Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.

Abstract

A cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) transduz a energia derivada da quebra de vários combustíveis na moeda bioenergética da célula, a ATP. O ETC é composto de 5 complexos de proteínas maciças, que também se reúnem em supercomplexos chamados respirasomes (CI, C-III e C-IV) e synthasomes (CV) que aumentam a eficiência do transporte de elétrons e produção de ATP. Vários métodos foram usados ​​por mais de 50 anos para medir a função ETC, mas esses protocolos não fornecem informações sobre a montagem de complexos e supercomplexos individuais. Este protocolo descreve a técnica de eletroforese de gel de poliacrilamida de gel nativo (PAGE), um método que foi modificado há mais de 20 anos para estudar a estrutura do complexo ETC. A eletroforese nativa permite a separação de complexos ETC em suas formas ativas, e esses complexos podem então ser estudados usando imunotransferência, ensaios em gel (IGA) e purificação por eletroeluição. Ao combinar o reResultados da PAGE PAGE nativa com os de outros ensaios mitocondriais, é possível obter uma imagem completa da atividade ETC, sua montagem dinâmica e desmontagem, e como isso rege a estrutura e função mitocondrial. Este trabalho também irá discutir limitações dessas técnicas. Em resumo, a técnica de PAGE nativa, seguida de imunotransferência, IGA e eletroeluição, apresentada abaixo, é uma maneira poderosa de investigar a funcionalidade e a composição dos supercomplexos ETC mitocondriais.

Introduction

A energia mitocondrial na forma de ATP não é apenas essencial para a sobrevivência celular, mas também para a regulação da morte celular. A geração de ATP por fosforilação oxidativa requer uma cadeia funcional de transporte de elétrons (ETC, Cx-I a IV) e ATP sintetase mitocondrial (Cx-V). Estudos recentes mostraram que esses grandes complexos de proteínas são organizados em supercomplexos, chamados respirasomes e synthasomes 1 , 2 . É desafiador analisar a montagem, a dinâmica e a regulação da atividade desses complexos maciços e supercomplexos. Enquanto as medições de consumo de oxigênio tomadas com um eletrodo de oxigênio e ensaios enzimáticos realizados usando um espectrofotômetro podem fornecer informações valiosas sobre a atividade do complexo ETC, esses ensaios não podem fornecer informações sobre a presença, tamanho e composição da subunidade do complexo de proteína ou supercomplexos envolvidos. No entanto, o desenvolvimento de nativos azuis e nítidos (BN e CN, respectivamente) A PAGE 3 criou uma ferramenta poderosa para revelar informações importantes sobre composição complexa e montagem / desmontagem e sobre a regulação dinâmica da organização supramolecular desses complexos respiratórios vitais em condições fisiológicas e patológicas 4 .

A montagem desses complexos em supercomplexos de ordem superior parece regular a estrutura mitocondrial e a função 5 . Por exemplo, a montagem do respirasome aumenta a eficiência da transferência de elétrons e a geração da força motora do próton através da membrana interna mitocondrial 5 . Além disso, a montagem de synthasomes não só aumenta a eficiência da produção de ATP e a transferência de equivalentes de energia para o citoplasma 2 , mas também molda a membrana interna mitocondrial nas cristas tubulares 6 , </ Sup> 7 . Estudos de montagem de supercomplexos durante o desenvolvimento cardíaco em embriões de ratos mostram que a geração de supercomplexos contendo Cx-I no coração começa no dia embrionário 13,5 8 . Outros mostraram que a quantidade de supercomplexos contendo Cx-I diminui no coração devido ao envelhecimento ou lesões de isquemia / reperfusão 9 , 10 ou pode desempenhar um papel na progressão de doenças neurodegenerativas 11 .

Este protocolo descreve métodos para o PAGE gel nativo que podem ser usados ​​para investigar a montagem e a atividade dos complexos ETC e supercomplexos. O peso molecular aproximado dos supercomplexos mitocondriais pode ser avaliado separando os complexos de proteínas em géis de poliacrilamida CN ou BN. O CN PAGE também permite a visualização da atividade enzimática de todos os complexos mitocondriais diretamente no gel (ensaios em gel;IGA) 12 . Este trabalho demonstra a atividade dos respirasomes ao destacar a capacidade do Cx-I de oxidar o NADH através do IGA e a presença de sinteticos devido à atividade de hidrolização de ATP da Cx-V pela IGA. Os múltiplos complexos e supercomplexos contendo Cx-I e Cx-V também podem ser demonstrados pela transferência das proteínas para membranas de nitrocelulose e realização de imunotransferência. A vantagem desta abordagem é que BN ou CN PAGE geralmente separam complexos de proteínas com base em seu tamanho e composição fisiológica; A transferência para uma membrana preserva esse padrão de bandas. A análise de complexos de proteína em uma BN ou CN PAGE também pode ser feita usando 2D-PAGE (ver Fiala et al. 13 para uma demonstração) ou por centrifugação de densidade de sacarose 14 , 15 . Para analisar ainda mais uma banda específica, ela pode ser excluída da BN PAGE, e as proteínas deste complexo proteico podem ser purificadasD, electroelutando-os sob condições nativas. A eletroeluição nativa pode ser realizada dentro de poucas horas, o que poderia fazer uma diferença significativa na difusão passiva (como usada na Referência 16) de proteínas de um gel para o amortecedor circundante.

Em resumo, esses métodos descrevem várias abordagens que permitem a caracterização adicional de supercomplexos de alto peso molecular de membranas mitocondriais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todas as experiências foram realizadas usando corações de ratos C57BL / 6N (tipo selvagem). Os ratos foram anestesiados com CO 2 antes da luxação cervical e todos os procedimentos foram realizados em estrita conformidade com a Divisão de Medicina Animal de Laboratório da Universidade de Rochester e em conformidade com a lei estadual, estatuto federal e a política NIH. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Rochester (Comitê Universitário de Recursos Animais).

1. CN e BN PAGE

NOTA: Todo o equipamento usado para BN e CN PAGE deve estar livre de detergente. Para garantir isso, lave todo o equipamento com ácido clorídrico 0,1 M, seguido de enxaguamento extensivo com H 2 O desionizada.

  1. Preparação
    1. Preparar tampão de ânodo consistindo em imidazol 25 mM, pH 7,0, a 4 ° C; Armazenar a 4 ° C.
    2. Prepare o tampão catódico para CN ou BN PAGE.
      1. Para CN PAGE, use 7,5 mM de imidazole e 50 mM de tricina; Adicionar 0,5 g de desoxicolato de sódio e 0,2 g de lauril maltósido por litro de tampão. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
      2. Para BN PAGE, use 7,5 mM de imidazole e 50 mM de tricina e ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C. Armazenar a 4 ° C.
      3. Para tampão de cátodo BN azul claro, use imidazol 7,5 mM e tricina 50 mM. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e adicione 20 mg de Coomassie por litro de tampão. Armazenar a 4 ° C.
    3. Prepare o tampão de extração (EB) com 50 mM de NaCl, 50 mM de imidazole, 2 mM de ácido aminocaproico e 1 mM de EDTA. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
    4. Prepare o tampão de gel 3x (usado para os géis BN e CN) com imidazole 75 mM e ácido aminocaproico 1,5 M. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
    5. Prepare um tampão de carga (LB) de 0,01 g de Ponceau S, 5 g de glicerol e 5 mL de H 2 O. Armazene na salatemperatura.
    6. Prepare o azul de Coomassie adicionando 50 mg de Coomassie a 1 mL de ácido 6-amino-hexanóico 500 mM. Ajuste o pH para 7,0 a 4 ° C e armazene a 4 ° C.
    7. Prepare 20 mM e 200 mM de lauril maltosido em H 2 O. Faça alíquotas de 200 μL e guarde-as congeladas. Desengate o detergente antes de usar.
3% a 8% (mini) 4% a 10% (maxi)
0,5 géis (luz) 0,5 géis (pesados) 0,5 géis (luz) 0,5 géis (pesados)
AAB (mL) 0,42 1,3 2,5 7,7
Tampão CN / BN (mL) 1,6 1,6 8,5 8,5
H2O (mL) 2,7 1,4 14 6.3
Glicerol (g) 0 0,47 0 2,5
Volume (mL) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabela 1: Quantidades de Ingredientes Necessárias para Verter 1 Mini- ou Maxi-PAGE. Os volumes utilizados nesta tabela são calculados para 1 mini- ou 1 maxi-gel, 1,5 mm de espessura. O volume de AAB baseia-se em uma solução de estoque de 40%. Light e heavy se referem ao concentradoIon de AAB. APS e TEMED são adicionados após cada coluna do misturador de gradiente ser preenchida com a solução AAB.

  1. Vertendo e correndo géis
    NOTA: Use 3-8% ou 4-10% de gradiente de acrilamida / bisacrilamida (AAB) para geles CN ou BN, respectivamente. A Tabela 1 resume as quantidades de tampão, AAB, H2O, glicerol, sulfato de amônio (APS) e tetrametiletilenodiamina (TEMED) utilizados para um mini-gel (85 mm de largura x 73 mm de altura x 1,5 mm de espessura) ou maxi-gel (160 Mm de largura x 200 mm de altura x 1,5 mm de espessura). As montagens de placas de vidro com geles CN ou BN podem ser refrigeradas em um saco com alguns mL de 1x tampão de gel ou envolvidos em uma toalha de papel molhada com 1x tampão de gel para armazenamento. Os géis são estáveis ​​para uso por até uma semana.
    1. Para derramar o gel, coloque o misturador de gradiente em uma placa de agitação elevada para garantir que o gel fluirá por gravidade na câmara de gel preparada.
    2. Preencha a câmara de saída do misturador gradiente com 4,77 / 25 mL (Mini / maxi) da solução pesada (com maior concentração de AAB).
    3. Abra suavemente a conexão da bujão entre a câmara pesada e a câmara de luz e permita que uma gota de solução atravesse o outro lado.
      NOTA: Isso empurra bolhas de ar do tubo de conexão e do pino de parada, o que impedirá o fluxo entre as duas câmaras. Isso não pode ser feito se ambos os lados já foram preenchidos, porque a pressão igual impedirá que a bolha se mova.
    4. Encha a outra câmara do misturador gradiente com 4,72 / 25 mL (mini / maxi) da solução de luz.
    5. Coloque uma barra de agitação na câmara de saída com a solução pesada e comece a mexer. Use uma velocidade de barra de agitação que não cause borbulhamento.
    6. Adicione rapidamente APS e TEMED a cada câmara para iniciar a polimerização.
    7. Abra a conexão entre as duas câmaras do misturador de gradiente e permita a mistura por alguns segundos antes de abrir a câmara de saída para despejar o gel.
      NOTA: gravidade wiVai drenar as duas câmaras igualmente e a mistura da luz na solução pesada diminuirá lentamente a densidade de acrilamida do fundo para o topo do gel. Use todo o conteúdo que está no misturador de gradiente para despejar o gel.
      1. No final, monte cuidadosamente o pente, com os poços dentro do gel para evitar a mistura de bolhas e camadas.
    8. Lavar imediatamente o misturador de gradiente com etanol para enxaguar qualquer gel. Enxague com água e despeje o segundo gel. Deixe que os géis polimerizem (geralmente menos de 20 min é necessário para mini-géis).
    9. Para executar os géis, montá-los na braçadeira do conjunto do eléctrodo e preencher a câmara central / superior com tampão de cátodo BN ou azul claro. Aguarde alguns minutos para verificar se há vazamentos antes de adicionar o buffer anódico à câmara externa / inferior.
      1. Retire delicadamente os pentes bem e lave os poços com tampão de cátodo usando uma seringa ou uma pipeta.
      2. Execute os géis em uma sala fria (4 ° C) ou completamente embalado em gelo.
        1. Para o CN mini-PAGE, use 100 V pela primeira hora e 200 V até terminar, geralmente um adicional de 1-1,5 h. Alternativamente, execute a mini-PAGE da NC a 30-40 V durante a noite.
          NOTA: O foco aqui é sobre complexos de proteína de alto peso molecular, de modo que os complexos de proteína com um peso molecular inferior a 140 kDa ficarão fora do gel. Pequenos tempos de funcionamento para eletroforese podem ser usados ​​para reter complexos de baixo peso molecular.
        2. Para BN maxi-PAGE, use 100 V e execute os géis durante a noite (cerca de 18 h).
          NOTA: A corrente será muito baixa (<15 mA), portanto, é necessária uma fonte de alimentação que possa lidar com essas condições. Neste ponto, os géis podem ser usados ​​para IGA ou imunotransferência. Em alguns casos, bandas ou faixas podem ser cortadas dos géis usando uma lâmina de barbear em uma placa de vidro para eletroeluição.
  2. Preparação de amostra
    NOTA: Os supercomplexos mitocondriais ligados à membrana devem ser extraídos deE membrana mitocondrial interna. Para preservar supercomplexos mitocondriais, use mitocôndrias recentemente isoladas ou amostras congeladas e descongeladas apenas uma vez. Os cálculos / volumes abaixo são dados para mini-géis (o poço de um pente de 10 poços em um gel de 1,5 mm de espessura detém até 35-40 μL) e maxi-géis (o poço de um pente de 15 po mantém até 200 μL). Além disso, salve uma alíquota de cada amostra (geralmente 10 μL), para ser executada em um gel SDS desnaturante para a detecção do canal aniónico dependente da tensão (VDAC), como controle de carga.
    1. Coloque uma quantidade apropriada ( por exemplo, 10-50 μg de proteína para mini-géis e 50 - 200 μg para maxi géis) de mitocôndrias isoladas ou homogeneizado de tecido em microtubos e centrifugação a 17.000 xg durante 10-15 min a 4 ° C.
      NOTA: Esta etapa remove algumas das proteínas mitocondriais solúveis e / ou citossólidas solúveis.
    2. Aspirar e descartar o sobrenadante e adicionar o buffer de extração à quantidade desejadaPara carregar no gel. Ressuspenda gentilmente o sedimento no gelo. Se desejado, adicione uma mistura geral de inibidor de protease neste ponto.
      NOTA: Com base no equipamento aqui utilizado, utilizou-se 30 μL para um mini-gel e 100 μL para um maxi-gel, limitando a relação proteína / tampão a não mais de 2 μg de proteína para 1 μL de tampão.
    3. Adicione detergente ( por exemplo, 2 μg de lauril maltósido / 1 μg de proteína, veja os Resultados representativos e Discussão para mais informações).
      NOTA: Geralmente, utiliza-se lauril maltosido, mas a digitonina também pode ser usada.
    4. Incubar no gelo por 20 min. Misture gentilmente no início e ocasionalmente durante a incubação triturando e / ou agitando o tubo.
    5. Centrifugar a 17,000 xg durante 10 min a 4 ° C para remover qualquer fragmento de membrana e tecido.
    6. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Para amostras de CN, adicionar 1 μL de LB por cada 10 μL de volume da amostra; O volume total da amostra deve ser a aplicaçãoAproximadamente 40 μL para um mini-gel e 130 μL para um maxi-gel. Para amostras de BN, adicione Coomassie às amostras para que a proporção de corante para detergente seja de 1: 4 (p / p).
    7. Carregue 30 e 120 μL das amostras nos poços do mini- ou maxi-gel, respectivamente. Use os 10 μL restantes de cada amostra para o gel SDS desnaturante para detectar VDAC como um controle de carga.
    8. Para preparar os marcadores de peso molecular, dissolva 1 frasco de uma mistura de calibração de alto peso molecular (veja a Tabela de Materiais para mais informações) em 60 μL de tampão de gel BN / CN e adicione 120 μL de H 2 0 e 20 μL de LIBRA. Carregue 15 μL por pista.
    9. Execute os géis conforme descrito na etapa 1.2.9.2.

2. Ensaios em gel para Cx-I e Cx-V

NOTA: Os ensaios são realizados a temperatura ambiente. Tire fotos, varredura ou imagens das bandas em desenvolvimento para obter documentação. (Importante) As proteínas não podem ser transferidas aiO membranas de nitrocelulose após completar um IGA.

  1. Ensaio Cx-I
    1. Preparação.
      1. Preparar um tampão de ensaio de Tris 5 mM em H 2 O, com um pH de 7,4; armazenar em temperatura ambiente.
      2. Dissolver 10 mg de NADH em 1 mL de tampão de ensaio. Armazenar em alíquotas de 100 μL a -20 ° C até o uso; Evite congelar e descongelar.
      3. Pesar 25 mg de Nitroblue tetrazolium em um microtube.
      4. Prepare o fixador diluindo 5 mL de ácido acético em 95 mL de H 2 O; armazenar em temperatura ambiente.
    2. Realizando o ensaio.
      1. Combine 10 mL de tampão de ensaio com 25 mg de Nitroblue tetrazolium (concentração final: 2,5 mg / mL) e 100 μL de 10 mg / mL de NADH (0,1 mg / mL). Adicione isso a todo o gel, uma pista ou uma área de interesse excisada de um gel de CN.
        NOTA: Isto pode ser feito em um recipiente de plástico ou vidro transparente. Observe que este ensaio não pode ser realizado após BN PAGE.
      2. Siga o desenvolvimento de bandas azuis após agitação suave (rocker) por> 3 min.
      3. Corrigir o gel em 10 a 20 mL de solução de ácido acético ou lavar em Tris 5 mM, pH 7,4 para parar a reação. Pegue fotografias para documentação (veja a Tabela de Materiais).
  2. Ensaio Cx-V
    NOTA: O ensaio Cx-V deve ser feito usando geles CN ou BN duplicados, onde um é incubado com 5 μg / mL de oligomicina (um inibidor de Cx-V) para demonstrar atividade independente de Cx-V.
    1. Preparação.
      1. Preparar um tampão de ensaio com Tris 35 mM e glicina 270 mM; Ajuste o pH para 8,3 à temperatura ambiente. Armazene o tampão congelado em alíquotas de 50 mL, mas verifique o pH após congelamento e descongelamento.
      2. Preparar MgSO4 1 M em H 2 O; Armazenar a 4 ° C até o uso.
      3. Pesar 27,28 mg de Pb (NO 3 ) 2 em um microtube.
      4. Pesar 60 mg de ATP em um microtube.
      5. Dissolver 1 mg de oLigomicina em 1 mL de etanol. Armazenar a -20 ° C até o uso.
      6. Prepare um fixador misturando 50 mL de metanol com 50 mL de H 2 O; armazenar em temperatura ambiente.
    2. Realizando o ensaio.
      1. Incube um gel, uma pista ou uma área de interesse de um gel BN ou CN durante 2 h com agitação suave (rocker) em 10-20 mL de tampão de ensaio ± 5 μg / mL de oligomicina (50-100 μL de 1 mg / ML em etanol) à temperatura ambiente.
      2. Após a incubação, substitua o tampão por 14 mL de tampão de ensaio fresco e adicione, por ordem, 190 μL de MgSO4 1 M (14 mM), 27,28 mg de Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg de ATP ( 8 mM) e 75 μL de oligomicina (quando necessário).
      3. Incubar com agitação suave (rocker) e assistir a um precipitado branco, como bandas sobre géis tratados com oligomicina darão bandas não dependentes de Cx-V.
        NOTA: O aparecimento do precipitado pode levar várias horas.
      4. Corrigir o gel em metanol-Fixador baseado ( por exemplo, 50% de metanol), porque soluções ácidas dissolverão o precipitado de chumbo. Fotografe os resultados.
        NOTA: O precipitado de chumbo não interfere com a coloração de Coomassie dos géis.

3. Transferência de Proteína para Membranas de Nitrocelulose ou Difluoreto de Polivinilideno (PVDF)

  1. Prepare um tampão de transferência de Tris 25 mM e glicina 200 mM. Ajuste o pH para 8,3 e adicione 0,0005 g / L de SDS e 200 mL / L de metanol. Armazenar em temperatura ambiente.
    1. Corte uma membrana de nitrocelulose ou PVDF (tamanho de poro: 0,45 μm) com uma lâmina de barbear ou tesoura para um tamanho ligeiramente maior que o do gel.
      NOTA: As membranas de nitrocelulose permitem a coloração de Ponceau S para avaliar o carregamento de proteínas, enquanto as membranas de PVDF produzem bandas mais definidas.
  2. Protocolo.
    1. Mergulhe a membrana de nitrocelulose, o papel de filtro e as esponjas para umaPelo menos 10 min no buffer de transferência. Coloque a membrana PVDF em metanol a 100% durante 15 s ou de acordo com a recomendação do fabricante antes de colocá-la em buffer de transferência. Coloque a cassete aberta do kit de transferência em uma tigela plana com buffer de transferência.
    2. Coloque a esponja e 1-2 camadas de papel de filtro na parte de trás da cassete. Remova as bolhas.
    3. Coloque o gel no papel de filtro. Indique a orientação do gel cortando um canto do gel e / ou a membrana.
    4. Coloque a membrana sobre o gel. Remova todas as bolhas.
    5. Coloque papel de filtro e uma esponja na parte superior da membrana. Remova todas as bolhas neste sanduíche.
    6. Feche a cassete e coloque-a no suporte da cassete do kit de transferência.
    7. Transfira as proteínas a 25 V por cerca de 12-18 h.

4. Imunotransferência

  1. Preparação.
    1. Prepare uma Mancha de Ponceau (500 mL) adicionando 25 mLDe ácido acético e 0,5 g de Ponceau S a 475 mL de H 2 O; Armazenar à temperatura ambiente (pode ser reutilizado).
    2. Preparar solução salina tamponada com Tris (TBS) com 200 mM de NaCl, 25 mM de Tris-Base e 2,7 mM de KCl. Ajuste o pH para 8.0 e armazene à temperatura ambiente.
    3. Prepare o TBS-tween (TBST) adicionando 0,5 mL / L de Tween 20 ao TBS; armazenar em temperatura ambiente.
    4. Preparar sólidos de leite / TBST dissolvendo 5 g de sólidos de leite em 100 mL de TBST. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de 3 dias.
    5. Preparar BSA / TBST dissolvendo 3 g de albumina de soro bovino (BSA, fração V) em 100 mL de TBST. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de 3 dias.
  2. Protocolo.
    1. Quando a transferência for concluída, coloque a membrana na solução Ponceau S para visualizar todas as proteínas transferidas. Rotule a posição dos marcadores na membrana com um lápis e documente a membrana pintada com Ponceau-S por fotografia ou digitalização.
    2. Lave a membrana 3 vezes por 10 min cada wiTh TBS sob suave agitação.
    3. Bloqueie a membrana com sólidos de leite / TBST durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite em uma sala fria com agitação suave.
    4. Lave a membrana por 10 min com TBST sob agitação suave.
    5. Incubar com anticorpo primário durante a noite na sala fria sob agitação suave. Diluir o anticorpo ( por exemplo, 1: 1000 para anti-ATP5A e -NDUFB6) em BSA / TBST.
      NOTA: A maioria dos anticorpos dá um sinal melhor nas membranas a partir de géis nativos quando incubados durante a noite.
    6. Lave a membrana por 10 min com TBST sob agitação suave.
    7. Incubar com anticorpo secundário durante pelo menos 60 minutos à temperatura ambiente sem agitação suave. Diluir o anticorpo (1: 5.000 a 1: 50.000) em sólidos de leite / TBST.
    8. Lave a membrana 3 vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente com TBST com agitação suave.
    9. Durante a última lavagem, prepare o substrato de quimioluminiscência melhorada (ECL) de acordo com as instruções da manufaCturer.
    10. Incube a membrana com o substrato ECL usando as instruções fornecidas pelo fabricante.
    11. Detectar o sinal no filme usando as instruções fornecidas pelo fabricante do substrato ECL.

5. Electroeluição

  1. Preparação.
    1. Prepare um tampão de eluição de tricina 25 mM, imidazole 3,75 mM (pH 7,0 a 4 ° C) e ácido 6-aminohexanóico 5 mM.
      NOTA: Use luvas sempre que manipule o eletroeluter e tampas de membrana para evitar contaminação com proteínas externas.
  2. No dia anterior ao uso do eletroelutador para eletroeluição nativa, execute o seguinte:
    1. Mergulhe as tampas de membrana (corte: 3,5 kDa) em tampão de eluição durante 1 h a 60 ° C. Transfira as tampas para o tampão de eluição fresco e remova-os por 12 h ou mais no refrigerador.
      NOTA: Um peso molecular de corte de 3,5 kDa evita a perda de pequenas pRoteínas que podem facilmente dissociar-se do complexo proteico de interesse.
    2. Lave bem o módulo de eletroeluter, tubos de vidro, tanque e tampa com etanol. Enxaguar com água e deixar o equipamento secar.
  3. No dia da eletroeluição nativa, faça o seguinte.
    1. Coloque uma frita no fundo (fosco) de cada tubo de vidro a ser usado. Se necessário, coloque o tubo de vidro no tampão de eluição e empurre a frita do interior para o fundo do tubo.
    2. Empurre o tubo de vidro com a frita no módulo do eletroelutador. Molhe o grommet com tampão de eluição e deslize o tubo de vidro no lugar. Certifique-se de que a parte superior dos tubos de vidro seja uniforme com o grommet.
    3. Feche os grommets vazios com rolhas.
    4. Coloque uma tampa de membrana molhada na parte inferior do adaptador de silicone e encha o adaptador com tampão de eluição. Puxe lentamente o buffer no adaptador para cima e para baixo para remover as bolhas de ar ao redor da membrana de diálise. </ Li>
    5. Deslize o adaptador cheio de buffer para a parte inferior do tubo de vidro. Remova todas as bolhas que aparecem na frita dentro do tubo de vidro.
    6. Encha cada tubo de vidro com tampão de eluição.
    7. Coloque as bandas excisadas da BN PAGE nos tubos de vidro (ver passo 1.2.9.3). Corte peças grandes em pedaços menores. Certifique-se de que a altura de preenchimento dentro do tubo de vidro seja de cerca de 1 cm.
    8. Coloque todo o módulo no tanque.
    9. Adicione cerca de 600 ml de tampão de eluição fria ao tanque. Certifique-se de que as tampas de adaptador de silício estejam no buffer para evitar bolhas na membrana de diálise.
    10. Coloque uma barra de agitação na parte inferior do tanque.
      NOTA: A agitação evitará que as bolhas se aderem ao fundo da membrana de diálise.
    11. Elute as proteínas por 4 h a 350 V em uma sala fria.
    12. Depois que a eluição for completada, remova o módulo eletroeluter do tanque tampão e coloque-o em uma pia ou tigela.
    13. Se uma rolha foi usada, remova-a para desenharNa câmara tampão superior. Caso contrário, use uma pipeta grande para remover o buffer.
    14. Remova o tampão de cada tubo de vidro e descarte. Certifique-se de que o adaptador de silicone permaneça no lugar e que o líquido abaixo da frita não seja perturbado ou abalado.
    15. Remova cuidadosamente o adaptador de silicone, juntamente com a tampa da membrana do fundo do tubo de vidro. Pipetar o conteúdo (cerca de 400 μL) da tampa de silicone em um microtube. Com outros 200 μL de tampão de eluição, enxágue a tampa de silicone e adicione ao microtube. Repita para todos os tubos de vidro.
    16. À medida que as tampas de membrana podem ser reutilizadas, preserve as tampas de membrana, colocando-as em tampão de eluição contendo 0,5 mg / mL de azida de sódio. Refrigere-os.
      NOTA: O eluato tem baixa concentração de proteína e pode ser concentrado usando dispositivos de filtro centrífugo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para visualizar supercomplexos mitocondriais, foram usadas 17 , 18 mitocôndrias recentemente isoladas de camundongos. Os supercomplexos mitocondriais são sensíveis a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, levando à sua desintegração, embora isso possa ser tolerável para alguns pesquisadores. Se o congelamento for necessário para o armazenamento, para garantir melhores resultados, as amostras não devem sofrer mais de um ciclo de congelamento e descongelamento.

Para visualizar os complexos ETC mitocondriais com BN PAGE, 100 μg de proteína de mitocôndria cardíaca isolada foram carregados em um 4-10% de gel ( Figura 1A ). A mancha de Coomassie no tampão de carga e cátodo é suficiente para rotular os complexos de proteínas durante a corrida. Supercomplexes aparecem após aumentar o contraste digitalmente (não mostrado). Para CN PAGE, duas amostras de 20 μg oF de proteínas de mitocôndrias isoladas foram carregados em um gel CN ​​de 3 a 8% e separados ( Figura 1B ). A CN PAGE foi corada com Coomassie e desintegrada para visualizar os complexos protéicos. Depois de aumentar o contraste digitalmente, vários complexos de proteína com um peso molecular maior do que o monómero de Cx-I apareceram ( Figura 1B , à direita). As concentrações de AAB utilizadas permitiram que os supercomplexos maiores entrem no gel do poço. No entanto, um gel que termina com um gradiente de menos de 3% AAB não é suficientemente estável para manipular para transferência ou para excisão de uma faixa ou pista. Além disso, a baixa concentração de AAB nas partes superiores dos géis de 3-8% CN mantém uma certa mobilidade dos complexos protéicos, o que é importante se considerar a eletroeluição nativa 19 .

Monómeros e supercomplexos de Cx-I e monómeros, dímeros e supercomplexos de CXV são enzimaticamente ativos e podem ser visualizados por IGA ( Figura 1C- F ). Os ensaios mostram que, em mitocôndrias cardíacas isoladas, Cx-I e Cx-V estão presentes em complexos de proteína maiores que os respectivos monômeros. No ensaio IGA para Cx-I, NADH é oxidado e os elétrons são transferidos para reduzir nitroblue tetrazolium. Isso resulta em uma cor azul localizada ao peso molecular dos monómeros Cx-I e os respirasomes / supercomplexos contendo Cx-I ( Figura 1C ). A atividade de Cx-V é avaliada a partir da capacidade da subunidade F 1 para hidrolisar ATP e pode ser feita usando géis CN ou BN ( Figura 1D- F ). O ADP gerado a partir desta reação interage com o chumbo e resulta em um precipitado branco ao nível dos monómeros Cx-V, dímeros, synthasomes e subcomplexos (provavelmente a porção F 1 não montada de Cx-V). Note-se que a oligomicina elimina o lAborrecimento dessas bandas, confirmando que eles contêm Cx-V ( Figura 1E ).

Para todos os experimentos descritos aqui, o detergente zwiterionico, lauril maltósido, foi utilizado a uma concentração de 2 μg / 1 μg de proteína, que é a maior concentração possível que preserva os supercomplexos, ao mesmo tempo em que fornece resultados consistentes e reprodutíveis ( Figura 1F ). No entanto, a eficácia do lauril maltosido depende do número do lote, das condições de armazenamento e da idade. Assim, a concentração exata utilizada em um laboratório não é necessariamente a mesma que nos manuscritos. A concentração adequada de detergente solubilizará as membranas, mas manterá os complexos e supercomplexos intactos e deve ser determinado usando uma variedade de concentrações de lauril maltósido ( Figura 1F ). Para CN PAGE, um volume de amostra total de 40 μL por poço foi preparadaAqui, resultando em uma relação proteína / detergente de 1 μg / 2 μg ou uma relação detergente / tampão de 1 μg / 1 μL (igual a 1,9 mM). A partir dos 40 μL, aplicou-se 30 μL por poço do mini-gel; O restante foi usado como uma alíquota para a detecção de VDAC, um controle de carga ( Figura 2D ).

Para imunotransferência, o CN é preferido para BN PAGE porque as proteínas não são carregadas com Coomassie, o que pode interferir com a detecção por anticorpos. A Figura 2 mostra a detecção de supercomplexos contendo as proteínas Cx-I e Cx-V NDUFB6 e ATP5A de isolados coração, fígado e mitocôndrias cerebrais. A rotulação de Ponceau S após a transferência e antes da imunotransferência pode ser usada para marcar os marcadores de peso molecular e para controlar a carga de proteínas ( Figura 2A ). Isto irá visualizar os monómeros dos complexos protéicos do ETC no nitrocelulMembranas ose, mas a rotulação Ponceau S nem sempre é suficiente para a visualização de supercomplexos mitocondriais ( Figura 2A ), que pode ser alcançada por imunotransferência.

Cx-I não se monta em dímeros e tetrâmeros, por si só, mas forma supercomplexos de peso molecular cada vez mais elevados com Cx-III e Cx-IV 14 , 20 , 21 . Aqui, o uso de um anticorpo contra NDUFB6 mostra que a amostra do coração continha mais monómeros Cx-I e supercomplexos de alto peso molecular (bandas superiores) que as mitocôndrias do fígado ou do cérebro ( Figura 2B ). A quantidade de supercomplexos respiratórios de médio alcance também foi muito maior no coração do que nos outros tecidos ( Figura 2B ).

Usando anticorpos anti-ATP5A,Os monómeros de Cx-V são detectáveis ​​nas mitocôndrias de todos os tecidos, enquanto um padrão distinto de bandas representativas de dímeros (D) e supercomplexos maiores (SC), que são claramente visíveis nas mitocôndrias do coração, não são tão proeminentes nas mitocôndrias do fígado e do cérebro ( Figura 2C ). A superexposição (1 min versus 20 s) da imunotransferência mostra vários supercomplexos contendo Cx-V, que podem representar tetrâmeros e synthasomes ( Figura 2C ). Esses padrões de complexos de proteína contendo Cx-V nas mitocôndrias do coração, fígado e cerebral mostram diferenças que podem ser específicas de tecido e ainda não foram exploradas.

O carregamento de proteínas destas transferências pode ser seguido pela coloração de Ponceau S e detecção de VDAC da alíquota acima mencionada por SDS PAGE, conforme demonstrado na Figura 2D .

Nem todos os antiboAs matrizes são adequadas para detectar uma proteína dentro da estrutura quaternária ou terciária de um complexo proteico após PAGE nativa. Para superar este problema, as pistas inteiras e parciais do gel nativo podem ser montadas em um gel desnaturante para uma segunda dimensão (géis 2D, ver Referência 13 para uma demonstração). A eletroforese 2D é uma ferramenta valiosa para visualizar proteínas em um complexo supramolecular. No entanto, como mostrado na Figura 2 , supercomplexos estão presentes em quantidades variáveis, e o sinal de proteínas individuais de supercomplexos pode ser difícil de visualizar na segunda dimensão desnaturante. Para superar este problema, utilizou-se a eletroeluição de complexos de proteínas a partir de géis nativos. Isso isola bandas supercomplexas de várias pistas para produzir mais material para estudo posterior.

Ao usar a eletroeluição, apenas a faixa de interesse, que foi identificada pela IGA e / ou visualizada em uma BN PAGE, é excIsed; As proteínas deste fragmento de gel são ainda purificadas por eluição a partir do gel. A Figura 3A mostra uma pista de uma BN PAGE a partir da qual as bandas que representam o monómero foram excisadas para a eletroeluição. Para avaliar a actividade de Cx-V do monómero após a eletrelução, o eluato foi aplicado a uma segunda PÁGINA CN. O eluato do monómero ainda contém Cx-V enzimicamente ativo, mas também os subcomplexos aparecem ( Figura 3B ). A coloração de prata do eluato após a CN PAGE nativa ( Figura 3C ) ou desnaturando a SDS PAGE ( Figura 3D ) indica a presença de proteínas no eluído e a imunotransferência contra ATP5A indica a presença de Cx-V em ambas as amostras ( Figura 3D ).

figura 1
Figura 1: Visualização de MitochSupercomplexes. ( A ) Duas pistas de um maxi-gel de 4-10%, com amostras de mitocôndrias cardíacas isoladas. Alíquotas da mesma amostra foram executadas em ambas as faixas, a 100 μg de proteína por poço. Os monómeros dos complexos de proteínas I, II, III, IV e V do ETC são claramente visíveis e são rotulados à direita do gel. ( B ) Duas amostras de mitocôndrias do coração (1 e 2, 20 μg de proteína / pista) foram separadas em uma CN PAGE e visualizadas por coloração com Coomassie. SC indica a posição dos supercomplexos após ampliação e aprimoramento digital da parte superior do gel (a área é indicada por setas vermelhas). ( C ) 20 μg de proteína mitocondrial foram separadas em 3-8% de CN PAGE e foram processadas para CGA-I IGA. As imagens ampliadas e digitalmente aprimoradas demonstram bandas do produto de reação Cx-I. ( D ) 20 μg de proteína mitocondrial foram separadas em uma BN PAGE de 3-8% e processadas para CGA-V IGA. Magnifi As imagens digitais e aumentadas demonstram bandas de produtos de reação Cx-V. ( E ) 50 μg de proteína mitocondrial foram separadas em uma PAGE CN de 5-15% e processadas para CGA-V IGA sem (-) e com (+) 5 μg / mL de oligomicina (Oligo). ( F ) A proteína mitocondrial (20 μg / lane) foi solubilizada com 2 a 6 μg de lauril maltosido / 1 μg de proteína, como indicado no topo do gel, e separada em um gel CN ​​de 3-8% seguido de Cx- V IGA. Todas as imagens foram fotografadas usando uma mesa de luz ( A - C ) ou uma superfície preta ( D - F ). As especificações da câmera estão na Tabela de Materiais. A localização dos marcadores de peso molecular (MW) é indicada no lado esquerdo de todos os painéis. Abreviações: D = dímeros; F 1 * = subcomplexo de Cx-V; LM = lauril maltósido; M = marcador de peso molecular; M = monómeros; SC = supercomplexos.G1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Detecção de supercomplexos mitocondriais por imunotransferência. 20 μg de proteína do coração (H), do fígado (Li) e do cérebro (B) foram separadas em uma PAGE CN de 3-8% e transferidas para membrana de nitrocelulose. ( A ) A coloração de Ponceau S da membrana indica a presença de complexos proteicos e marcadores de peso molecular (m). A flecha azul aponta para o topo do gel. ( B ) A proteína Cx-I, NDUFB6, foi imunomarcada na mancha mostrada em (A) (1 min de tempo de exposição). ( C ) Cx-V foi visualizado com anticorpo anti-ATP5A (exposição de 20 s e 1 min, como indicado). As setas vermelhas em (B) e (C) indicam a área ampliada e aumentada digitalmente para a visuaLização de supercomplexos contendo Cx-I e Cx-V, e a flecha azul aponta para o topo do gel. ( D ) Ponceau S e imunomarcação da alíquota VDAC de cada extrato utilizado em (A), (B) e (C), que foram separados por SDS PAGE e transferidos para nitrocelulose. Abreviaturas: M = monómeros de Cx-I ou Cx-V, D = dímeros de Cx-V, SC = supercomplexos contendo Cx-I ou Cx-V. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Electroeluição de Cx-V. ( A ) BN PAGE de uma amostra mitocondrial. A banda em caixa representa o monómero de Cx-V que foi excisado e eletroeluído. ( B ) O eluato foi submetido a CN PAGE, e subsequente IGA para Cx-V demonstra monómeros (M)E subcomplexos contendo F 1 de Cx-V. ( C ) A coloração de prata da CN PAGE do eluato demonstra os monómeros (M). ( D ) A coloração de prata (painel esquerdo) e a imunotransferência para ATP5A (painel direito) de um dodecilsulfato de sódio desnaturante (SDS) PAGE do eluato indica a presença de Cx-V. Para a página SDS, consulte os protocolos publicados em outro lugar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um ETC funcional é necessário para a geração de ATP mitocondrial. Os complexos do ETC são capazes de formar dois tipos de supercomplexos: os respirasomes (Cx-I, -III e -IV) 1 e os synthasomes (Cx-V) 2 . A montagem de cada complexo é necessária para um ETC intacto, enquanto a organização do ETC em supercomplexos é pensado para aumentar a eficiência geral ETC 5 , 22 . Como esses supercomplexos se mestam e desmontam não são bem compreendidos, mas os protocolos aqui apresentados podem permitir uma melhor compreensão desses processos.

O principal desafio de estudar a montagem de ETC é o tamanho desses complexos de proteínas. Por exemplo, as respirasomas mitocondriais podem consistir em Cx-I (cerca de 880 kDa) e uma ou mais moléculas de Cx-III (460 kDa) e Cx-IV (200 kDa, ativo como um dímero), resultando em um supercomplexo com um molecular Peso de cerca de2.000 kDa. Além disso, Cx-V tem um peso molecular de cerca de 600 kDa, mas mostrou-se que se monta em dímeros, tetrâmeros, oligómeros e fitas de dímeros 7 , 23 , resultando em supercomplexos com um peso molecular de pelo menos 2.000 kDa. Considerando o enorme tamanho desses supercomplexos, várias abordagens parcialmente relacionadas têm sido tradicionalmente usadas para identificar e caracterizar esses supercomplexos, por este laboratório e por outros 8 , 14 , 24 .

Este trabalho demonstrou a técnica de gel nativo PAGE, onde os complexos de proteína ativos são extraídos suavemente da membrana mitocondrial usando detergentes leves. Os complexos migram nos géis principalmente devido ao seu tamanho e carga intrínseca (CN PAGE) ou devido ao tamanho e à carga negativa do azul de Coomassie ligado a proteínas (BN PAGE). Estes géis podem ser corados usando CAzul oomassie ( por exemplo, em géis CN) ou mancha de prata ( por exemplo, em BN e CN PAGE) para revelar bandas de proteínas.

O Lauryl maltoside foi utilizado para os experimentos demonstrados aqui porque este detergente funcionava de forma mais confiável. Alternativamente, a digitonina pode ser utilizada para extrair complexos de proteínas 12 . Os dados das mitocôndrias isoladas de corações, fígados e cérebros adultos foram mostrados aqui, mas essas técnicas foram realizadas em homogeneizados de coração embrionário e adulto 8 . Outros realizaram esta técnica usando mitocôndrias isoladas de células cultivadas 24 . No entanto, quando se utilizam homogeneizados de tecido ou células cultivadas com um alto teor de DNA, pode ser útil adicionar uma nuclease para evitar a formação de estrias durante a eletroforese 25 .

A atividade dos diferentes complexos pode ser testada diretamente no gel, como demonstrado aqui para Cx-I e Cx-V, e tecHá também técnicas disponíveis para examinar as atividades de Cx-II, -III e -IV 12 . No entanto, a análise dessas IGAs deve ser feita com cuidado. Em primeiro lugar, a reação enzimática pode ser devida a enzimas não-ETC ou complexos incompletamente montados. Por exemplo, é rotina realizar o IGA Cx-V com um gel paralelo que foi tratado com oligomicina para inibir o Cx-V intacto ( Figura 3 ). Além disso, outras oxidases de NADH podem explicar a atividade de Cx-1 em gel. Pode-se realizar um IGA paralelo na presença de um inibidor Cx-I, como a rotenona. No entanto, na Figura 1 , utilizaram-se mitocôndrias isoladas, de modo que as oxidases de NADH citoplasmáticas não estavam presentes; Assim, os dados provavelmente representam monómeros e supercomplexos contendo Cx-I. Além disso, a quantificação desses resultados é possível medindo a intensidade do sinal das bandas em fotografias ou varreduras. As desvantagens desta abordagem incluem as diferenças entreDentro dos géis, a mobilidade do produto da reação, a incapacidade de quantificar adequadamente o produto ao longo da profundidade do gel e a potencial não linearidade da reação 27 . Para superar o último, alguns sugeriram obter taxas de reações usando fotografias em série, mas isso não foi tentado aqui.

A proteína em géis nativos também pode ser transferida para membranas, e a composição protéica das bandas pode ser examinada por imunotransferência (demonstrada aqui) ou 2D PAGE (demonstrada na referência 13 ). Os monómeros dos complexos ETC foram tradicionalmente identificados por sua abundância em géis nativos de mitocôndrias isoladas, sua localização no gel e sua posição em relação à proteína marcador molecular ( Figura 1 ). Além disso, a rotulagem de imunotransferências subsequentes com anticorpos específicos para subunidades de diferentes complexos ajuda a identificar o complexo e a composiçãoDe supercomplexos. Portanto, anti-NDUFB6 e -ATP5A identificam monómeros e supercomplexos contendo Cx-1 e Cx-V, respectivamente, como demonstrado aqui. Os anticorpos para Cx-II a IV podem ser utilizados para o mesmo propósito. Em alguns casos, os anticorpos que funcionam bem em géis de desnaturação podem não funcionar bem em géis nativos devido ao fato de que alguns anticorpos são específicos da proteína desnaturada ou que um epítopo pode ser mascarado por outras proteínas em um complexo nativo.

A determinação exata do peso molecular destes supercomplexos é difícil, uma vez que a maioria dos marcadores de peso molecular disponíveis está abaixo do tamanho dos monómeros Cx-V. A migração de complexos protéicos em um gel nativo depende do tamanho, da carga intrínseca e do detergente utilizado 28 . Nos exemplos aqui, os monómeros dos complexos foram identificados com base em géis, marcadores e imunotransferência. Os dímeros de Cx-V foram identificados com base na migração relativa em comparação com monómeros de Cx-I e -V e em imunoBorrão. Tudo o resto acima dos monómeros e dímeros em géis, IGAs e imunoblots são considerados supercomplexos.

As imunotransferências nativas também podem ser quantificadas para supercomplexos, analisando a densidade da banda usando técnicas padrão. Este método não foi mostrado aqui, mas uma publicação recente demonstra essa técnica 8 . A normalização do carregamento de proteínas pode ser feita usando a coloração vermelha Ponceau da pista ou salvando uma amostra do extrato mitocondrial para medir a densidade da banda VDAC em uma imunotransferência desnaturante ( Figura 2A e D ). Além disso, examinar a proporção de supercomplexos para monómeros na mesma imunotransferência é outra maneira de quantificar a densidade da banda, mas é preciso ter o cuidado de tirar fotos em momentos diferentes durante o desenvolvimento da mancha, de modo que as bandas não sejam expostas demais.

Finalmente, bandas de géis nativos podem ser eletratadas para gerar purificaçãoD, complexos de proteínas activas que podem se unir em complexos de ordem superior e podem ser utilizados para estudos adicionais de funções complexas. Por exemplo, os monómeros Cx-V foram previamente eletratados e reconstituídos em lipossomas para demonstrar a funcionalidade elétrica 29 . Uma abordagem alternativa à eletroeluição nativa é a eluição por meio de difusão passiva para o buffer intermediário 16 , mas isso é lento comparado à eletroeluição nativa. Finalmente, um grande problema com a eletroeluição é manter a função enzimática do complexo de proteínas eletroeluídas, já que o complexo pode dissociar durante a purificação. Portanto, qualquer ensaio de função após o isolamento por esta técnica teria que ser rigorosamente testado.

Ao combinar esses protocolos com ensaios enzimáticos e medições de consumo de oxigênio, que sondam a função dos complexos ETC individuais e a atividade de todo o ETC 30 e outros metanfetaminaOds, como a avaliação cristalográfica 31 e eletrônica microscópica da estrutura de complexos e supercomplexos, uma imagem completa dos funcionamentos internos do ETC pode e emergiu. Estamos mais perto de entender como os complexos são montados, como os elétrons fluem para baixo da cadeia e como os prótons são bombeados através da membrana para gerar o gradiente e depois retornar para a matriz através de Cx-V para gerar ATP. Indubitavelmente, essas técnicas serão refinadas para fornecer detalhes adicionais sobre a estrutura, função e regulação dinâmica do ETC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por bolsas do Afiliado do Fundador da American Heart Association [12GRNT12060233] e do Centro de Pesquisa de Crianças Fortes da Universidade de Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Tags

Bioquímica edição 124 mitocôndrias cadeia de transporte de elétrons respirasomes synthasomes eletroforese natural nítida ensaios em gel eletroeluição
Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter