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Biochemistry

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Abstract

La cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) transduce la energía derivada de la descomposición de varios combustibles en la moneda bioenergética de la célula, ATP. El ETC se compone de 5 complejos masivos de proteínas, que también se agrupan en supercomplejos llamados respirasomes (CI, C-III y C-IV) y synthasomes (CV) que aumentan la eficiencia del transporte de electrones y la producción de ATP. Se han utilizado varios métodos durante más de 50 años para medir la función ETC, pero estos protocolos no proporcionan información sobre el ensamblaje de complejos individuales y supercomplejos. Este protocolo describe la técnica de electroforesis en gel de gel de poliacrilamida nativa (PAGE), un método que fue modificado hace más de 20 años para estudiar la estructura compleja de ETC. La electroforesis nativa permite la separación de los complejos ETC en sus formas activas, y estos complejos pueden entonces estudiarse usando inmunotransferencia, ensayos en gel (IGA) y purificación por electroelución. Combinando el reLos resultados de PAGE PAGE nativo con los de otros ensayos mitocondriales, es posible obtener una imagen completa de la actividad ETC, su ensamblaje dinámico y desmontaje, y cómo esto regula la estructura y función mitocondrial. Este trabajo también discutirá las limitaciones de estas técnicas. En resumen, la técnica de PAGE nativo, seguida de immunoblotting, IGA y electroelución, presentada a continuación, es una poderosa manera de investigar la funcionalidad y composición de los supercomplexos mitocondriales ETC.

Introduction

La energía mitocondrial en forma de ATP no sólo es esencial para la supervivencia celular, sino también para la regulación de la muerte celular. La generación de ATP por fosforilación oxidativa requiere una cadena funcional de transporte de electrones (ETC, Cx-I a IV) y ATP sintasa mitocondrial (Cx-V). Estudios recientes han demostrado que estos grandes complejos de proteínas están organizados en supercomplejos, llamados respirasomes y synthasomes 1 , 2 . Es difícil analizar la asamblea, la dinámica y la regulación de la actividad de estos complejos y supercomplejos masivos. Mientras que las mediciones del consumo de oxígeno tomadas con un electrodo de oxígeno y los ensayos enzimáticos llevados a cabo utilizando un espectrofotómetro pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad compleja de ETC, estos ensayos no pueden proporcionar información con respecto a la presencia, tamaño y composición de subunidades del complejo proteico o supercomplejos implicados. Sin embargo, el desarrollo de azul y claro nativo (BN y CN, respectivamente) PAGE 3 ha creado una potente herramienta para revelar información importante sobre la composición compleja y el montaje / desmontaje y sobre la regulación dinámica de la organización supramolecular de estos complejos respiratorios vitales en condiciones fisiológicas y patológicas 4 .

El montaje de estos complejos en supercomplejos de orden superior parece regular la estructura y función mitocondrial 5 . Por ejemplo, el montaje respirasome aumenta la eficiencia de la transferencia de electrones y la generación de la fuerza motriz del protón a través de la membrana interna mitocondrial 5 . Además, el montaje de los sintomas no sólo aumenta la eficiencia de la producción de ATP y la transferencia de equivalentes de energía al citoplasma 2 , sino que también moldea la membrana interna mitocondrial en las crestas tubulares 6 ,/ Sup> 7 . Estudios de montaje supercompleto durante el desarrollo cardíaco en embriones de ratón muestran que la generación de Cx-I que contienen supercomplejos en el corazón comienza en alrededor del día embrionario 13,5 8 . Otros han demostrado que la cantidad de supercomplexos que contienen Cx-I disminuye en el corazón debido al envejecimiento o lesiones por isquemia / reperfusión 9 , 10 o pueden jugar un papel en la progresión de enfermedades neurodegenerativas 11 .

Este protocolo describe métodos para gel PAGE nativo que puede usarse para investigar el montaje y la actividad de los complejos ETC y supercomplejos. El peso molecular aproximado de los supercomplejos mitocondriales puede evaluarse separando los complejos proteicos en geles de poliacrilamida CN o BN. CN PAGE también permite la visualización de la actividad enzimática de todos los complejos mitocondriales directamente en el gel (ensayos en gel;IGA) 12 . Este trabajo demuestra la actividad de respirasomes resaltando la capacidad de Cx-I para oxidar NADH a través de IGA y la presencia de synthasomes debido a la actividad de hidrolización de ATP de Cx-V por IGA. Los múltiples complejos y supercomplejos que contienen Cx-I y Cx-V también pueden demostrarse transfiriendo las proteínas sobre membranas de nitrocelulosa y realizando inmunotransferencia. La ventaja de este enfoque es que BN o CN PAGE generalmente separa complejos proteicos basados ​​en su tamaño fisiológico y composición; La transferencia a una membrana conserva este patrón de bandas. Análisis de complejos de proteínas en un BN o CN PAGE también se puede hacer utilizando 2D-PAGE (véase Fiala et al 13 para una demostración) o por centrifugación de densidad de sacarosa [ 14 , 15] . Para analizar más a fondo una banda específica, puede ser extirpada de la BN PAGE, y las proteínas de este complejo de proteínas pueden ser purificadasD electroelutándolos bajo condiciones nativas. La electroelución nativa puede realizarse en pocas horas, lo que podría hacer una diferencia significativa en la difusión pasiva (tal como se utiliza en la Referencia 16) de proteínas desde un gel al tampón circundante.

En resumen, estos métodos describen varios enfoques que permiten la caracterización adicional de los supercomplexos de alto peso molecular de las membranas mitocondriales.

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Protocol

Todos los experimentos se realizaron utilizando corazones de ratones C57BL / 6N (tipo salvaje). Los ratones fueron anestesiados con CO 2 antes de la dislocación cervical, y todos los procedimientos se realizaron en estricta conformidad con la División de Laboratorio de Medicina Animal en la Universidad de Rochester y en cumplimiento con la ley estatal, estatuto federal y NIH política. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rochester (Comité Universitario de Recursos Animales).

1. CN y BN PAGE

NOTA: Todos los equipos utilizados para BN y CN PAGE deben estar libres de detergente. Para asegurar esto, lave todo el equipo con ácido clorhídrico 0,1 M, seguido de enjuague extensivo con H2O desionizada.

  1. Preparación
    1. Preparar un tampón anódico consistente en imidazol 25 mM, pH 7,0, a 4ºC; Almacenar a 4 ° C.
    2. Preparar buffer de cátodo para CN o BN PAGE.
      1. Para CN PAGE, usar imidazol 7,5 mM y tricina 50 mM; Añadir 0,5 g de desoxicolato de sodio y 0,2 g de lauril maltosida por litro de tampón. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
      2. Para BN PAGE, usar imidazol 7,5 mM y tricina 50 mM y ajustar el pH a 7,0 a 4ºC. Almacenar a 4 ° C.
      3. Para el tampón de cátodo BN de color azul claro, utilice imidazol 7,5 mM y tricina 50 mM. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y añadir 20 mg de Coomassie por litro de tampón. Almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar el tampón de extracción (EB) con 50 mM de NaCl, 50 mM de imidazol, 2 mM de ácido aminocaproico y 1 mM de EDTA. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
    4. Preparar tampón de gel 3x (utilizado para geles BN y CN) con imidazol 75 mM y ácido aminocaproico 1,5 M. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
    5. Preparar un tampón de carga (LB) de 0,01 g de Ponceau S, 5 g de glicerol y 5 ml de H 2 O. Almacenar en la habitacióntemperatura.
    6. Preparar azul de Coomassie añadiendo 50 mg de Coomassie a 1 ml de ácido 6 - aminohexanoico 500 mM. Ajustar el pH a 7,0 a 4 ° C y almacenar a 4 ° C.
    7. Preparar 20 mM y 200 mM de lauril maltosida en H 2 O. Hacer alícuotas de 200 μL y almacenarlos congelados. Descongele el detergente antes de usarlo.
3% a 8% (mini) 4% a 10% (maxi)
0,5 geles (luz) 0,5 geles (pesados) 0,5 geles (luz) 0,5 geles (pesados)
AAB (ml) 0,42 1.3 2,5 7,7
Tampón CN / BN (ml) 1,6 1,6 8.5 8.5
H $ ₂ $ O (ml) 2.7 1,4 14 6,3
Glicerol (g) 0 0,47 0 2,5
Volumen (ml) 4,72 4,77 25 25
APS (μL) 27 27 sesenta y cinco sesenta y cinco
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabla 1: Cantidad de Ingredientes Necesarios para Verter 1 Mini- o Maxi-PAGE. Los volúmenes utilizados en esta tabla se calculan para 1 mini- o 1 maxi-gel, de 1,5 mm de espesor. El volumen de AAB se basa en una solución madre al 40%. Luz y pesado se refieren a la concentratIon de AAB. APS y TEMED se añaden después de que cada columna del mezclador de gradiente se llena con solución de AAB.

  1. Geles para colar y correr
    NOTA: Utilizar gradiente de 3-8% o 4-10% de acrilamida / bisacrilamida (AAB) para los geles CN o BN, respectivamente. La Tabla 1 resume las cantidades de tampón, AAB, H2O, glicerol, persulfato de amonio (APS) y tetrametiletilendiamina (TEMED) utilizado para un mini gel (85 mm de ancho x 73 mm de alto x 1,5 mm de espesor) o maxi-gel Mm de ancho x 200 mm de alto x 1,5 mm de espesor). Los ensamblajes de placas de vidrio con geles CN o BN se pueden refrigerar en una bolsa con unos pocos ml de tampón de gel 1x o envueltos en una toalla de papel mojada con 1x tampón de gel para almacenamiento. Los geles son estables para su uso por hasta una semana.
    1. Para verter el gel, coloque el mezclador gradiente sobre una placa de agitación elevada para asegurar que el gel fluirá por gravedad hacia la cámara de gel preparada.
    2. Llenar la cámara de salida del mezclador de gradiente con 4,77 / 25 mL (Mini / maxi) de la solución pesada (con una mayor concentración de AAB).
    3. Abra suavemente la conexión del grifo de parada entre la cámara pesada y ligera y permita que una gota de solución pase al otro lado.
      NOTA: Esto empuja burbujas de aire del tubo de conexión y del grifo, lo que evitará el flujo entre las dos cámaras. Esto no puede hacerse si ambos lados ya han sido llenados, porque la presión igual evitará que la burbuja se mueva a través.
    4. Llene la otra cámara del mezclador de gradiente con 4,72 / 25 mL (mini / maxi) de la solución ligera.
    5. Coloque una barra de agitación en la cámara de salida con la solución pesada y comience a agitar. Utilice una velocidad de barra de agitación que no cause burbujas.
    6. Agregue rápidamente APS y TEMED a cada cámara para iniciar la polimerización.
    7. Abrir la conexión entre las dos cámaras del mezclador de gradiente y permitir la mezcla durante unos segundos antes de abrir la cámara de salida para verter el gel.
      NOTA: Gravedad wiLl drenar ambas cámaras por igual, y la mezcla de la luz en la solución pesada disminuirá lentamente la densidad de acrilamida desde el fondo hasta la parte superior del gel. Utilice todo el contenido que está en el mezclador de degradado para verter el gel.
      1. Al final, monte cuidadosamente el peine, con los pocillos dentro del gel para evitar burbujas y mezcla de capas.
    8. Lavar inmediatamente el mezclador de gradiente con etanol para enjuagar cualquier gel. Enjuague con agua y vierta el segundo gel. Deje que los geles se polimerizan (normalmente se necesitan menos de 20 min para mini-geles).
    9. Para hacer funcionar los geles, montarlos en la abrazadera del ensamblaje del electrodo y llenar la cámara central / superior con tampón catódico CN o azul claro. Espere unos minutos para verificar si hay fugas antes de añadir tampón anódico a la cámara externa / inferior.
      1. Tire suavemente de los peines de los pocillos y lave los pocillos con tampón de cátodo utilizando una jeringa o una pipeta.
      2. Ejecutar los geles en una habitación fría (4 ° C) o completamente envasados ​​en hielo.
        1. Para CN mini-PAGE, utilice 100 V durante la primera hora y 200 V hasta que termine, usualmente un adicional de 1-1,5 h. Alternativamente, ejecute la mini-PAGE CN a 30-40 V durante la noche.
          NOTA: El enfoque aquí es sobre complejos de proteína de alto peso molecular, por lo que los complejos de proteína con un peso molecular de menos de 140 kDa saldrán del gel. Pueden usarse tiempos de funcionamiento más cortos para la electroforesis para retener complejos de bajo peso molecular.
        2. Para BN maxi-PAGE, utilizar 100 V y administrar los geles durante la noche (aproximadamente 18 h).
          NOTA: La corriente será muy baja (<15 mA), por lo que se necesita una fuente de alimentación que pueda manejar estas condiciones. En este punto, los geles pueden usarse para IGA o inmunotransferencia. En algunos casos, bandas o carriles se pueden cortar de los geles usando una cuchilla de afeitar sobre una placa de vidrio para electroelución.
  2. preparación de la muestra
    NOTA: Los supercomplexos mitocondriales unidos a membranas deben ser extraídos deE membrana mitocondrial interna. Para preservar los supercomplexos mitocondriales, utilice mitocondrias recién aisladas o muestras que hayan sido congeladas y descongeladas sólo una vez. Los cálculos / volúmenes siguientes se dan para mini-geles (el pocillo de un peine de 10 pocillos en un gel de 1,5 mm de grosor sostiene hasta 35-40 μL) y maxi-geles (el pocillo de un peine de 15 pocillos 200 mu L). Además, guarde una alícuota de cada muestra (usualmente 10 μl), para que se ejecute en un gel SDS desnaturalizante para la detección del canal aniónico dependiente de la tensión (VDAC), como un control de carga.
    1. Coloque una cantidad apropiada ( por ejemplo, 10-50 μg de proteína para mini-geles y 50 - 200 μg para maxi-gels) de mitocondrias aisladas o homogeneizado de tejido en microtubos y centrifugue a 17.000 xg durante 10-15 min a 4 ° C.
      NOTA: Este paso elimina parte de la matriz mitocondrial soluble y / o proteínas citosólicas.
    2. Aspirar y desechar el sobrenadante y añadir tampón de extracción a la cantidad deseadaPara cargar sobre el gel. Resuspender suavemente el sedimento sobre hielo. Si se desea, añada una mezcla general de inhibidores de proteasa en este punto.
      NOTA: En base al equipo utilizado, se utilizaron 30 μl para un mini-gel y 100 μL para un maxi-gel, limitando la relación proteína / buffer a no más de 2 μg de proteína a 1 μl de tampón.
    3. Añada detergente ( por ejemplo, 2 μg de lauril maltosida / 1 μg de proteína, consulte los resultados representativos y la discusión para obtener más información).
      NOTA: Generalmente, se usa lauril maltosida, pero también se puede usar digitonina.
    4. Incubar en hielo durante 20 min. Mezclar suavemente al principio y ocasionalmente durante la incubación triturando y / o agitando el tubo.
    5. Centrifugar a 17.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar cualquier membrana y fragmentos de tejido.
    6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Para las muestras de CN, añada 1 μl de LB por cada 10 μl de volumen de la muestra; El volumen total de la muestra debe ser appAproximadamente 40 μl para un mini-gel y 130 μL para un maxi-gel. Para las muestras BN, añada Coomassie a las muestras de modo que la proporción de colorante a detergente sea de 1: 4 (p / p).
    7. Cargar 30 y 120 μL de las muestras en los pocillos del mini- o maxi-gel, respectivamente. Utilice los 10 μL restantes de cada muestra para el gel SDS desnaturalizante para detectar VDAC como control de carga.
    8. Para preparar los marcadores de peso molecular, disolver 1 vial de una mezcla de calibración de alto peso molecular (ver la Tabla de Materiales para obtener más información) en 60 μL de tampón de gel BN / CN y añadir 120 μl de H2O y 20 μl de LB. Carga de 15 μL por carril.
    9. Ejecutar los geles como se describe en el paso 1.2.9.2.

2. Ensayos en gel para Cx-I y Cx-V

NOTA: Los ensayos se realizan a temperatura ambiente. Tome fotos, escaneos o imágenes de bandas en desarrollo para documentación. (Importante) Las proteínas no pueden ser transferidasO membranas de nitrocelulosa después de completar una IGA.

  1. Ensayo Cx-I
    1. Preparación.
      1. Preparar un tampón de ensayo de Tris 5 mM en H $ ₂ $ O, con un pH de 7,4; almacenar a temperatura ambiente.
      2. Disolver 10 mg de NADH en 1 mL de tampón de ensayo. Almacenar en alícuotas de 100 μl a -20 ° C hasta su uso; Evite congelar y descongelar.
      3. Pesar 25 mg de Nitroblue tetrazolium en un microtubo.
      4. Preparar el fijador diluyendo 5 mL de ácido acético en 95 mL de H2O; almacenar a temperatura ambiente.
    2. Realización del ensayo.
      1. Se combinan 10 ml de tampón de ensayo con 25 mg de Nitroblue tetrazolium (concentración final: 2,5 mg / ml) y 100 μl de NADH 10 mg / ml (0,1 mg / ml). Añadir esto a todo el gel, un carril o un área de interés extirpada de un gel de CN.
        NOTA: Esto se puede hacer en un recipiente de plástico o vidrio transparente. Tenga en cuenta que este ensayo no se puede realizar después de BN PAGE.
      2. Seguir el desarrollo de bandas azules después de agitación suave (rocker) durante> 3 min.
      3. Fijar el gel en 10-20 mL de solución de ácido acético o lavar en Tris 5 mM, pH 7,4 para detener la reacción. Tome fotografías para documentación (vea la Tabla de Materiales).
  2. Ensayo Cx-V
    NOTA: El ensayo de Cx-V debe realizarse usando geles duplicados de CN o BN, donde se incuba con 5 μg / mL de oligomicina (un inhibidor de Cx-V) para demostrar actividad independiente de Cx-V.
    1. Preparación.
      1. Preparar un tampón de ensayo con Tris 35 mM y glicina 270 mM; Ajustar el pH a 8,3 a temperatura ambiente. Guarde el tampón congelado en alícuotas de 50 ml, pero compruebe el pH después de congelar y descongelar.
      2. Preparar MgSO $ ₄ $ 1 M en H $ ₂ $ O; Guardar a 4 ° C hasta su uso.
      3. Pesar 27,28 mg de Pb (NO3) 2 en un microtubo.
      4. Pesar 60 mg de ATP en un microtube.
      5. Disolver 1 mg de oLigomicina en 1 ml de etanol. Guarde a -20 ° C hasta su uso.
      6. Preparar un fijador mezclando 50 mL de metanol con 50 mL de H2O; almacenar a temperatura ambiente.
    2. Realización del ensayo.
      1. Incubar un gel, un carril o un área de interés de un gel de BN o CN durante 2 h con agitación suave (rocker) en 10-20 mL de tampón de ensayo ± 5 μg / mL de oligomicina (50-100 μl de 1 mg / Ml en etanol) a temperatura ambiente.
      2. Después de la incubación, se sustituye el tampón por 14 ml de tampón de ensayo nuevo y se añaden, en orden, 190 μl de MgSO4 1 mM (14 mM), 27,28 mg de Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg de ATP 8 mM) y 75 μL de oligomicina (cuando sea necesario).
      3. Incubar con agitación suave (rocker) y observar un precipitado blanco, como bandas de geles tratados con oligomicina dará non-Cx-V dependientes bandas.
        NOTA: La aparición del precipitado puede tardar varias horas.
      4. Fijar el gel en metanol-( Por ejemplo, metanol al 50%), porque las soluciones ácidas disolverán el precipitado de plomo. Fotografíe los resultados.
        NOTA: El precipitado de plomo no interfiere con la tinción con Coomassie de los geles.

3. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF)

  1. Preparar un tampón de transferencia de Tris 25 mM y glicina 200 mM. Ajustar el pH a 8,3 y añadir SDS 0,0005 g / L y metanol 200 ml / l. Almacenar a temperatura ambiente.
    1. Cortar una membrana de nitrocelulosa o PVDF (tamaño de poro: 0,45 μm) con una cuchilla de afeitar o unas tijeras hasta un tamaño ligeramente mayor que el del gel.
      NOTA: Las membranas de nitrocelulosa permiten la tinción con Ponceau S para evaluar la carga de proteínas, mientras que las membranas de PVDF producen bandas más definidas.
  2. Protocolo.
    1. Remojar la membrana de nitrocelulosa, el papel de filtro y las esponjasAl menos 10 min en tampón de transferencia. Colocar la membrana de PVDF en metanol al 100% durante 15 s o según la recomendación del fabricante antes de colocarla en tampón de transferencia. Coloque el casete abierto del kit de transferencia en un recipiente plano con tampón de transferencia.
    2. Coloque la esponja y 1-2 capas de papel de filtro en la parte posterior del cassette. Quite las burbujas.
    3. Coloque el gel en el papel de filtro. Indicar la orientación del gel recortando una esquina del gel y / o la membrana.
    4. Coloque la membrana en la parte superior del gel. Quite todas las burbujas.
    5. Coloque papel de filtro y una esponja encima de la membrana. Quite todas las burbujas en este sándwich.
    6. Cierre el cassette y colóquelo en el portacartucho del kit de transferencia.
    7. Transferir las proteínas a 25 V durante aproximadamente 12-18 h.

4. Inmunotransferencia

  1. Preparación.
    1. Preparar una tinción de Ponceau (500 ml) añadiendo 25 mlDe ácido acético y 0,5 g de Ponceau S a 475 ml de H2O; Almacenar a temperatura ambiente (se puede reutilizar).
    2. Preparar solución salina tamponada con Tris (TBS) con NaCl 200 mM, Tris-Base 25 mM y KCl 2,7 mM. Ajustar el pH a 8,0 y almacenar a temperatura ambiente.
    3. Preparar TBS-tween (TBST) mediante la adición de 0,5 mL / L de Tween 20 a TBS; almacenar a temperatura ambiente.
    4. Preparar sólidos de leche / TBST disolviendo 5 g de sólidos de leche en 100 mL de TBST. Almacenar a 4 ° C y utilizar en el plazo de 3 días.
    5. Preparar BSA / TBST disolviendo 3 g de albúmina de suero bovino (BSA, fracción V) en 100 ml de TBST. Almacenar a 4 ° C y utilizar en el plazo de 3 días.
  2. Protocolo.
    1. Una vez finalizada la transferencia, coloque la membrana en la solución Ponceau S para visualizar todas las proteínas transferidas. Etiquetar la posición de los marcadores en la membrana con un lápiz y documentar la membrana manchada de Ponceau-S por fotografía o escáner.
    2. Lavar la membrana 3 veces durante 10 min cada unaDe TBS bajo agitación suave.
    3. Bloquear la membrana con sólidos de leche / TBST durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche en una habitación fría con agitación suave.
    4. Lavar la membrana durante 10 min con TBST bajo agitación suave.
    5. Incubar con anticuerpo primario durante la noche en la habitación fría bajo agitación suave. Diluir el anticuerpo ( por ejemplo, 1: 1.000 para anti-ATP5A y -NDUFB6) en BSA / TBST.
      NOTA: La mayoría de los anticuerpos proporcionan una mejor señal en las membranas de los geles nativos cuando se incuban durante la noche.
    6. Lavar la membrana durante 10 min con TBST bajo agitación suave.
    7. Incubar con anticuerpo secundario durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente y agitación suave. Diluir el anticuerpo (1: 5.000 a 1: 50.000) en sólidos de leche / TBST.
    8. Lavar la membrana 3 veces durante 10 min a temperatura ambiente con TBST una agitación suave.
    9. Durante el último lavado, preparar el substrato mejorado de quimioluminiscencia (ECL) de acuerdo con las instrucciones de la manufaCturer
    10. Incube la membrana con sustrato ECL siguiendo las instrucciones del fabricante.
    11. Detectar la señal en la película utilizando las instrucciones proporcionadas por el fabricante del sustrato ECL.

5. Electroelución

  1. Preparación.
    1. Preparar un tampón de elución de tricina 25 mM, imidazol 3,75 mM (pH 7,0 a 4 ° C), y ácido 6 - aminohexanoico 5 mM.
      NOTA: Use guantes en todo momento mientras maneja el electroeluter y las tapas de la membrana para prevenir la contaminación con proteínas externas.
  2. El día antes de usar el electroeluter para la electroelución nativa, realice lo siguiente:
    1. Remoje las tapas de la membrana (corte: 3,5 kDa) en tampón de elución durante 1 h a 60 ° C. Transferir las tapas a tampón de elución fresco y dejarlas en remojo durante 12 h o más en el refrigerador.
      NOTA: Un peso molecular de corte de 3,5 kDa previene la pérdida de pRotenas que pueden disociarse fácilmente del complejo de proteínas de interés.
    2. Lave el módulo de electroeluero, los tubos de vidrio, el tanque y la tapa a fondo con etanol. Enjuague con agua y deje que el equipo se seque.
  3. El día de la electroelución nativa, haga lo siguiente.
    1. Coloque una frita en el fondo (helada) de cada tubo de vidrio para ser utilizado. Si es necesario, coloque el tubo de vidrio en tampón de elución y empuje la frita desde el interior hasta el fondo del tubo.
    2. Empuje el tubo de vidrio con la frita en el módulo del electroeluter. Humedezca el ojal con tampón de elución y deslice el tubo de vidrio en su lugar. Asegúrese de que la parte superior de los tubos de vidrio son incluso con el ojal.
    3. Cierre las arandelas vacías con tapones.
    4. Coloque una tapa de membrana húmeda en la parte inferior del adaptador de silicona y llene el adaptador con tampón de elución. Lentamente pipetee el buffer en el adaptador hacia arriba y hacia abajo para eliminar cualquier burbuja de aire alrededor de la membrana de diálisis.Li
    5. Deslice el adaptador lleno de tampón a la parte inferior del tubo de vidrio. Retire todas las burbujas que aparecen en la frita dentro del tubo de vidrio.
    6. Llenar cada tubo de vidrio con tampón de elución.
    7. Coloque las bandas escindidas de la BN PAGE en los tubos de vidrio (ver paso 1.2.9.3). Corte piezas grandes en pedazos más pequeños. Asegúrese de que la altura de llenado dentro del tubo de vidrio es de aproximadamente 1 cm.
    8. Coloque todo el módulo en el tanque.
    9. Añadir aproximadamente 600 mL de tampón de elución en frío al tanque. Asegúrese de que las tapas del adaptador de silicio estén en el buffer para evitar burbujas en la membrana de diálisis.
    10. Coloque una barra de agitación en la parte inferior del tanque.
      NOTA: La agitación evitará que las burbujas se peguen al fondo de la membrana de diálisis.
    11. Eluir las proteínas durante 4 h a 350 V en una habitación fría.
    12. Una vez completada la elución, retire el módulo de electroeluero del tanque de almacenamiento y colóquelo en un fregadero o en un recipiente.
    13. Si se utilizó un tapón, retírelo paraEn la cámara amortiguadora superior. De lo contrario, utilice una pipeta grande para eliminar el búfer.
    14. Retire el tampón de cada tubo de vidrio y deséchelo. Asegúrese de que el adaptador de silicona permanece en su lugar y de que el líquido por debajo de la frita no se altera o se sacude.
    15. Retire cuidadosamente el adaptador de silicona, junto con la tapa de la membrana de la parte inferior del tubo de vidrio. Pipetear el contenido (aproximadamente 400 μl) de la tapa de silicona en un microtubo. Con otros 200 μl de tampón de elución, enjuague el tapón de silicona y añada al microtubo. Repetir para todos los tubos de vidrio.
    16. Como las tapas de membrana pueden reutilizarse, conservar las tapas de la membrana colocándolas en tampón de elución que contiene 0,5 mg / ml de azida sódica. Refrigerarlos.
      NOTA: El eluato tiene baja concentración de proteína y puede concentrarse usando un dispositivo de filtro centrífugo.

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Representative Results

Para visualizar supercomplexos mitocondriales, se utilizaron mitocondrias recién aisladas de ratones 17 , 18 . Los supercomplejos mitocondriales son sensibles a ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que conduce a su desintegración, aunque esto puede ser tolerable para algunos investigadores. Si la congelación es necesaria para el almacenamiento, para asegurar mejores resultados, las muestras no deben someterse a más de un ciclo de congelación y descongelación.

Para visualizar los complejos mitocondriales ETC con BN PAGE, se cargaron 100 μg de proteína de mitocondrias aisladas del corazón en un gel de 4-10% ( Figura 1A ). La tinción de Coomassie en el tampón de carga y de cátodo es suficiente para marcar los complejos de proteína durante la ejecución. Aparecen supercomplexes después de aumentar el contraste digitalmente (no se muestra). Para CN PAGE, dos muestras de 20 μg oF de mitocondrias aisladas se cargaron en un 3 - 8% de gel de CN y se separaron ( Figura 1B ). El CN PAGE fue teñido con Coomassie y destained para visualizar los complejos de proteína. Después de aumentar el contraste digitalmente, aparecieron varios complejos de proteínas con un peso molecular mayor que el monómero de Cx-I ( Figura 1B , derecha). Las concentraciones de AAB utilizadas permitieron que los supercomplejos más grandes reciban el gel del pocillo. Sin embargo, un gel que termina con un gradiente de menos del 3% de AAB no es lo suficientemente estable como para manipular para la transferencia o para excisar una banda o carril. Además, la baja concentración de AAB en las partes superiores de los geles CN 3-8% mantiene cierta movilidad de los complejos de proteínas, lo que es importante si se considera la electroelución nativa [ 19] .

Monómeros y supercomplexos de Cx-I y monómeros, dímeros y supercomplejos de CXV son enzimáticamente activos y pueden ser visualizados por IGA ( Figura 1C- F ). Los ensayos muestran que, en las mitocondrias aisladas del corazón, Cx-I y Cx-V están presentes en complejos de proteínas mayores que sus respectivos monómeros. En el ensayo IGA para Cx-I, el NADH se oxida y los electrones se transfieren para reducir el nitroazul tetrazolio. Esto da como resultado un color azul localizado al peso molecular de los monómeros Cx-I y los respirasomas / supercomplejos que contienen Cx-I ( Figura 1C ). La actividad de Cx-V se evalúa a partir de la capacidad de la subunidad F1 para hidrolizar ATP y se puede hacer usando geles CN o BN ( Figura 1D- F ). El ADP generado a partir de esta reacción interactúa con el plomo y da lugar a un precipitado blanco al nivel de los monómeros Cx-V, dímeros, sintomas y subcomplejos (lo más probable es que la porción F 1 no ensamblada de Cx-V). Tenga en cuenta que la oligomicina elimina el lAbeling de estas bandas, lo que confirma que contienen Cx-V ( Figura 1E ).

Para todos los experimentos descritos aquí, el detergente zwitteriónico, lauril maltosida, se usó a una concentración de 2 μg / 1 μg de proteína, que es la concentración más alta posible que preserva los supercomplejos al tiempo que proporciona resultados consistentes y reproducibles ( Figura 1F ). Sin embargo, la eficacia del lauril maltósido depende del número de lote, las condiciones de almacenamiento y la edad. Por lo tanto, la concentración exacta utilizada en un laboratorio no es necesariamente la misma que se indica en los manuscritos. La concentración adecuada de detergente solubilizará las membranas pero mantendrá intactos los complejos y supercomplejos y deberá determinarse usando una variedad de concentraciones de lauril maltosida ( Figura 1F ). Para CN PAGE, se preparó un volumen de muestra total de 40 μL por pocillo, Lo que da como resultado una relación proteína / detergente de 1 μg / 2 μg o una relación detergente / tampón de 1 μg / 1 μl (igual a 1,9 mM). A partir de los 40 μl, se aplicaron 30 μl por pocillo del mini-gel; El resto se utilizó como una alícuota para la detección de VDAC, un control de carga ( Figura 2D ).

Para la inmunotransferencia, se prefiere CN a BN-PAGE porque las proteínas no se cargan con Coomassie, que puede interferir con la detección por anticuerpos. La Figura 2 muestra la detección de supercomplejos que contienen las proteínas Cx-I y Cx-V NDUFB6 y ATP5A de mitocondrias aisladas de corazón, hígado y cerebro. Ponceau S marcaje después de la transferencia y antes de immunoblotting se puede utilizar para marcar los marcadores de peso molecular y para controlar la carga de proteínas ( Figura 2A ]. Esto visualizará los monómeros de los complejos de proteína del ETC sobre nitrocellulPero el etiquetado de Ponceau S no siempre es suficiente para la visualización de supercomplexos mitocondriales ( Figura 2A ), lo que se puede lograr mediante inmunotransferencia.

Cx-I no se ensambla en dímeros y tetrámeros, per se, pero forma supercomplexos de peso molecular cada vez más altos con Cx-III y Cx-IV 14 , 20 , 21 . En este caso, el uso de un anticuerpo contra NDUFB6 muestra que la muestra del corazón contenía más monómero Cx-1 y supercomplejos de alto peso molecular (bandas superiores) que las mitocondrias del hígado o el cerebro ( Figura 2B ). La cantidad de supercomplexos respiratorios de rango medio fue también mucho mayor en el corazón que en los otros tejidos ( Figura 2B ).

Utilizando anticuerpos anti-ATP5A,Los monómeros de Cx-V son detectables en las mitocondrias de todos los tejidos, mientras que un patrón distinto de bandas representativas de dímeros (D) y supercomplejos más grandes (SC), claramente visibles en las mitocondrias cardíacas, no son tan prominentes en las mitocondrias hepáticas y cerebrales Figura 2C ). La sobreexposición (1 min frente a 20 s) del inmunoblot muestra varios supercomplexos que contienen Cx-V, que podrían representar tetrámeros y sintomasas ( Figura 2C ). Estos patrones de complejos de proteínas que contienen Cx-V en el corazón, el hígado y las mitocondrias cerebrales muestran diferencias que pueden ser específicas de tejidos y aún no han sido exploradas.

La carga de proteínas de estas transferencias puede ser seguida por tinción con Ponceau S y detección VDAC de la alícuota antes mencionada por SDS PAGE, como se demuestra en la Figura 2D .

No todos los antiboSon adecuados para detectar una proteína dentro de la estructura cuaternaria o terciaria de un complejo de proteína después de PAGE nativo. Para superar este problema, se pueden montar carriles completos y parciales del gel nativo sobre un gel desnaturalizante para una segunda dimensión (geles 2D, véase la referencia 13 para una demostración). La electroforesis 2D es una valiosa herramienta para visualizar las proteínas en un complejo supramolecular. Sin embargo, como se muestra en la Figura 2 , supercomplejos están presentes en cantidades variables, y la señal de proteínas individuales de supercomplejos puede ser difícil de visualizar en la segunda dimensión, la desnaturalización. Para superar este problema, se usó la electroelución de complejos de proteína a partir de geles nativos. Esto aísla las bandas supercompletas de múltiples carriles para producir más material para estudio adicional.

Cuando se utiliza la electroelución, sólo la banda de interés, que ha sido identificada por IGA y / o visualizada en una BN PAGE, es excIsed Las proteínas de esta pieza de gel se purifican adicionalmente por elución del gel. La Figura 3A muestra un carril de una BN PAGE a partir de la cual las bandas que representan el monómero se escindieron para electroelución. Para evaluar la actividad Cx-V del monómero después de la electroelución, el eluido se aplicó a una segunda PÁGINA CN. El eluido del monómero contiene todavía Cx-V enzimáticamente activo, pero también aparecen subcomplexos ( Figura 3B ). La tinción con plata del eluato después de CN PAGE nativo ( Figura 3C ) o SDS PAGE desnaturalizante ( Figura 3D ) indica la presencia de proteínas en el eluato, y la inmunotransferencia contra ATP5A indica la presencia de Cx-V en ambas muestras ( Figura 3D ).

Figura 1
Figura 1: Visualización de MitochSupercomplexos ondulares. ( A ) Dos carriles de un maxi-gel BN de 4-10%, con muestras de mitocondrias aisladas del corazón. Se realizaron alícuotas de la misma muestra en ambos carriles, a 100 μg de proteína por pocillo. Los monómeros de los complejos de proteínas I, II, III, IV y V del ETC son claramente visibles y están marcados a la derecha del gel. ( B ) Se separaron dos muestras de mitocondrias del corazón (1 y 2, 20 μg de proteína / carril) en una PAGE de CN y se visualizaron mediante tinción con Coomassie. SC indica la posición de los supercomplejos después de la ampliación y realce digital de la parte superior del gel (el área está indicada por flechas rojas). ( C ) Se separaron 20 μg de proteína mitocondrial en una PAGE de 3 a 8% de CN y se procesaron para Cx-I IGA. Las imágenes ampliadas y mejoradas digitalmente muestran bandas de producto de reacción Cx-I. ( D ) Se separaron 20 μg de proteína mitocondrial en una PAGE de 3 a 8% de BN y se procesaron para Cx-V IGA. Magnifi Ed y imágenes mejoradas digitalmente demuestran bandas de producto de reacción Cx-V. ( E ) Se separaron 50 μg de proteína mitocondrial en una PAGE de 5-15% de CN y se procesaron para IGA de Cx-V sin (-) y con (+) 5 μg / mL de oligomicina (Oligo). ( F ) La proteína mitocondrial (20 μg / carril) se solubilizó con 2 - 6 μg de lauril maltosida / 1 μg de proteína, como se indica en la parte superior del gel, y se separó en un gel NC al 3 - 8% seguido por Cx - V IGA. Todas las imágenes fueron fotografiadas utilizando una mesa de luz ( A - C ) o una superficie negra ( D - F ). Las especificaciones de la cámara se encuentran en la Tabla de materiales. La ubicación de los marcadores de peso molecular (MW) se indican en el lado izquierdo de todos los paneles. Abreviaturas: D = dímeros; F 1 * = subcomplexo de Cx-V; LM = maltosido de laurilo; M = marcador de peso molecular; M = monómeros; SC = supercomplejos.G1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Detección de supercomplexos mitocondriales por inmunotransferencia. Se separaron 20 μg de proteína de las mitocondrias del corazón (H), del hıgado (Li) y del cerebro (B) en una PAGE de CN de 3-8% y se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa. ( A ) Ponceau S tinción de la membrana indica la presencia de complejos de proteínas y marcadores de peso molecular (m). La flecha azul apunta a la parte superior del gel. ( B ) Se inmunomarcó la proteína Cx-I, NDUFB6, en la mancha mostrada en (A) (tiempo de exposición de 1 min). ( C ) Cx-V se visualizó con anticuerpo anti-ATP5A (exposición de 20 sy 1 min, según se indica). Las flechas rojas en (B) y (C) indican el área ampliada y digitalmente mejorada para el visuaLización de supercomplexos que contienen Cx-I y Cx-V, y la flecha azul apunta a la parte superior del gel. ( D ) Ponceau S e inmunomarcación de la alícuota de VDAC de cada extracto utilizado en (A), (B) y (C), que se separaron por SDS PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Abreviaturas: M = monómeros de Cx-I o Cx-V, D = dímeros de Cx-V, SC = supercomplejos que contienen Cx-I o Cx-V. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Electroelución de Cx-V. ( A ) BN PAGE de una muestra mitocondrial. La banda en caja representa el monómero de Cx-V que se escindió y se electroeluyó. ( B ) El eluato se sometió a CN PAGE, y IGA subsiguiente para Cx-V demuestra monómeros (M)Y subcomplejos que contienen F $ ₁ $ de Cx-V. ( C ) La tinción con plata de la CN PAGE del eluato demuestra monómeros (M). ( D ) La tinción con plata (panel izquierdo) y la inmunotransferencia para ATP5A (panel derecho) de una SDA de dodecil sulfato de sodio desnaturalizante (SDS) del eluato indica la presencia de Cx-V. Para SDS PAGE, consulte los protocolos publicados en otro lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Un ETC funcional es necesario para la generación de ATP mitocondrial. Los complejos del ETC son capaces de formar dos tipos de supercomplejos: los respirasomes (Cx-I, -III, y -IV) 1 y los sintomas (Cx-V) 2 . El montaje de cada complejo es necesario para un ETC intacto, mientras que la organización de la ETC en supercomplexes se cree que aumentar la eficiencia global ETC [ 5 , 22] . No se conocen bien cómo se montan y desarman estos supercomplejos, pero los protocolos aquí presentados pueden permitir una mejor comprensión de estos procesos.

El mayor desafío de estudiar el montaje de ETC es el tamaño de estos complejos de proteínas. Por ejemplo, los respirasomas mitocondriales pueden consistir en Cx-I (alrededor de 880 kDa) y una o más moléculas de Cx-III (460 kDa) y Cx-IV (200 kDa, activa como dímero), dando como resultado un supercomplejo con una molécula Peso de aproximadamente2.000 kDa. Además, Cx-V tiene un peso molecular de aproximadamente 600 kDa pero se ha demostrado que se ensambla en dímeros, tetrámeros, oligómeros y cintas de dímeros 7 , 23 , dando como resultado supercomplejos con un peso molecular de al menos 2.000 kDa. Teniendo en cuenta el enorme tamaño de estos supercomplejos, varios enfoques parcialmente relacionados se han utilizado tradicionalmente para identificar y caracterizar estos supercomplejos, por este laboratorio y por otros 8 , 14 , 24 .

Este trabajo ha demostrado la técnica de gel PAGE nativo, donde complejos de proteínas activas se extraen suavemente de la membrana mitocondrial con detergentes suaves. Los complejos migran en los geles principalmente debido a su tamaño y carga intrínseca (CN PAGE) o debido al tamaño y carga negativa de azul de Coomassie ligado a proteínas (BN PAGE). Estos geles se pueden teñir usando CAzul de oomassie ( por ejemplo, en geles de CN) o manchas de plata ( por ejemplo, en BN y CN PAGE) para revelar bandas de proteínas.

Lauryl maltoside se utilizó para los experimentos demostrados aquí porque este detergente funcionó de manera más fiable. Alternativamente, la digitonina se puede utilizar para extraer complejos de proteínas [ 12] . Los datos de las mitocondrias aisladas de los corazones de los adultos, el hígado y el cerebro se han demostrado aquí, pero estas técnicas se han realizado en el corazón embrionario y homogenados adultos [ 8] . Otros han realizado esta técnica utilizando mitocondrias aisladas de células cultivadas [ 24] . Sin embargo, cuando se usan homogeneizados de tejido o células cultivadas con un alto contenido de ADN, puede ser útil añadir una nuclease para evitar la formación de rayas durante la electroforesis 25 .

La actividad de los diferentes complejos se puede ensayar directamente en el gel, como se demuestra aquí para Cx-I y Cx-V, y tecTambién se dispone de técnicas para examinar las actividades de Cx-II, -III y -IV 12 . Sin embargo, el análisis de estos IGAs debe hacerse con cuidado. En primer lugar, la reacción enzimática podría deberse a enzimas no-ETC o complejos incompletamente ensamblados. Por ejemplo, es rutinario realizar la IGA de Cx-V con un gel paralelo que ha sido tratado con oligomicina para inhibir la Cx-V intacta ( Figura 3 ). Además, otras oxidasas de NADH pueden explicar la actividad en gel Cx-1. Se podría realizar una IGA paralela en presencia de un inhibidor de Cx-I, tal como rotenona. Sin embargo, en la Figura 1 , se usaron mitocondrias aisladas, por lo que no se encontraron oxidasas de NADH citoplásmicas; Por lo tanto, los datos representan muy probablemente monómeros y supercomplejos que contienen Cx-I. Además, la cuantificación de estos resultados es posible midiendo la intensidad de la señal de las bandas en las fotografías o las exploraciones. Los inconvenientes de este enfoque incluyen las diferencias entreDentro de los geles, la movilidad del producto de reacción, la incapacidad para cuantificar adecuadamente el producto a lo largo de la profundidad del gel y la potencial no linealidad de la reacción 27 . Para superar este último, algunos han sugerido la obtención de tasas de reacciones utilizando fotografías en serie, pero esto no ha sido probado aquí.

La proteína en geles nativos también se puede transferir a membranas, y la composición proteica de las bandas puede ser examinada por inmunotransferencia (demostrada aquí) o 2D PAGE (demostrada en la referencia 13 ). Los monómeros de los complejos ETC se han identificado tradicionalmente por su abundancia en geles nativos de mitocondrias aisladas, su ubicación en el gel y su posición con respecto a la proteína marcador molecular ( Figura 1 ). Además, el marcaje de inmunotransferencias posteriores con anticuerpos específicos para subunidades de diferentes complejos ayuda a identificar el complejo y la composiciónDe supercomplejos. Por lo tanto, anti-NDUFB6 y -ATP5A identificar los monómeros y supercomplejos que contienen Cx-1 y Cx-V, respectivamente, como se demuestra aquí. Los anticuerpos para Cx-II a IV pueden usarse para el mismo propósito. En algunos casos, los anticuerpos que funcionan bien en geles desnaturalizantes pueden no funcionar bien en geles nativos debido al hecho de que algunos anticuerpos son específicos de la proteína desnaturalizada o que un epítopo puede ser enmascarado por otras proteínas en un complejo nativo.

La determinación exacta del peso molecular de estos supercomplejos es difícil, puesto que la mayoría de los marcadores de peso molecular disponibles están por debajo del tamaño de los monómeros Cx-V. La migración de complejos de proteínas en un gel nativo depende del tamaño, la carga intrínseca y detergente utilizado [ 28] . En los ejemplos aquí, los monómeros de los complejos se identificaron basándose en geles, marcadores e inmunotransferencia. Los dímeros de Cx-V se identificaron basándose en la migración relativa en comparación con los monómeros de Cx-I y -V y en inmunoBlotting Todo lo demás por encima de los monómeros y dímeros en geles, IGAs y inmunotransferencias se consideran supercomplejos.

Las inmunotransferencias nativas también se pueden cuantificar para supercomplejos analizando la densidad de banda usando técnicas estándar. Este método no se muestra aquí, pero una publicación reciente demuestra esta técnica 8 . La normalización de la carga de la proteína se puede hacer usando la tinción roja de Ponceau del carril o ahorrando una muestra del extracto mitocondrial para medir la densidad de la venda de VDAC en un immunoblot desnaturalizante ( figuras 2A y D ). Además, examinar la relación de supercomplejos a monómeros en la misma inmunotransferencia es otra forma de cuantificar la densidad de banda, pero hay que tener cuidado de tomar fotos en diferentes momentos durante el desarrollo de la mancha para que las bandas no estén sobreexpuestas.

Finalmente, las bandas de geles nativos pueden ser electroluidas para generar purifieD, complejos de proteínas activas que se pueden ensamblar en complejos de orden superior y pueden utilizarse para estudios adicionales de función compleja. Por ejemplo, los monómeros Cx-V fueron electroeluidos previamente y reconstituidos en liposomas para demostrar la funcionalidad eléctrica 29 . Un enfoque alternativo para la electroelución nativa es la elución por difusión pasiva en el tampón circundante 16 , pero esto es lento comparado con la electroelución nativa. Por último, un problema importante con la electroelución es el mantenimiento de la función enzimática del complejo de proteínas electroeluidas, ya que el complejo puede disociarse durante la purificación. Por lo tanto, cualquier ensayo de función después del aislamiento por esta técnica tendría que ser rigurosamente probado.

Combinando estos protocolos con ensayos enzimáticos y mediciones del consumo de oxígeno, que sondean la función de los complejos ETC individuales y la actividad de todo el ETC 30 , y otros métodosComo la evaluación cristalográfica 31 y microscopía electrónica 32 de la estructura de complejos y supercomplejos, se puede y ha surgido una imagen más completa del funcionamiento interno de la ETC. Estamos más cerca de entender cómo se ensamblan los complejos, cómo los electrones fluyen hacia abajo de la cadena y cómo los protones se bombean a través de la membrana para generar el gradiente y luego fluyen de nuevo a la matriz a través de Cx-V para generar ATP. Sin lugar a dudas, estas técnicas se perfeccionarán más para proporcionar detalles adicionales sobre la estructura, la función y la regulación dinámica del ETC.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de la American Heart Association Afiliado [12GRNT12060233] y el Centro de Investigación de Niños fuertes de la Universidad de Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

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Bioquímica Número 124 Mitocondrias cadena de transporte de electrones respirasomes synthomas electroforesis nativa clara ensayos en gel electroelución
Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución
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Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

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