Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analysera superkomplex av den mitokondriella elektrontransportkedjan med naturliga elektrofores, in-gel-analyser och elektrolys

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Detta protokoll beskriver separation av funktionella mitokondriella elektrontransportkedjekomplex (Cx) IV och superkomplex därav med användning av nativ elektrofores för att avslöja information om deras sammansättning och struktur. Den nativa gelén kan utsättas för immunoblottning, in-gel-analyser och rening genom elektroeluering för att ytterligare karakterisera individuella komplex.

Abstract

Den mitokondriella elektrontransportkedjan (ETC) omvandlar den energi som härrör från nedbrytningen av olika bränslen till cellens bioenergetiska valuta, ATP. ETC består av 5 massiva proteinkomplex, som också monteras i superkomplex som kallas respirasomer (CI, C-III och C-IV) och syntasomer (CV) som ökar effektiviteten hos elektrontransport och ATP-produktion. Olika metoder har använts i över 50 år för att mäta ETC-funktionen, men dessa protokoll ger inte information om montering av enskilda komplex och superkomplex. Detta protokoll beskriver tekniken av naturlig gelpolyakrylamidgelelektrofores (PAGE), en metod som modifierades för mer än 20 år sedan för att studera ETC-komplexstruktur. Naturlig elektrofores tillåter separation av ETC-komplex i sina aktiva former, och dessa komplex kan sedan studeras med användning av immunoblottning, in-gel-analyser (IGA) och rening genom elektroeluering. Genom att kombinera reSulten av inhemsk gel PAGE med de andra mitokondriella analyserna är det möjligt att få en komplett bild av ETC-aktivitet, dess dynamiska montering och demontering och hur detta reglerar mitokondriell struktur och funktion. Detta arbete kommer också att diskutera begränsningar av dessa tekniker. Sammanfattningsvis är tekniken med infödd PAGE, följd av immunoblottning, IGA och elektroelution, presenterad nedan, ett kraftfullt sätt att undersöka funktionaliteten och sammansättningen av mitokondriella ETC-superkomplex.

Introduction

Mitokondriell energi i form av ATP är inte bara väsentlig för cellöverlevnad, men också för reglering av celldöd. Genereringen av ATP genom oxidativ fosforylering kräver en funktionell elektrontransportkedja (ETC, Cx-I-IV) och mitokondrialt ATP-syntas (Cx-V). Nya studier har visat att dessa stora proteinkomplex organiseras i superkomplex, kallat respirasomer och syntasomer 1 , 2 . Det är utmanande att analysera montering, dynamik och aktivitetsreglering av dessa massiva komplex och superkomplex. Medan syreförbrukningsmätningar som tas med en syreelektrod och enzymanalys utförd med användning av en spektrofotometer kan ge värdefull information om ETC-komplexaktivitet, kan dessa analyser inte ge information om närvaron, storlek och subenhetskompositionen hos proteinkomplexet eller de involverade superkomplexen. Utvecklingen av blått och klart naturligt (BN och CN) PAGE 3 har skapat ett kraftfullt verktyg för att avslöja viktig information om komplex komposition och montering / demontering och om den dynamiska reglering av den supramolekylära organisationen av dessa vitala respiratoriska komplex under fysiologiska och patologiska förhållanden 4 .

Sammansättningen av dessa komplex i högre ordningens superkomplex tycks reglera mitokondriell struktur och funktion 5 . Till exempel ökar respirasom-sammansättningen effektiviteten hos elektronöverföring och genereringen av protonmotivkraften över mitokondriellt inre membran 5 . Dessutom ökar sammansättningen av syntasomer inte bara effektiviteten hos ATP-produktion och överföringen av energiekvivalenter i cytoplasman 2 , utan det formar också det mitokondriella inre membranet i den rörformiga kristallen 6 , </ Sup> 7 . Studier av superkomplexmontering under hjärtutveckling i musembryon visar att generationen av Cx-I-innehållande superkomplex i hjärtat börjar vid ungefär embryonal dag 13,5 8 . Andra har visat att mängden Cx-I-innehållande superkomplex minskar i hjärtat på grund av åldrande eller ischemi / reperfusionsskador 9 , 10 eller kan spela en roll i utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar 11 .

Detta protokoll beskriver metoder för inbyggd gel PAGE som kan användas för att undersöka sammansättningen och aktiviteten hos ETC-komplexen och superkomplexen. Den approximativa molekylvikten av mitokondriella superkomplex kan bedömas genom separation av proteinkomplexen i CN- eller BN-polyakrylamidgeler. CN PAGE möjliggör även visualisering av den enzymatiska aktiviteten hos alla mitokondriska komplex direkt i gelén (in-gel-analyser;IGA) 12 . Detta arbete demonstrerar aktiviteten hos respirasomer genom att framhäva förmågan hos Cx-I att oxidera NADH genom IGA och närvaron av syntasomer på grund av ATP-hydrolyseringsaktiviteten av Cx-V genom IGA. De multipla komplexen och superkomplexen innehållande Cx-I och Cx-V kan också demonstreras genom att överföra proteinerna på nitrocellulosemembran och utföra immunoblottning. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att BN eller CN PAGE separerar i allmänhet proteinkomplex baserat på deras fysiologiska storlek och sammansättning; Överföringen till ett membran bevarar detta mönster av band. Analys av proteinkomplex i en BN- eller CN-PAGE kan också göras med användning av 2D-PAGE (se Fiala et al. 13 för en demonstration) eller genom sackarosdensitetscentrifugering 14 , 15 . För att ytterligare analysera ett specifikt band kan det skäras ut från BN PAGE, och proteinerna från detta proteinkomplex kan vara renaD genom att elektroelutera dem under naturliga förhållanden. Inbyggd elektroeluering kan utföras inom några timmar, vilket kan göra en signifikant skillnad mot den passiva diffusionen (som användes i Referens 16) av proteiner från en gel i den omgivande bufferten.

Sammanfattningsvis beskriver dessa metoder flera tillvägagångssätt som möjliggör ytterligare karakterisering av superkomplex från högmolekylära vikt från mitokondriella membran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes med användning av hjärtan från C57BL / 6N möss (vildtyp). Mössen bedövades med CO2 före cervikal dislokation och alla förfaranden utfördes i strikt överensstämmelse med divisionen av laboratoriemedicin på University of Rochester och i enlighet med statlig lag, federal stadga och NIH-policy. Protokollet godkändes av Institutionen för djurvård och användningskommitté vid University of Rochester (University Committee on Animal Resources).

1. CN och BN PAGE

OBS! All utrustning som används för BN och CN PAGE måste vara fri från tvättmedel. För att säkerställa detta, tvätta all utrustning med 0,1 M saltsyra, följt av mycket sköljning med avjoniserad H2O .

  1. Förberedelse
    1. Förbered anodbuffert bestående av 25 mM imidazol, pH 7,0, vid 4 ° C; Lagra vid 4 ° C.
    2. Förbered katodbuffert för CN eller BN PAGE.
      1. För CN PAGE använd 7,5 mM imidazol och 50 mM trikin; Tillsätt 0,5 g natriumdeoxikolat och 0,2 g laurylmaltosid per liter buffert. Justera pH till 7,0 vid 4 ° C och förvara vid 4 ° C.
      2. För BN PAGE använd 7,5 mM imidazol och 50 mM trikin och justera pH till 7,0 vid 4 ° C. Förvara vid 4 ° C.
      3. För ljusblå BN-katodbuffert använd 7,5 mM imidazol och 50 mM trikin. Justera pH till 7,0 vid 4 ° C och tillsätt 20 mg Coomassie per liter buffert. Förvara vid 4 ° C.
    3. Framställ extraktionsbuffert (EB) med 50 mM NaCl, 50 mM imidazol, 2 mM aminokapronsyra och 1 mM EDTA. Justera pH till 7,0 vid 4 ° C och förvara vid 4 ° C.
    4. Förbered 3x gelbuffert (använd för BN och CN geler) med 75 mM imidazol och 1,5 M aminokapronsyra. Justera pH till 7,0 vid 4 ° C och förvara vid 4 ° C.
    5. Förbered en laddningsbuffert (LB) på 0,01 g Ponceau S, 5 g glycerol och 5 ml H 2 O. Förvara vid rumtemperatur.
    6. Förbered Coomassie blå genom att tillsätta 50 mg Coomassie till 1 ml 500 mM 6-aminohexansyra. Justera pH till 7,0 vid 4 ° C och förvara vid 4 ° C.
    7. Bered 20 mM och 200 mM laurylmaltosid i H2O . Gör alikvoter av 200 pl och förvara dem frusna. Tina diskmedel före användning.
3% till 8% (mini) 4% till 10% (maxi)
0,5 geler (lätta) 0,5 gels (tung) 0,5 geler (lätta) 0,5 gels (tung)
AAB (ml) 0,42 1,3 2,5 7,7
CN / BN-buffert (ml) 1,6 1,6 8,5 8,5
H20 (ml) 2,7 1,4 14 6,3
Glycerol (g) 0 0,47 0 2,5
Volym (ml) 4,72 4,77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabell 1: Mängder av ingredienser som behövs för att hälla 1 Mini- eller Maxi-PAGE. De volymer som används i denna tabell beräknas för 1 min- eller 1 maxi-gel, 1,5 mm tjock. Volymen av AAB baseras på en 40% stamlösning. Lätt och tungt hänvisar till koncentratetJon av AAB. APS och TEMED tillsätts när varje kolonn av gradientblandaren är fylld med AAB-lösning.

  1. Hällande och löpande geler
    OBS: Använd 3-8% eller 4-10% akrylamid / bisakrylamid (AAB) gradient för CN- eller BN-geler. Tabell 1 sammanfattar mängden buffert, AAB, H20, glycerol, ammoniumpersulfat (APS) och tetrametyletylendiamin (TEMED) som används för en mini-gel (85 mm bred x 73 mm hög x 1,5 mm tjock) eller maxi-gel (160 Mm bred x 200 mm hög x 1,5 mm tjock). Sammansättningar av glasplattor med CN- eller BN-geler kan kylas i en påse med några ml 1x gelbuffert eller insvept i pappershandduk fuktad med 1x gelbuffert för lagring. Gelerna är stabila för användning i upp till en vecka.
    1. För att hälla gelén placera gradientblandaren på en förhöjd omröringsplatta för att säkerställa att gelén kommer att strömma genom gravitation i den beredda gelkammaren.
    2. Fyll utloppskammaren i gradientblandaren med 4,77 / 25 ml (Mini / maxi) av den tunga lösningen (med en högre koncentration av AAB).
    3. Öppna försiktigt stoppkrananslutningen mellan den tunga och lätta kammaren och låt en droppe lösning passera till andra sidan.
      OBS: Detta skjuter luftbubblor från anslutningsröret och stoppkranen, vilket förhindrar flöde mellan de två kamrarna. Detta kan inte göras om båda sidorna redan är fyllda, eftersom lika tryck kommer att hindra bubblan från att röra sig igenom.
    4. Fyll den andra kammaren i gradientblandaren med 4,72 / 25 ml (mini / maxi) av ljuslösningen.
    5. Placera en omrörningsstång i utloppskammaren med den tunga lösningen och börja omröra. Använd en rörhastighet som inte orsakar bubbling.
    6. Lägg snabbt till APS och TEMED till varje kammare för att initiera polymerisationen.
    7. Öppna förbindelsen mellan de två kamrarna i gradientblandaren och låt blanda i några sekunder innan du öppnar utflödeskammaren för att hälla gelén.
      OBS: Gravity wiLl dränerar båda kamrarna lika, och blandning av ljuset i den tunga lösningen sänker långsamt akrylamiddensiteten från botten till toppen av gelén. Använd hela innehållet i gradientblandaren för att hälla gelén.
      1. I slutet ska du försiktigt montera kammen, med brunnarna inuti gelén för att undvika bubblor och lagblandning.
    8. Tvätta gradientblandaren med etanol och skölj omedelbart eventuell gel. Skölj med vatten och häll den andra gelén. Låt gelerna polymerisera (vanligtvis mindre än 20 minuter behövs för mini-geler).
    9. För att köra gelerna, montera dem i elektrodmonteringsspänningen och fyll i mitten / övre kammaren med CN eller ljusblå BN-katodbuffert. Vänta några minuter för att kontrollera läckor innan du lägger anodbuffert till den yttre / undre kammaren.
      1. Dra försiktigt ut brunnkammarna och tvätta brunnarna med katodbuffert med hjälp av en spruta eller pipett.
      2. Kör gelerna i ett kallrum (4 ° C) eller helt packat i is.
        1. För CN mini-PAGE, använd 100 V för den första timmen och 200 V tills färdig, vanligtvis ytterligare 1-1,5 h. Alternativt kan du köra CN mini-PAGE vid 30-40 V över natten.
          OBS: Fokus här är på proteinkomplex med hög molekylvikt, så proteinkomplex med en molekylvikt mindre än 140 kDa kommer att rinna ur gelén. Kortare löptider för elektrofores kan användas för att kvarhålla komplex med låg molekylvikt.
        2. För BN maxi-PAGE, använd 100 V och kör gelerna över natten (ca 18 h).
          OBS: Strömmen är mycket låg (<15 mA), så en strömförsörjning som kan hantera dessa förhållanden behövs. Vid denna tidpunkt kan gelerna användas för IGA eller immunoblottning. I vissa fall kan band eller banor skärs ut av gelerna med ett rakblad på en glasplatta för elektroeluering.
  2. Provberedning
    OBS: Membranbundna mitokondriella superkomplex måste extraheras från thE inre mitokondriska membranet. För att bevara mitokondriella superkomplexer, använd antingen nyligen isolerade mitokondrier eller prov som har frysts och tinas en gång endast. Beräkningarna / volymerna nedan ges för mini-geler (brunnen i en 10-brunnskam i en gel 1,5 mm tjock håller upp till 35-40 μl) och maxi-geler (brunnen i en 15 brunnskam håller sig till 200 pl). Dessutom sparar du en alikvot av varje prov (vanligtvis 10 μl), som ska köras på en denaturerande SDS-gel för detektering av den spänningsberoende anjonkanalen (VDAC) som en laddningskontroll.
    1. Placera en lämplig mängd ( t.ex. 10-50 μg protein för mini-geler och 50-200 μg för maxi-geler) av isolerade mitokondrier eller vävnadshomogenat i mikrotubes och centrifuger vid 17 000 xg i 10-15 min vid 4 ° C.
      OBS: Detta steg avlägsnar några av de lösliga mitokondriska matrisen och / eller cytosoliska proteinerna.
    2. Aspirera och kassera supernatanten och tillsätt extraktionsbuffert till önskad mängdAtt ladda på gelén. Resuspendera sedimentet försiktigt på is. Om så önskas, lägg till en allmän proteashämmarmix vid denna punkt.
      ANMÄRKNING: Baserat på den utrustning som användes här användes 30 μl för en mini-gel och 100 μl för en maxi-gel, vilket begränsade protein / buffertförhållandet till inte mer än 2 μg protein till 1 μl buffert.
    3. Lägg till tvättmedel ( t.ex. 2 μg laurylmaltosid / 1 μg protein, se representativa resultat och diskussion för mer information).
      OBS! Generellt används laurylmaltosid, men digitonin kan också användas.
    4. Inkubera på is i 20 minuter. Blanda försiktigt i början och ibland under inkubation genom triturering och / eller omröring av röret.
    5. Centrifugera vid 17 000 xg i 10 min vid 4 ° C för att avlägsna eventuella membran och vävnadsfragment.
    6. Överför supernatanten till ett nytt rör. För CN-prover tillsätt 1 μL LB för varje 10 μL provvolym; Den totala volymen av provet ska vara ca.Ungefär 40 μl för en mini-gel och 130 μl för en maxi-gel. För BN-prover lägger du Coomassie till proverna så att förhållandet mellan färg och rengöringsmedel är 1: 4 (vikt / vikt).
    7. Ladda 30 och 120 pl av proven i respektive brunnarna i mini- eller maxi-gel. Använd de återstående 10 μL från varje prov för denaturerings SDS-gelén för att detektera VDAC som lastkontroll.
    8. För att bereda molekylviktsmarkörerna, lösa upp 1 injektionsflaska med en kalibreringsblandning med hög molekylvikt (se tabell över material för mer information) i 60 | il BN / CN-gelbuffert och tillsätt 120 | il H20 och 20 | il LB. Ladda 15 μL per lane.
    9. Kör gelerna enligt skiss 1.2.9.2.

2. In-gel-analyser för Cx-I och Cx-V

OBS: Analyserna utförs vid rumstemperatur. Ta bilder, skanningar eller bilder av de utvecklande banden för dokumentation. (Viktigt) Proteiner kan inte överföras ontO nitrocellulosamembran efter fullbordande av en IGA.

  1. Cx-I-analys
    1. Förberedelse.
      1. Förbered en analysbuffert med 5 mM Tris i H2O med ett pH av 7,4; Lagra vid rumstemperatur.
      2. Lös 10 mg NADH i 1 ml analysbuffert. Förvara i alikvoter av 100 | il vid -20 ° C tills användning; Undvik frysning och upptining.
      3. Väg 25 mg Nitroblue tetrazolium i en mikrotub.
      4. Förbered fixativet genom att späda 5 ml ättiksyra i 95 ml H2O; Lagra vid rumstemperatur.
    2. Utföra analysen.
      1. Kombinera 10 ml analysbuffert med 25 mg Nitroblue tetrazolium (slutkoncentration: 2,5 mg / ml) och 100 | il 10 mg / ml NADH (0,1 mg / ml). Lägg till detta på hela gelén, en körfält eller ett intresseområde excised från en CN-gel.
        OBS: Detta kan göras i en klar plast- eller glasbehållare. Observera att denna analys inte kan utföras efter BN PAGE.
      2. Följ utvecklingen av blåband efter mild omröring (rocker) i> 3 min.
      3. Fixa gelén i 10-20 ml ättiksyra lösning eller tvätta i 5 mM Tris, pH 7,4 för att stoppa reaktionen. Ta bilder för dokumentation (se materialet).
  2. Cx-V-analys
    OBS: Cx-V-analysen bör göras med dubbla CN- eller BN-geler, där man inkuberas med 5 μg / ml oligomycin (en Cx-V-hämmare) för att visa Cx-V-oberoende aktivitet.
    1. Förberedelse.
      1. Bered en analysbuffert med 35 mM Tris och 270 mM glycin; Justera pH till 8,3 vid rumstemperatur. Förvara bufferten frusen i 50 ml alikvoter, men kontrollera pH efter frysning och upptining.
      2. Förbered 1 M MgS04 i H2O; Förvara vid 4 ° C tills användning.
      3. Väg 27,28 mg Pb (NO3) 2 i en mikrotub.
      4. Väg 60 mg ATP i en mikrotub.
      5. Lös upp 1 mg oLigomycin i 1 ml etanol. Förvaras vid -20 ° C tills användning.
      6. Förbered ett fixativ genom att blanda 50 ml metanol med 50 ml H20; Lagra vid rumstemperatur.
    2. Utföra analysen.
      1. Inkubera en gel, en bana eller ett intresseområde från en BN- eller CN-gel i 2 timmar med försiktig agitation (rocker) i 10-20 ml analysbuffert ± 5 μg / ml oligomycin (50-100 μl 1 mg / Ml i etanol) vid rumstemperatur.
      2. Efter inkubation ersätt bufferten med 14 ml färsk analysbuffert och tillsätt 190 μL 1 M MgSO4 (14 mM), 27,28 mg Pb (N03) 2 (5 mM), 60 mg ATP ( 8 mM) och 75 | il oligomycin (vid behov).
      3. Inkubera med mild omröring (rocker) och titta på en vit fällning, eftersom band på oligomycinbehandlade geler ger icke-Cx-V-beroende band.
        OBS: Utfallet av fällningen kan ta flera timmar.
      4. Fixa gelén i metanol-Baserad fixativ ( t ex 50% metanol), eftersom sura lösningar kommer att lösa upp blyfällningen. Fotografera resultaten.
        OBS: Den ledande fällningen interfererar inte med Coomassie-färgningen av gelerna.

3. Proteinöverföring till nitrocellulosa eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran

  1. Förbered en överföringsbuffert med 25 mM Tris och 200 mM glycin. Justera pH till 8,3 och tillsätt 0.0005 g / L SDS och 200 mL / L metanol. Förvara vid rumstemperatur.
    1. Skär ett nitrocellulosa eller PVDF-membran (porstorlek: 0,45 μm) med ett rakblad eller en sax till en storlek något större än den hos gelén.
      OBS: Nitrocellulosa membran tillåter Ponceau S-färgning för att bedöma proteinbelastning, medan PVDF-membran ger mer skarpt definierade band.
  2. Protokoll.
    1. Blötlägg nitrocellulosamembranet, filterpappret och svamparna för aMinst 10 minuter i överföringsbuffert. Placera PVDF-membranet i 100% metanol i 15 s eller enligt tillverkarens rekommendation innan den placeras i överföringsbuffert. Placera överföringspaketets öppna kassett i en platt skål med överföringsbuffert.
    2. Placera svampen och 1-2 lager av filterpapper på baksidan av kassetten. Ta bort bubblorna.
    3. Placera gelén på filterpapperet. Ange gelens orientering genom att klippa ett hörn av gelén och / eller membranet.
    4. Placera membranet på toppen av gelén. Ta bort alla bubblor.
    5. Placera filterpapper och en svamp på toppen av membranet. Ta bort alla bubblor i denna smörgås.
    6. Stäng kassetten och placera den i överföringspaketets kassetthållare.
    7. Överför proteinerna vid 25 V i ca 12-18 h.

4. Immunoblotting

  1. Förberedelse.
    1. Förbered en Ponceau-fläck (500 ml) genom att tillsätta 25 mlAv ättiksyra och 0,5 g Ponceau S till 475 ml H20; Lagra vid rumstemperatur (kan återanvändas).
    2. Beredda Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base och 2,7 mM KCl. Ställ in pH till 8,0 och förvara vid rumstemperatur.
    3. Förbered TBS-tween (TBST) genom att tillsätta 0,5 ml / L Tween 20 till TBS; Lagra vid rumstemperatur.
    4. Förbered mjölkfastämnen / TBST genom att lösa 5 g fastämne i mjölk i 100 ml TBST. Förvara vid 4 ° C och använd inom 3 dagar.
    5. Förbered BSA / TBST genom att lösa 3 g bovint serumalbumin (BSA, fraktion V) i 100 ml TBST. Förvara vid 4 ° C och använd inom 3 dagar.
  2. Protokoll.
    1. När överföringen är klar, placera membranet i Ponceau S lösning för att visualisera alla överförda proteiner. Märka markörernas position på membranet med en penna och dokumentera det Ponceau-S-färgade membranet genom fotografering eller skanning.
    2. Tvätta membranet 3 gånger i 10 min varje wiTBS under försiktig omröring.
    3. Blockera membranet med mjölkfastämne / TBST i 1-2 h vid rumstemperatur eller över natten i ett kallrum med försiktig omröring.
    4. Tvätta membranet i 10 min med TBST under försiktig omröring.
    5. Inkubera med primär antikropp över natten i kallrummet under försiktig omröring. Späd antikroppen ( t.ex. 1: 1000 för anti-ATP5A och -NDUFB6) i BSA / TBST.
      OBS! De flesta antikroppar ger en bättre signal på membran från inhemska geler när de inkuberas över natten.
    6. Tvätta membranet i 10 min med TBST under försiktig omröring.
    7. Inkubera med sekundär antikropp i minst 60 minuter vid rumstemperatur, oerfter mild omröring. Torka antikroppen (1: 5 000 till 1: 50 000) i fast substans i mjölk / TBST.
    8. Tvätta membranet 3 gånger i 10 minuter vid rumstemperatur med TBST-oändlig mild omröring.
    9. Under den senaste tvätten, förbered det förbättrade substratet för kemoluminescens (ECL) enligt instruktionerna från manufacturer.
    10. Inkubera membranet med ECL-substrat med hjälp av instruktioner från tillverkaren.
    11. Upptäck signalet på filmen med anvisningar från tillverkaren av ECL-substratet.

5. Electroelution

  1. Förberedelse.
    1. Bered en elueringsbuffert av 25 mM trikin, 3,75 mM imidazol (pH 7,0 vid 4 ° C) och 5 mM 6-aminohexansyra.
      OBS! Använd handskar hela tiden när du hanterar elektrolytorn och membranlocken för att förhindra kontaminering med externa proteiner.
  2. På dagen innan du använder elektrolytorn för inbyggd elektroeluering, utför följande:
    1. Blöt membranlocken (cut-off: 3,5 kDa) i elueringsbuffert under 1 h vid 60 ° C. Överför kepsarna till ny elueringsbuffert och dra dem i 12 timmar eller längre i kylskåpet.
      OBS! En avskärmd molekylvikt på 3,5 kDa förhindrar förlust av liten pRoteiner som lätt kan dissociera från proteinkomplexet av intresse.
    2. Tvätta elektroelutermodulen, glasrören, tanken och locket noggrant med etanol. Skölj med vatten och låt utrustningen torka.
  3. På dagen för inbyggd elektroelution gör du följande.
    1. Placera en fritt i botten (frostat) av varje glasrör som ska användas. Placera om nödvändigt glasröret i elueringsbuffert och tryck fritt från insidan till rörets botten.
    2. Skjut glasröret med fritt in i elektrolytorns modul. Våt grommet med elueringsbuffert och skjut glasröret på plats. Försäkra dig om att glasrören är jämn med grommen.
    3. Stäng de tomma grenarna med stopparna.
    4. Placera en våt membranlock i botten av silikonadaptern och fyll i adaptern med elueringsbuffert. Långsamt pipera bufferten i adaptern upp och ner för att ta bort eventuella luftbubblor runt dialysmembranet. </ Li>
    5. Skjut den buffertfyllda adaptern i botten av glasröret. Ta bort alla bubblor som syns på fritan i glasröret.
    6. Fyll varje glasrör med elueringsbuffert.
    7. Placera BN PAGE: s utspridda band i glasrören (se steg 1.2.9.3). Skär stora bitar i mindre bitar. Se till att fyllhöjden i glasröret är ca 1 cm.
    8. Placera hela modulen i tanken.
    9. Tillsätt ca 600 ml kall elueringsbuffert till tanken. Se till att kiseladapterkapslarna är i bufferten för att förhindra bubblor vid dialysmembranet.
    10. Placera en omrörningsstång längst ner på tanken.
      OBS: Omrörning hindrar bubblor från att klibba i botten av dialysmembranet.
    11. Eluta proteinerna i 4 h vid 350 V i ett kallrum.
    12. Efter att elueringen är avslutad, ta bort elektrodermodulen från buffertbehållaren och placera den i en diskbänk eller skål.
    13. Om ett stopp användes, ta bort det för att draI den övre bufferkammaren. Annars, använd en stor pipett för att ta bort bufferten.
    14. Ta bort bufferten från varje glasrör och kassera. Se till att silikonadaptern är på plats och att vätskan under fritiden inte störs eller skakas.
    15. Ta försiktigt bort silikonadaptern, tillsammans med membranlocket från botten av glasröret. Pipettera innehållet (ca 400 μl) av silikonhatten i en mikrotub. Skölj silikongärlet med ytterligare 200 μL elueringsbuffert och sätt i mikrotuben. Upprepa för alla glasrör.
    16. Eftersom membranlocken kan återanvändas, behåll membranlocken genom att placera dem i elueringsbuffert innehållande 0,5 mg / ml natriumazid. Kyl dem.
      OBS: Eluatet har låg proteinkoncentration och kan koncentreras med hjälp av en centrifugalfilteranordning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att visualisera mitokondriella superkomplex användes nyligen isolerade mitokondrier från möss 17 , 18 . Mitokondriella superkomplex är känsliga för upprepade cykler av frysning och upptining, vilket leder till deras sönderdelning, även om detta kan vara acceptabelt för vissa forskare. Om frysning är nödvändig för lagring, för att säkerställa bästa resultat, ska proverna inte genomgå mer än en cykel av frysning och upptining.

För att visualisera mitokondrie-ETC-komplexen med BN PAGE laddades 100 | ig protein från isolerade hjärtmitokondrier på en 4-10% gel ( Figur 1A ). Coomassie-fläcken i laddnings- och katodbufferten är tillräcklig för att märka proteinkomplexen under körningen. Superkomplex visas efter att kontrasten har ökats digitalt (ej visad). För CN PAGE, två prover av 20 μg oF-protein från isolerade mitokondrier laddades på en 3-8% CN-gel och separerades ( Figur IB ). CN-PAGE färgades med Coomassie och avlägsnades för att visualisera proteinkomplexen. Efter ökad kontrast digitalt uppträdde flera proteinkomplex med en molekylvikt större än monomeren av Cx-I ( Figur IB , höger). Koncentrationerna av AAB som används tillåts för de största superkomplexen för att bara komma in i gelén från brunnen. En gel som slutar med en gradient mindre än 3% AAB är emellertid inte tillräckligt stabil för att manipulera för överföring eller för exciering av ett band eller körfält. Dessutom upprätthåller den låga koncentrationen av AAB i de övre delarna av 3-8% CN-gelerna viss rörlighet för proteinkomplexen, vilket är viktigt om man överväger naturlig elektroeluering 19 .

Monomerer och superkomplex av Cx-I och monomerer, dimerer och superkomplexer av CXV är enzymatiskt aktiv och kan visualiseras av IGA ( Figur 1C- F ). Analyserna visar att Cx-I och Cx-V i isolerade hjärtmitokondrier är närvarande i proteinkomplex som är större än deras respektive monomerer. I IGA-analysen för Cx-I oxideras NADH och elektroner överförs för att reducera nitroblue tetrazolium. Detta resulterar i en lokaliserad blå färg vid molekylvikten hos Cx-I-monomererna och Cx-I-innehållande respirasomer / superkomplexen ( Figur 1C ). Aktiviteten hos Cx-V bedöms från förmågan hos Fl-underenheten att hydrolysera ATP och kan göras med användning av CN- eller BN-geler ( Figur 1D- F ). Den ADP som alstras från denna reaktion interagerar med bly och resulterar i en vit fällning vid nivån av Cx-V monomerer, dimerer, syntasomer och subkomplex (sannolikt den ej sammansatta F 1- delen av Cx-V). Observera att oligomycin eliminerar lAbeling av dessa band, bekräftar att de innehåller Cx-V ( Figur 1E ).

För alla experiment som beskrivits här användes det zwitterjoniska tvättmedlet, laurylmaltosid, i en koncentration av 2 | ig / 1 | ig protein, vilket är den högsta möjliga koncentrationen som bevarar superkomplexen samtidigt som det ger konsekventa och reproducerbara resultat ( Figur 1F ). Effektiviteten av laurylmaltosid beror emellertid på lotnummer, lagringsförhållanden och ålder. Således är den exakta koncentrationen som används i ett laboratorium inte nödvändigtvis densamma som rapporterats i manuskript. Den korrekta koncentrationen av tvättmedel kommer att solubilisera membranen men hålla komplexen och superkomplexen intakta och måste bestämmas genom att använda olika koncentrationer av laurylmaltosid ( Figur 1F ). För CN PAGE framställdes en total provvolym av 40 | il per brunnHärmed resultera i ett protein / detergentförhållande av 1 pg / 2 pg eller ett detergent / buffertförhållande av 1 pg / 1 pi (lika med 1,9 mM). Från 40 μl applicerades 30 | jL per brunn i minigelen; De återstående användes som en alikvot för detektering av VDAC, en laddningskontroll ( Figur 2D ).

För immunoblottning föredras CN för BN PAGE eftersom proteinerna inte är laddade med Coomassie, vilket kan störa detektion av antikroppar. Figur 2 visar detektering av superkomplex som innehåller Cx-I- och Cx-V-proteinerna NDUFB6 och ATP5A från isolerade hjärt-, lever- och hjärn mitokondrier. Ponceau S-märkning efter överföring och före immunoblottning kan användas för att markera molekylviktsmarkörerna och för kontroll för proteinbelastning ( Figur 2A ). Detta kommer att visualisera monomererna av proteinkomplexen av ETC på nitrocellulOsmembran, men Ponceau S-märkning är inte alltid tillräcklig för visualisering av mitokondriella superkomplex ( Figur 2A ), som kan uppnås genom immunoblottning.

Cx-I monteras inte i dimerer och tetramerer i sig men bildar alltmer högre molekylviktskomplex med Cx-III och Cx-IV 14 , 20 , 21 . Här visar användningen av en antikropp mot NDUFB6 att provet från hjärtat innehöll mer Cx-I-monomer och högmolekylära superkomplex (toppband) som mitokondrier från levern eller hjärnan ( Figur 2B ). Mängden medelhöga respirasom-superkomplexen var också mycket högre i hjärtat än i de andra vävnaderna ( Figur 2B ).

Användning av anti-ATP5A-antikroppar,Monomerer av Cx-V är detekterbara i mitokondrier från alla vävnader, medan ett tydligt mönster av band som är representativa för dimerer (D) och större superkomplex (SC), som är tydligt synliga i hjärtmitokondrier, inte är lika framträdande i lever- och hjärn mitokondrier ( Figur 2C ). Overexponering (1 min mot 20 s) i immunobloten visar flera Cx-V-innehållande superkomplex, som kan representera tetramer och syntasomer ( Figur 2C ). Dessa mönster av Cx-V-innehållande proteinkomplex i hjärt-, lever- och hjärn mitokondrier visar skillnader som kan vara vävnadsspecifika och har ännu inte utforskats.

Proteinbelastning av dessa blottor kan följas av Ponceau S-färgning och VDAC-detektering av ovan nämnda alikvot genom SDS PAGE, såsom visas i figur 2D .

Inte alla antibiotikaFormar är lämpliga att detektera ett protein inom den kvaternära eller tertiära strukturen av ett proteinkomplex efter infödd PAGE. För att övervinna detta problem kan hela och partiella banor från den inhemska gelen monteras på en denaturerande gel för en andra dimension (2D geler, se referens 13 för en demonstration). 2D-elektrofores är ett värdefullt verktyg för visualisering av proteiner i ett supramolekylärt komplex. Såsom visas i figur 2 är dock superkomplex närvarande i varierande mängder och signalen från individuella proteiner från superkomplex kan vara svår att visualisera i den andra denatureringsdimensionen. För att övervinna detta problem användes elektroelueringen av proteinkomplex från nativa geler här. Detta isolerar superkomplexband från flera banor för att ge mer material för vidare studier.

Vid användning av elektroelution är endast det intressanta bandet, som har identifierats av IGA och / eller visualiserats på en BN-sida, excaliserade; Proteinerna från denna gel gel renas vidare genom eluering från gelén. Figur 3A visar en bana av en BN-PAGE från vilken band som representerar monomeren skars ut för elektroeluering. För att bedöma monomerens Cx-V-aktivitet efter elektroeluering applicerades eluatet på en andra CN-PAGE. Eluatet av monomeren innehåller fortfarande enzymatiskt aktiv Cx-V, men delkomplex uppträder också ( Figur 3B ). Silverfärgning av eluatet efter inhemskt CN-PAGE ( Figur 3C ) eller denaturerande SDS-PAGE ( Figur 3D ) indikerar närvaron av proteiner i eluatet och immunoblottning mot ATP5A indikerar närvaron av Cx-V i båda proven ( Figur 3D ).

Figur 1
Figur 1: Visualisering av MitochOndrial superkomplex. ( A ) Två banor med en 4-10% BN maxi-gel, med prov av isolerade hjärtmitokondrier. Alikvoter av samma prov kördes i båda banorna, vid 100 | ig protein per brunn. Monomererna av proteinkomplexen I, II, III, IV och V i ETC är tydligt synliga och märks till höger om gelén. ( B ) Två prov av hjärtmitokondrier (1 och 2, 20 | jg protein / bana) separerades på en CN PAGE och visualiserades genom Coomassie-färgning. SC anger superkomplexens position efter förstoring och digital förstärkning av gelens övre del (området är indikerat med röda pilar). ( C ) 20 | jg mitokondrialt protein separerades på en 3-8% CN-PAGE och bearbetades för Cx-I IGA. Förstorrade och digitalt förbättrade bilder visar band av Cx-I-reaktionsprodukten. ( D ) 20 | jg mitokondrialt protein separerades på en 3-8% BN PAGE och behandlades för Cx-V IGA. magnifi Ed och digitalt förbättrade bilder visar band av Cx-V reaktionsprodukt. ( E ) 50 | jg mitokondrialt protein separerades på en 5-15% CN PAGE och behandlades för Cx-V IGA utan (-) och med (+) 5 | ig / ml oligomycin (Oligo). ( F ) Mitokondriskt protein (20 μg / lane) solubiliserades med 2 - 6 μg laurylmaltosid / 1 μg protein, vilket indikeras på toppen av gelén och separerades på en 3-8% CN-gel följt av Cx- V IGA. Alla bilder fotograferades med antingen ett ljusbord ( A - C ) eller en svart yta ( D - F ). Kamera specifikationer finns i materialet. Placeringen av molekylviktsmarkörerna (MW) är indikerad på vänster sida av alla paneler. Förkortningar: D = dimerer; F 1 * = subkomplex av Cx-V; LM = laurylmaltosid; M = molekylviktmarkör; M = monomerer; SC = superkomplex.G1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Detektion av mitokondriella superkomplexer genom immunoblottning. 20 | jg protein från hjärtat (H), lever (Li) och hjärn (B) mitokondrier separerades på en 3-8% CN PAGE och överfördes till nitrocellulosamembran. ( A ) Ponceau S-färgning av membranet indikerar närvaron av proteinkomplex och molekylviktsmarkörer (m). Den blå pilen pekar på toppen av gelén. ( B ) Cx-I-proteinet, NDUFB6, immunomärktes på blottet visat i (A) (1 min exponeringstid). ( C ) Cx-V visualiserades med anti-ATP5A-antikropp (20 s och 1 min exponering, såsom anges). De röda pilarna i (B) och (C) indikerar området förstorat och digitalt förbättrat för visuaLering av Cx-I- och Cx-V-innehållande superkomplex, och den blå pilen pekar mot toppen av gelén. ( D ) Ponceau S och immunomärkning av VDAC-alikvoten av varje extrakt som användes i (A), (B) och (C), vilka separerades genom SDS PAGE och överfördes till nitrocellulosa. Förkortningar: M = monomerer av Cx-I eller Cx-V, D = dimerer av Cx-V, SC = superkomplex som innehåller Cx-I eller Cx-V. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Elektroeluering av Cx-V. ( A ) BN PAGE av ett mitokondriellt prov. Det boxade bandet representerar monomeren av Cx-V som skars ut och elektroeluerades. ( B ) Eluatet utsattes för CN PAGE, och efterföljande IGA för Cx-V demonstrerade monomerer (M)Och subkomplex som innehåller F1 av Cx-V. ( C ) Silverfärgning av CN-PAGE av eluatet demonstrerar monomerer (M). ( D ) Silverfärgning (vänster panel) och immunoblott för ATP5A (höger panel) av en denaturerande natriumdodecylsulfat (SDS) PAGE av eluatet indikerar närvaron av Cx-V. För SDS PAGE hänvisas till protokoll som publiceras någon annanstans. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En funktionell ETC är nödvändig för mitokondriell ATP-generering. ETC-komplexen kan bilda två typer av superkomplex: respirasomerna (Cx-I, -III och -IV) 1 och syntasomerna (Cx-V) 2 . Sammansättningen av varje komplex krävs för en intakt ETC, medan organisationen av ETC till superkomplexer antas öka den totala ETC-effektiviteten 5 , 22 . Hur dessa superkomplex monteras och demonteras är inte väl förstådda, men de protokoll som presenteras här kan möjliggöra en bättre förståelse av dessa processer.

Den stora utmaningen att studera ETC-montering är storleken på dessa proteinkomplex. Till exempel kan mitokondriella respirasomer bestå av Cx-I (ca 880 kDa) och en eller flera molekyler av Cx-III (460 kDa) och Cx-IV (200 kDa, aktiv som dimer), vilket resulterar i en superkomplex med en molekyl Vikten av omkring2000 kDa. Dessutom har Cx-V en molekylvikt av ca 600 kDa men har visat sig monteras i dimerer, tetramerer, oligomerer och band av dimerer 7 , 23 , vilket resulterar i superkomplex med en molekylvikt av minst 2000 kDa. Med tanke på den enorma storleken hos dessa superkomplex har flera delvis relaterade tillvägagångssätt traditionellt använts för att identifiera och karakterisera dessa superkomplex, av detta laboratorium och av andra 8 , 14 , 24 .

Detta arbete har visat tekniken av inhemsk gel PAGE, där aktiva proteinkomplex försiktigt extraheras från mitokondriamembranet med användning av milda tvättmedel. Komplexen migrerar i gelerna huvudsakligen på grund av deras storlek och inneboende laddning (CN PAGE) eller på grund av storleken och negativ laddning av proteinbunden Coomassie blue (BN PAGE). Dessa geler kan färgas med användning av COomassieblått ( t.ex. i CN-geler) eller silverfärg ( t.ex. i BN och CN PAGE) för att avslöja proteinband.

Lauryl maltosid användes för experimenten visade sig här eftersom detta tvättmedel arbetade mest tillförlitligt. Alternativt kan digitonin användas för att extrahera proteinkomplex 12 . Data från mitokondrier isolerade från vuxna hjärtan, lever och hjärnor har visats här, men dessa tekniker har utförts på embryonala och vuxna hjärthomogenater 8 . Andra har utfört denna teknik med användning av isolerade mitokondrier från odlade celler 24 . När man använder vävnadshomogenat eller odlade celler med hög DNA-innehåll kan det emellertid vara användbart att tillsätta ett nukleas för att förhindra strimmor under elektrofores 25 .

Aktiviteten hos de olika komplexen kan analyseras direkt i gelén, såsom visas här för Cx-I och Cx-V och tecHniques är också tillgängliga för att undersöka aktiviteterna i Cx-II, -III och -IV 12 . Analys av dessa IGA måste emellertid ske noggrant. För det första kan den enzymatiska reaktionen bero på icke-ETC-enzymer eller ofullständigt sammansatta komplex. Det är till exempel rutin att utföra Cx-V IGA med en parallellgel som har behandlats med oligomycin för att hämma intakt Cx-V ( Figur 3 ). Dessutom kan andra NADH-oxidaser stå för Cx-1 in-gel-aktivitet. Man kan utföra en parallell IGA i närvaro av en Cx-I-hämmare, såsom rotenon. I figur 1 användes emellertid isolerade mitokondrier, så cytoplasmatiska NADH-oxidaser var inte närvarande; Sålunda representerar data mest sannolikt Cx-I-innehållande monomerer och superkomplex. Dessutom är kvantifieringen av dessa resultat möjlig genom att mäta bandens signalintensitet på fotografier eller scanningar. Nackdelar med detta tillvägagångssätt är skillnaderna mellan ochInom geler, rörligheten för reaktionsprodukten, oförmågan att tillräckligt kvantifiera produkten i hela gelens djup och den potentiella icke-linjäriteten hos reaktionen 27 . För att övervinna sistnämnda har vissa föreslagit att man fått reaktionshastigheter med hjälp av seriella fotografier, men det har inte testats här.

Proteinet i nativa geler kan också överföras till membraner, och bandets proteinkomposition kan undersökas genom immunoblottning (demonstrerad här) eller 2D PAGE (demonstrerad i referens 13 ). Monomerer av ETC-komplexen har traditionellt identifierats av deras överflöd i nativa geler av isolerade mitokondrier, deras placering i gelén och deras position i förhållande till molekylärmarkörproteinet ( Figur 1 ). Vidare bidrar märkningen av efterföljande immunoblottar med antikroppar specifika för subenheter av olika komplex att identifiera komplexet och kompositionenAv superkomplex. Därför identifierar anti-NDUFB6 och -ATP5A monomerer av och superkomplex som innehåller Cx-1 respektive Cx-V, såsom visas här. Antikroppar mot Cx-II till IV kan användas för samma ändamål. I vissa fall kan antikroppar som fungerar bra i denaturerande geler inte fungera bra i naturliga geler på grund av det faktum att vissa antikroppar är specifika för denaturerat protein eller att en epitop kan maskeras av andra proteiner i ett nativt komplex.

Den exakta bestämningen av molekylvikten hos dessa superkomplex är svår eftersom de flesta tillgängliga molekylviktsmarkörer ligger under storleken av Cx-V-monomerer. Migrering av proteinkomplex i en nativ gel beror på storleken, inneboende laddning och tvättmedel 28 . I exemplen här identifierades monomerer av komplexen baserat på geler, markörer och immunoblottning. Dimer av Cx-V identifierades baserat på relativ migration jämfört med monomerer av Cx-I och -V och på immunblotting. Allt annat än monomerer och dimerer i geler, IGA och immunoblott anses vara superkomplex.

Native immunoblots kan också kvantifieras för superkomplex genom att analysera bandtäthet med användning av standardtekniker. Denna metod visades inte här, men en ny publikation visar denna teknik 8 . Normalisering av proteinbelastning kan utföras med användning av Ponceau-rödfärgning av banan eller genom att spara ett prov av mitokondriextraktet för att mäta densiteten hos VDAC-bandet på en denaturerande immunoblot ( Figur 2A och D ). Vidare är undersökning av förhållandet mellan superkomplex till monomerer i samma immunoblot ett annat sätt att kvantifiera bandtätheten, men man måste vara försiktig med att ta bilder vid olika tidpunkter under blötutveckling så att banden inte är överexponerade.

Slutligen kan band från inhemska geler elektroelueras för att generera purifieD, aktiva proteinkomplex som kan monteras i högre ordningskomplex och kan användas för vidare studier av komplex funktion. Cx-V-monomerer elektrolyserades exempelvis tidigare och rekonstituerades i liposomer för att demonstrera den elektriska funktionaliteten 29 . Ett alternativt tillvägagångssätt mot naturlig elektroelution elueras genom passiv diffusion i den omgivande bufferten 16 , men detta är långsamt jämfört med nativ elektroeluering. Slutligen upprätthåller ett stort problem med elektroelution den enzymatiska funktionen hos det elektroeluterade proteinkomplexet, eftersom komplexet kan dissociera under rening. Därför måste varje analys av funktion efter isolering med denna teknik testas noggrant.

Genom att kombinera dessa protokoll med enzymatiska analyser och mätningar av syreförbrukning, som sondar funktionen av individuella ETC-komplex och aktiviteten hos hela ETC 30 och andra metOds, såsom den kristallografiska 31- och elektronmikroskopiska 32- utvärderingen av strukturen hos komplex och superkomplex, kan en komplett bild av ETC: s inre verkningar uppträda. Vi närmare förstår hur komplexen monteras, hur elektroner flyter ner i kedjan och hur protoner pumpas över membranet för att generera gradienten och sedan flyta tillbaka till matrisen genom Cx-V för att generera ATP. Utan tvekan kommer dessa tekniker att förfina ytterligare för att ge ytterligare detaljer om ETC: s struktur, funktion och dynamiska reglering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidrag från American Heart Association Founders Affiliate [12GRNT12060233] och Strong Children's Research Center vid University of Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Tags

Biochemistry Mitochondria elektrontransportkedja respirasomer syntasomer klar naturlig elektrofores in-gel-analyser elektroeluering
Analysera superkomplex av den mitokondriella elektrontransportkedjan med naturliga elektrofores, in-gel-analyser och elektrolys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter