Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Этот протокол описывает разделение функциональных комплексов транспортной цепи митохондриальных электронов (Cx) IV и их суперкомплексов с использованием нативного электрофореза для раскрытия информации об их сборке и структуре. Нативный гель можно подвергать иммуноблоттингу, в-гель-анализе и очищать путем электроэлюции для дальнейшего характеристики отдельных комплексов.

Abstract

Транспортная цепь митохондриального электрона (ETC) трансдуцирует энергию, полученную в результате пробоя различных видов топлива в биоэнергетическую валюту клетки, АТФ. ETC состоит из 5 массивных белковых комплексов, которые также собираются в суперкомплексы, называемые респирасомами (CI, C-III и C-IV) и synthasomes (CV), которые повышают эффективность транспорта электронов и производства ATP. В течение более 50 лет для измерения функции ETC использовались различные методы, но эти протоколы не содержат информации о сборке отдельных комплексов и суперкомплексов. В этом протоколе описывается методика электрофореза на основе полиакриламидного геля на месте (PAGE), метод, который был модифицирован более 20 лет назад для изучения структуры комплекса ETC. Нативный электрофорез позволяет разделять комплексы ETC на их активные формы, и эти комплексы затем могут быть изучены с использованием иммуноблоттинга, в-гель-анализах (IGA) и очистки путем электроэлюции. Объединив reSAGE с исходным гелем PAGE с результатами других митохондриальных анализов, можно получить полную картину активности ETC, ее динамическую сборку и разборку и как это регулирует структуру и функцию митохондрий. В этой работе также будут обсуждаться ограничения этих методов. Таким образом, техника нативного PAGE с последующим иммуноблоттингом, IGA и электролечением, представленная ниже, является мощным способом исследования функциональности и состава суперкомплексов митохондриальных ETC.

Introduction

Митохондриальная энергия в виде АТФ не только необходима для выживания клеток, но и для регуляции клеточной смерти. Генерация АТФ путем окислительного фосфорилирования требует функциональной транспортной цепи электрона (ETC, Cx-I-IV) и митохондриальной АТФ-синтазы (Cx-V). Недавние исследования показали, что эти крупные белковые комплексы организованы в суперкомплексы, называемые респирасомами и синтасомами 1 , 2 . Трудно проанализировать сборку, динамику и регулирование активности этих массивных комплексов и суперкомплексов. В то время как измерения потребления кислорода, проведенные с помощью кислородного электрода и анализа ферментов, проводимые с использованием спектрофотометра, могут дать ценную информацию о активности комплекса ETC, эти анализы не могут предоставить информацию о составе присутствия, размера и субъединицы белкового комплекса или суперкомплексов. Тем не менее, развитие синего и чистого родного (BN и CN соответственно). СТРАНИЦА 3 создала мощный инструмент для выявления важной информации о сложном составе и сборе / разборке и о динамической регуляции супрамолекулярной организации этих жизненно важных респираторных комплексов в физиологических и патологических условиях.

Сборка этих комплексов в суперкомплексах высшего порядка, по-видимому, регулирует структуру и функцию митохондрий 5 . Например, респираторная сборка повышает эффективность переноса электрона и генерирование движущей силы протона через внутреннюю мембрану митохондрии 5 . Кроме того, сборка синтазомов не только повышает эффективность производства АТФ и перенос энергетических эквивалентов в цитоплазму 2 , но также формирует митохондриальную внутреннюю мембрану в трубчатые кристы 6 , </ Sup> 7 . Исследования суперкомплексной сборки во время развития сердца у эмбрионов мыши показывают, что генерация суперкомплексов Cx-I в сердце начинается примерно с эмбрионального дня 13,5 8 . Другие показали, что количество суперкомплексов, содержащих Cx-I, уменьшается в сердце из-за старения или повреждений от ишемии / реперфузии 9 , 10 или может играть роль в прогрессировании нейродегенеративных заболеваний 11 .

В этом протоколе описаны методы для основного гелевого PAGE, которые могут быть использованы для исследования сборки и активности комплексов ETC и суперкомплексов. Примерную молекулярную массу митохондриальных суперкомплексов можно оценить путем разделения белковых комплексов на полиакриламидные гели CN или BN. CN PAGE также позволяет визуализировать ферментативную активность всех митохондриальных комплексов непосредственно в геле (in-gel assays;ИГА) 12 . Эта работа демонстрирует активность респирасом, выделяя способность Cx-I окислять NADH через IGA и присутствие синтазомов из-за активности АТФ-гидролиза Cx-V с помощью IGA. Множественные комплексы и суперкомплексы, содержащие Cx-I и Cx-V, можно также продемонстрировать путем переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны и проведения иммуноблоттинга. Преимущество этого подхода состоит в том, что BN или CN PAGE обычно разделяют белковые комплексы на основе их физиологических размеров и состава; Перенос на мембрану сохраняет эту картину полос. Анализ белковых комплексов в BN или CN PAGE также может быть осуществлен с использованием 2D-PAGE (см. Fiala и др. 13 для демонстрации) или центрифугированием плотности сахарозы 14 , 15 . Для дальнейшего анализа конкретной полосы ее можно вырезать из BN PAGE, и белки из этого белкового комплекса могут быть очищеныD путем электроэлюции их в естественных условиях. Наземная электроэлюция может быть выполнена в течение нескольких часов, что может существенно повлиять на пассивную диффузию (как используется в ссылке 16) белков из геля в окружающий буфер.

Таким образом, эти методы описывают несколько подходов, которые позволяют дополнительно характеризовать высокомолекулярные суперкомплексы из митохондриальных мембран.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводили с использованием сердец у мышей C57BL / 6N (дикий тип). Мышей анестезировали СО 2 до дислокации шейки матки, и все процедуры выполнялись в строгом соответствии с Отделом лабораторной медицины животных в Рочестерском университете и в соответствии с государственным законодательством, федеральным законом и политикой НИЗ. Протокол был одобрен Институтом по уходу за животными и его использованием в Университете Рочестера (Университетский комитет по животным ресурсам).

1. CN и BN PAGE

ПРИМЕЧАНИЕ. Все оборудование, используемое для BN и CN PAGE, должно быть свободным от моющего средства. Для этого промойте все оборудование 0,1 М соляной кислотой, а затем тщательно промыть деионизированным H 2 O.

  1. подготовка
    1. Подготовьте анодный буфер, состоящий из 25 мМ имидазола, pH 7,0, при 4 ° С; Хранить при температуре 4 ° C.
    2. Подготовьте катодный буфер для CN или BN PAGE.
      1. Для CN PAGE используйте 7,5 мМ имидазола и 50 мМ трицина; Добавляют 0,5 г дезоксихолата натрия и 0,2 г лаурилмалтозида на литр буфера. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
      2. Для BN PAGE используйте 7,5 мМ имидазола и 50 мМ трицина и отрегулируйте рН до 7,0 при 4 ° С. Хранить при температуре 4 ° C.
      3. Для светло-голубого BN-катодного буфера используют 7,5 мМ имидазола и 50 мМ трицина. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и добавьте 20 мг кумасси на литр буфера. Хранить при температуре 4 ° C.
    3. Подготовьте буфер для экстракции (ЕВ) 50 мМ NaCl, 50 мМ имидазола, 2 мМ аминокапроновой кислоты и 1 мМ ЭДТК. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
    4. Подготовьте 3х гель-буфер (используется для гелей BN и CN) с 75 мМ имидазолом и 1,5 М аминокапроновой кислотой. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
    5. Подготовьте загрузочный буфер (LB) 0,01 г Ponceau S, 5 г глицерина и 5 мл H 2 O. Хранить в помещениитемпература.
    6. Подготовьте кумасси синим, добавив 50 мг кумасси к 1 мл 500 мМ 6-аминогексановой кислоты. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
    7. Подготовьте 20 мМ и 200 мМ лаурилмалтозида в H 2 O. Сделайте аликвоты по 200 мкл и заморозьте их. Перед использованием оттереть моющее средство.
От 3% до 8% (мини) От 4% до 10% (максимум)
0,5 геля (светлый) 0,5 геля (тяжелые) 0,5 геля (светлый) 0,5 геля (тяжелые)
AAB (мл) 0,42 1,3 2.5 7,7
Буфер CN / BN (мл) 1,6 1,6 8,5 8,5
H 2 O (мл) 2,7 1.4 14 6,3
Глицерин (г) 0 0,47 0 2.5
Объем (мл) 4,72 4,77 25 25
APS (мкл) 27 27 65 65
TEMED (мкл) 4 4 10 10

Таблица 1: Количество ингредиентов, необходимых для заливки 1 Mini- или Maxi-PAGE. Объемы, используемые в этой таблице, рассчитаны для 1 мини- или 1 макси-гель толщиной 1,5 мм. Объем AAB основан на 40% -ном исходном растворе. Легкие и тяжелые относятся к концентратуИон AAB. APS и TEMED добавляются после того, как каждая колонка градиентного смесителя заполнена раствором AAB.

  1. Заливка и запуск гелей
    ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте градиент 3-8% или 4-10% акриламида / бисакриламида (AAB) для гелей CN или BN соответственно. В таблице 1 приведены количества буфера, AAB, H 2 O, глицерина, аммонийперсульфата (APS) и тетраметилэтилендиамина (TEMED), используемого для мини-геля (толщиной 85 мм x 73 мм с высотой х 1,5 мм) или макси-геля (160 Мм в ширину х 200 мм с высотой х 1,5 мм). Сборка стеклянных пластин с гелями CN или BN может быть охлаждена в мешке с помощью нескольких мл 1x буфера для геля или завернута в бумажное полотенце, смоченное 1x буфером для хранения геля. Гели стабильны для использования в течение недели.
    1. Чтобы вылить гель, поместите градиентный смеситель на повышенную перемешивающую пластину, чтобы гарантировать, что гель будет течь под действием силы тяжести в подготовленную камеру геля.
    2. Заполните выпускную камеру градиентного мешалки 4,77 / 25 мл (Mini / maxi) тяжелого раствора (с более высокой концентрацией AAB).
    3. Аккуратно откройте соединение стопорного крана между тяжелой и легкой камерой и позвольте капле раствора перейти на другую сторону.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это выталкивает пузырьки воздуха из соединительной трубки и стопорного крана, что предотвратит поток между двумя камерами. Это невозможно сделать, если обе стороны уже заполнены, потому что равное давление предотвратит движение пузыря.
    4. Заполните другую камеру градиентного миксера 4,72 / 25 мл (мини / макси) светового раствора.
    5. Поместите мешалку в выпускную камеру с помощью тяжелого раствора и начните перемешивание. Используйте скорость мешалки, которая не вызывает пузыри.
    6. Быстро добавьте APS и TEMED в каждую камеру, чтобы начать полимеризацию.
    7. Откройте соединение между двумя камерами градиентного смесителя и дайте им перемешать в течение нескольких секунд, прежде чем открывать выпускную камеру для заливки геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Гравитация wiСлив обе камеры одинаково, и смешение света в тяжелом растворе будет медленно уменьшать плотность акриламида снизу до верхней части геля. Используйте весь контент, который находится в градиентном смесителе, чтобы вылить гель.
      1. В конце осторожно установите гребенку с лунками внутри геля, чтобы избежать пузырей и смешивания слоев.
    8. Немедленно промойте градиентный смеситель с этанолом, чтобы ополоснуть любой гель. Промойте водой и вылейте второй гель. Пусть гели полимеризуются (обычно менее 20 минут необходимы для мини-гелей).
    9. Чтобы запустить гели, установите их в зажим для электродов и заполните центральную / верхнюю камеру CN или голубым BN-катодным буфером. Подождите несколько минут, чтобы проверить утечки перед добавлением анодного буфера во внешнюю / нижнюю камеру.
      1. Аккуратно вытащите лунки и вымойте лунки с помощью катодного буфера, используя шприц или пипетку.
      2. Запустите гели в холодной комнате (4 ° C) или полностью упакованы во льду.
        1. Для CN-PAGE CN используйте 100 В в течение первого часа и 200 В до окончания, обычно дополнительно 1-1,5 ч. Кроме того, запустите мини-PAGE CN на 30-40 V за одну ночь.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь основное внимание уделяется высокомолекулярным белковым комплексам, поэтому белковые комплексы с молекулярной массой менее 140 кДа выйдут из геля. Для сохранения низкомолекулярных комплексов можно использовать более короткие времена работы для электрофореза.
        2. Для BN maxi-PAGE используйте 100 В и запустите гели в течение ночи (около 18 часов).
          ПРИМЕЧАНИЕ. Ток будет очень низким (<15 мА), поэтому необходим источник питания, который может обрабатывать эти условия. На этом этапе гели могут использоваться для IGA или иммуноблоттинга. В некоторых случаях полосы или дорожки могут быть вырезаны из гелей, используя лезвие бритвы на стеклянной пластине для электроэлюции.
  2. Базовые приготовления
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мемотранзиальные суперкомплексы, связанные с мембранами, должны быть извлечены изВнутренняя митохондриальная мембрана. Чтобы сохранить суперкомплексы митохондрий, используйте либо свежеизолированные митохондрии, либо образцы, которые были заморожены и разморожены только один раз. Ниже приведены расчеты / объемы для мини-гелей (лунка 10-луночного гребня в геле толщиной 1,5 мм вмещает до 35-40 мкл) и макси-гелей (колодец 15-луночного гребня вмещает до 200 мкл). Кроме того, сохраните аликвоту каждого образца (обычно 10 мкл) для запуска на денатурирующем геле SDS для обнаружения зависящего от напряжения анионного канала (VDAC) в качестве контроля загрузки.
    1. Поместите соответствующее количество ( например, 10-50 мкг белка для мини-гелей и 50-200 мкг для макси-гелей) изолированных митохондрий или гомогенатов ткани в микропробирки и центрифугируйте при 17000 × g в течение 10-15 минут при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе удаляются некоторые растворимые митохондриальные матрицы и / или цитозольные белки.
    2. Аспирируйте и отбросьте супернатант и добавьте буфер экстракции в желаемое количествоДля загрузки на гель. Аккуратно ресуспендируйте осадок на льду. При желании добавьте в этот момент общую смесь ингибиторов протеазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Основываясь на используемом здесь оборудовании, 30 мкл использовали для мини-геля и 100 мкл для макси-геля, ограничивая отношение белка / буфера до не более 2 мкг белка до 1 мкл буфера.
    3. Добавьте моющее средство ( например, 2 мкг лаурилмалтозида / 1 мкг белка, см. Представительские результаты и обсуждение для получения дополнительной информации).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно используют лаурилмалтозид, но также может использоваться дигитонин.
    4. Инкубируйте на льду в течение 20 мин. Аккуратно перемешайте в начале и иногда во время инкубации путем растирания и / или взбалтывания трубки.
    5. Центрифуга при 17000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С для удаления любых фрагментов мембраны и ткани.
    6. Перенесите супернатант в новую пробирку. Для образцов CN добавьте 1 мкл LB на каждые 10 мкл объема образца; Общий объем выборки должен быть приложениемПримерно 40 мкл для мини-геля и 130 мкл для макси-геля. Для образцов BN добавьте Coomassie к образцам, чтобы отношение красителя к моющему средству составляло 1: 4 (мас. / Мас.).
    7. Загрузите 30 и 120 мкл образцов в лунки мини- или макси-гел соответственно. Используйте оставшиеся 10 мкл из каждого образца для денатурирующего геля SDS для определения VDAC в качестве контроля загрузки.
    8. Для получения маркеров молекулярной массы растворите 1 флакон с высокомолекулярной калибровочной смесью (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации) в 60 мкл буфера BN / CN и добавьте 120 мкл H 2 O и 20 мкл ФУНТ. Загрузите 15 мкл на дорожку.
    9. Запустите гели, как описано в шаге 1.2.9.2.

2. В-гель-анализы для Cx-I и Cx-V

ПРИМЕЧАНИЕ. Анализы проводят при комнатной температуре. Снимайте фотографии, сканирование или изображения разрабатывающих полос для документации. (Важно) Белки не могут быть переданы ontO нитроцеллюлозные мембраны после завершения IGA.

  1. Анализ Cx-I
    1. Подготовка.
      1. Подготовьте буфер для анализа 5 мМ Трис в H 2 O с рН 7,4; Хранить при комнатной температуре.
      2. Растворяют 10 мг NADH в 1 мл буфера для анализа. Хранить в аликвотах по 100 мкл при -20 ° C до использования; Избегайте замораживания и оттаивания.
      3. Взвесьте 25 мг нитроцеллюлозного тетразолия в микротрубочку.
      4. Подготовьте фиксатор, разбавив 5 мл уксусной кислоты в 95 мл H 2 O; Хранить при комнатной температуре.
    2. Выполнение анализа.
      1. Объединить 10 мл аналитического буфера с 25 мг нитроцеллюлозного тетразолия (конечная концентрация: 2,5 мг / мл) и 100 мкл 10 мг / мл NADH (0,1 мг / мл). Добавьте это на весь гель, полосу или область интереса, вырезаемую из геля CN.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Это можно сделать в прозрачном пластиковом или стеклянном контейнере. Обратите внимание, что этот анализ не может быть выполнен после BN PAGE.
      2. Следуйте за развитием синих полос после нежного возбуждения (рокера) в течение> 3 мин.
      3. Исправить гель в 10 - 20 мл раствора уксусной кислоты или промыть в 5 мМ Трис, pH 7,4, чтобы остановить реакцию. Сделайте фотографии для документации (см. Таблицу материалов).
  2. Анализ Cx-V
    ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ Cx-V должен проводиться с использованием повторяющихся гелей CN или BN, где один инкубируется с 5 мкг / мл олигомицина (ингибитор Cx-V), чтобы продемонстрировать Cx-V-независимую активность.
    1. Подготовка.
      1. Подготовьте буфер для анализа с 35 мМ Трис и 270 мМ глицина; Отрегулируйте pH до 8,3 при комнатной температуре. Хранить буфер, замороженный в аликвотах по 50 мл, но проверить рН после замораживания и оттаивания.
      2. Подготовьте 1 M MgSO 4 в H 2 O; Хранить при 4 ° C до использования.
      3. Взвесьте 27,28 мг Pb (NO 3 ) 2 в микротрубу.
      4. Взвесьте 60 мг АТФ в микротрубу.
      5. Растворить 1 мг оЛигомицина в 1 мл этанола. Хранить при температуре -20 ° C до использования.
      6. Подготовьте фиксатор путем смешивания 50 мл метанола с 50 мл H 2 O; Хранить при комнатной температуре.
    2. Выполнение анализа.
      1. Инкубируйте гель, полосу или область, представляющую интерес, из BN или CN-геля в течение 2 ч при осторожном перемешивании (качалке) в 10-20 мл буфера для анализа ± 5 мкг / мл олигомицина (50-100 мкл 1 мг / Мл в этаноле) при комнатной температуре.
      2. После инкубации замените буфер на 14 мл свежего буфера для анализа и добавьте по порядку 190 мкл 1 М MgSO 4 (14 мМ), 27,28 мг Pb (NO 3 ) 2 (5 мМ), 60 мг АТФ ( 8 мМ) и 75 мкл олигомицина (при необходимости).
      3. Инкубируйте с осторожным перемешиванием (рокер) и наблюдайте за белым осадком, так как полосы на обработанных олигомицином гелях будут давать не-Cx-V-зависимые полосы.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Внешний вид осадка может занять несколько часов.
      4. Закрепите гель в метаноле-( Например, 50% метанола), потому что кислые растворы растворяют осадок свинца. Фотографируйте результаты.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Осадок свинца не мешает окрашиванию Кумасси гелей.

3. Передача белка в мембраны из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (PVDF)

  1. Подготовьте буфер переноса 25 мМ Трис и 200 мМ глицина. Отрегулируйте pH до 8,3 и добавьте 0,0005 г / л SDS и 200 мл / л метанола. Хранить при комнатной температуре.
    1. Отрежьте нитроцеллюлозу или PVDF-мембрану (размер пор: 0,45 мкм) с лезвием для бритвы или ножницами до размера, немного большего, чем размер геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Нитроцеллюлозные мембраны позволяют окрашивать Ponceau S для оценки загрузки белка, тогда как мембраны PVDF дают более четко определенные полосы.
  2. Протокол.
    1. Замачивайте нитроцеллюлозную мембрану, фильтровальную бумагу и губки дляНе менее 10 мин в переносном буфере. Поместите мембрану PVDF в 100% метанол в течение 15 с или в соответствии с рекомендацией производителя перед тем, как поместить его в буфер переноса. Поместите открытую кассету комплекта для переноса в плоскую миску с переносным буфером.
    2. Поместите губку и 1-2 слоя фильтровальной бумаги на задней стороне кассеты. Удалите пузырьки.
    3. Поместите гель на фильтровальную бумагу. Укажите ориентацию геля, обрезая угол геля и / или мембрану.
    4. Поместите мембрану поверх геля. Удалите все пузырьки.
    5. Поместите фильтровальную бумагу и губку поверх мембраны. Удалите все пузырьки в этом бутерброд.
    6. Закройте кассету и поместите ее в держатель кассеты комплекта переноса.
    7. Перенесите белки при 25 В в течение примерно 12-18 ч.

4. Иммуноблоттинг

  1. Подготовка.
    1. Приготовить Ponceau Stain (500 мл), добавив 25 млУксусной кислоты и 0,5 г Ponceau S до 475 мл H 2 O; Хранить при комнатной температуре (можно использовать повторно).
    2. Подготовьте трис-буферный солевой раствор (TBS) 200 мМ NaCl, 25 мМ трис-основания и 2,7 мМ KCl. Отрегулируйте pH до 8,0 и сохраните при комнатной температуре.
    3. Подготовьте TBS-tween (TBST), добавив 0,5 мл / л Tween 20 в TBS; Хранить при комнатной температуре.
    4. Подготовьте твердые вещества молока / TBST, растворяя 5 г сухого молока в 100 мл TBST. Хранить при температуре 4 ° C и использовать в течение 3 дней.
    5. Подготовьте BSA / TBST путем растворения 3 г бычьего сывороточного альбумина (BSA, фракция V) в 100 мл TBST. Хранить при температуре 4 ° C и использовать в течение 3 дней.
  2. Протокол.
    1. Когда передача завершена, поместите мембрану в раствор Ponceau S, чтобы визуализировать все перенесенные белки. Обозначьте положение маркеров на мембране карандашом и запишите пленку Ponceau-S путем фотографии или сканирования.
    2. Промойте мембрану 3 раза в течение 10 мин. Каждый wiTh TBS при осторожном перемешивании.
    3. Заблокируйте мембрану твердыми веществами молока / TBST в течение 1-2 часов при комнатной температуре или на ночь в холодной комнате с легким перемешиванием.
    4. Промойте мембрану в течение 10 минут с помощью TBST при осторожном перемешивании.
    5. Инкубируйте с первичным антителом в течение ночи в холодной комнате при осторожном перемешивании. Разбавьте антитело ( например, 1: 1000 для анти-ATP5A и -NDUFB6) в BSA / TBST.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Большинство антител дают лучший сигнал на мембранах из нативных гелей при инкубации в течение ночи.
    6. Промойте мембрану в течение 10 минут с помощью TBST при осторожном перемешивании.
    7. Инкубируйте со вторичным антителом в течение по меньшей мере 60 мин при комнатной температуре, не менее мягкое перемешивание. Разбавьте антитело (от 1: 5000 до 1: 50000) в сухих веществах молока / TBST.
    8. Промойте мембрану 3 раза в течение 10 мин при комнатной температуре, при этом TBEST осторожно перемешайте.
    9. Во время последней промывки подготовьте усиленный хемолюминесцентный (ECL) субстрат в соответствии с инструкциями manufacturer.
    10. Инкубируйте мембрану с субстратом ECL, используя инструкции, предоставленные производителем.
    11. Обнаружение сигнала на пленке с помощью инструкций производителя субстрата ECL.

5. Электроизлучение

  1. Подготовка.
    1. Подготовьте буфер для элюции 25 мМ трицина, 3,75 мМ имидазола (рН 7,0 при 4 ° С) и 5 ​​мМ 6-аминогексановой кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Всегда надевайте перчатки во время работы с электроэлементом и мембранными колпачками, чтобы предотвратить загрязнение внешних белков.
  2. В день перед использованием электроэлемента для естественного электрооборудования выполните следующие действия:
    1. Замачивайте мембранные колпачки (срезание: 3,5 кДа) в буфере для элюирования в течение 1 часа при 60 ° C. Перенесите колпачки в свежий буфер элюирования и промойте их в течение 12 часов или дольше в холодильнике.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Отключающая молекулярная масса 3,5 кДа предотвращает потерю небольшого pКоторые могут легко диссоциировать из интересующего белкового комплекса.
    2. Промойте электроэлементный модуль, стеклянные трубки, бак и крышку тщательно этанолом. Промойте водой и дайте оборудованию высохнуть.
  3. В день естественного электроэлюции сделайте следующее.
    1. Поместите фритту в нижнюю часть (матовое) каждой стеклянной трубки, которая будет использоваться. При необходимости поместите стеклянную трубку в бункер элюирования и нажмите фритту изнутри на дно трубки.
    2. Вставьте стеклянную трубку с помощью фритты в модуль электроэлемента. Смочите втулку буфером для элюирования и вставьте стеклянную трубку на место. Убедитесь, что верхние части стеклянных трубок ровны с втулкой.
    3. Закройте пустые втулки пробками.
    4. Поместите мокрый мембранный колпачок в нижней части силиконового адаптера и заполните адаптер элюирующим буфером. Медленно пипетируйте буфер в адаптере вверх и вниз, чтобы удалить пузырьки воздуха вокруг диализной мембраны. </ Li>
    5. Сдвиньте заполненный буфером адаптер к нижней части стеклянной трубки. Удалите все пузырьки, которые появляются на фритте внутри стеклянной трубки.
    6. Заполните каждую стеклянную трубку буфером для элюирования.
    7. Поместите вырезанные полосы BN PAGE в стеклянные трубки (см. Шаг 1.2.9.3). Вырезать большие кусочки на мелкие кусочки. Убедитесь, что высота заполнения в стеклянной трубке составляет около 1 см.
    8. Поместите весь модуль в резервуар.
    9. Добавьте около 600 мл холодного элюирующего буфера в резервуар. Убедитесь, что колпачки переходника из кремния находятся в буфере для предотвращения образования пузырьков на мембране диализа.
    10. Поместите мешалку в нижней части бака.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Перемешивание предотвращает прилипание пузырьков к нижней части диализной мембраны.
    11. Элюируйте белки в течение 4 ч при 350 В в холодной комнате.
    12. После завершения элюирования удалите электроэлементный модуль из буферной емкости и поместите его в раковину или миску.
    13. Если использовали пробку, удалите ееВ верхней буферной камере. В противном случае используйте большую пипетку для удаления буфера.
    14. Удалите буфер из каждой стеклянной трубки и выбросьте. Убедитесь, что силиконовый адаптер остается на месте и что жидкость ниже фритты не потревожена или не встряхивается.
    15. Осторожно удалите силиконовый адаптер вместе с мембранным колпачком со дна стеклянной трубки. Внесите содержимое (около 400 мкл) силиконовой крышки в микротрубочку. С еще 200 мкл буфера для элюирования промойте кремниевый колпачок и добавьте в микротрубу. Повторите все стеклянные трубки.
    16. Поскольку мембранные колпачки можно повторно использовать, сохраните мембранные колпачки, помещая их в буфер элюирования, содержащий 0,5 мг / мл азида натрия. Охладите их.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Элюат имеет низкую концентрацию белка и может быть сконцентрирован с использованием центробежных фильтрующих устройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для визуализации суперкомплексов митохондрий использовались свежеизолированные митохондрии у мышей 17 , 18 . Митохондриальные суперкомплексы чувствительны к повторяющимся циклам замораживания и оттаивания, что приводит к их распаду, хотя это может быть приемлемым для некоторых исследователей. Если замораживание необходимо для хранения, чтобы обеспечить наилучшие результаты, образцы не должны подвергаться более чем одному циклу замораживания и оттаивания.

Чтобы визуализировать митохондриальные комплексы ETC с BN PAGE, 100 мкг белка из изолированных митохондрий сердца загружали на 4-10% гель ( рис. 1А ). Пятна Кумасси в загрузочном и катодном буфере достаточны для маркировки белковых комплексов во время пробега. Суперкомплексы появляются после увеличения контраста в цифровом виде (не показано). Для CN PAGE два образца по 20 мкгF белка из изолированных митохондрий загружали на 3-8% -ный CN-гель и отделяли ( фиг. 1B ). CN PAGE окрашивали кумасси и пытались визуализировать белковые комплексы. После увеличения контрастности в цифровом виде появилось несколько белковых комплексов с молекулярным весом, большим, чем мономер Cx-I ( рис. 1В , справа). Концентрации AAB позволили, чтобы крупнейшие суперкомплексы просто вошли в гель из лунки. Однако гель, заканчивающийся градиентом менее 3% AAB, недостаточно стабилен, чтобы манипулировать для передачи или для извлечения полосы или полосы. Кроме того, низкая концентрация AAB в верхних частях 3-8% CN-гелей поддерживает некоторую подвижность белковых комплексов, что важно, если учитывать природное электролечение 19 .

Мономеры и суперкомплексы Cx-I и мономеров, димеров и суперкомплексов CXV являются ферментативно активными и могут быть визуализированы IGA ( рисунок 1C- F ). Анализы показывают, что в изолированных митохондриях сердца Cx-I и Cx-V присутствуют в белковых комплексах, превышающих их соответствующие мономеры. В анализе IGA для Cx-I NADH окисляется и электроны переносятся для снижения содержания нитроцеллюлозы в тетразолии. Это приводит к локализованному синему цвету при молекулярном весе мономеров Cx-I и Cx-I-содержащих респирасомах / суперкомплексах ( рис. 1C ). Активность Cx-V оценивают по способности субъединицы F 1 гидролизовать АТФ и могут быть выполнены с использованием гелей CN или BN ( рисунок 1D- F ). АДФ, образующийся в результате этой реакции, взаимодействует со свинцом и приводит к образованию белого осадка на уровне мономеров Cx-V, димеров, синтазомов и подкомплексов (скорее всего, несобранная часть F 1 Cx-V). Обратите внимание, что олигомицин устраняет lЧто они содержат Cx-V ( рисунок 1E ).

Для всех описанных здесь экспериментов цвиттерионное моющее средство, лаурилмалтозид, использовалось при концентрации 2 мкг / 1 мкг белка, что является наивысшей возможной концентрацией, которая сохраняет суперкомплексы при одновременном обеспечении последовательных и воспроизводимых результатов ( рисунок 1F ). Однако эффективность лаурилмалтозида зависит от количества партии, условий хранения и возраста. Таким образом, точная концентрация, используемая в одной лаборатории, не обязательно такая же, как и в рукописях. Правильная концентрация детергента будет солюбилизировать мембраны, но сохранить комплексы и суперкомплексы неповрежденными и должна определяться с использованием различных концентраций лаурилмалтозида ( рис. 1F ). Для CN PAGE был подготовлен общий объем образца 40 мкл на лункуПриведенным здесь, в результате чего соотношение белка / моющего средства составляет 1 мкг / 2 мкг или отношение моющего средства / буфера 1 мкг / 1 мкл (равное 1,9 мМ). Из 40 мкл на каждую лунку мини-гель наносят 30 мкл; Остальное использовалось в качестве аликвоты для обнаружения VDAC, контроля загрузки ( рисунок 2D ).

Для иммуноблоттинга CN является предпочтительным для BN PAGE, поскольку белки не загружаются Coomassie, что может мешать обнаружению антителами. На рисунке 2 показано обнаружение суперкомплексов, содержащих белки Cx-I и Cx-V NDUFB6 и ATP5A из изолированных митохондрий сердца, печени и мозга. Маркировка Ponceau S после переноса и до иммуноблоттинга может использоваться для маркировки маркеров молекулярной массы и для контроля загрузки белка ( рисунок 2A ). Это позволит визуализировать мономеры белковых комплексов ETC на нитроцеллюлитныхOse, но маркировка Ponceau S не всегда достаточна для визуализации суперкомплексов митохондрий ( рис. 2A ), что может быть достигнуто путем иммуноблоттинга.

Cx-I не собирается в димеры и тетрамеры, как таковые, но образует все более высокомолекулярные суперкомплексы с Cx-III и Cx-IV 14 , 20 , 21 . Здесь, используя антитело против NDUFB6, показано, что образец из сердца содержит больше мономеров Cx-I и суперкомплексов с высокой молекулярной массой (верхние полосы), которые митохондрии из печени или мозга ( рис. 2B ). Количество среднекомплексных респирасомальных суперкомплексов также было значительно выше в сердце, чем в других тканях ( рисунок 2B ).

Используя антитела против АТФ5А,Мономеры Cx-V обнаруживаются в митохондриях из всех тканей, в то время как четкая структура полос, представляющих димеры (D) и более крупные суперкомплексы (SC), которые хорошо видны в митохондриях сердца, не столь заметна в митохондриях печени и мозга ( Рисунок 2C ). Overexposure (1 мин против 20 с) иммуноблота показывает несколько Cx-V-содержащих суперкомплексов, которые могут представлять собой тетрамеры и синтасомы ( рис. 2C ). Эти образцы Cx-V-содержащих белковых комплексов в митохондриях сердца, печени и мозга показывают различия, которые могут быть тканеспецифическими и еще не изучены.

Постепенную загрузку этих блотов можно сопровождать окрашиванием Ponceau S и обнаружением VDAC вышеуказанной аликвоты с помощью SDS PAGE, как показано на рисунке 2D .

Не все антителаШтампы пригодны для обнаружения белка в четвертичной или третичной структуре белкового комплекса после нативного PAGE. Чтобы преодолеть эту проблему, целые и частичные полосы из нативного геля могут быть установлены на денатурирующем геле для второго измерения (двумерные гели, см. Ссылку 13 для демонстрации). 2D-электрофорез является ценным инструментом для визуализации белков в супрамолекулярном комплексе. Однако, как показано на рисунке 2 , суперкомплексы присутствуют в переменных количествах, а сигнал отдельных белков из суперкомплексов может быть трудно визуализироваться во втором, денатурирующем измерении. Чтобы преодолеть эту проблему, здесь использовалось электроэлемент белковых комплексов из нативных гелей. Это изолирует суперкомплексные полосы из нескольких полос, чтобы получить больше материала для дальнейшего изучения.

При использовании электроизлучения только интересующая полоса, которая была идентифицирована IGA и / или визуализирована на BN PAGE, является исключениемИСЭД; Белки из этого куска геля дополнительно очищают элюированием из геля. На фигуре 3А показана полоса BN PAGE, из которой полосы, представляющие мономер, вырезали для электроэлюции. Для оценки активности Cx-V мономера после электроэлюции элюат наносили на вторую CN PAGE. Элюат мономера все еще содержит ферментативно активный Cx-V, но также появляются подкомплексы ( рисунок 3B ). Серебряное окрашивание элюата после нативного CN PAGE ( рисунок 3C ) или денатурация SDS PAGE ( рисунок 3D ) указывает на присутствие белков в элюате, а иммуноблоттинг против ATP5A указывает на присутствие Cx-V в обоих образцах ( рисунок 3D ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Визуализация МитохаOndrial Суперкомплексы. ( A ) Две полосы 4-10% BN maxi-gel с образцами изолированных митохондрий сердца. Аликвоты одного и того же образца проводили на обеих дорожках при 100 мкг белка на лунку. Мономеры белковых комплексов I, II, III, IV и V ETC хорошо видны и помечены справа от геля. ( B ) Два образца митохондрий сердца (1 и 2, 20 мкг белка / полосы) разделяли на CN PAGE и визуализировали окрашиванием Кумасси. SC указывает положение суперкомплексов после увеличения и цифрового улучшения верхней части геля (область обозначена красными стрелками). ( C ) 20 мкг митохондриального белка разделяли на 3-8% CN PAGE и обрабатывали для Cx-I IGA. Изображения с увеличенным и цифровым изображением демонстрируют полосы продукта реакции Cx-I. ( D ) 20 мкг митохондриального белка отделяли на 3-8% BN PAGE и обрабатывали для Ix Cx-V. Впечатляет Ed и цифровое изображение демонстрируют полосы продукта реакции Cx-V. ( E ) 50 мкг митохондриального белка разделяли на 5-15% CN PAGE и обрабатывали для Ix Cx-V без (-) и с (+) 5 мкг / мл олигомицина (олиго). ( F ) Митохондриальный белок (20 мкг / л) солюбилизировали с 2-6 мкг лаурилмалтозида / 1 мкг белка, как указано в верхней части геля, и разделяли на 3-8% CN-геле, а затем Cx- V IGA. Все снимки были сфотографированы либо с помощью светлого стола ( A - C ), либо с черной поверхности ( D - F ). Спецификации камеры приведены в Таблице материалов. Расположение маркеров молекулярной массы (MW) указано на левой стороне всех панелей. Сокращения: D = димеры; F 1 * = подкомплекс Cx-V; LM = лаурилмалтозид; M = маркер молекулярной массы; M = мономеры; SC = суперкомплексы.G1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Обнаружение суперкомплексов митохондрий методом иммуноблоттинга. 20 мкг белка из сердца (H), печени (Li) и митохондрии головного мозга (B) разделяли на 3-8% CN PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. ( A ) окрашивание Ponceau S мембраны указывает на наличие белковых комплексов и маркеров молекулярной массы (м). Синяя стрелка указывает на верхнюю часть геля. ( B ) Белок Cx-I, NDUFB6, был иммуноблотрован на блоттинге, показанном в (A) (время экспозиции 1 мин). ( C ) Cx-V визуализировали анти-ATP5A-антителом (20 с и 1-минутным воздействием, как указано). Красные стрелки в (B) и (C) указывают область, увеличенную и увеличенную цифру для visuaЛизирование Cx-I- и Cx-V-содержащих суперкомплексов, а синяя стрелка указывает на верхнюю часть геля. ( D ) Ponceau S и иммунокалибровку аликвоты VDAC каждого экстракта, используемого в (A), (B) и (C), которые разделяли SDS PAGE и переносили в нитроцеллюлозу. Сокращения: M = мономеры Cx-I или Cx-V, D = димеры Cx-V, SC = суперкомплексы, содержащие Cx-I или Cx-V. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Электроизлучение Cx-V. ( A ) BN PAGE образца митохондрий. Коробчатая полоса представляет собой мономер Cx-V, который был вырезан и электроэлемент. ( B ) Элюат подвергали CN PAGE, а последующая IGA для Cx-V демонстрирует мономеры (M)И подкомплексы, содержащие F 1 из Cx-V. ( C ) Серебряное окрашивание CN PAGE элюата демонстрирует мономеры (M). ( D ) Серебряное окрашивание (левая панель) и иммуноблот для ATP5A (правая панель) денатурирующего натриевого додецилсульфата (SDS) PAGE элюата указывает на присутствие Cx-V. Для SDS PAGE см. Протоколы, опубликованные в других местах. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Функциональный ETC необходим для генерации митохондриального АТФ. Комплексы ETC способны образовывать два типа суперкомплексов: респирасомы (Cx-I, -III и -IV) 1 и синтазомы (Cx-V) 2 . Сборка каждого комплекса необходима для неповрежденного ETC, в то время как считается, что организация ETC в суперкомплексах повышает общую эффективность ETC 5 , 22 . Как эти суперкомплексы собираются и разбираются, не совсем понятны, но представленные здесь протоколы могут обеспечить лучшее понимание этих процессов.

Основной проблемой изучения сборки ETC является размер этих белковых комплексов. Например, митохондриальные респиразомы могут состоять из Cx-I (около 880 кДа) и одной или нескольких молекул Cx-III (460 кДа) и Cx-IV (200 кДа, активных в качестве димера), что приводит к суперкомплексу с молекулярным Вес около2000 кДа. Кроме того, Cx-V имеет молекулярную массу около 600 кДа, но, как было показано, собирается в димеры, тетрамеры, олигомеры и ленты димеров 7 , 23 , что приводит к суперкомплексам с молекулярной массой не менее 2000 кДа. Учитывая огромные размеры этих суперкомплексов, некоторые частично связанные подходы традиционно использовались для идентификации и характеристики этих суперкомплексов этой лабораторией и другими 8 , 14 , 24 .

Эта работа продемонстрировала технику нативного гелеобразного ПААГ, где активные белковые комплексы осторожно экстрагируются из митохондриальной мембраны с использованием мягких детергентов. Комплексы мигрируют в гели в основном из-за их размера и собственного заряда (CN PAGE) или из-за размера и отрицательного заряда связанного с белком кумасси-синего (BN PAGE). Эти гели можно окрашивать, используя COomassie blue ( например, в гелях CN) или серебряном пятне ( например, в BN и CN PAGE), чтобы выявить полосы белков.

Lauryl maltoside использовали для экспериментов, продемонстрированных здесь, потому что это моющее средство работало наиболее надежно. Альтернативно, дигитонин можно использовать для извлечения белковых комплексов 12 . Здесь показаны данные из митохондрий, выделенных из взрослых сердец, печени и головного мозга, но эти методы были выполнены на эмбриональных и взрослых гомогенатах сердца 8 . Другие использовали этот метод, используя изолированные митохондрии из культивируемых клеток 24 . Однако при использовании тканевых гомогенатов или культивируемых клеток с высоким содержанием ДНК может быть полезно добавить нуклеазу для предотвращения полос во время электрофореза 25 .

Активность различных комплексов может быть проанализирована непосредственно в геле, как показано здесь для Cx-I и Cx-V, и tecТакже доступны для изучения деятельности Cx-II, -III и -IV 12 . Однако анализ этих IGA должен быть сделан тщательно. Во-первых, ферментативная реакция может быть вызвана не-ETC-ферментами или неполностью собранными комплексами. Например, для выполнения CGA-V IGA с параллельным гелем, обработанным олигомицином, ингибировать интактный Cx-V ( рис. 3 ). Кроме того, другие оксидазы NADH могут объяснять активность Cx-1 в геле. Можно проводить параллельную IGA в присутствии ингибитора Cx-I, такого как ротенон. Однако на рисунке 1 были использованы изолированные митохондрии, поэтому цитоплазматических NADH-оксидаз не было; Таким образом, данные, скорее всего, представляют собой Cx-I-содержащие мономеры и суперкомплексы. Кроме того, количественная оценка этих результатов возможна путем измерения интенсивности сигнала полос на фотографиях или сканировании. Недостатки этого подхода включают различия междуВ гелях, подвижность продукта реакции, неспособность адекватно количественно определять продукт по всей глубине геля и потенциальную нелинейность реакции 27 . Чтобы преодолеть последнее, некоторые предложили получить скорости реакций с использованием серийных фотографий, но здесь это не было опробовано.

Белок в нативных гелях также может быть перенесен на мембраны, и белковый состав полос может быть исследован путем иммуноблоттинга (продемонстрированный здесь) или 2D PAGE (продемонстрирован в ссылке 13 ). Мономеры комплексов ETC традиционно были идентифицированы по их обилию в нативных гелях изолированных митохондрий, их расположении в геле и их положении относительно белка молекулярного маркера ( рис. 1 ). Кроме того, маркировка последующих иммуноблоттов антителами, специфичными для субъединиц различных комплексов, помогает идентифицировать комплекс и составСуперкомплексов. Следовательно, анти-NDUFB6 и -ATP5A идентифицируют мономеры и суперкомплексы, содержащие Cx-1 и Cx-V, соответственно, как показано здесь. Антитела к Cx-II-IV могут использоваться для этой же цели. В некоторых случаях антитела, которые хорошо работают в денатурирующих гелях, могут плохо работать в нативных гелях из-за того, что некоторые антитела специфичны для денатурированного белка или что эпитоп может быть замаскирован другими белками в нативном комплексе.

Точное определение молекулярного веса этих суперкомплексов затруднено, так как большинство доступных маркеров молекулярной массы лежат ниже размера мономеров Cx-V. Миграция белковых комплексов в нативном геле зависит от размера, собственного заряда и используемого детергента 28 . В примерах здесь мономеры комплексов были идентифицированы на основе гелей, маркеров и иммуноблоттинга. Димеры Cx-V идентифицировали на основе относительной миграции по сравнению с мономерами Cx-I и -V и на иммуноглобулинеблоттинга. Все остальное выше мономеров и димеров в гелях, IGA и иммуноблотах считается суперкомплексом.

Родные иммуноблоты также могут быть количественно определены для суперкомплексов путем анализа плотности полосы с использованием стандартных методов. Этот метод здесь не показан, но недавняя публикация демонстрирует этот метод 8 . Нормализация загрузки белка может быть выполнена с использованием окрашивания по краю Понсео в полосе или путем сохранения образца экстракта митохондрий для измерения плотности полосы VDAC на денатурирующем иммуноблоте ( рис. 2А и D ). Кроме того, изучение соотношения суперкомплексов к мономерам в одном и том же иммуноблоте является еще одним способом количественной оценки плотности полос, но нужно быть осторожным, чтобы делать снимки в разное время во время блот-развития, чтобы полосы не подвергались чрезмерной экспозиции.

Наконец, полосы из нативных гелей могут быть электроэлюминированы для получения очищенияD, активные белковые комплексы, которые могут собираться в комплексы более высокого порядка и могут быть использованы для дальнейших исследований сложной функции. Например, мономеры Cx-V ранее были электроэлюминированы и восстановлены в липосомы, чтобы продемонстрировать электрическую функциональность 29 . Альтернативным подходом к естественному электроэлементу является элюирование пассивной диффузией в окружающий буфер 16 , но это медленное по сравнению с природным электроизлучением. Наконец, серьезной проблемой электроэлюции является поддержание ферментативной функции электроэлюированного белкового комплекса, так как комплекс может диссоциировать во время очистки. Поэтому любой анализ функции после выделения по этой методике должен быть тщательно протестирован.

Объединив эти протоколы с ферментативными анализами и измерениями потребления кислорода, которые исследуют функцию отдельных комплексов ETC и активность всего ETC 30 и другие методыТаких как кристаллографическая 31 и электронно-микроскопическая оценка структуры комплексов и суперкомплексов, может и возникла полная картина внутренних выработок ETC. Мы ближе к пониманию того, как собираются комплексы, как электроны текут по цепочке и как протоны перекачиваются через мембрану, чтобы генерировать градиент, а затем возвращаются к матрице через Cx-V для получения АТФ. Несомненно, эти методы будут дополнительно уточнены, чтобы предоставить дополнительные сведения о структуре, функции и динамическом регулировании ETC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от Аффилированного основателя Американской ассоциации сердца [12GRNT12060233] и Сильного детского исследовательского центра в Рочестерском университете.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Tags

Биохимия выпуск 124 Митохондрии электронная транспортная цепь респирасомы синтасомы ясный нативный электрофорез гель-анализы электроэлемент
Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter