Summary
该方案描述了使用天然电泳分离功能性线粒体电子传递链复合物（Cx）IV及其超复合物，以揭示其组装和结构信息。天然凝胶可以进行免疫印迹，凝胶内测定，并通过电洗脱纯化以进一步表征单个复合物。
Abstract
线粒体电子传递链（ETC）将从各种燃料分解的能量转化为细胞的生物能量货币。 ETC由5个大型蛋白质复合物组成，它们还组装成称为呼吸面罩（CI，C-III，C-IV）和合成体（CV）的超复合物，提高电子传输和ATP生产的效率。 50多年来已经使用各种方法来测量ETC功能，但是这些协议并不提供关于单个复合体和超级复合物组装的信息。该方案描述了天然凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的技术，该方法在20多年前被修改以研究ETC复合物结构。天然电泳可以将ETC复合物分离成其活性形式，然后可以使用免疫印迹，凝胶内测定（IGA）和电洗脱纯化来研究这些复合物。通过组合天然凝胶PAGE与其他线粒体测定结果的结果，可以获得ETC活性，动态组装和反汇编的完整图片，以及如何调节线粒体结构和功能。这项工作还将讨论这些技术的局限性。总之，以下给出的本地PAGE技术，随后的免疫印迹，IGA和电洗脱技术是研究线粒体ETC超复合物的功能和组成的有效方法。
Introduction
ATP形式的线粒体能量不仅对于细胞存活是必需的，而且对于细胞死亡的调控是重要的。通过氧化磷酸化产生ATP需要功能性电子传递链（ETC; Cx-1至IV）和线粒体ATP合成酶（Cx-V）。最近的研究表明，这些大蛋白质复合物被组织成超复合物，称为呼吸器和合成体1,2 。分析这些大型复合物和超复合物的组装，动力学和活性调节是很困难的。尽管用氧电极进行的氧消耗测量和使用分光光度计进行的酶测定可以提供关于ETC复合物活性的有价值的信息，但是这些测定不能提供关于所涉及的蛋白质复合物或超复合物的存在，大小和亚基组成的信息。然而，蓝色和清楚的本地人的发展（BN和CN）PAGE 3创造了一个强大的工具，用于揭示复杂组合和装配/拆卸的重要信息，以及生理和病理条件下这些重要呼吸复合物超分子组织的动态调节。
这些复合物组装成高阶超复合物似乎调节线粒体结构和功能5 。例如，呼吸装置组装增加了电子转移的效率和跨越线粒体内膜的质子动力的产生5 。此外，合成体的装配不仅提高了ATP生产的效率和将能量转移到细胞质2中 ，而且还将线粒体内膜模制成管状碎屑6 ，/ sup> 7 。在小鼠胚胎心脏发育过程中超复合组装的研究表明，心脏中含有Cx-1的超复合物的产生在大约胚胎期13.58开始。其他人已经表明，由于老化或缺血/再灌注损伤9或10 ，含有Cx-1的超复合物的量在心脏中降低，或者可能在神经退行性疾病进展中起作用。
该方案描述了可用于研究ETC复合物和超复合物的组装和活性的天然凝胶PAGE的方法。可以通过分离CN或BN聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质复合物来评估线粒体超复合物的近似分子量。 CN PAGE还允许直接在凝胶中显示所有线粒体复合物的酶活性（凝胶内测定;IGA） 12 。这项工作通过强调Cx-I通过IGA氧化NADH的能力和由于IGA的Cx-V的ATP水解活性而导致的合成体的存在，证明了呼吸面具的活性。含有Cx-1和Cx-V的多重复合物和超复合物也可以通过将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并进行免疫印迹来证明。这种方法的优点是BN或CN PAGE通常根据其生理大小和组成分离蛋白复合物;转移到膜保留了这种带状图案。在BN或CN PAGE中分析蛋白质复合物也可以使用2D-PAGE（参见Fiala 等人 13 ，用于论证）或通过蔗糖密度离心14,15完成 。为了进一步分析特异性条带，可以从BN PAGE中切下来，这种蛋白质复合物的蛋白质可以是纯净的d通过在天然条件下电泳。天然电洗脱可以在几个小时内进行，这可能对从凝胶到周围缓冲液中的蛋白质的被动扩散（如参考文献16中所使用的）有显着差异。
总之，这些方法描述了允许从线粒体膜进一步表征高分子量超复合物的几种方法。
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Protocol
使用C57BL / 6N小鼠（野生型）的心脏进行所有实验。在颈椎脱位之前，用二氧化碳麻醉小鼠，所有手术都严格按照罗切斯特大学实验动物医学部进行，并符合州法律，联邦法规和NIH政策。该议定书由罗切斯特大学动物保护和使用委员会（动物资源大学委员会）批准。
CN和BN PAGE
注意：用于BN和CN PAGE的所有设备均不得含有洗涤剂。为了确保这一点，用0.1M盐酸洗涤所有设备，然后用去离子水二氧化氯大量冲洗。
- 制备
- 在4℃下制备由25mM咪唑，pH 7.0组成的阳极缓冲液;储存于4°C。
- 为CN或BN PAGE准备阴极缓冲液。
- 对于CN PAGE，使用7.5mM咪唑和50mM tricine;每升缓冲液中加入0.5g脱氧胆酸钠和0.2g月桂基麦芽糖苷。在4℃将pH调节至7.0，并储存在4℃。
- 对于BN PAGE，使用7.5mM咪唑和50mM三羟甲基胺，并在4℃下将pH调节至7.0。储存于4°C。
- 对于浅蓝色BN阴极缓冲液，使用7.5mM咪唑和50mM三氯甲烷。在4℃下将pH调节至7.0，并加入每升缓冲液20毫克考马斯。储存于4°C。
- 用50mM NaCl，50mM咪唑，2mM氨基己酸和1mM EDTA制备提取缓冲液（EB）。在4℃将pH调节至7.0，并储存在4℃。
- 用75 mM咪唑和1.5M氨基己酸制备3x凝胶缓冲液（用于BN和CN凝胶）。在4℃将pH调节至7.0，并储存在4℃。
- 制备0.01g Ponceau S的负载缓冲液（LB），5g甘油和5mL H 2 O.储存在室温度。
- 通过向1mL 500mM 6-氨基己酸中加入50mg考马斯制备考马斯蓝。在4℃将pH调节至7.0，并储存在4℃。
- 在H 2 O中制备20mM和200mM月桂基麦芽糖苷。制备200μL等分试样并将其冷冻储存。使用前解冻洗涤剂。
| 3％至8％（迷你） | 4％至10％（最大） | |||
| 0.5凝胶（光） | 0.5克（重） | 0.5凝胶（光） | 0.5克（重） | |
| AAB（mL） | 0.42 | 1.3 | 2.5 | 7.7 |
| CN / BN缓冲液（mL） | 1.6 | 1.6 | 8.5 | 8.5 |
| H 2 O（mL） | 2.7 | 1.4 | 14 | 6.3 |
| 甘油（g） | 0 | 0.47 | 0 | 2.5 |
| 体积（mL） | 4.72 | 4.77 | 25 | 25 |
| APS（μL） | 27 | 27 | 65 | 65 |
| TEMED（μL） | 4 | 4 | 10 | 10 |
表1：需要倾倒1 Mini或Maxi-PAGE的成分的量。该表中使用的体积计算为1 mini-或1 maxi-gel，1.5 mm厚。 AAB的体积基于40％的库存解决方案。轻和重指的是浓缩物AAB离子。在梯度混合器的每一列填充有AAB溶液后，加入APS和TEMED。
- 倾吐和运行凝胶
注意：分别为CN或BN凝胶使用3-8％或4-10％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（AAB）梯度。 表1总结了用于微型凝胶（85mm宽×73mm高×1.5mm厚）或最大凝胶（160）的缓冲液，AAB，H 2 O，甘油，硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）宽×200mm高×1.5mm厚）。具有CN或BN凝胶的玻璃板组件可以用几毫升1x凝胶缓冲液的袋子冷藏，或者用浸有1x凝胶缓冲液的纸巾包裹在一起存放。凝胶稳定使用长达一周。- 要倾倒凝胶，将梯度混合器放置在升高的搅拌板上，以确保凝胶通过重力流动到制备的凝胶室中。
- 将梯度混合器的流出室填入4.77 / 25mL（迷你/最大）的重溶液（具有较高浓度的AAB）。
- 轻轻打开重型和轻型室之间的止动螺栓连接，并允许一滴溶液穿过另一侧。
注意：这从连接管和止动阀推动气泡，这将防止两个腔室之间的流动。如果双方已经被填补，这是不能做到的，因为同等的压力会阻止泡沫的流动。 - 用梯度混合器的另一个室填充4.72 / 25mL（mini / maxi）的光溶液。
- 将搅拌棒用重溶液放在流出室中，开始搅拌。使用不会引起冒泡的搅拌棒速度。
- 快速添加APS和TEMED到每个室以启动聚合。
- 打开梯度混合器的两个腔室之间的连接，并允许混合几秒钟，然后打开流出室以倒出凝胶。
注意：重力wi将两个腔室均匀地排出，并将光混入重溶液将缓慢降低凝胶从底部到顶部的丙烯酰胺密度。使用梯度搅拌机中的全部内容倒入凝胶。- 最后，小心地安装梳子，凝胶内部的孔子可以避免气泡和层混合。
- 立即用乙醇冲洗梯度搅拌器以冲洗任何凝胶。用水冲洗并倒入第二个凝胶。让凝胶聚合（通常需要少于20分钟的迷你凝胶）。
- 运行凝胶，将它们安装到电极组件夹具中，并用CN或浅蓝色BN阴极缓冲液填充中心/上部腔室。在将阳极缓冲液添加到外部/下部室之前，请等待几分钟以检查泄漏。
- 使用注射器或移液管，用阴极缓冲液轻轻拉出孔梳并清洗孔。
- 在冷藏室（4°C）中运行凝胶或完全装入冰中。
- 对于CN mini-PAGE，第一小时使用100 V，直到完成200 V，通常需要1-1.5 h。或者，在30-40V运行CN迷你页面过夜。
注意：这里的重点是高分子量蛋白质复合物，因此分子量小于140 kDa的蛋白质复合物将从凝胶中流出。电泳运行时间较短可用于保留低分子量复合物。 - 对于BN maxi-PAGE，使用100 V并运行凝胶过夜（约18 h）。
注意：电流将非常低（<15 mA），因此需要能够处理这些条件的电源。此时，凝胶可用于IGA或免疫印迹。在某些情况下，可以使用玻璃板上的剃须刀片将胶带或泳道从凝胶中切出，以进行电洗脱。
- 对于CN mini-PAGE，第一小时使用100 V，直到完成200 V，通常需要1-1.5 h。或者，在30-40V运行CN迷你页面过夜。
- 样品制备
注意：膜结合的线粒体超复合物必须从th提取e内线粒体膜。要保留线粒体超复合物，请使用新鲜分离的线粒体或已经冷冻和解冻一次的样品。以下的计算/体积是给予迷你凝胶（凝胶中的10孔梳，1.5毫米厚的孔保存高达35-40μL）和最大凝胶（15孔梳子的孔可以达到200μL）。另外，将每个样品（通常为10μL）的等分试样保存在变性SDS凝胶上，以检测电压依赖性阴离子通道（VDAC）作为加载对照。- 在微管中放置适量的量（ 例如， 10微克的微凝胶蛋白质和50-200微克最大分离的线粒体或组织匀浆），并在4℃下以17,000×g离心10-15分钟。
注意：该步骤去除一些可溶性线粒体基质和/或胞质蛋白。 - 吸出并丢弃上清液，加入提取缓冲液至所需量加载到凝胶上。轻轻地将沉积物重新悬浮在冰上。如果需要，在这一点添加一般的蛋白酶抑制剂混合物。
注意：根据这里使用的设备，微型凝胶使用30μL，maxi-gel使用100μL，将蛋白质/缓冲液比例限制在不超过2μg蛋白质的1μL缓冲液中。 - 添加洗涤剂（ 例如， 2μg月桂基麦芽糖苷/ 1μg蛋白质;详见代表性结果和讨论）。
注意：通常使用月桂基麦芽糖苷，但也可以使用雌二醇。 - 在冰上孵育20分钟。通过研磨和/或搅拌管子在孵育期间开始轻轻混合。
- 在4℃下以17,000xg离心10分钟以除去任何膜和组织碎片。
- 将上清液转移到新管中。对于CN样品，每10μL样品体积加入1μLLB;样品的总体积应为app微型凝胶约40μL，maxi-gel为130μL。对于BN样品，将考马斯添加到样品中，使染料与洗涤剂的比例为1:4（w / w）。
- 将30和120μL样品分别装入mini-或maxi-gel的孔中。使用每个样品的其余10μL进行变性SDS凝胶检测VDAC作为加载对照。
- 为了制备分子量标记物，在60μL的BN / CN凝胶缓冲液中溶解1瓶高分子量校准组合物（参见材料表），加入120μL的H 2 O和20μL的磅。每泳道加载15μL。
- 按照步骤1.2.9.2中的说明运行凝胶。
- 在微管中放置适量的量（ 例如， 10微克的微凝胶蛋白质和50-200微克最大分离的线粒体或组织匀浆），并在4℃下以17,000×g离心10-15分钟。
2. Cx-I和Cx-V的凝胶内测定
注意：测定在室温下进行。拍摄照片，扫描或图像的开发乐队的文件。 （重要）蛋白质不能转移o硝酸纤维素膜完成IGA后。
- Cx-I测定
- 制备。
- 制备pH为7.4的H 2 O中5mM Tris的测定缓冲液;在室温下储存。
- 将10mg NADH溶于1 mL测定缓冲液中。在-20°C下保存100μL等分试样，直至使用;避免冻融。
- 称取25毫克的硝基蓝四唑进入微管。
- 通过在95 mL H 2 O中稀释5 mL乙酸来制备固定剂;在室温下储存。
- 进行测定
- 将10 mL测定缓冲液与25 mg Nitroblue四唑（终浓度：2.5 mg / mL）和100μL10mg / mL NADH（0.1 mg / mL）混合。将其添加到从CN凝胶切除的整个凝胶，泳道或兴趣区域。
注意：这可以在透明的塑料或玻璃容器中完成。请注意，此检测不能在BN PAGE后进行。 - 温和搅拌（摇杆）后，跟随蓝带的发展> 3分钟。
- 将凝胶固定在10-20mL乙酸溶液中，或在5mM Tris，pH 7.4中洗涤以终止反应。拍照以获取文件（参见材料表）。
- 将10 mL测定缓冲液与25 mg Nitroblue四唑（终浓度：2.5 mg / mL）和100μL10mg / mL NADH（0.1 mg / mL）混合。将其添加到从CN凝胶切除的整个凝胶，泳道或兴趣区域。
- 制备。
- Cx-V测定
注意：Cx-V测定应使用重复的CN或BN凝胶进行，其中一个与5μg/ mL的低密度霉素（Cx-V抑制剂）一起孵育以显示Cx-V独立的活性。- 制备。
- 用35mM Tris和270mM甘氨酸制备测定缓冲液;在室温下将pH调节至8.3。将缓冲液以50 mL等分试样储存，但在冷冻和解冻后检查pH值。
- 在H 2 O中制备1 M MgSO4;储存于4°C直至使用。
- 将27.28mg的Pb（NO 3 ） 2称量成微管。
- 称量60毫克ATP进入微管。
- 溶解1毫克o在1mL乙醇中的霉菌素。储存于-20°C直至使用。
- 通过将50mL甲醇与50mL H 2 O混合来制备固定剂;在室温下储存。
- 进行测定
- 在10-20mL测定缓冲液±5μg/ mL的寡霉素（50-100μL的1mg / mL）中，用BN或CN凝胶孵育2小时的凝胶，泳道或感兴趣区域2小时， mL在乙醇中）。
- 孵育后，用14mL新鲜的测定缓冲液代替缓冲液，依次加入190μL1M MgSO 4 （14mM），27.28mg Pb（NO 3 ） 2 （5mM），60mg ATP 8mM）和75μL的寡霉素（必要时）。
- 温和搅拌（摇杆）孵育并观察白色沉淀，因为寡霉素处理过的凝胶上的条带将产生非Cx-V依赖性条带。
注意：沉淀物的外观可能需要几个小时。 - 将凝胶固定在甲醇 -（ 例如， 50％甲醇），因为酸性溶液会溶解铅沉淀物。拍照结果。
注意：铅沉淀物不会干扰凝胶的考马斯染色。
- 制备。
蛋白质转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜
- 制备25mM Tris和200mM甘氨酸的转移缓冲液。将pH调节至8.3，加入0.0005g / L SDS和200mL / L甲醇。在室温下储存。
- 用剃须刀或剪刀将硝酸纤维素或PVDF膜（孔径：0.45μm）切割成略大于凝胶的尺寸。
注意：硝化纤维素膜允许Ponceau S染色来评估蛋白质负载，而PVDF膜产生更明确的带。
- 用剃须刀或剪刀将硝酸纤维素或PVDF膜（孔径：0.45μm）切割成略大于凝胶的尺寸。
- 协议。
- 浸泡硝酸纤维素膜，滤纸和海绵在转移缓冲液中至少10分钟。将PVDF膜置于100％甲醇中15秒或根据制造商的建议将其置于转移缓冲液中。将转移套件的打开的盒子放入带有转移缓冲器的平坦的碗中。
- 将海绵和1-2层滤纸放在盒背面。去除气泡。
- 将凝胶放在滤纸上。通过剪切凝胶和/或膜的角来指示凝胶的取向。
- 将膜放在凝胶上。去除所有气泡。
- 将滤纸和海绵放在膜的顶部。清除这个三明治中的所有气泡。
- 关闭纸盒并将其放入转印盒的盒式支架中。
- 将蛋白质在25 V下转移约12-18小时。
4.免疫印迹
- 制备。
- 通过加入25毫升来制备一种Ponceau染色剂（500毫升）的乙酸和0.5g的Ponceau S至475mL的H 2 O;在室温下储存（可重复使用）。
- 用200mM NaCl，25mM Tris-Base和2.7mM KCl制备Tris缓冲盐水（TBS）。将pH调节至8.0并储存在室温下。
- 通过向TBS中加入0.5mL / L吐温20制备TBS-吐温（TBST）;在室温下储存。
- 通过将5克牛奶固体溶解在100毫升TBST中来制备牛奶固体/ TBST。储存于4°C，3天内使用。
- 通过将3g牛血清白蛋白（BSA，级分V）溶解在100mL TBST中来制备BSA / TBST。储存于4°C，3天内使用。
- 协议。
- 转移完成后，将膜置于Ponceau S溶液中以显现所有转移的蛋白质。用铅笔标记膜上标记的位置，并通过照片或扫描记录Ponceau-S染色的膜。
- 每次洗涤膜3次，每次10分钟TBS在温和的搅动下。
- 用乳固体/ TBST在室温下封闭膜1-2小时或在温和搅拌的冷室中过夜。
- 在温和搅拌下用TBST洗涤膜10分钟。
- 在温和搅拌下，在冷室中与初级抗体孵育过夜。在BSA / TBST中稀释抗体（ 例如，抗ATP5A和-NDUFB6为1：1,000）。
注意：当孵育过夜时，大多数抗体在来自天然凝胶的膜上产生更好的信号。 - 在温和搅拌下用TBST洗涤膜10分钟。
- 在室温下温和搅拌下与二抗孵育至少60分钟。在牛奶固体/ TBST中稀释抗体（1:5000至1:50000）。
- 在室温下用TBST轻轻搅拌将膜洗涤3次10分钟。
- 在最后一次洗涤过程中，根据制造商的说明准备增强的化学发光（ECL）底物cturer。
- 使用制造商提供的说明使用ECL底物孵育膜。
- 使用ECL基板制造商提供的说明检测胶片上的信号。
电解
- 制备。
- 制备25mM三羟甲基纤维素，3.75mM咪唑（4℃pH 7.0）和5mM 6-氨基己酸的洗脱缓冲液。
注意：在处理电子涂层和膜帽时，请始终戴上手套，以防止外部蛋白质受到污染。
- 制备25mM三羟甲基纤维素，3.75mM咪唑（4℃pH 7.0）和5mM 6-氨基己酸的洗脱缓冲液。
- 在使用电凝器进行原生电洗脱前一天，执行以下操作：
- 在60℃下将洗脱缓冲液中的膜帽（截止值：3.5kDa）浸泡1小时。将盖子转移到新鲜的洗脱缓冲液中，并将其浸泡在冰箱中12小时以上。
注意：截止分子量为3.5 kDa可防止小p的损失可能容易从感兴趣的蛋白质复合物解离的蛋白质。 - 用乙醇彻底清洗electroeluter模块，玻璃管，罐和盖子。用水冲洗并让设备干燥。
- 在60℃下将洗脱缓冲液中的膜帽（截止值：3.5kDa）浸泡1小时。将盖子转移到新鲜的洗脱缓冲液中，并将其浸泡在冰箱中12小时以上。
- 在当地电洗脱当天，请执行以下操作。
- 将玻璃料放在要使用的每个玻璃管的底部（磨砂）中。如有必要，将玻璃管置于洗脱缓冲液中，并将玻璃料从管内向内推。
- 将带有玻璃料的玻璃管推入电熨烫机的模块中。用洗脱缓冲液润湿垫圈，并将玻璃管滑入适当位置。确保玻璃管的顶部与护环平齐。
- 用塞子关闭空的索环。
- 在硅胶适配器的底部放置湿膜盖，并将适配器与洗脱缓冲液填充。缓慢地将适配器中的缓冲液上下移动以除去透析膜周围的任何气泡/ LI>
- 将缓冲填充的适配器滑入玻璃管的底部。清除玻璃管内玻璃料上出现的所有气泡。
- 每个玻璃管填充洗脱缓冲液。
- 将BN PAGE的切除带放入玻璃管中（见步骤1.2.9.3）。将大块切成小块。确保玻璃管内的填充高度约为1厘米。
- 将整个模块放入罐中。
- 向罐中加入约600 mL冷洗脱缓冲液。确保硅适配器帽位于缓冲液中以防止透析膜上的气泡。
- 在水箱的底部放置搅拌棒。
注意：搅拌会阻止气泡粘在透析膜的底部。 - 在一个寒冷的房间里，以350V的速度洗脱蛋白质4小时。
- 洗脱完成后，从缓冲罐中取出电凝器模块并将其放入水槽或碗中。
- 如果使用塞子，将其取下在上缓冲室中。否则，使用大的移液器去除缓冲区。
- 从每个玻璃管中取出缓冲液并丢弃。确保硅胶适配器保持在适当位置，并且玻璃料下方的液体不会受到干扰或晃动。
- 小心地将硅胶适配器与玻璃管底部的膜帽一起取出。将硅胶盖的内容物（约400μL）吸入微管中。再加入200μL洗脱缓冲液，冲洗硅胶盖并加入微管。对所有玻璃管重复。
- 当膜帽可以重复使用时，通过将膜放置在含有0.5mg / mL叠氮化钠的洗脱缓冲液中来保护膜盖。冷藏
注意：洗脱液的蛋白质浓度低，可以使用离心过滤装置进行浓缩。
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Representative Results
为了可视化线粒体超复合物，使用来自小鼠的新鲜分离的线粒体17,18 。线粒体超复合物对重复的冷冻和解冻循环敏感，导致其分解，尽管这可能是一些研究人员可以忍受的。如果冷藏是必要的储存，为了确保最佳结果，样品不应经受多于一个循环的冻融。
为了用BN PAGE可视化线粒体ETC复合物，将100μg来自分离的心脏线粒体的蛋白质加载到4-10％凝胶上（ 图1A ）。载体和阴极缓冲液中的考马斯染色体足以在运行过程中标记蛋白质复合物。超级复合物在数字增加对比度（未显示）后出现。对于CN PAGE，两个样品为20μgof蛋白从分离的线粒体加载到3-8％CN凝胶上并分离（ 图1B ）。使用考马斯染色CN PAGE，使其脱色，使蛋白质复合物显现。在数字增加对比度后，出现分子量大于Cx-1单体的几种蛋白质复合物（ 图1B ，右图）。使用的AAB的浓度允许最大的超复合物从井中进入凝胶。然而，以小于3％AAB的梯度结束的凝胶不足以操纵用于转移或切除条带或泳道。此外，3-8％CN凝胶上部的低浓度AAB保持了蛋白质复合物的一些迁移性，如果考虑到本机电洗脱，这很重要19 。
Cx-1和C的单体，二聚体和超复合物的单体和超复合物xV是酶促活性的，并且可以通过IGA可视化（ 图1C -F ）。测定显示，在分离的心脏线粒体中，Cx-1和Cx-V存在于大于其各自单体的蛋白质复合物中。在Cx-1的IGA测定中，NADH被氧化并转移电子以还原硝基蓝四唑。这导致Cx-1单体和含Cx-1的呼吸面罩/超复合物的分子量的局部蓝色（ 图1C ）。通过F 1亚基水解ATP的能力评估Cx-V的活性，可以使用CN或BN凝胶进行（ 图1D -F ）。由该反应产生的ADP与铅相互作用，导致Cx-V单体，二聚体，合成子和亚复合物（最可能是Cx-V的未组装的F 1部分）的白色沉淀物。请注意，少霉素消除了l玷污这些带，确认它们含有Cx-V（ 图1E ）。
对于本文所述的所有实验，两性离子洗涤剂月桂基麦芽糖苷以2μg/1μg蛋白质的浓度使用，这是保留超复合物的最高可能浓度，同时提供一致和可重复的结果（ 图1F ）。然而，月桂基麦芽糖苷的有效性取决于批号，储存条件和年龄。因此，一个实验室中使用的确切浓度不一定与原稿中报道的相同。洗涤剂的适当浓度会溶解膜，但保持复合物和超复合物完整，必须通过使用各种浓度的月桂基麦芽糖苷来确定（ 图1F ）。对于CN PAGE，制备每孔40μL的总样品体积这导致蛋白质/洗涤剂比例为1μg/2μg或洗涤剂/缓冲液比为1μg/lμL（等于1.9mM）。从40μL中，每孔加入30μL微型凝胶;剩余的作为等分试样用于检测VDAC，一种加载控制（ 图2D ）。
对于免疫印迹，CN优选于BN PAGE，因为蛋白质不装载考马斯，可能会干扰抗体的检测。 图2显示了从分离的心脏，肝脏和脑线粒体中检测到含有Cx-1和Cx-V蛋白NDUFB6和ATP5A的超复合物。转移后和免疫印迹前的Ponceau S标记可用于标记分子量标记物并控制蛋白质负载（ 图2A ）。这将使硝酸纤维素上的ETC的蛋白质复合物的单体可视化但是对于线粒体超复合物的可视化（ 图2A ），Ponceau S标记并不总是足够的，这可以通过免疫印迹实现。
Cx-I本身不会组装成二聚体和四聚体，但与Cx-III和Cx-IV分别成为越来越高的分子量超复合物14,20,21。在这里，使用针对NDUFB6的抗体显示来自心脏的样品含有来自肝脏或大脑的线粒体更多的Cx-1单体和高分子量超复合物（顶部带）（ 图2B ）。中等程度的呼吸面罩超复合物的量在心脏中也高于其他组织（ 图2B ）。
使用抗ATP5A抗体，Cx-V的单体在所有组织的线粒体中是可检测的，而在心脏线粒体中清楚可见的代表二聚体（D）和较大超复合物（SC）的不同带状图谱在肝和脑线粒体中不是那么突出（ 图2C ）。免疫印迹的过度暴露（1分钟至20秒）显示出几个含有Cx-V的超复合物，其可以代表四聚体和合成体（ 图2C ）。心脏，肝脏和脑线粒体中含有Cx-V的蛋白质复合物的这些模式显示出可能是组织特异性的并且尚未被探索的差异。
如图2D所示 ，这些印迹的蛋白质负载可以之后是通过SDS PAGE进行的Ponceau S染色和VDAC检测上述等分试样。
不是所有的反波模具适合于在天然PAGE之后检测蛋白质复合物的四级或三级结构内的蛋白质。为了克服这个问题，可以将天然凝胶的全部和部分泳道安装在变性凝胶上，用于第二维（2D凝胶，参见参考文献13进行演示）。 2D电泳是超分子复合物中可视化蛋白质的有价值的工具。然而， 如图2所示 ，超复合物以可变的量存在，并且来自超级复合物的单个蛋白质的信号可能在第二变性维度中难以可视化。为了克服这个问题，这里使用来自天然凝胶的蛋白质复合物的电洗脱。这样可以隔离多条通道的超复合条带，以产生更多的材料用于进一步的研究。
当使用电洗脱时，只有通过IGA识别和/或在BN PAGE上显现的感兴趣的条带是excISED;来自该片凝胶的蛋白质通过从凝胶洗脱进一步纯化。 图3A显示了BN PAGE的泳道，从其中切出代表单体的带电电洗脱。为了评估电洗脱后单体的Cx-V活性，将洗脱液应用于第二CN PAGE。单体的洗脱液仍然含有酶活性Cx-V，但也出现亚复合物（ 图3B ）。在天然CN PAGE（ 图3C ）或变性SDS PAGE（ 图3D ）后洗脱液的银染色表明洗脱液中存在蛋白质，并且针对ATP5A的免疫印迹指示两种样品中存在Cx-V（ 图3D ）。
图1：线索的可视化ondrial超复合物。 （ A ）两道4-10％BN maxi-gel，带有孤立的心脏线粒体样品。相同样品的等分试样在两条泳道中运行，每孔100μg蛋白质。 ETC的蛋白质复合物I，II，III，IV和V的单体清晰可见，并标记在凝胶的右侧。 （ B ）在CN PAGE上分离两个心脏线粒体样品（1和2,20μg蛋白/泳道），并通过考马斯染色显现。 SC表示超级复合物在凝胶上部放大和数字增强后的位置（该区域用红色箭头表示）。 （ C ）在3-8％CN PAGE上分离20μg线粒体蛋白，并对Cx-I IGA进行处理。放大和数字增强的图像显示Cx-1反应产物的带。 （ D ）在3-8％BN PAGE上分离20μg线粒体蛋白，并对Cx-V IGA进行处理。 Magnifi ed和数字增强图像显示Cx-V反应产物的带。 （ E ）在5-15％CN PAGE上分离50μg线粒体蛋白，并处理不含（ - ）和（+）5μg/ mL寡霉素（Oligo）的Cx-V IGA。 （ F ）线性蛋白（20μg/泳道）用2-6μg月桂基麦芽糖苷/1μg蛋白质溶解，如凝胶顶部所示，并在3-8％CN凝胶上分离，然后用Cx- V IGA。使用光台（ A - C ）或黑色表面（ D - F ）拍摄所有图像。相机规格在材料表中。分子量标记（MW）的位置显示在所有面板的左侧。缩写：D =二聚体; F 1 * = Cx-V的子复合体; LM =月桂基麦芽糖苷; m =分子量标记; M =单体; SC =超复合物。g1large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图2：通过免疫印迹检测线粒体超复合物。在3-8％CN PAGE上分离来自心脏（H），肝脏（Li）和脑（B）线粒体的20μg蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。 （ A ）膜的Ponceau S染色表明存在蛋白复合物和分子量标记（m）。蓝色的箭头指向凝胶的顶部。 （ B ）在（A）（1分钟暴露时间）所示的印迹上，对Cx-1蛋白NDUFB6进行免疫标记。 （ C ）用抗ATP5A抗体（20秒和1分钟曝光，如所示）显现Cx-V。 （B）和（C）中的红色箭头表示视域的放大和数字增强的面积含有Cx-I和Cx-V的超复合物，蓝色箭头指向凝胶顶部。 （ D ）Ponceau S和（A），（B）和（C）中使用的每种提取物的VDAC等分试样的免疫标记，其通过SDS PAGE分离并转移到硝酸纤维素上。缩写：M = Cx-1或Cx-V的单体，D = Cx-V的二聚体，SC =含有Cx-1或Cx-V的超复合物。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：Cx-V的电洗脱。 （ A ）线粒体样品的BN PAGE。盒装带代表被切断并电熨烫的Cx-V单体。 （ B ）洗脱液进行CN PAGE，Cx-V的随后的IGA显示单体（M）和含有Cx-V的F 1的亚复合物。 （ C ）洗脱液的CN PAGE的银染色显示单体（M）。 （ D ）银染色（左图）和洗脱液变性十二烷基硫酸钠（SDS）PAGE的ATP5A（右图）的免疫印迹表明存在Cx-V。对于SDS PAGE，请参阅其他地方公布的方案。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
功能性ETC对于线粒体ATP生成是必需的。 ETC的复合物能够形成两种类型的超复合物：呼吸机（Cx-I，-III和-IV） 1和合成体（Cx-V） 2 。每个复合体的组装对于完整的ETC是必需的，而将ETC组织成超复合物被认为可以提高总体ETC效率5,22。这些超级复合体如何组装和拆卸还不太清楚，但是这里介绍的协议可能有助于更好地了解这些过程。
研究ETC装配的主要挑战是这些蛋白质复合物的大小。例如，线粒体呼吸机可以由Cx-1（约880kDa）和一个或多个Cx-III分子（460kDa）和Cx-IV（200kDa，作为二聚体活性）组成，产生与分子重量约2,000 kDa。此外，Cx-V具有约600kDa的分子量，但已显示其组装成二聚体，四聚体，低聚物和二聚体7-23的带，导致分子量至少为2,000kDa的超复合物。考虑到这些超级复合体的庞大规模，传统上已经使用几种部分相关的方法来鉴别和表征这些超复合物，本实验室和其他8,14,24。
这项工作已经证明了天然凝胶PAGE的技术，其中使用温和的去污剂从线粒体膜轻轻地提取活性蛋白复合物。复合物在凝胶中迁移主要是由于其大小和固有电荷（CN PAGE）或由于蛋白质结合的考马斯兰（BN PAGE）的大小和负电荷。这些凝胶可以用C染色（ 例如在CN凝胶中）或银染（ 例如，在BN和CN PAGE中）以显示蛋白质条带。
月桂基麦芽糖苷用于这里所示的实验，因为这种洗涤剂最可靠地工作。或者，黄芪素可用于提取蛋白质复合物12 。已经在这里显示了从成年心脏，肝脏和大脑分离的线粒体的数据，但是这些技术已经在胚胎和成年心脏匀浆上进行了。其他人已经使用来自培养细胞的分离的线粒体进行这种技术24 。然而，当使用具有高DNA含量的组织匀浆或培养细胞时，添加核酸酶以防止电泳期间的条纹可能是有用的25 。
可以在凝胶中直接测定不同复合物的活性，如Cx-1和Cx-V所示，tec还可以查阅Cx-II，-III和-IV 12的活动 。但是，必须仔细分析这些IGA。首先，酶反应可能是由于非ETC酶或不完全组装的复合物。例如，使用已经用oligomycin处理的平行凝胶来执行Cx-V IGA以抑制完整的Cx-V是常规的（ 图3 ）。此外，其他NADH氧化酶可能占Cx-1凝胶内活性。在Cx-1抑制剂如鱼藤酮存在下，可以进行平行的IGA。然而，在图1中 ，使用分离的线粒体，因此不存在胞质NADH氧化酶;因此，数据最有可能代表含Cx-1的单体和超复合物。此外，通过测量照片或扫描上的条带的信号强度，可以量化这些结果。这种方法的缺点包括和之间的差异在凝胶内，反应产物的流动性，在凝胶的整个深度处不能充分量化产物，以及反应27的潜在的非线性。为了克服后者，有些人建议使用连续照片获得反应率，但这并没有在这里尝试。
天然凝胶中的蛋白质也可以转移到膜上，并且可以通过免疫印迹（在此显示）或2D PAGE（参考文献13中证明）来检测条带的蛋白质组成。传统上，ETC复合物的单体通过其在分离的线粒体的天然凝胶中的丰度，它们在凝胶中的位置以及它们相对于分子标记蛋白的位置来鉴定（ 图1 ）。此外，用不同复合物亚基特异的抗体对随后的免疫印迹的标记有助于鉴定复合物和组成的超级复合体。因此，抗NDUFB6和-ATP5A分别识别含有Cx-1和Cx-V的单体和超复合物，如此处所示。针对Cx-II至IV的抗体可用于相同的目的。在一些情况下，在变性凝胶中工作良好的抗体在天然凝胶中可能不能很好地工作，因为一些抗体对变性蛋白质是特异性的，或者表位可以被天然复合物中的其他蛋白质掩蔽。
这些超复合物的分子量的确切测定是困难的，因为大多数可用的分子量标记低于Cx-V单体的大小。蛋白质复合物在天然凝胶中的迁移取决于使用的大小，固有电荷和洗涤剂28 。在这里的实施例中，基于凝胶，标记和免疫印迹鉴定复合物的单体。基于与Cx-1和-V的单体相比的相对迁移和免疫测定鉴定Cx-V的二聚体印迹。在凝胶，IGAs和免疫印迹中的单体和二聚体以上的其它一切被认为是超复合物。
也可以通过使用标准技术分析带密度来定量本体免疫印迹用于超复合物。这种方法在这里没有显示，但最近的出版物展示了这种技术8 。蛋白质负载的归一化可以使用泳道的红景色红斑或通过保存线粒体提取物的样品来测量变性免疫印迹上的VDAC带的密度（ 图2A 和D ）。此外，在相同的免疫印迹中检查超复合物与单体的比例是量化带密度的另一种方法，但是在印迹开发期间必须小心拍摄不同时间的图像，使得条带不被过度曝光。
最后，可以将来自天然凝胶的条纹电泳以产生纯净物质d，可以组装成高阶复合物的活性蛋白复合物，可用于复杂功能的进一步研究。例如，Cx-V单体预先电洗脱并重构成脂质体以证明电功能29 。本机电洗脱的另一种方法是通过被动扩散进入周围缓冲器16进行洗脱，但与本机电洗脱相比较慢。最后，电洗脱的主要问题是保持电洗脱的蛋白质复合物的酶功能，因为络合物可以在纯化期间解离。因此，通过这种技术分离后的任何功能测定都必须进行严格的测试。
通过将这些方案与酶测定和氧消耗测量结合起来，其探测个体ETC复合物的功能和整个ETC 30的活性，以及其它甲基ods，如晶体31和电子显微镜32的复合物和超复合物的结构评估，ETC的内部工作的完整图片可以并已经出现。我们更接近于了解复合物的组装方式，电子如何从链路中流出，以及如何将质子泵送穿过膜产生梯度，然后通过Cx-V流回到基质以产生ATP。毫无疑问，这些技术将进一步完善，以提供有关ETC的结构，功能和动态调节的更多细节。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作得到美国心脏病协会创始人会员[12GRNT12060233]和罗切斯特大学强力儿童研究中心的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCl | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
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