondriyal süper kompleksler,İç mitokondrial zar. Mitokondriyal süper kompleksleri korumak için, yeni izole edilmiş mitokondri ya da sadece bir kez dondurulmuş ve çözülmüş numuneler kullanın. Aşağıdaki hesaplamalar / hacimler, mini jel (1.5 mm kalınlığında bir jelde 10 kuyucuklu tarağın kuyusu, 35-40 μL'ye kadar tutar) ve maxi jeller (15 kuyucuklu kuyucuğun kuyusu için geçerlidir) için verilmiştir. 200 uL). Buna ek olarak, bir yükleme kontrolü olarak voltaja bağlı anyon kanalının (VDAC) tespiti için bir denatüre SDS jel üzerinde çalışacak şekilde, her numunenin bir bölümünü (genellikle 10 uL) saklayın.
    1. Mikrotüblerde izole mitokondriyum veya doku homojenatına uygun bir miktarda (mini jel için 10-50 μg protein ve maksimal jel için 50-200 μg) yerleştirin ve 4 ° C'de 10-15 dakika süreyle 17.000 xg'de santrifüjleyin.
      NOT: Bu adım, çözünür mitokondrial matris ve / veya sitosolik proteinlerin bir kısmını ortadan kaldırır.
    2. Süpernatantı aspire edin ve atın ve ekstraksiyon tamponu arzu edilen miktara ekleyinJel üzerine yüklemek için. Çökeltiyi buz üzerinde yavaşça tekrar süspanse edin. İsterseniz, bu noktada genel bir proteaz inhibitörü karışımı ekleyin.
      NOT: Burada kullanılan ekipmana dayanarak, bir mini jel için 30 uL ve maksi jel için 100 uL, proteinin / tampon oranının 2 mcg'den fazla proteine ​​1 uL tampona sınırlandırılması için kullanıldı.
    3. Deterjan ekleyin ( örneğin, 2 μg lauril maltozid / 1 μg protein, daha fazla bilgi için Temsilcilik Sonuçlarına ve Tartışmaya bakın).
      NOT: Genellikle, lauril maltosid kullanılır, ancak digitonin de kullanılabilir.
    4. Buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Tüpü öğütmek ve / veya çalkalamak suretiyle, başlangıçta ve bazen inkübasyon sırasında nazikçe karıştırın.
    5. Herhangi bir membran ve doku parçasını kaldırmak için 4 ° C'de 10 dakika süreyle 17,000 xg'de santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. CN örnekleri için her 10 μL örnek hacmi için 1 μL LB ekleyin; Numunenin toplam hacmi app olmalıdırBir mini jel için yaklaşık olarak 40 μL ve maksimum jel için 130 μL. BN numuneleri için, boya ile deterjana oranı 1: 4 (a / a) olacak şekilde numunelere Coomassie ekleyin.
    7. Örneklerin sırasıyla 30 ve 120 μL'sini mini veya maxi-jelin oyuklarına yükleyin. VDAC'yi yükleme kontrolü olarak algılamak için denatüre SDS jeli için her bir örnekten kalan 10 μL'yi kullanın.
    8. Moleküler ağırlık belirteçlerini hazırlamak için, 60 μL BN / CN jel tamponundaki bir yüksek molekül ağırlıklı kalibrasyon karışımının 1 şişesini (daha fazla bilgi için Malzeme Tablosuna bakın) çözündürün ve 120 μL H 2 0 ve 20 uL 1 POUND = 0.45 KG. Şerit başına 15 μL yükleyin.
    9. Adım 1.2.9.2'de belirtildiği gibi jelleri çalıştırın.

2. Cx-I ve Cx-V için jel Analizleri

NOT: Testler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Belgeler için gelişen bantların fotoğraflarını, taramalarını veya görüntülerini alın. (Önemli) Proteinler ont üzerinden transfer edilemezO nitroselüloz membranlar bir IGA tamamlandıktan sonra.

  1. Cx-I tahlili
    1. Hazırlık.
      1. 7.4'lük bir pH ile H20'da 5 mM Tris'lik bir deney tamponu hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
      2. 10 mg NADH'yi 1 mL tahlil tamponu içinde eritin. Kullanıma kadar -20 ° C'de 100 uL'lik alikotlar halinde saklayın; Donma ve çözülmeyi önleyin.
      3. 25 mg Nitroblue tetrazolyum'u mikrotuba koyun.
      4. 95 mL H20'da 5 mL asetik asit inceltilerek fiksatif hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
    2. Tahlil gerçekleştiriliyor.
      1. 10 mL tahlil tamponu, 25 mg Nitroblue tetrazolyum (nihai konsantrasyon: 2.5 mg / mL) ve 100 μL 10 mg / mL NADH (0.1 mg / mL) ile birleştirin. Bunu, bir jel jelden çıkarılan tüm jel, bir şerit veya ilgi alanı ekleyin.
        NOT: Bu, açık bir plastik veya cam kap içinde yapılabilir. Lütfen bu tahlilin BN PAGE'den sonra gerçekleştirilemeyeceğini unutmayın.
      2. > 3 dakika boyunca hafifçe çalkalandıktan sonra (külbütör) mavi bantların gelişimini takip edin.
      3. Jeli 10-20 mL asetik asit solüsyonu içinde sabitleyin veya reaksiyonu durdurmak için 5 mM Tris, pH 7.4 içinde yıkayın. Dokümantasyon için fotoğraf çekin (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Cx-V tahlili
    NOT: Cx-V tahlili, Cx-V-bağımsız aktivitesini göstermek için bir tanesi 5 ug / mL oligomisin (bir Cx-V inhibitörü) ile inkübe edildiğinde, kopya CN veya BN jelleri kullanılarak yapılmalıdır.
    1. Hazırlık.
      1. 35 mM Tris ve 270 mM glisin ile bir deney tamponu hazırlayın; Oda sıcaklığında pH'ı 8.3'e ayarlayın. Tamponu 50 mL'lik alikotlar halinde dondurulmuş olarak saklayın, ancak dondurarak ve çözdükten sonra pH değerini kontrol edin.
      2. H20'da 1 M MgS04 hazırlayın; Kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
      3. 27.28 mg Pb (NO3) 2'yi bir mikro tüpe koyun.
      4. 60 mg ATP'yi bir mikro tüpe girin.
      5. 1 mg o çözünür1 mL etanol içindeki ligomisin. Kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
      6. 50 mL metanol 50 mL H20 ile karıştırılarak bir fiksatif hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
    2. Tahlil gerçekleştiriliyor.
      1. 10-20 mL tahlil tamponu ± 5 μg / mL oligomisin (50-100 uL 1 mg / ml oligomisin) içerisinde hafifçe çalkalamayla (rocker) 2 saat boyunca bir BN veya CN jelden bir jel, şerit veya ilgi alanı inkübe edin, ML etanol) oda sıcaklığında ilave edildi.
      2. İnkübasyondan sonra, tamponu 14 mL taze tayin tamponu ile değiştirin ve sırayla, 190 uL 1 M MgS04 (14 mM), 27.28 mg Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg ATP 8 mM) ve 75 uL oligomisin (gerekirse).
      3. Oligomisin ile muamele edilmiş jellerin üzerindeki bantlar Cx-V'ye bağlı olmayan bantlar verecekleri için yumuşak bir ajitasyonla (rocker) kuluçkaya yatın ve beyaz bir çökelti için izleyin.
        NOT: Çökeltinin görünümü birkaç saat sürebilir.
      4. Jeli metanol-( Örn., % 50 metanol), çünkü asidik çözeltiler kurşun çökeltisini çözer. Sonuçları fotoğraflayın.
        NOT: Kurşun çökeltisi, jellerin Coomassie boyanmasına müdahale etmez.

3. Nitro Selüloz veya Poliviniliden Difluorid (PVDF) Membranlara Protein Transferi

  1. 25 mM Tris ve 200 mM glisin'den bir transfer tamponu hazırlayın. PH'ı 8.3'e ayarlayın ve 0.0005 g / L SDS ve 200 mL / L metanol ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
    1. Bir nitroselüloz veya PVDF zarı (gözenek boyutu: 0.45 μm) jiletin biraz daha büyük bir tıraş bıçağı veya makasla kesin.
      NOT: Nitro selüloz zarlar Ponceau S boyamasının protein yüklemesini değerlendirmesine izin verirken, PVDF zarları daha keskin tanımlanmış bantlar üretir.
  2. Protokol.
    1. Nitroselüloz zar, filtre kağıdı ve süngerleri birTransfer tamponunda en az 10 dakika. PVDF zarını 15 saniye süreyle% 100 metanolde veya üretici önerisine göre aktarım tamponuna yerleştirmeden önce yerleştirin. Transfer kitinin açık kasetini, transfer tamponu bulunan düz bir kaseye yerleştirin.
    2. Kasetin arka tarafına sünger ve 1-2 kat filtre kağıdı yerleştirin. Kabarcıkları çıkarın.
    3. Jeli filtre kağıdına yerleştirin. Jelin ve / veya zarı bir köşesinden kırparak jelin yönünü belirtin.
    4. Membranı jelin üzerine yerleştirin. Tüm kabarcıkları çıkarın.
    5. Membran üzerine filtre kağıdı ve sünger koyun. Bu sandviçteki tüm kabarcıkları çıkarın.
    6. Kaseti kapatın ve aktarma kitinin kaset yuvasına yerleştirin.
    7. Proteinleri yaklaşık 12-18 saat boyunca 25 V'de aktarın.

4. Immünoblotting

  1. Hazırlık.
    1. Ponceau Lekesi (500 mL) 25 mLAsetik asit ve 0.5 g Ponceau S'den 475 mL H20'ya; Oda sıcaklığında saklayın (tekrar kullanılabilir).
    2. Tris tamponlu salin (TBS), 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Baz ve 2.7 mM KCI ile hazırlanır. PH'ı 8.0'a ayarlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
    3. TBS'ye 0.5 mL / L Tween 20 ekleyerek TBS-tween (TBST) hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
    4. 5 g süt katığını 100 mL TBST'ye eriterek süt katı / TBST hazırlayın. 4 ° C'de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
    5. 3 g sığır serum albümini (BSA, fraksiyon V) 100 mL TBST içinde eritilerek BSA / TBST hazırlayın. 4 ° C'de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
  2. Protokol.
    1. Transfer tamamlandığında, aktarılmış tüm proteinleri görselleştirmek için membranı Ponceau S çözeltisine yerleştirin. Membran üzerindeki işaretlerin konumunu kalemle etiketleyin ve Ponceau-S-lekelenmiş membranı fotoğrafla tarayın veya tarayın.
    2. Membranı 3 kez her 10 dakikada bir yıkayınYumuşak bir çalkantı altında.
    3. Memeyi süt katıları / TBST ile 1-2 saat oda sıcaklığında veya yavaşça çalkalamayla soğuk bir odada bir gece boyunca bloke edin.
    4. Membranı yumuşak ajitasyon altında TBST ile 10 dakika boyunca yıkayın.
    5. Hafif ajitasyon altında soğuk odada gece boyunca birincil antikor ile inkübe edin. Antikoru ( örneğin anti-ATP5A için 1: 1000 ve -NDUFB6) BSA / TBST'de seyreltin.
      NOT: Çoğu antikor, gece boyunca inkübe edildiğinde yerli jellerden zarlar üzerinde daha iyi bir sinyal verir.
    6. Membranı yumuşak ajitasyon altında TBST ile 10 dakika boyunca yıkayın.
    7. Oda sıcaklığında en az 60 dakika ikincil antikor ile inkübe ederek yumuşak çalkalamayı sağlayın. Süt katıları / TBST içinde antikoru (1: 5,000 ila 1: 50,000) inceltin.
    8. Membranı oda sıcaklığında 10 dakika 3 kez yıkayın, TBST yumuşak ajitasyonla uygulayın.
    9. Son yıkama sırasında, geliştirilmiş kemolüminesans (ECL) substratını manufa talimatlarına göre hazırlayıncturer.
    10. Memeyi üreticinin talimatları doğrultusunda ECL substratı ile inkübe edin.
    11. ECL alt tabakasının üreticisi tarafından verilen talimatları kullanarak film üzerindeki sinyali algılayın.

5. Elektroelüsyon

  1. Hazırlık.
    1. 25 mM triksin, 3.75 mM imidazol (pH 7.0, 4 ° C) ve 5 mM 6-aminoheksanoik asitten oluşan bir elüsyon tamponu hazırlayın.
      NOT: Harici proteinlerle kontaminasyonu önlemek için elektroöldürücü ve membran kapaklarını tutarken eldiven kullanın.
  2. Elektroeluteri yerli elektroelüsyon için kullanmadan önceki gün, aşağıdakileri gerçekleştirin:
    1. Zar kapakları (kesme: 3.5 kDa) elüsyon tamponunda 60 ° C'de 1 saat süreyle bekletin. Kapakları taze elüsyon tamponuna aktarın ve buzdolabında 12 saat veya daha uzun süre ıslatın.
      NOT: Kesilen bir molekül ağırlığı 3.5 kDa küçük p kaybını önlerIlgi konusu protein kompleksinden kolaylıkla ayrışabilen roteinler.
    2. Elektroeluter modülünü, cam tüpleri, tankı ve kapağı etanol ile iyice yıkayın. Su ile durulayın ve ekipmanın kuru kalmasına izin verin.
  3. Yerli elektroklorizasyonun yapıldığı gün aşağıdakileri yapın.
    1. Kullanılacak her cam borunun altına (buzlu) bir cam hamuru yerleştirin. Gerekirse, cam tüpü elüsyon tamponuna yerleştirin ve cambeyi tüpün içinden altına doğru itin.
    2. Cam tüpünü frit ile birlikte elektrohidrolik düzeninin modülüne itin. Yığın yıkama tamponu ile ıslatın ve cam tüpü yerine kaydırın. Cam tüplerin üstlerinin yaldız bile olmasına dikkat edin.
    3. Boş grometleri durdurucuyla kapatın.
    4. Silikon adaptörün altına ıslak bir zar kapağı yerleştirin ve adaptörü elution buffer ile doldurun. Diyaliz zarının çevresindeki hava kabarcıklarını gidermek için yavaşça adaptördeki tamponu piplayın. </ Li>
    5. Tamponla dolu adaptörü cam tüpün altına kaydırın. Cam tüpün içindeki hamurda görünen tüm kabarcıkları çıkarın.
    6. Her cam boruyu elüsyon tamponuyla doldurun.
    7. Çıkartılan BN PAGE bantlarını cam tüplere yerleştirin (basamağa 1.2.9.3'e bakın). Büyük parçaları küçük parçalara kesin. Cam tüpün içindeki dolum yüksekliğinin yaklaşık 1 cm olduğundan emin olun.
    8. Tüm modülü depoya yerleştirin.
    9. Depoya yaklaşık 600 mL soğuk yıkama tamponu ekleyin. Diyaliz membranında kabarcıkları önlemek için silikon adaptör kapaklarının tamponda olduğundan emin olun.
    10. Deponun altına bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
      NOT: Karıştırma baloncukların diyaliz zarının altına yapışmasını önleyecektir.
    11. Soğuk bir odada proteinleri 350 V'de 4 saat boyunca eleyin.
    12. Elüsyon tamamlandıktan sonra, elektrolüiter modülü tampon deposundan çıkarın ve bir lavaboya veya kaseye yerleştirin.
    13. Bir tıkaç kullanılmışsa, drapeyi çıkarınÜst tampon bölmesinde. Aksi takdirde, tamponu çıkarmak için büyük bir pipet kullanın.
    14. Her bir cam borudan tampon çıkarın ve atın. Silikon adaptörün yerinde kalmasını ve fritin altındaki sıvının rahatsız edilmemesine veya sarsılmamasına dikkat edin.
    15. Silikon adaptörü cam tüpün altındaki membran kapağı ile birlikte dikkatlice çıkarın. Silikon kapağın içeriğini (yaklaşık 400 μL) bir mikrotube içine pipetleyin. Elüsyon tamponundan 200 μL daha ilave edin, silikon kapağı durulayın ve mikro tübün içine ekleyin. Tüm cam tüpler için tekrarlayın.
    16. Membran kapakları tekrar kullanılabilir olduğundan, membran kapaklarını, 0.5 mg / mL sodyum azid içeren yıkama tamponuna yerleştirerek koruyun. Onları soğutun.
      NOT: Eluatın protein konsantrasyonu düşüktür ve bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak konsantre edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mitokondriyal süper kompleksleri görselleştirmek için, farelerden yeni izole edilen mitokondri 17 , 18'de kullanıldı. Mitokondriyal süper kompleksler, bazı araştırmacılar için tolere edilebilir olmasına rağmen tekrar tekrar donma ve çözülme döngülerine duyarlıdır ve parçalanmalarına neden olur. Depolama için dondurma gerekiyorsa, en iyi sonuçların elde edilmesi için numunelerin birden fazla donma ve çözülme döngüsünden geçmemesi gerekir.

Mitokondrial ETC komplekslerini BN PAGE ile görselleştirmek için izole edilmiş kalp mitokondrilerinden 100 μg protein% 4-10 jel üzerine yüklenmiştir ( Şekil 1A ). Yükleme ve katot tamponundaki Coomassie lekesi, çalıştırma sırasında protein komplekslerini etiketlemek için yeterlidir. Süper kompleksler kontrastı dijital olarak arttırdıktan sonra ortaya çıkar (gösterilmemiştir). CN PAGE için, 20 ug o'nun iki örneğiF proteini,% 3 - 8 CN jel üzerine yüklendi ve ayrıldı ( Şekil 1B ). CN PAGE Coomassie ile lekelenmiş ve protein komplekslerini görselleştirmek için tahrip edilmiştir. Karşıtlığı dijital olarak artırdıktan sonra, Cx-I monomerinden daha büyük bir molekül ağırlığına sahip birkaç protein kompleksi ortaya çıktı ( Şekil 1B , sağda). Kullanılan AAB konsantrasyonları en büyük süper komplekslerin kuyudan jöre girmesine izin verdi. Bununla birlikte,% 3'ten daha düşük bir gradyan ile biten bir jel, transfer için veya bir bandın veya şeritin çıkarılması için manipüle edilemeyecek kadar kararlı değildir. Buna ek olarak,% 3-8 CN jellerin üst bölümlerinde AAB'nin düşük konsantrasyonu protein komplekslerinin bir miktar hareketliliğini sürdürür; bu da doğal elektroklorizasyon dikkate alındığında önemlidir 19 .

Cx-I monomerler ve süper kompleksleri ve C monomerleri, dimerleri ve süper kompleksleriXV, enzimatik olarak aktiftir ve IGA ile görüntülenebilir ( Şekil 1C -F ). Deneyler, izole kalp mitokondrilerinde, Cx-I ve Cx-V'nin, ilgili monomerlerinden daha büyük protein komplekslerinde bulunduğunu göstermektedir. Cx-I için IGA tahlilinde NADH oksitlenir ve nitroblue tetrazolyumu indirgemek için elektronlar aktarılır. Bu, Cx-I monomerlerinin ve Cx-I içeren respirasomların / süper komplekslerin moleküler ağırlığında lokalize mavi renk ile sonuçlanır ( Şekil 1C ). Cx-V aktivitesi, F 1 alt biriminin ATP'yi hidrolize etme kabiliyetinden değerlendirilir ve CN veya BN jelleri kullanılarak yapılabilir ( Şekil 1D -F ). Bu reaksiyon sonucu oluşan ADP, kurşun ile etkileşime girer ve Cx-V monomerler, dimerler, synthasomes ve alt kompleksler seviyesinde beyaz bir çökelti ile sonuçlanır (muhtemelen Cx-V'nin birleştirilmemiş F 1 kısmı). Oligomisin'in lBu bantların kapatılması, Cx-V içerdiklerini doğrulamaktadır ( Şekil 1E ).

Burada açıklanan tüm deneyler için zwitterionik deterjan lauril maltozid, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar verirken süper kompleksleri koruyan en yüksek konsantrasyon olan 2 μg / 1 μg protein konsantrasyonunda kullanılmıştır ( Şekil 1F ). Bununla birlikte, lauril maltosidin etkinliği parti numarası, depolama koşulları ve yaşa bağlıdır. Dolayısıyla, bir laboratuarda kullanılan kesin konsantrasyon el yazmalarında bildirilenle aynı olmayabilir. Deterjan konsantrasyonu membranları çözündürecek, ancak kompleksleri ve süper kompleksleri sağlam tutacak ve lauril maltosid konsantrasyonlarını kullanarak belirlenecektir ( Şekil 1F ). CN PAGE için, oyuk başına 40 mcL'lik toplam bir numune hacmi hazırlandıBurada 1 μg / 2 ug protein / deterjan oranı veya 1 ug / 1 uL (1.9 mM'ye eşit) bir deterjan / tampon oranı elde edilir. 40 μL'den itibaren mini jelin oyuk başına 30 uL uygulanmıştır; Geriye kalan, bir yükleme kontrolü olan VDAC'nin algılanması için bir kısım olarak kullanılmıştır ( Şekil 2D ).

İmmünoblotlama için, proteinler Coomassie ile yüklenmediğinden, antikorlarla bulguyu etkileyebileceğinden, CN, BN PAGE'ye tercih edilir. Şekil 2 , izole edilen kalp, karaciğer ve beyin mitokondrilerinden Cx-I ve Cx-V proteinleri NDUFB6 ve ATP5A içeren süper komplekslerin saptanmasını göstermektedir. Ponceau S transferden sonra ve immünoblotlama öncesi etiketleme, moleküler ağırlık belirteçlerini işaretlemek ve protein yüklenmesini kontrol etmek için kullanılabilir ( Şekil 2A ). Bu, ETC'nin protein komplekslerinin monomerlerini nitrocellul üzerinde görselleştirecektirOse zarları içerir, fakat Ponceau S etiketi immünoblotlama ile elde edilebilen mitokondriyal süper komplekslerin görselleştirilmesi için her zaman yeterli değildir ( Şekil 2A ).

Cx-I, kendi başına dimer ve tetramerlerle bir araya gelmez, ancak Cx-III ve Cx-IV 14 , 20 , 21 ile giderek daha yüksek molekül ağırlıklı süper kompleks oluşturur. Burada, NDUFB6'ya karşı bir antikor kullanılması, kalpten alınan numunenin karaciğerden veya beyindeki mitokondriyondan daha fazla Cx-I monomer ve yüksek molekül ağırlıklı süper kompleksler (en iyi bantlar) içerdiğini gösterir ( Şekil 2B ). Orta aralıktaki respirasome süper komplekslerin miktarı kalpte diğer dokulardan daha yüksekti ( Şekil 2B ).

Anti-ATP5A antikorlarını kullanarak,Cx-V monomerleri tüm dokulardan mitokondri içerisinde saptanabilirken, kalp mitokondrilerinde açıkça görülebilen dimerleri (D) ve daha büyük süper kompleksleri (SC) temsil eden farklı bant modelleri karaciğer ve beyin mitokondrinde belirgin değildir Şekil 2C ). İmmünobotun aşırı maruz kalması (1 dakika veya 20 saniye), tetramerler ve sentazomları temsil edebilen birkaç Cx-V içeren süper kompleksi gösterir ( Şekil 2C ). Kalp, karaciğer ve beyin mitokondrilerindeki Cx-V içeren protein komplekslerinin bu kalıpları, dokuya özgü ve henüz araştırılmamış farklılıkları göstermektedir.

Bu lekelerin protein yüklemesi, Şekil 2D'de gösterildiği gibi SDS PAGE ile Ponsce S boyaması ve yukarıda belirtilen alikuotun VDAC bulgulanması ile takip edilebilir.

Hepsi antibo değilKalıplar, doğal PAGE'den sonra bir protein kompleksinin kuaterner veya tersiyer yapı içindeki bir proteini algılamak için uygundur. Bu sorunun üstesinden gelmek için, yerli jelin tümü ve kısmi şeritleri ikinci bir boyut için bir denatüre jel üzerine monte edilebilir (2D jelleri, bir gösteri için Referans 13'a bakın). 2D elektroforez, supramolekül kompleksindeki proteinleri görselleştirmek için değerli bir araçtır. Bununla birlikte, Şekil 2'de gösterildiği gibi, süper kompleksler değişken miktarlarda bulunur ve süper komplekslerden gelen tek tek proteinlerin sinyali, ikinci denatürasyon boyutunda görselleştirmek zor olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, burada yerli jellerden protein komplekslerinin elektroklorizasyonu kullanıldı. Bu, ileri inceleme için daha fazla materyal üretmek için çok katlı şeritlerden oluşan süper kompleks bantları izole eder.

Elektroelüsyon kullanılırken yalnızca IGA tarafından tanımlanan ve / veya bir BN PAGE üzerinde görselleştirilen ilgi bandı,ised; Bu jel parçasından gelen proteinler, jelden elüsyon ile daha da saflaştırılır. Şekil 3A , monomeri temsil eden bantların elektroelüsyon için eksize edildiği bir BN PAGE şeridini göstermektedir. Elektrolizasyondan sonra monomerin Cx-V etkinliğini değerlendirmek için eluat ikinci bir CN PAGE'ye uygulandı. Monomerin eluatı hala enzimatik olarak aktif Cx-V içerir, ancak alt kompleksler de görülür ( Şekil 3B ). Eliminasyonun doğal CN PAGE ( Şekil 3C ) veya denatüre SDS PAGE ( Şekil 3D ) sonrasında gümüş boyaması, eluatta proteinlerin varlığını ve ATP5A'ya karşı imünoblotlama, her iki numunede de Cx-V varlığını gösterir ( Şekil 3D ).

Şekil 1
Şekil 1: Mitokun GörselleştirilmesiOndrial Supercomplexes. ( A ) İzole edilmiş kalp mitokondri örnekleri ile,% 4-10 BN maxi-jelin iki şeridi. Aynı numunenin alikotları, her şeritte, göz başına 100 ug protein ile çalıştırıldı. ETC'nin I, II, III, IV ve V protein komplekslerinin monomeri açıkça görülür ve jelin sağında etiketlenir. ( B ) İki kalp mitokondri (1 ve 2, 20 μg protein / şerit) bir CN PAGE'de ayrılmış ve Coomassie boyaması ile görüntülenmiştir. SC, süper komplekslerin jelin üst kısmının büyütülmesinden ve sayısal olarak zenginleştirilmesinden sonraki konumunu belirtir (alan kırmızı oklarla gösterilir). ( C ) 20 μg mitokondriyal protein% 3-8 CN PAGE ile ayrılmış ve Cx-I IGA için işlenmiştir. Büyütülmüş ve dijital olarak zenginleştirilen görüntüler, Cx-I reaksiyon ürünlerinin bantlarını gösterir. ( D )% 3-8 BN PAGE'de 20 μg mitokondriyal protein ayrılmış ve Cx-V IGA için işlenmiştir. magnifi Ed ve dijital olarak zenginleştirilmiş görüntüler Cx-V reaksiyon ürünlerinin bantlarını gösterir. ( E ) 50 ug mitokondriyal protein% 5-15 CN PAGE ile ayrılmış ve Cx-V IGA için (-) ve (+) 5 ug / mL oligomisin (Oligo) olmaksızın işlenmiştir. ( F ) Jelatin tepesinde belirtildiği gibi 2 - 6 μg lauril maltozid / 1 μg protein ile mitokondriyal protein (20 ug / şerit) çözündürüldü ve ardından% 3-8 CN jel üzerinde ayrıldı ve ardından Cx- VGA. Tüm resimler hafif bir masa ( A - C ) veya siyah bir yüzey ( D - F ) kullanılarak fotoğraflandı. Kamera özellikleri Malzeme Tablosu'nda bulunmaktadır. Moleküler ağırlık belirteçlerinin (MW) konumu tüm panellerin sol tarafında gösterilir. Kısaltmalar: D = dimerler; F 1 * = Cx-V'nin alt kompleksi; LM = lauril maltosid; M = moleküler ağırlık markörü; M = monomerler; SC = Süper kompleksler.G1large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Immünoblotting ile Mitokondriyal Süper Komplekslerin Saptanması. Kalp (H), karaciğer (Li) ve beyin (B) mitokondriyumdan 20 ug protein% 3-8 CN PAGE'de ayrılmış ve nitroselüloz zara aktarılmıştır. ( A ) Membran Ponceau S boyaması, protein kompleksleri ve moleküler ağırlık belirteçlerinin varlığını gösterir (m). Mavi ok, jelin tepesine işaret eder. ( B ) Cx-I proteini, NDUFB6, (A) 'da gösterilen leke üzerinde (1 dakika maruz kalma süresi) immüno işaretlendi. ( C ) Cx-V, anti-ATP5A antikoru ile görselleştirildi (belirtilen şekilde 20 saniye ve 1 dakika maruz bırakıldı). (B) ve (C) 'deki kırmızı oklar, visua için büyütülmüş ve dijital olarak zenginleştirilmiş alanı gösterirCx-I ve Cx-V içeren süper komplekslerin lizasyonu ve mavi ok jelin üst kısmını işaret eder. ( D ) Ponceau S ve (A), (B) ve (C) 'de kullanılan her bir ekstraktın VDAC kısımlarının immünolojik olarak belirlenmesi, bunlar SDS PAGE ile ayrılmış ve nitroselüloza aktarılmıştır. Kısaltmalar: M = Cx-I veya Cx-V monomerleri, D = Cx-V dimerleri, SC = Cx-I veya Cx-V içeren süper kompleksler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: Cx-V'nin elektrikle eritilmesi. ( A ) Mitokondriyal bir numunenin BN PAGE. Kutulu bant, eksize edilen ve elektrolize olan Cx-V monomerini temsil eder. ( B ) Elüat, CN PAGE'ye tabi tutuldu ve Cx-V için takip eden IGA, monomerler (M)Ve Fx Cx-V içeren alt kompleksler. ( C ) Eluatın CN PAGE'sinin gümüş renginde boyanması monomerleri (M) göstermektedir. ( D ) Eluatın bir denatüre edici sodyum dodesil sülfat (SDS) PAGE'sinin ATP5A (sağ panel) için gümüş boyama (sol panel) ve imünoblot Cx-V varlığını belirtir. SDS PAGE için lütfen başka yerde yayınlanmış protokollere bakın. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mitokondriyal ATP üretimi için fonksiyonel bir ETC gerekir. ETC kompleksleri, iki tip süper kompleks oluşturabilirler: respirazomlar (Cx-I, -III ve -IV) 1 ve synthasomes (Cx-V) 2 . ETC'nin süper kompleksler halinde düzenlenmesinin, toplam ETC verimliliğini arttırdığı düşünülürken, her bir kompleksin sağlam bir ETC için bir araya getirilmesi gerekiyor 5,22. Bu süper komplekslerin nasıl bir araya gelip parçalarına ayrıldığı iyi anlaşılmamıştır, ancak burada sunulan protokoller bu süreçlerin daha iyi anlaşılmasına olanak tanıyabilir.

ETC montajını incelemekteki en büyük zorluk, bu protein komplekslerinin büyüklüğüdür. Örneğin, mitokondriyal respirazomlar Cx-I (yaklaşık 880 kDa) ve Cx-III (460 kDa) ve Cx-IV (200 kDa, dimer olarak aktif) bir veya daha fazla molekülünden oluşabilir; bu da moleküler bir süper kompleks oluşturur Yaklaşık ağırlığı2.000 kDa. Buna ek olarak, Cx-V, yaklaşık 600 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahiptir; ancak, dimer, tetramer, oligomer ve dimer 7 , 23 şeritleri içine bir araya getirilerek, en azından 2.000 kDa bir molekül ağırlığına sahip süper komplekslere neden olduğu gösterilmiştir. Bu süper komplekslerin muazzam büyüklüğünü göz önünde bulundurarak, bu süper kompleksleri tanımlamak ve karakterize etmek için bazı laboratuarlar ve diğerleri tarafından kısmen ilgili yaklaşımlar kullanılmıştır ( 8 , 14 , 24) .

Bu çalışma, aktif protein komplekslerinin hafif deterjanlar kullanılarak mitokondriyal membrandan hafifçe ekstraksiyona tabi tutulduğu yerli jel PAGE tekniğini göstermiştir. Kompleksler jellerde öncelikle büyüklükleri ve iç yükleri (CN PAGE) nedeniyle veya protein bağlı Coomassie mavisinin (BN PAGE) boyut ve negatif yükünden dolayı göç eder. Bu jeller C kullanılarak boyanabilirProtein bantları ortaya çıkarmak için oomassie mavisi ( örneğin, CN jellerinde) veya gümüş leke (BN ve CN PAGE'de).

Burada gösterilen deneyler için Lauril maltosid kullanılmıştır, çünkü bu deterjan en güvenilir şekilde çalıştı. Alternatif olarak, protein kompleksleri 12 çıkarmak için digitonin kullanılabilir. Yetişkin kalpler, karaciğerler ve beyinlerden izole edilen mitokondriyalin verileri burada gösterilmiştir, ancak bu teknikler embriyonik ve erişkin kalp homojenatları 8 üzerinde gerçekleştirilmiştir. Diğerleri, kültürlenmiş hücrelerden izole edilmiş mitokondri kullanarak bu tekniği uygularlar 24 . Bununla birlikte, yüksek DNA içeriğine sahip doku homojenatlarını veya kültürlenmiş hücreleri kullanırken, elektroforez sırasında çizginin oluşmasını engellemek için bir nükleaz eklemek yararlı olabilir 25 .

Farklı komplekslerin aktivitesi burada, Cx-I ve Cx-V için gösterildiği gibi jel içinde ve tecCx-II, -III ve -IV 12 faaliyetlerini de inceleme olanakları vardır. Bununla birlikte, bu IGA'ları analiz etmek dikkatle yapılmalıdır. Birincisi, enzimatik reaksiyon, ETC olmayan enzimlere ya da tamamlanmamış komplekslere bağlı olabilir. Örneğin, bozulmamış Cx-V'yi inhibe etmek için oligomisin ile tedavi edilen paralel bir jel ile Cx-V IGA'nın gerçekleştirilmesi rutindir ( Şekil 3 ). Buna ek olarak, diğer NADH oksidazları Cx-1 in-jel aktivitesini açıklayabilir. Biri rotenon gibi Cx-I inhibitörünün varlığında paralel bir IGA gerçekleştirebilir. Bununla birlikte, Şekil 1'de , izole mitokondriyalar kullanıldı, bu nedenle sitoplazmik NADH oksidazları mevcut değildi; Bu nedenle, veriler muhtemelen Cx-I içeren monomerler ve süper kompleksleri temsil eder. Ek olarak, bu sonuçların nicelenmesi, fotoğraflardaki veya taramalardaki bantların sinyal yoğunluğunun ölçülmesi ile mümkündür. Bu yaklaşımın sakıncaları arasında veJel içinde, reaksiyon ürününün hareketliliğini, ürünün jel derinliği boyunca yeterince miktarlanamamasını ve tepkimenin potansiyel doğrusal olmamasını kapsar. Bunların üstesinden gelmek için bazıları seri fotoğraflar kullanarak reaksiyon oranlarını elde etmeyi önerdi ancak bu burada denenmedi.

Doğal jellerde protein membranlara da aktarılabilir ve bantların protein kompozisyonu imünoblotlama (burada gösterilmiştir) veya 2D PAGE (referans 13'de gösterilmiştir) ile incelenebilir. ETC komplekslerinin monomeri, geleneksel olarak izole mitokondrinin yerli jelleri, jel içindeki konumu ve moleküler markör proteini ile olan konumlarına göre zenginliği ile tanımlanmıştır ( Şekil 1 ). Dahası, sonraki immünoblotların farklı komplekslerin alt birimleri için spesifik antikorlarla etiketlenmesi, kompleksin ve bileşimin tanımlanmasına yardımcı olurSüper komplekslerin. Bu nedenle, anti-NDUFB6 ve -ATP5A, burada gösterildiği gibi sırasıyla Cx-1 ve Cx-V içeren monomerler ve süper kompleksleri tanımlar. Cx-II ila IV arasındaki antikorlar aynı amaca yönelik olarak kullanılabilir. Bazı durumlarda denatüre edici jellerde iyi çalışan antikorlar, bazı antikorların denatüre proteine ​​spesifik olması veya bir epitopun doğal bir komplekste diğer proteinler tarafından maskelenebilmesinden dolayı yerli jellerde iyi çalışmayabilir.

Bu süper komplekslerin molekül ağırlığının tam olarak belirlenmesi zordur çünkü mevcut moleküler ağırlık markerlerinin çoğu Cx-V monomerlerinin altındadır. Yerli bir jeldeki protein komplekslerinin göçü kullanılan boyuta, içsel yüke ve deterjana bağlıdır 28 . Buradaki örneklerde, komplekslerin monomeri, jellere, işaretleyicilere ve immünoblotlamaya dayanılarak tanımlandı. Cx-V'nin dimerleri, Cx-I ve -V'nin monomerlerine kıyasla göreli göçe dayalı olarak ve immüno üzerindekurutma. Jellerin, IGA'ların ve immünoblotların içindeki monomerler ve dimerler üzerindeki her şey süper kompleks olarak kabul edilir.

Standart teknikler kullanılarak bant yoğunluğunu analiz ederek süper kompleksler için doğal immünblotlar da ölçülebilir. Bu yöntem burada gösterilmemiştir; ancak yakın tarihli bir yayın bu tekniği 8 göstermektedir. Protein yüklemesinin normalleştirilmesi, şeridin Ponceau kırmızı boyası kullanılarak veya bir denatüre edici immünoblot üzerinde VDAC bandının yoğunluğunu ölçmek için mitokondrial ekstraktın bir örneğini kullanarak yapılabilir ( Şekil 2A ve D ). Ayrıca süper komplekslerin aynı immünoblottaki monomerlere oranının incelenmesi bant yoğunluğunu belirlemenin başka bir yoludur, ancak lekelerin gelişmesi sırasında farklı zamanlarda resim çekmek için bandların fazla maruz kalmamak için dikkatli olması gerekir.

Nihayet, yerli jellerden gelen bantlar saflaştırmak için elektro-eritilebilirD, daha yüksek dereceli kompleksler halinde bir araya gelebilen ve kompleks fonksiyonun ileri araştırmaları için kullanılabilen aktif protein kompleksleri. Örneğin, Cx-V monomerler daha önce elektro-eritilmiş ve elektriksel işlevselliği göstermek için lipozomlara dönüştürülmüştür 29 . Doğal elektroelüsyona alternatif bir yaklaşım, çevreleyen tampona 16 pasif difüzyon yoluyla elüsyon yapılmasıdır, ancak doğal elektroklorizasyona kıyasla yavaştır. Son olarak, elektroelüsyonla ilgili büyük bir problem, elektrolize olmuş protein kompleksinin enzimatik işlevini sürdürmesidir, çünkü kompleks saflaştırma sırasında ayrılabilir. Bu nedenle, bu tekniğe göre izolasyondan sonraki herhangi bir fonksiyon testi titizlikle test edilmelidir.

Bu protokolleri, bireysel ETC komplekslerinin fonksiyonunu ve tüm ETC 30'un aktivitesini ve diğer metotları araştıran enzimatik testler ve oksijen tüketimi ölçümleri ile birleştirerekOds, kristalografik 31 ve elektron mikroskopik 32 gibi komplekslerin ve süper komplekslerin yapısının değerlendirilmesi, ETC'nin iç işleyişinin tamamlayıcı bir resmini ortaya çıkabilir ve ortaya çıkmış olabilir. Karmaşıkların nasıl bir araya getirildiğini, elektronların zincirin altına nasıl aktığını ve degradeyi oluşturmak için protonların zar boyunca pompalanmasını ve daha sonra ATP oluşturmak için Cx-V vasıtasıyla matriste geri akışını anlamaya daha yakınız. Kuşkusuz, bu teknikler, ETC'nin yapısı, işlevi ve dinamik düzenlemesi hakkında ek bilgi sağlamak için daha da arıtılacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Kurucu Ortaklığı [12GRNT12060233] ve Rochester Üniversitesi'ndeki Güçlü Çocuk Araştırma Merkezi'nden hibeler tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Tags

Biyokimya Sayı 124 Mitokondri elektron taşıma zinciri respirazomlar sentazomlar açık doğal elektroforez in-jel testleri elektroklorizasyon
Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter