Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Dit protocol beschrijft de scheiding van functionele mitochondriale elektronen transportketen complexen (Cx) IV en supercomplexen daarvan door gebruik te maken van natieve elektroforese om informatie over hun montage en structuur te onthullen. De inheemse gel kan onderworpen worden aan immunoblotting, in-gel assays, en zuivering door elektroelutie om individuele complexen verder te karakteriseren.

Abstract

De mitochondriale elektronen transportketen (ETC) omzetten de energie die wordt afgeleid van de verdeling van verschillende brandstoffen in de bioenergetische munteenheid van de cel, ATP. De ETC bestaat uit 5 massieve eiwitcomplexen, die ook worden samengevoegd in supercomplexen die respirasomen genoemd worden (CI, C-III en C-IV) en synthasomen (CV), die de efficiëntie van elektronenvervoer en ATP-productie verhogen. Voor meer dan 50 jaar zijn verschillende methoden gebruikt om de ETC-functie te meten, maar deze protocollen geven geen informatie over de montage van individuele complexen en supercomplexen. Dit protocol beschrijft de techniek van native gel polyacrylamide gelelektroforese (PAGE), een methode die meer dan 20 jaar geleden werd gemodificeerd om ETC complexe structuur te bestuderen. Inheemse elektroforese maakt het mogelijk de ETC-complexen te scheiden in hun actieve vormen, en deze complexen kunnen dan worden onderzocht met behulp van immunoblotting, in-gel assays (IGA) en zuivering door elektroelutie. Door de reSulten van inheemse gel PAGE met die van andere mitochondriale tests, is het mogelijk om een ​​vollediger beeld van ETC-activiteit, zijn dynamische montage en demontage te verkrijgen en hoe dit mitochondriale structuur en functie regelt. In dit werk worden ook beperkingen van deze technieken besproken. Samengevat is de techniek van native PAGE, gevolgd door immunoblotting, IGA en electroelution, hieronder weergegeven, een krachtige manier om de functionaliteit en samenstelling van mitochondriale ETC supercomplexen te onderzoeken.

Introduction

Mitochondriale energie in de vorm van ATP is niet alleen essentieel voor de overleving van cellen, maar ook voor de regulering van de cel dood. De generatie van ATP door oxidatieve fosforylering vereist een functionele elektronen transportketen (ETC, Cx-I tot IV) en mitochondriale ATP synthase (Cx-V). Recente studies hebben aangetoond dat deze grote eiwitcomplexen in supercomplexen worden georganiseerd, respirasomen en synthasomen 1 , 2 genoemd . Het is uitdagend om de assemblage, dynamiek en activiteitregulering van deze massale complexen en supercomplexen te analyseren. Terwijl zuurstofverbruiksmetingen die zijn genomen met een zuurstofelektrode en enzymassays die worden uitgevoerd met behulp van een spectrofotometer, waardevolle informatie over ETC-complexe activiteit kunnen geven, kunnen deze analyses geen informatie verschaffen over de aanwezigheid, grootte en subeenheidssamenstelling van het betrokken eiwitcomplex of supercomplexen. De ontwikkeling van blauw en duidelijk natuurlijk (BN en CN) PAGINA 3 heeft een krachtig instrument gecreëerd voor het onthullen van belangrijke informatie over complexe samenstelling en montage / demontage en over de dynamische regulering van de supramoleculaire organisatie van deze vitale ademhalingscomplexen onder fysiologische en pathologische aandoeningen 4 .

De montage van deze complexen in hogere orde supercomplexen lijkt de mitochondriale structuur en functie 5 te reguleren. Bijvoorbeeld, respirasome assemblage verhoogt de efficiëntie van elektronoverdracht en de generatie van de protonmotief kracht over het mitochondriale binnenmembraan 5 . Bovendien verhoogt de assemblage van synthasomen niet alleen de efficiëntie van ATP-productie en de overdracht van energie-equivalenten in de cytoplasma 2 , maar vormt ook het mitochondriale binnenmembraan in de buisvormige cristae 6 , </ Sup> 7 . Studies van supercomplexe assemblage tijdens hartontwikkeling in muisembryo's tonen aan dat de opwekking van Cx-I-bevattende supercomplexen in het hart begint op ongeveer embryonale dag 13,5 8 . Anderen hebben aangetoond dat de hoeveelheid Cx-I-bevattende supercomplexen afneemt in het hart door aging of ischemie / reperfusie verwondingen 9 , 10 of kan een rol spelen bij de progressie van neurodegeneratieve ziekten 11 .

Dit protocol beschrijft methoden voor native gel PAGE die kunnen worden gebruikt om de assemblage en activiteit van de ETC complexen en supercomplexen te onderzoeken. Het geschatte molecuulgewicht van mitochondriale supercomplexen kan worden beoordeeld door het scheiden van de eiwitcomplexen in CN- of BN-polyacrylamidegelen. CN PAGE staat ook toe voor het visualiseren van de enzymatische activiteit van alle mitochondriale complexen direct in de gel (in-gel assays;IGA) 12 . Dit werk demonstreert de activiteit van de respirasomen door het vermogen van Cx-I om NADH door IGA te oxideren en de aanwezigheid van synthasomen te wijzen door de ATP-hydrolyserende activiteit van Cx-V door IGA. De meervoudige complexen en supercomplexen die Cx-I en Cx-V bevatten, kunnen ook worden aangetoond door de eiwitten over te brengen op nitrocellulosemembranen en immunoblotting uit te voeren. Het voordeel van deze aanpak is dat BN of CN PAGE in het algemeen scheidt eiwitcomplexen op basis van hun fysiologische grootte en samenstelling; De overdracht naar een membraan behoudt dit patroon van banden. Analyse van eiwitcomplexen in een BN of CN PAGE kan ook worden uitgevoerd met behulp van 2D-PAGE (zie Fiala et al. 13 voor een demonstratie) of door middel van sucrose-dichtheidcentrifugatie 14 , 15 . Om een ​​specifieke band verder te analyseren kan het worden uitgesneden uit de BN PAGE, en de eiwitten uit dit eiwitcomplex kunnen purifie zijnD door ze te electroeluteren onder natieve omstandigheden. Inheemse elektroelutie kan binnen enkele uren uitgevoerd worden, wat een significant verschil zou kunnen maken voor de passieve diffusie (zoals gebruikt in Referentie 16) van eiwitten van een gel in de omliggende buffer.

Samengevat beschrijven deze werkwijzen verschillende benaderingen die het mogelijk maken de verdere karakterisering van supermoleculen met een hoge molecuulgewicht van mitochondriale membranen mogelijk te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van harten van C57BL / 6N muizen (wild type). Muizen werden verdoofd met CO 2 vóór cervicale dislocatie, en alle procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de afdeling Laboratorium diergeneeskunde aan de Universiteit van Rochester en in overeenstemming met de nationale wetgeving, federaal statuut en NIH-beleid. Het protocol werd goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van de Universiteit van Rochester (University Committee on Animal Resources).

1. CN en BN PAGE

OPMERKING: Alle apparatuur die wordt gebruikt voor BN en CN PAGE moet vrij zijn van wasmiddel. Om dit te waarborgen, moet u alle apparatuur wassen met 0,1 M zoutzuur, gevolgd door het spoelen met gedeïoniseerd H 2 O.

  1. Voorbereiding
    1. Anodebuffer bestaande uit 25 mM imidazool, pH 7,0, bij 4 ° C bereiden; Opslaan bij 4 ° C.
    2. Bereid kathode buffer voor CN of BN PAGE.
      1. Voor CN PAGE gebruik 7,5 mM imidazool en 50 mM tricine; Voeg 0,5 g natriumdeoxycholaat en 0,2 g laurylmaltoside per liter buffer toe. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
      2. Voor BN PAGE gebruik 7,5 mM imidazool en 50 mM tricine en pas de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C. Bewaren bij 4 ° C.
      3. Voor lichtblauwe BN kathode buffer gebruik 7,5 mM imidazool en 50 mM tricine. Stel de pH op 7,0 bij 4 ° C en voeg 20 mg Coomassie per liter buffer toe. Bewaren bij 4 ° C.
    3. Bereid extractiebuffer (EB) op met 50 mM NaCl, 50 mM imidazool, 2 mM aminocaprozuur en 1 mM EDTA. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
    4. Bereid 3x gelbuffer (gebruikt voor BN en CN gels) met 75 mM imidazool en 1,5 M aminocaprozuur. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
    5. Bereid een laadbuffer (LB) van 0,01 g Ponceau S, 5 g glycerol en 5 ml H 2 O op. Opslaan bij kamertemperatuur.
    6. Bereid Coomassie blauw door 50 mg Coomassie toe te voegen aan 1 ml 500 mM 6-aminohexaanzuur. Stel de pH op bij 7 ° C bij 4 ° C en sla bij 4 ° C op.
    7. Bereid 20 mM en 200 mM laurylmaltoside in H20. Maak porties van 200 μl en houd ze bevroren. Doe het wasmiddel voor gebruik.
3% tot 8% (mini) 4% tot 10% (maxi)
0,5 gels (licht) 0,5 gels (zwaar) 0,5 gels (licht) 0,5 gels (zwaar)
AAB (mL) 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN buffer (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H20 (mL) 2.7 1.4 14 6.3
Glycerol (g) 0 0.47 0 2.5
Volume (mL) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabel 1: Hoeveelheden Ingrediënten nodig om 1 Mini- of Maxi-PAGE te gieten. De in deze tabel gebruikte volumes worden berekend voor 1 mini- of 1 maxi-gel, 1,5 mm dik. Het volume van AAB is gebaseerd op een 40% voorraadoplossing. Licht en zwaar verwijzen naar de concentraatIonen van AAB. APS en TEMED worden toegevoegd nadat elke kolom van de gradiëntmenger is gevuld met AAB-oplossing.

  1. Gieten en rennen
    OPMERKING: Gebruik 3-8% of 4-10% acrylamide / bisacrylamide (AAB) gradiënt voor respectievelijk CN- of BN-gel. Tabel 1 geeft een samenvatting van de hoeveelheden buffer, AAB, H20, glycerol, ammoniumpersulfaat (APS) en tetramethylethylendiamine (TEMED) gebruikt voor een mini-gel (85 mm breed x 73 mm hoog x 1,5 mm dik) of maxi-gel (160 Mm breed x 200 mm hoog x 1,5 mm dik). Montages van glasplaten met CN of BN-gels kunnen in een zak worden gekoeld met een paar ml 1x gelbuffer of verpakt in papieren handdoek bevochtigd met 1x gelbuffer voor opslag. De gels zijn voor maximaal een week stabiel.
    1. Om de gel te gieten, plaats de verloopmenger op een verhoogde roerplaat om ervoor te zorgen dat de gel door de zwaartekracht stroomt in de bereide gelkamer.
    2. Vul de uitstroomkamer van de gradiëntmenger met 4,77 / 25 ml (Mini / maxi) van de zware oplossing (met een hogere concentratie AAB).
    3. Open de stophaanverbinding tussen de zware en lichte kamer voorzichtig en laat een druppel oplossing doorgaan naar de andere kant.
      OPMERKING: dit duw luchtbellen uit de verbindingsbuis en stophaan, die de stroom tussen de twee kamers voorkomt. Dit kan niet gebeuren als beide kanten al zijn ingevuld, omdat de gelijke druk de bel voorkomt.
    4. Vul de andere kamer van de gradiëntmenger met 4,72 / 25 ml (mini / maxi) van de lichte oplossing.
    5. Plaats een roerbalk in de uitloopkamer met de zware oplossing en begin met roeren. Gebruik een roer snelheid die geen bubbels veroorzaakt.
    6. Voeg snel APS en TEMED toe aan elke kamer om polymerisatie te starten.
    7. Open de verbinding tussen de twee kamers van de gradientmixer en laat het mengsel enkele seconden duren voordat u de uitloopruimte opent om de gel te gieten.
      OPMERKING: Gravity wiLl beide kamers gelijkmatig afvoeren en het mengen van het licht in de zware oplossing vermindert de acrylamidedichtheid langzaam van de bodem naar de bovenkant van de gel. Gebruik de gehele inhoud die in de verloopmixer staat om de gel te gieten.
      1. Aan het einde, zet de kam met de putjes zorgvuldig in de gel om de bellen en het mengen van de lagen te vermijden.
    8. Was de gradiëntmenger onmiddellijk met ethanol om eventuele gel te spoelen. Spoel met water en giet de tweede gel. Laat de gels polymeriseren (meestal minder dan 20 minuten is nodig voor mini-gels).
    9. Om de gels te rennen, monteer ze in de elektrode montageklem en vul de midden- of bovenkamer met CN of lichtblauwe BN kathode buffer. Wacht een paar minuten om te controleren of er lekken zijn voordat u anodebuffer toevoegt aan de buitenste / onderste kamer.
      1. Haal de putjes voorzichtig uit en doe de putjes met kathodebuffer af met een spuit of pipet.
      2. Breng de gels in een koude kamer (4 ° C) of compleet in ijs.
        1. Voor CN mini-PAGE, gebruik 100 V voor het eerste uur en 200 V tot het einde, meestal nog een 1-1,5 uur. Alternatief, voer de CN mini-PAGE bij 30-40 V overnacht.
          OPMERKING: De focus ligt hier op eiwitten met een hoge molecuulgewicht, zodat eiwitcomplexen met een molecuulgewicht van minder dan 140 kDa uit de gel zullen lopen. Kortere looptijden voor elektroforese kunnen worden gebruikt om complexen met een laag molecuulgewicht te behouden.
        2. Voor BN maxi-PAGE, gebruik 100 V en laat de gels overnacht (ongeveer 18 uur).
          OPMERKING: De stroom is zeer laag (<15 mA), dus een stroomvoorziening die aan deze voorwaarden kan voldoen is nodig. Op dit punt kunnen de gels worden gebruikt voor IGA of immunoblotting. In sommige gevallen kunnen banden of rijstroken uit de gels worden gesneden met behulp van een scheermesje op een glasplaat voor elektrogeluchting.
  2. Voorbeeld bereiding
    OPMERKING: Membraangebonden mitochondriale supercomplexen moeten uit de stam worden geëxtraheerdE innerlijke mitochondriale membraan. Om mitochondriale supercomplexen te behouden, gebruik of vers geïsoleerd mitochondria of monsters die slechts één keer bevroren en ontdooid zijn. De onderstaande berekeningen / volumes worden gegeven voor mini-gels (de put van een 10-brons kam in een gel 1,5 mm dikke tot 35-40 μL) en maxi-gels (de put van een 15-brons kam houdt in tot 200 μl). Daarnaast dient u een aliquot van elk monster (gewoonlijk 10 μL) op te slaan op een denaturerende SDS-gel voor het detecteren van het spanning-afhankelijke anionkanaal (VDAC) als laadcontrole.
    1. Plaats een geschikte hoeveelheid (bijvoorbeeld 10-50 μg eiwit voor mini-gels en 50 - 200 μg voor maxi-gels) van geïsoleerd mitochondria of weefselhomogenaat in microtubes en centrifuge bij 17.000 xg gedurende 10-15 minuten bij 4 ° C.
      OPMERKING: Deze stap verwijdert een deel van de oplosbare mitochondriale matrix en / of cytosolische eiwitten.
    2. Aspireren en weggooi de supernatant en voeg extractiebuffer toe aan de gewenste hoeveelheidOp de gel laden. Resusteer het sediment op ijs zachtjes. Voeg indien gewenst een algemene proteaseremmersmix op dit punt toe.
      OPMERKING: Op basis van de hier gebruikte apparatuur werd 30 μl gebruikt voor een mini-gel en 100 μl voor een maxi-gel, waardoor de eiwit / buffer verhouding tot niet meer dan 2 μg eiwit tot 1 μl buffer werd beperkt.
    3. Voeg detergent toe ( bv. 2 μg laurylmaltoside / 1 μg eiwit, zie de representatieve resultaten en discussie voor meer informatie).
      OPMERKING: Lauryl maltoside wordt doorgaans gebruikt, maar digitonin kan ook gebruikt worden.
    4. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Meng het aan het begin en soms af tijdens het incuberen door het tritureren en / of roeren van de buis voorzichtig te mengen.
    5. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om eventuele membraan- en weefselfragmenten te verwijderen.
    6. Breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Voor CN-monsters voeg 1 μL LB toe voor elke 10 μL monstervolume; Het totale volume van het monster moet app zijnOngeveer 40 μl voor een mini-gel en 130 μl voor een maxi-gel. Voor BN-monsters, voeg Coomassie toe aan de monsters, zodat de verhouding kleurstof tot detergent 1: 4 (w / w) is.
    7. Laad 30 en 120 μl van de monsters in respectievelijk de putjes van de mini- of maxi-gel. Gebruik de overige 10 μL van elk monster voor de denaturerende SDS gel om VDAC te detecteren als een laadbeheersing.
    8. Om de molecuulgewichtsmarkers op te stellen, los 1 injectieflacon met een kalibratiemengsel met een hoge molecuulgewicht op (zie de tabel van materialen voor meer informatie) in 60 μl BN / CN gelbuffer en voeg 120 μl H20 en 20 μl POND. Laad 15 μL per baan.
    9. Run de gels zoals beschreven in stap 1.2.9.2.

2. In-gel analyses voor Cx-I en Cx-V

OPMERKING: De analyses worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Neem foto's, scans of afbeeldingen van de ontwikkelende bands voor documentatie. (Belangrijk) Proteïnen kunnen niet worden overgedragen ontO nitrocellulose membranen na het voltooien van een IGA.

  1. Cx-I-analyse
    1. Voorbereiding.
      1. Bereid een assaybuffer van 5 mM Tris in H20 met een pH van 7,4; bewaar op kamertemperatuur.
      2. Los 10 mg NADH op in 1 ml assaybuffer. Bewaar in porties van 100 μL bij -20 ° C tot gebruik; Vermijden bevriezen en ontdooien.
      3. Weeg 25 mg Nitroblue tetrazolium in een microtube.
      4. Bereid het fixatief door 5 ml azijnzuur in 95 ml H20 te verdunnen; bewaar op kamertemperatuur.
    2. Het uitvoeren van de test.
      1. Combineer 10 ml assaybuffer met 25 mg Nitroblue tetrazolium (uiteindelijke concentratie: 2,5 mg / ml) en 100 μl 10 mg / ml NADH (0,1 mg / ml). Voeg dit toe aan de gehele gel, een baan of een gebied van belang, uitgesneden uit een CN gel.
        OPMERKING: dit kan gebeuren in een duidelijke plastic of glazen houder. Houd er rekening mee dat deze test niet kan worden uitgevoerd na BN PAGE.
      2. Volg de ontwikkeling van blauwe banden na zachte agitatie (rocker) voor> 3 min.
      3. Bevestig de gel in 10 - 20 ml azijnzuuroplossing of was in 5 mM Tris, pH 7,4 om de reactie te stoppen. Neem foto's voor documentatie (zie de Tabel van Materialen).
  2. Cx-V-analyse
    OPMERKING: De Cx-V-analyse moet worden uitgevoerd met behulp van dubbele CN- of BN-gels, waar één geïncubeerd wordt met 5 μg / ml oligomycine (een Cx-V-remmer) om Cx-V-onafhankelijke activiteit te demonstreren.
    1. Voorbereiding.
      1. Bereid een assaybuffer met 35 mM Tris en 270 mM glycine op; Stel de pH op bij 8,3 bij kamertemperatuur. Bewaar de buffer bevroren in 50 ml alikvoten, maar controleer de pH na bevriezen en ontdooien.
      2. Bereid 1 M MgS04 in H20; Bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
      3. Weeg 27,28 mg Pb (NO3) 2 in een microtube.
      4. Weeg 60 mg ATP in een microtube.
      5. Oplossen 1 mg oLigomycine in 1 ml ethanol. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
      6. Bereid een fixatief door 50 ml methanol met 50 ml H20 te mengen; bewaar op kamertemperatuur.
    2. Het uitvoeren van de test.
      1. Incubeer een gel, een baan of een gebied van belang van een BN of CN-gel gedurende 2 uur met zachte agitatie (tuimelaar) in 10-20 ml assaybuffer ± 5 μg / ml oligomycine (50-100 μl 1 mg / ML in ethanol) bij kamertemperatuur.
      2. Na incubatie, vervang de buffer met 14 ml verse analysebuffer en voeg 190 μL 1 M MgSO4 (14 mM), 27,28 mg Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg ATP 8 mM) en 75 ul oligomycine (waar nodig).
      3. Incubeer met zachte agitatie (rocker) en let op een wit neerslag, aangezien banden op oligomycine behandelde gels niet-Cx-V-afhankelijke banden zullen geven.
        OPMERKING: Het uiterlijk van het neerslag kan enkele uren duren.
      4. Bevestig de gel in methanol-Based fixative (bijvoorbeeld 50% methanol), omdat zure oplossingen het lood neerslag oplossen. Fotografeer de resultaten.
        OPMERKING: Het lood neerslag doet geen inbreuk op de Coomassie-kleuring van de gels.

3. Proteïneoverdracht naar Nitrocellulose of Polyvinylideendifluoride (PVDF) Membranen

  1. Bereid een transferbuffer van 25 mM Tris en 200 mM glycine op. Pas de pH op op 8.3 en voeg 0,0005 g / L SDS en 200 ml / L methanol toe. Bewaar op kamertemperatuur.
    1. Snijd een nitrocellulose- of PVDF-membraan (poriënmaat: 0,45 μm) met een scheermesje of een schaar tot een iets groter formaat dan die van de gel.
      OPMERKING: Met nitrocellulose membranen kunnen Ponceau S-kleuring worden gebruikt om eiwitbelasting te beoordelen, terwijl PVDF-membranen meer scherp gedefinieerde banden opleveren.
  2. Protocol.
    1. Zacht het nitrocellulosemembraan, het filterpapier en de sponzen voor aTenminste 10 minuten in transfer buffer. Plaats het PVDF membraan in 100% methanol gedurende 15 s of volgens de aanbeveling van de fabrikant alvorens het in de transferbuffer te plaatsen. Plaats de open cassette van de transfer kit in een platte kom met transfer buffer.
    2. Plaats de spons en 1-2 lagen filterpapier op de achterkant van de cassette. Verwijder de bellen.
    3. Plaats de gel op het filterpapier. Duid de oriëntatie van de gel aan door een hoek van de gel en / of het membraan te knippen.
    4. Plaats het membraan bovenop de gel. Verwijder alle bellen.
    5. Plaats filterpapier en een spons op de membraan. Verwijder alle bubbels in deze sandwich.
    6. Sluit de cassette en plaats deze in de cassettehouder van de transfer kit.
    7. Breng de eiwitten bij 25 V gedurende ongeveer 12-18 uur.

4. Immunoblotting

  1. Voorbereiding.
    1. Bereid een Ponceau-vlek (500 ml) door 25 ml aan te brengenVan azijnzuur en 0,5 g Ponceau S tot 475 ml H20; Opslaan bij kamertemperatuur (kan hergebruikt worden).
    2. Bereid Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base en 2,7 mM KCl. Stel de pH op op 8,0 en houd deze bij kamertemperatuur op.
    3. Bereid TBS-tween (TBST) door 0,5 ml / L Tween 20 aan TBS toe te voegen; bewaar op kamertemperatuur.
    4. Bereid melk vaste stoffen / TBST door 5 g melk vaste stoffen in 100 ml TBST op te lossen. Bewaar bij 4 ° C en gebruik binnen 3 dagen.
    5. Bereid BSA / TBST door 3 g boviene serumalbumine (BSA, fractie V) in 100 ml TBST op te lossen. Bewaar bij 4 ° C en gebruik binnen 3 dagen.
  2. Protocol.
    1. Plaats de membraan in de Ponceau S oplossing zodra de overdracht klaar is om alle overgedragen eiwitten te visualiseren. Benoem de positie van de merkers op het membraan met een potlood en documenteer het Ponceau-S-gekleurde membraan door foto of scan.
    2. Was de membraan 3 keer gedurende 10 minuten per wiDe TBS onder zachte agitatie.
    3. Blok de membraan met melk vaste stoffen / TBST gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht in een koude kamer met zachte roering.
    4. Was het membraan gedurende 10 minuten met TBST onder zachte agitatie.
    5. Incubeer met het primaire antilichaam 's nachts in de koude kamer onder zachte roering. Verdun het antilichaam ( bijv. 1: 1000 voor anti-ATP5A en -NDUFB6) in BSA / TBST.
      OPMERKING: De meeste antilichamen geven een beter signaal op membranen uit inheemse gels wanneer ze gedurende de nacht worden geïncubeerd.
    6. Was het membraan gedurende 10 minuten met TBST onder zachte agitatie.
    7. Incubeer met secundair antilichaam gedurende tenminste 60 minuten bij kamertemperatuur zonder zachte agitatie. Verdun het antilichaam (1: 5000 tot 1: 50.000) in melk vaste stoffen / TBST.
    8. Was het membraan 3 keer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met TBST zonder zachte agitatie.
    9. Bereid tijdens het laatste was het verbeterde chemoluminescentie (ECL) substraat volgens de instructies van de manufacturer.
    10. Incubeer het membraan met ECL-substraat volgens gebruiksaanwijzingen van de fabrikant.
    11. Ontdek het signaal op de film met gebruik van instructies van de fabrikant van het ECL-substraat.

5. Electroelution

  1. Voorbereiding.
    1. Bereid een elutiebuffer van 25 mM tricine, 3,75 mM imidazool (pH 7,0 bij 4 ° C) en 5 mM 6-aminohexaanzuur.
      OPMERKING: Draag handschoenen te allen tijde tijdens het hanteren van de elektro- en membraankapjes om contaminatie met externe eiwitten te voorkomen.
  2. Op de dag voordat u de elektroeluter gebruikt voor native electroelution, voer dan het volgende uit:
    1. Week de membraankappen (cut-off: 3,5 kDa) in elutiebuffer gedurende 1 uur bij 60 ° C. Breng de kappen over naar verse elueringsbuffer en week ze gedurende 12 uur of langer in de koelkast.
      OPMERKING: een afsnijdend molecuulgewicht van 3,5 kDa voorkomt het verlies van kleine pRoteinen die gemakkelijk kunnen dissociëren van het eiwitcomplex van belang.
    2. Was de elektroeluter module, glazen buizen, tank en deksel grondig met ethanol. Spoel met water en laat de apparatuur drogen.
  3. Op de dag van inheemse elektroeluering, doe het volgende.
    1. Plaats een frit in de bodem (matte) van elke glazen buis die u wilt gebruiken. Plaats indien nodig de glazen buis in elueringsbuffer en duw de fres van binnen naar onderkant van de buis.
    2. Duw de glazen buis met de frit in de module van de elektroleuter. Vet de grommet met elutiebuffer en schuif de glazen buis op zijn plaats. Zorg ervoor dat de toppen van de glazen buizen gelijk zijn aan de grommet.
    3. Sluit de lege grommets met stopjes.
    4. Plaats een natte membraan dop onderaan de siliconen adapter en vul de adapter met elutie buffer. Pijp de buffer langzaam in de adapter omhoog en omlaag om luchtbellen rond het dialysemembraan te verwijderen. </ Li>
    5. Schuif de buffer gevulde adapter op de bodem van de glazen buis. Verwijder alle bellen die op de frit in de glazen buis verschijnen.
    6. Vul elke glazen buis met elueringsbuffer.
    7. Plaats de uitgesneden banden van de BN PAGE in de glazen buizen (zie stap 1.2.9.3). Knip grote stukken in kleinere stukken. Zorg ervoor dat de vulhoogte binnen de glazen buis ongeveer 1 cm is.
    8. Plaats de gehele module in de tank.
    9. Voeg ongeveer 600 ml koude elueringsbuffer toe aan de tank. Zorg ervoor dat de siliconadapterkappen in de buffer zijn om bellen in het dialysemembraan te voorkomen.
    10. Plaats een roerbalk onderaan de tank.
      OPMERKING: Met roeren wordt voorkomen dat bellen aan de onderkant van het dialysemembraan vallen.
    11. Verwijder de eiwitten gedurende 4 uur bij 350 V in een koude kamer.
    12. Nadat de elutie is voltooid, verwijder de elektroeluter module uit de buffertank en plaats deze in een gootsteen of een kom.
    13. Als er een stop werd gebruikt, verwijder het om te dragenIn de bovenste bufferkamer. Anders, gebruik een grote pipet om de buffer te verwijderen.
    14. Verwijder de buffer uit elke glazen buis en weggooi. Zorg ervoor dat de siliconenadapter op zijn plaats blijft en dat de vloeistof onder de frit niet verstoord of geschud wordt.
    15. Verwijder de siliconenadapter zorgvuldig, samen met de membraankap uit de bodem van de glazen buis. Pipet de inhoud (ongeveer 400 μL) van de siliconenkap in een microtube. Met een andere 200 μl elutiebuffer spoel de siliconenkap af en voeg deze aan de microtube. Herhaal voor alle glazen buizen.
    16. Aangezien de membraankappen hergebruikt kunnen worden, behoudt u de membraankappen door ze in elutiebuffer te plaatsen die 0,5 mg / ml natriumazide bevat. Koel ze.
      OPMERKING: Het eluaat heeft een lage eiwitconcentratie en kan geconcentreerd worden met behulp van een centrifugaalfilterapparatuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om mitochondriale supercomplexen te visualiseren, werden vers geïsoleerde mitochondria van muizen gebruikt 17 , 18 . Mitochondriale supercomplexen zijn gevoelig voor herhaalde cycli van bevriezen en ontdooien, wat leidt tot hun desintegratie, hoewel dit voor sommige onderzoekers tolerant kan zijn. Indien bevriezing noodzakelijk is voor opslag, om de beste resultaten te waarborgen, mogen de monsters niet meer dan één cyclus van bevriezing en ontdooien ondergaan.

Om de mitochondriale ETC complexen met BN PAGE te visualiseren, werden 100 μg eiwit uit geïsoleerde hart mitochondria geladen op een 4-10% gel ( Figuur 1A ). De Coomassie-vlek in de laad- en kathodebuffer is voldoende om de eiwitcomplexen gedurende de run te labelen. Supercomplexen verschijnen na het contrast digitaal vergroten (niet getoond). Voor CN PAGE, twee monsters van 20 μg oF eiwit uit geïsoleerde mitochondria werden geladen op een 3 - 8% CN gel en gescheiden ( Figuur 1B ). De CN PAGE was gekleurd met Coomassie en destijds om de eiwitcomplexen te visualiseren. Nadat het contrast digitaal is verhoogd, verschenen verschillende eiwitcomplexen met een molecuulgewicht groter dan het monomeer van Cx-I ( Figuur 1B , rechts). De toegepaste concentraties van AAB zijn toegestaan ​​voor de grootste supercomplexen om gewoon de gel uit de put in te voeren. Een gel eindigend met een gradiënt van minder dan 3% AAB is echter niet stabiel genoeg om te manipuleren voor overdracht of voor het uitsnijden van een band of baan. Bovendien handhaaft de lage concentratie van AAB in de bovenste delen van de 3-8% CN-gelen wat mobiliteit van de eiwitcomplexen, die belangrijk is als inheemse elektroelutie 19 wordt overwogen.

Monomeren en supercomplexen van Cx-I en monomeren, dimers en supercomplexen van CXV zijn enzymatisch actief en kunnen door IGA worden weergegeven ( Figuur 1C -F ). De analyses tonen aan dat Cx-I en Cx-V in geïsoleerde hart mitochondriën aanwezig zijn in eiwitcomplexen die groter zijn dan hun respectievelijke monomeren. In de IGA-analyse voor Cx-I wordt NADH geoxideerd en worden elektronen overgebracht om nitroblue tetrazolium te reduceren. Dit resulteert in een gelokaliseerde blauwe kleur bij het molecuulgewicht van de Cx-I monomeren en de Cx-I bevattende respirasomen / supercomplexen ( Figuur 1C ). De activiteit van Cx-V wordt beoordeeld aan het vermogen van de F1 subeenheid om ATP te hydrolyseer en kan worden uitgevoerd met behulp van CN of BN gels ( Figuur 1D- F ). De door deze reactie gegenereerde ADP interageert met lood en resulteert in een wit neerslag op het niveau van Cx-V monomeren, dimers, synthasomen en subcomplexen (waarschijnlijk het niet-gemonteerde F1 gedeelte van Cx-V). Merk op dat oligomycine de l elimineertAbelling van deze bands, bevestigen dat ze Cx-V bevatten ( Figuur 1E ).

Voor alle hier beschreven experimenten werd het zwitterionische wasmiddel, laurylmaltoside, gebruikt in een concentratie van 2 μg / 1 μg eiwit, die de hoogste concentratie is die de supercomplexen behoudt, terwijl consistente en reproduceerbare resultaten worden verkregen ( Figuur 1F ). De effectiviteit van laurylmaltoside hangt echter af van het lotnummer, de opslagomstandigheden en de leeftijd. Zo is de exacte concentratie die in een laboratorium wordt gebruikt niet noodzakelijkerwijs hetzelfde als in manuscripten. De juiste concentratie van detergent zal de membranen oplossen, maar de complexen en supercomplexen intact houden en moeten bepaald worden door gebruik te maken van verschillende concentraties laurylmaltoside ( Figuur 1F ). Voor CN PAGE werd een totaal monstervolume van 40 μl per put berekendHieruit resulterend in een eiwit / detergentverhouding van 1 μg / 2 μg of een detergent / buffer verhouding van 1 μg / 1 μL (gelijk aan 1,9 mM). Van de 40 μL werd 30 μl per put van de mini-gel aangebracht; De overige werd gebruikt als een aliquot voor de detectie van VDAC, een laadbesturing ( Figuur 2D ).

Voor immunoblotting heeft CN de voorkeur aan BN PAGE omdat de eiwitten niet geladen zijn met Coomassie, die interfereert met detectie door antilichamen. Figuur 2 toont de detectie van supercomplexen die de Cx-I en Cx-V eiwitten NDUFB6 en ATP5A bevatten uit geïsoleerde hart-, lever- en hersenmitochondria. Ponceau S-etikettering na overdracht en voor immunoblotting kan gebruikt worden om de molecuulgewichtsmarkers te markeren en te controleren voor eiwitbelasting ( Figuur 2A ). Dit zal de monomeren van de eiwitcomplexen van de ETC op nitrocellul visualiserenOzonmembranen, maar Ponceau S-etikettering is niet altijd voldoende voor de visualisatie van mitochondriale supercomplexen ( Figuur 2A ), die kan worden bereikt door immunoblotting.

Cx-I assembleert zich niet in dimeren en tetrameren, maar vormt steeds meer hogere moleculaire gewichts supercomplexen met Cx-III en Cx-IV 14 , 20 , 21 . Hierbij blijkt dat het gebruik van een antilichaam tegen NDUFB6 blijkt dat het monster uit het hart meer Cx-I monomeer en supermoleculaire supercomplexen (topbanden) van de mitochondriën uit de lever of de hersenen bevatte ( Figuur 2B ). De hoeveelheid mid-range respirasome supercomplexen was ook veel hoger in het hart dan in de andere weefsels ( Figuur 2B ).

Met behulp van anti-ATP5A antilichamen,Monomeren van Cx-V zijn detecteerbaar in mitochondriën uit alle weefsels, terwijl een duidelijk patroon van banden die representatief zijn voor dimers (D) en grotere supercomplexen (SC), die duidelijk zichtbaar zijn in hart mitochondriën, niet zo prominent zijn in lever- en hersenmitochondriën ( Figuur 2C ). Overexposure (1 min versus 20 s) van de immunoblot toont verscheidene Cx-V-bevattende supercomplexen, die tetrameren en synthasomen zouden kunnen vertegenwoordigen ( Figuur 2C ). Deze patronen van Cx-V-eiwitcomplexen in hart-, lever- en hersenmitochondria tonen verschillen die weefselspecifiek zijn en nog niet onderzocht zijn.

Proteïnebelasting van deze blots kan gevolgd worden door Ponceau S-kleuring en VDAC-detectie van de bovengenoemde aliquot door SDS PAGE, zoals getoond in Figuur 2D .

Niet alle antibo'sMatrijzen zijn geschikt om een ​​eiwit te detecteren binnen de quaternaire of tertiaire structuur van een eiwitcomplex na native PAGE. Om dit probleem te overwinnen kunnen hele en gedeeltelijke rijstroken van de inheemse gel op een denaturerende gel worden gemonteerd voor een tweede dimensie (2D gels, zie Referentie 13 voor een demonstratie). 2D elektroforese is een waardevol hulpmiddel voor het visualiseren van eiwitten in een supramoleculaire complex. Zoals in Figuur 2 blijkt, zijn supercomplexen echter aanwezig in variabele hoeveelheden en het signaal van individuele eiwitten uit supercomplexen kan moeilijk zijn om te visualiseren in de tweede denaturerende dimensie. Om dit probleem te overwinnen werd de elektroelutie van eiwitcomplexen van inheemse gels hier gebruikt. Dit isoleren supercomplex banden uit meerdere baan om meer materiaal te leveren voor verdere studie.

Bij gebruik van elektroelutie is alleen de belangengroep, die door IGA is geïdentificeerd en / of op een BN PAGE geconfigureerd, exclusiefseerd; De eiwitten uit dit stuk gel worden verder gezuiverd door elutie van de gel. Figuur 3A toont een baan van een BN PAGE waaruit banden die het monomeer vertegenwoordigen werden uitgesneden voor elektroelutie. Om de Cx-V activiteit van het monomeer na elektroelutie te beoordelen werd het eluaat aangebracht op een tweede CN PAGE. Het eluaat van het monomeer bevat nog steeds enzymatisch actieve Cx-V, maar subcomplexen verschijnen ook ( Figuur 3B ). Zilverkleuring van het eluaat na inheemse CN PAGE ( Figuur 3C ) of denaturerende SDS PAGE ( Figuur 3D ) geeft de aanwezigheid van eiwitten in het eluaat aan, en immunoblotting tegen ATP5A duidt op de aanwezigheid van Cx-V in beide monsters ( Figuur 3D ).

Figuur 1
Figuur 1: Visualisatie van MitochOndriale supercomplexen. ( A ) Twee rijstroken van een maximale-4-10% BN, met monsters van geïsoleerde hart mitochondria. Aliquots van hetzelfde monster werden uitgevoerd in beide rijstroken, bij 100 μg eiwit per put. De monomeren van eiwitcomplexen I, II, III, IV en V van het ETC zijn duidelijk zichtbaar en worden aan de rechterkant van de gel gemerkt. ( B ) Twee monsters van hart mitochondria (1 en 2, 20 μg eiwit / baan) werden gescheiden op een CN PAGE en visualiseerd door Coomassie-kleuring. SC geeft de positie van de supercomplexen aan na het vergroten en digitaal verbeteren van het bovenste gedeelte van de gel (het gebied wordt aangegeven met rode pijlen). ( C ) 20 μg mitochondriale eiwit werden gescheiden op een 3-8% CN PAGE en werden verwerkt voor Cx-I IGA. Vergrote en digitaal verbeterde beelden tonen bands van Cx-I reactieproduct. ( D ) 20 μg mitochondriale eiwit werden gescheiden op een 3-8% BN PAGE en verwerkt voor Cx-V IGA. magnifi Ed en digitaal verbeterde beelden tonen bands van Cx-V reactieproduct. ( E ) 50 μg mitochondriale eiwit werden gescheiden op een 5-15% CN PAGE en verwerkt voor Cx-V IGA zonder (-) en met (+) 5 ug / ml oligomycine (Oligo). ( F ) Mitochondriale eiwit (20 μg / laan) werd opgelost met 2 - 6 μg laurylmaltoside / 1 μg eiwit, zoals aangegeven bovenaan de gel, en gescheiden op een 3-8% CN gel gevolgd door Cx- V IGA. Alle afbeeldingen werden gefotografeerd met behulp van een lichttafel ( A - C ) of een zwart oppervlak ( D - F ). Camera specificaties zijn in de Tabel van Materialen. De locatie van de molecuulgewichtsmarkers (MW) is aan de linkerkant van alle panelen aangegeven. Afkortingen: D = dimers; F 1 * = subcomplex van Cx-V; LM = lauryl maltoside; M = molecuulgewichtsmarkering; M = monomeren; SC = supercomplexen.G1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 2
Figuur 2: Detectie van Mitochondriale Supercomplexen door Immunoblotting. 20 μg eiwit uit het hart (H), lever (Li) en hersen (B) mitochondria werden gescheiden op een 3-8% CN PAGE en overgebracht op nitrocellulosemembraan. ( A ) Ponceau S-kleuring van het membraan geeft de aanwezigheid van eiwitcomplexen en molecuulgewichtsmarkers aan (m). De blauwe pijl wijst naar de top van de gel. ( B ) Het Cx-I eiwit, NDUFB6, werd geïmmunkeerd op het in (A) getoonde vlees (1 min blootstellingstijd). ( C ) Cx-V werd gevisualiseerd met anti-ATP5A antilichaam (20 s en 1-min blootstelling, zoals aangegeven). De rode pijlen in (B) en (C) geven aan dat het gebied vergroot en digitaal verbeterd is voor de visuaLization van Cx-I- en Cx-V-supercomplexen, en de blauwe pijl wijst naar de top van de gel. ( D ) Ponceau S en immunolabelling van de VDAC-aliquot van elk extract dat wordt gebruikt in (A), (B) en (C), die door SDS PAGE werden gescheiden en overgebracht naar nitrocellulose. Afkortingen: M = monomeren van Cx-I of Cx-V, D = dimers van Cx-V, SC = supercomplexen die Cx-I of Cx-V bevatten. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Electroelution van Cx-V. ( A ) BN PAGE van een mitochondriale monster. De boxed band vertegenwoordigt het monomeer van Cx-V dat werd uitgesneden en geëlektroleerd. ( B ) Het eluaat werd onderworpen aan CN PAGE, en daaropvolgende IGA voor Cx-V demonstreert monomeren (M)En subcomplexen die F1 van Cx-V bevatten. ( C ) Zilverkleuring van de CN PAGE van het eluaat demonstreert monomeren (M). ( D ) Zilverkleuring (linker paneel) en immunoblot voor ATP5A (rechter paneel) van een denaturerende natriumdodecylsulfaat (SDS) PAGE van het eluaat geeft de aanwezigheid van Cx-V aan. Voor SDS PAGE, verwijzen wij u naar de elders gepubliceerde protocollen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een functionele ETC is nodig voor mitochondriale ATP generatie. De complexen van de ETC kunnen twee soorten supercomplexen vormen: de respirasomen (Cx-I, -III en -IV) 1 en de synthasomen (Cx-V) 2 . De montage van elk complex is nodig voor een intacte ETC, terwijl de organisatie van de ETC in supercomplexen de algemene ETC-efficiëntie 5 , 22 verbetert. Hoe deze supercomplexen elkaar verzamelen en demonteren, worden niet goed begrepen, maar de hier beschreven protocollen kunnen een beter begrip van deze processen mogelijk maken.

De grote uitdaging van het bestuderen van ETC-assemblage is de grootte van deze eiwitcomplexen. Mitochondriale respirasomen kunnen bijvoorbeeld bestaan ​​uit Cx-I (ongeveer 880 kDa) en een of meer moleculen Cx-III (460 kDa) en Cx-IV (200 kDa, actief als dimer), resulterend in een supercomplex met een molecuul Gewicht van ongeveer2000 kDa. Bovendien heeft Cx-V een molecuulgewicht van ongeveer 600 kDa, maar is aangetoond dat ze in dimeren, tetrameren, oligomeren en linten van dimeren 7 , 23 samenvoegen, resulterend in supercomplexen met een molecuulgewicht van ten minste 2000 kDa. Gezien de enorme omvang van deze supercomplexen, zijn verschillende gedeeltelijk gerelateerde benaderingen traditioneel gebruikt om deze supercomplexen te identificeren en te karakteriseren, door dit lab en door anderen 8 , 14 , 24 .

Dit werk heeft de techniek van native gel PAGE aangetoond, waarbij actieve eiwitcomplexen zachtjes worden geëxtraheerd uit het mitochondriale membraan met milde detergentia. De complexen migreren in de gels voornamelijk door hun grootte en intrinsieke lading (CN PAGE) of door de grootte en negatieve lading van eiwitgebonden Coomassie blue (BN PAGE). Deze gels kunnen door C worden gekleurdOomassie blauw ( bijv. In CN gels) of zilvervlek ( bijv. In BN en CN PAGE) om eiwitbanden te onthullen.

Lauryl maltoside werd gebruikt voor de hier getoonde experimenten omdat dit wasmiddel het meest betrouwbaar heeft gewerkt. Als alternatief kan digitonine gebruikt worden om eiwitcomplexen 12 te extraheren. Gegevens uit mitochondriën geïsoleerd uit volwassen harten, levers en hersenen zijn hier getoond, maar deze technieken zijn uitgevoerd op embryonale en volwassen harthomogenaten 8 . Anderen hebben deze techniek uitgevoerd met behulp van geïsoleerde mitochondria uit gekweekte cellen 24 . Bij gebruik van weefselhomogenaten of gekweekte cellen met een hoog DNA-gehalte kan het echter nuttig zijn een nuclease toe te voegen om te voorkomen dat strepen tijdens elektroforese 25 plaatsvinden.

De activiteit van de verschillende complexen kan direct in de gel worden geanalyseerd, zoals hier getoond voor Cx-I en Cx-V en tecHniques zijn ook beschikbaar om de activiteiten van Cx-II, -III en -IV 12 te onderzoeken. Analyse van deze IGA's moet echter zorgvuldig worden uitgevoerd. Ten eerste kan de enzymatische reactie te wijten zijn aan niet-ETC-enzymen of onvolledig samengestelde complexen. Het is bijvoorbeeld routine om de Cx-V IGA uit te voeren met een parallelle gel die met oligomycine is behandeld om intact Cx-V te voorkomen ( Figuur 3 ). Daarnaast kunnen andere NADH-oxidasen rekening houden met de Cx-1 in-gel activiteit. Men zou een parallelle IGA kunnen uitvoeren in aanwezigheid van een Cx-I-remmer, zoals rotenon. In figuur 1 werden echter geïsoleerde mitochondria gebruikt, zodat cytoplasmatische NADH-oxidasen niet aanwezig waren; Dus de gegevens vertegenwoordigen waarschijnlijk Cx-I-bevattende monomeren en supercomplexen. Daarnaast is de kwantificering van deze resultaten mogelijk door de signaalintensiteit van de bands op foto's of scans te meten. Nadelen bij deze aanpak omvatten de verschillen tussen enBinnen de gels, de mobiliteit van het reactieproduct, het onvermogen om het product adequaat te kwantificeren in de diepte van de gel en de potentiële niet-lineariteit van de reactie 27 . Om deze laatste te overwinnen hebben sommigen voorgesteld het verkrijgen van reactiesnelheden met seriële foto's, maar dit is hier niet geprobeerd.

Het eiwit in natieve gels kan ook worden overgebracht naar membranen, en de eiwitsamenstelling van de banden kan worden onderzocht door immunoblotting (hier aangetoond) of 2D PAGE (aangetoond in referentie 13 ). Monomeren van de ETC complexen zijn traditioneel geïdentificeerd door hun overvloed in natieve gels van geïsoleerde mitochondria, hun plaats in de gel, en hun positie ten opzichte van het moleculaire merkerproteïne ( Figuur 1 ). Bovendien helpt de etikettering van volgende immunoblots met antilichamen die specifiek zijn voor subeenheden van verschillende complexen het complex en de samenstelling te identificerenVan supercomplexen. Daarom identificeren anti-NDUFB6 en -ATP5A monomeren van en supercomplexen die respectievelijk Cx-1 en Cx-V bevatten, zoals hier getoond. Antilichamen tegen Cx-II tot IV kunnen voor hetzelfde doel worden gebruikt. In sommige gevallen kunnen antilichamen die goed werken in denaturerende gels wellicht niet goed werken in natieve gels doordat sommige antilichamen specifiek zijn voor gedenatureerd eiwit of dat een epitoop door andere eiwitten in een native complex kan worden gemaskeerd.

De exacte bepaling van het molecuulgewicht van deze supercomplexen is moeilijk, aangezien de meeste beschikbare molecuulgewichtsmarkers onder de grootte van Cx-V monomeren liggen. De migratie van eiwitcomplexen in een natieve gel hangt af van de grootte, de intrinsieke lading en het gebruikte wasmiddel 28 . In de voorbeelden werden monomeren van de complexen geïdentificeerd op basis van gels, markers en immunoblotting. Dimers van Cx-V werden geïdentificeerd op basis van relatieve migratie in vergelijking met monomeren van Cx-I en -V en op immunodeppen. Alles boven de monomeren en dimeren in gels, IGA's en immunoblots worden beschouwd als supercomplexen.

Inheemse immunoblots kunnen ook gekwantificeerd worden voor supercomplexen door banddichtheid te analyseren onder toepassing van standaard technieken. Deze methode is hier niet getoond, maar een recente publicatie laat deze techniek zien 8 . Normalisatie van eiwitbelading kan worden uitgevoerd met behulp van de Ponceau-rode kleuring van de baan of door het bewaren van een monster van het mitochondriale extract om de dichtheid van de VDAC-band op een denaturerende immunoblot te meten ( Figuur 2A en D ). Bovendien is het onderzoek naar de verhouding van supercomplexen naar monomeren in dezelfde immunoblot een andere manier om banddichtheid te kwantificeren, maar men moet voorzichtig zijn om op verschillende tijdstippen foto's te maken tijdens de blote ontwikkeling, zodat de bands niet overbelicht zijn.

Ten slotte kunnen banden van inheemse gels worden geëlektroleerd om purifie te genererenD, actieve eiwitcomplexen die in complexe complexen kunnen assembleren en kunnen worden gebruikt voor verdere studies van complexe functie. Bijvoorbeeld werden Cx-V monomeren eerder geëlektroleerd en opnieuw in liposomen gereconstitueerd om de elektrische functionaliteit 29 aan te tonen . Een alternatieve aanpak van inheemse elektroelutie is elutie door passieve diffusie in de omliggende buffer 16 , maar dit is traag in vergelijking met natieve elektroelutie. Tenslotte behoudt een belangrijk probleem met elektroelutie de enzymatische functie van het geëlektroleerde eiwitcomplex, aangezien het complex tijdens de zuivering kan dissociëren. Daarom moet elke bepaling van functie na isolatie door deze techniek streng worden getest.

Door deze protocollen te combineren met enzymatische analyses en zuurstofverbruiksmetingen, die de functie van individuele ETC-complexen en de activiteit van de gehele ETC 30 , en andere methodeOds, zoals de kristallografische 31 en elektronenmicroscopische 32- evaluatie van de structuur van complexen en supercomplexen, kan een vollediger beeld van de innerlijke werking van de ETC ontstaan. We zijn dichter bij het begrijpen hoe de complexen worden samengesteld, hoe elektronen de ketting stroomt en hoe protonen over het membraan worden gepompt om de gradiënt te genereren en vervolgens terug te vloeien naar de matrix via Cx-V om ATP te genereren. Ongetwijfeld zullen deze technieken verder verfijnd worden om aanvullende details te geven over de structuur, functie en dynamische regulering van de ETC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] en het Strong Children Research Center aan de Universiteit van Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Tags

Biochemie Mitochondria elektron transportketting respirasomen synthasomen duidelijke inheemse elektroforese in-gel analyses elektroeluctie
Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter